BÀI TẬP LỚN CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

Nhóm IV: Dịch phần 2.5

Thành viên:

Lê Thị Ngọc Ánh

Lê Nữ Ngọc Chương

Nguyễn Như Quỳnh

Phạm Thị Sen

(Lê Nữ Ngọc Chương dịch)

2.5 Sửa đổi Protein sau dịch mã

Nhiều Polypeptide trải qua quá trình biến đổi cộng hóa trị sau ( hoặc đôi khi trong )
quá trình lắp ráp Ribosome của chúng. Hầu hết các quan sát phổ biến nhất như PTMs
được liệt kê trong bảng 2.7. Những sửa đổi như vậy thường ảnh hưởng đến hoạt động
sinh học hoặc sự ổn định cấu trúc của Polypeptide. Phần lớn các Protein điều trị mang
một số dạng PTM. Mặc dù Glycosyl hóa đại diện cho sự sửa đổi phổ biến nhất như
vậy, PTMs bổ sung quan trọng trong bối cảnh dược phẩm sinh học bao gồm Carboxyl
hóa, hydroxyl hóa, sulfate hóa và amid hóa; các PTMs này đang được xem xét thêm.

2.5.1 Glycosyl hóa

Glycosyl hóa ( đính kèm Carbohydrate) là một trong những dạng PTM phổ biến nhất
liên quan đến protein eukaryote nói chung, đặc biệt là protein ngoại bào và tế bào
nhân thực. Trong trường hợp của một số glycoprotein, việc loại bỏ thành phần đường
không có tác dụng có thể phát hiện được đối với các đặc tính sinh học (các dạng
glycoprotein bị khử hóa có thể được tạo ra bằng cách bao gồm các chất ức chế con
đường glycosyl hóa, ví dụ như Tunicamycin trong kháng sinh.
Bảng 2.7 Các loại PTM mà polypeptide có thể trải qua. Tham khảo văn bản để biết
thêm chi tiết

Sự sửa đổi Ví dụ
Quá trình Proteolytic Các Protein khác nhau chỉ hoạt động
sinh học khi phân tách protein (ví dụ
một số yếu tố trong máu)
Glycosyl hóa Đối với một số protein glycosyl hóa có
thể làm tăng độ hòa tan, ảnh hưởng đến
thời gian bán sinh học và/hoặc hoạt
động sinh học.
Phosphoryl hóa Ảnh hưởng/ điều chỉnh hoạt động sinh
học của các Polypeptide khác.
Acetyl hóa Chức năng không rõ ràng
Acyl hóa Có thể giúp một số polypeptide tương
tác với/ neo trong màng sinh học
Amid hóa Ảnh hưởng đến hoạt động sinh học/
tính ổn định của một số Polypeptide.
Sunfate hóa Ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của
một số neuropeptide và quá trình phân
giải protein của một số polypeptide
Hydroxyl hóa Quan trọng đối vợi sự lắp ráp cấu trúc
của một số protein
ᵞ- Carboxyglutamate formation Quan trọng trong việc cho phép một số
protein máu liên kết với Canxi
ADP-ribosylation Điều chỉnh hoạt động sinh học của các
protein khác nhau
Disulfide Giúp ổn định cấu tạo của một số
Protein
Hoặc do sự phân hủy enzyme của Glycocomponent của Glycoprotein được tạo thành
trước bằng cách sử dụng enzyme glycosidase). Tuy nhiên, trong các trường hợp khác,
thành phần đường đóng vai trò trực tiếp trong hoạt tính sinh học của Glycoprotein
(bảng 2.8). Ví dụ, hCG bản địa ( Chương 11) là một laoị hormone tuyến sinh dục bị
glycosyl hóa nặng. Việc loại bỏ các thành phần đường của nó thường làm mất khả
năng tạo ra phản ứng sinh học, mặc dù ái lực gắn kết của hormone đối với thụ thể của
nó vẫn không thay đổi, hoặc đôi khi thực sự tăng lên. Các Protein điều trị hiện đã
được phê duyệt cho sử dụng y tế nói chung là glycolated được liệt kê trong bảng 2.9.

Chuỗi bên carbohydrate được tổng hợp bởi một họ các enzyme được gọi là
glycosyltransferase , chủ yếu nằm trong mạng lưới nội chất. Hai loại glycosyl hóa có
thể xảy ra: liên kết N và liên kết O. Trong trường hợp glycosyl hóa liên kết N, chuỗi
đường (oligosacarit) được gắn vào protein thông qua nguyên tử N của dư lượng
Asparagine, trong khi các hệ thống liên kết O. chuỗi đường được gắn với nguyên tử
Oxy của hydroxyl các nhóm, thường là những nhóm có dư lượng Serine hoặc
Theronine ( hình 2.9). Monoasacarit phổ biến nhất được tìm thấy trong các chuối bên
đường bao gồm mannose, galactose, glucose, fucose, N-acetylglucosamine, N-
acetylgalactosamine, xyloza, acid sialic. Chúng có thể được nối với nhau theo nhiều
trình tự khác nhau và bằng nhiều liên kết Glycosid. Carbonhidrate hóa học của
glycoprotein, do đó, khá phức tạp. Cấu trúc của hai chuỗi oligosacarit ví dụ như vậy
được trình bày trong hình 2.10.

(Lê Thị Ngọc Ánh dịch)

Quá trình glycosyl hóa liên kết N đặc hiệu theo trình tự, liên quan đến việc chuyển
đổi một chuỗi oligosaccaride được tổng hợp trước thành một lượng dự Asn được tìm
thấy trong một trình tự đặc trưng Asn-X-Ser hoặc Asn-X-Thr hoặc Asn-X-Cys, trong
đó X đại diện cho bất kỳ dư lượng axit amin nào, ngoại trừ Proline. Một yếu tố quyết
định quá trình glycosyl hóa cũng phải bổ sung vào, vì không phải tất cả các vị trí chứa
liên kết N tiềm năng đều được glycosyl hóa trong một số protein. Chuỗi bên
oligosacarit được tổng hợp trước sau đó trải qua quá trình cắt và sửa đổi trung gian
bằng bổ sung enzyme glycosyltranferase. Yếu tố quyết định của quá trình glycosyl
hóa liên kết O thậm chí còn ít được hiểu rõ. Việc nhận dạng ra các trình tự đặc trưng
thì không rõ ràng trong hầu hết các trường hợp và đặc điểm của cấu trúc ba chiều
dường như quan trọng hơn trong những trường hợp như vậy. Một số protein được
glycosyl hóa sẽ đặc trưng bởi một hoặc nhiều chuỗi bên liên kết N của đường, một số
khác thì đặc trưng bởi một hoặc nhiều chuỗi bên liên kết O và cũng có một số khác
nữa đặc trưng bởi cả chuỗi liên kết N và chuỗi liên kết O. Ví dụ trong Human EPO
(chương 10) thể hiện ba chuỗi bên liên kết N và một chuỗi liên kết O của đường.
Đối với bất kỳ glycoprotein nào thì thành phần và cấu trúc chính xác của chuỗi bên
carbonhydrate có thể thay đổi đôi chút ở một phân tử của glycoprotein này với
glycoprotein tiếp theo. Điều này dẫn đến tính không đồng nhất có thể được hình dung
trực tiếp bằng các kỹ thuật phân tích như tập trung đẳng điện (Chương 7). Ngoài ra,
tính không đồng nhất có thể là do sự glycosyl hóa vị trí có thể thay đổi, đó là một số vị
trí glycosyl hóa vẫn còn trống trong một phần các phân tử glycoprotein. Nhìn chung
cơ sở của tính không đồng nhất có thể là do tính đặc hiệu cơ chất của enzyme
glycosyltransferase và thực tế là chỉ một phần protein được glycosyl hóa có thể được
được tạo ra từ tế bào trước khi chúng được xử lý hoàn toàn bởi enzyme
glycosyltranferase.

Bảng 2.8. Những vai trò tiềm năng và ảnh hưởng của thành phần glyco trong
glycoprotein. Trích từ Nature Biotechnology 24 (Công nghệ sinh học tự nhiên),
1241-1252, của Walsh, G. and Jenfferies, R. (2006).

Vai trò/ Ảnh hưởng Giải thích

Gấp nếp protein Glycosyl hóa có thể ảnh hưởng đến cấu
trúc thứ cấp cục bộ của protein và giúp
gấp trực tiếp chuỗi polypeptide.
Nhắm mục tiêu và sự di chuyển của Thành phần glyco có thể tham gia vào
protein việc phân loại và định hướng của protein
đi đến đích cuối của nó.
Nhận biết hay liên kết cấu tử Hàm lượng cacbohydrate trong các
kháng thể, ví dụ thực hiện chức năng
trong kháng thể là liên kết các thụ thể F c
đơn bào và tương tác với thành phần bổ
sung Clq
Hoạt tính sinh học Chuỗi bên carbohydrate của
gonadotropin ( các hormone polypeptide
glycoprotein được tiết ra bởi các tế bào
sinh dục của tuyến yên trước của động
vật có xương sống) là rất cần thiết để
kích hoạt sự truyền tín hiệu
 gonadotropin.
Ổn định Chuỗi bên đường có khả năng ổn ddingj
một glycoprotein theo một số cách, bao
gồm tăng cường khả năng hòa tan của
chúng, che chắn màng kỵ nước trên bề
mặt của nó, bảo vệ khỏi sự phân giải
protein và bằng cách tham gia trực tiếp
vào tương tác xâm nhập ổn định.
Điều hòa chu kỳ bán rã Protein Nồng độ acid sialic (một họ đường có
tính axit thường bao gồm các chuỗi
đường bên) cao có thể làm tăng thời gian
chu kỳ bán rã của glycoprotein trong
huyết tương. Tiếp xúc với dư lượng
galactose có thể làm giảm thời gian bán
hủy trong huyết tương bằng cách thúc
đẩy sự hấp thụ thông qua dư lượng
galactose ở gan. Quá trình glycosyl hóa
nấm men thuộc loại mannose cao, cũng
có thể loại bỏ nhanh chóng khỏi lưu
thông thông qua các thụ thể bề mặt tế
bào mannose cụ thể.
Miễn dịch Một số mô típ glycosyl hóa đặc trưng
của glycoprotein có nguồn gốc thực vật
(thường chứa dư lượng fucose và xylose)
có khả năng miễn dịch cao ở động vật có
vú.

(Nguyễn Như Quỳnh dịch)

Bảng 2.9 : Các protein dược liệu được xác nhận là các protein được glycosyl hóa.
Những protein này được đề cập ở chương tiếp theo. Được ghi chép lại từ Walsh, G.
và Jefferies, R, 2006. Cuốn công nghệ sinh học tự nhiên, trang 1241 – 1252.
Danh mục protein dược liệu Sản phẩm cụ thể (theo tên thương mại)

Yếu tố máu, thuốc chống đông máu Activase, Advate, Benefix, Bioclate,
và huyết khối Helixate/ Kogenate, Metalyse/TNKase,
Novoseven,Recombinate,Refacto, Xigiris
Kháng thể Avastin, Bexxar, Erbitux, Herceptin,
Humaspect, Humira, Mabcampath,/
Campath-H1, Mabthera/ Rituxan, Mylotarg,
Neutrospec, Oncoscint, Orthoclone OKT-3,
Prostascint, Raptiva, Remicade, Simulect,
Synagis, Xolair, Zenapax, Zevalin
Hormone Gonal F, Luveris, Ovitrelle/ Ovidrel,
Puregon/ Follistim, Thyrogen
Các yếu tố kích thích khuẩn lạc bạch Epogen/Procrit, Leukine, Neorecormon,
cầu hạt và đại thực bào Nespo/Aranesp
Interferons Avonex, Rebif
Những yếu tố khác Aldurazyme, Amevive, Cerezyme, Enbrel,
Fabrazyme, Inductos, Infuse, Osigraft/OP-1
implant, Pulmozyme, Regranex, Replagal

Hình 2.9 (a) Glycosyl hóa protein ở vị trí N (b) Glycosyl hóa protein ở vị trí O.

“Đường” biểu diễn một chuỗi oligosaccharide, một ví dụ của nó được thể hiện ở
Hình 2.10 .
 Hình 2.10: Cấu trúc của hai chuỗi bên oligosaccharide (dạng liên kết N- hoặc
dạng liên kết O- ) được tìm thấy trong glycoproteins. Man: manose; Gal: galactose;
SA: salic acid, GlcNAc: N-acetyl glucosamine; GalNAc: N-acetyl galactomine.

Hầu như tất cả những chất glycolproteins dược liệu, thậm chí khi được sản
xuất tự nhiên trên cơ thể, đều thể hiện tính không đồng nhất, ví dụ như, 2 loại
interferon-γ (IFN-γ ) của người, một có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa và một loại
khác thì có khối lượng phân tử khoảng 25 kDa, nó sẽ khác nhau về bậc và vị trí của
(N-liên kết) glycosyl hóa protein.

Thêm vào đó, các kiểu glycosyl hóa thu được khi những glycolprotein ở người
được biểu hiện trong các hệ thống biểu hiện sinh vật nhân thực, không phải của con
người (ví dụ như nuôi cấy tế bào động vật) , thường hơi khác với kiểu glycosyl hóa
liên quan đến những protein tự nhiên của con người. Ví dụ, kiểu glycosyl hóa của
tPA ở người được tạo ra ở động vật chuyển gen, khác với kiểu thu được khi cùng
một kiểu gen được biểu hiện trong một dòng tế bào chuột tái tổ hợp. Cả hai kiểu này
đều lần lượt khác với kiểu tự nhiên của người. Về mặt ý nghĩa lâm sàng, nếu có, của
các kiểu glycosyl hóa thay đổi hay độ không đồng nhất không phải lúc nào cũng có
thể dự đoán được và được xác định tốt nhất bằng thử nghiệm lâm sàng trực tiếp. Nếu
sản phẩm được phát hiện là an toàn và hiệu quả thì việc phân tích kiểm soát chất
lượng sản phẩm cuối cùng (QC) để kiểm tra mức độ vi sinh vật dựa trên
Carbohydrate được tiến hành nhiều hơn để xác định tính nhất quán theo từng đợt
(mong muốn), thay vì phát hiện độ không đồng nhất trên mỗi per se.
(Phạm Thị Sen dịch)

2.5.2 Cacboxyl hóa và hydroxyl hóa.

α _ Carboxylation và β - Carboxylation là đặc tính PTMs của một số protein hạn chế,
chủ yếu là một tập hợp protein có chức năng trong quá trình cầm máu. α _
Carboxylation đòi hỏi phải chuyển đổi enzyme của chuỗi bên của dư lượng glutamate
cụ thể trong protein đích, tạo thành α _ Carboxylation ( chuyển đổi dư lượng “Glam”
thành dư lượng “Gla”; Hình 2.11a) β - Carboxylation của dư lượng aspartate (Asp) tạo
ra β - Hydroxyasparate (Asp → Hya; Hình 2.11b). Cả hai PTMs đều giúp điều hòa sự
liên kết của các ion canxi, rất quan trọng và cần thiết cho hoạt động hiệu quả của các
yếu tố máu VII, IX và X cũng như hoạt hóa protein C và protein S của hệ thống chống
đông máu (Chương 12).

Hình 2.11 α _ Carboxyl hóa dư lượng glutamate (Glu) tạo ra α _ Carboxylglutamate

(Gla), trong khi β - Hydroxyl hóa của aspartate (Asp) tạo ra β - hydroxyaspartate
(Hya) của asparagine (Asn) mang lại B-hydroxyasparagine (Hyn).
2.5.3 Sulfation và Amidation.

Sulfation và amidation là hai đặc tính PTMs bổ sung của một lượng nhỏ dược
phẩm sinh học.Quá trình sulfat hóa đòi hỏi sự xúc tác enzyme của các nhóm sulfate
(SO). Thường thông qua các chuỗi bên tyrosin cụ thể để nhắm mục tiêu polypeptide.
Sự sunfat hóa thường đóng một vai trò trong các tương tác giữa protein và sự thiếu hụt
suunfat có xu hướng làm giảm hoạt động của một polypeptide, trái ngược với việc
hoàn toàn loại bỏ nó. Các protein điều trị đáng chú ý được sunfat ở trạng thái tự nhiên
của chúng bao gồm hirudin chống đông máu (Chương 12) và các yếu tố máu VIII và
IX. Các dạng tái tổ hợp của các protein này được tạo ra bởi kỹ thuật di truyền nói
chung đã làm giảm mức độ hoặc không xảy ra sự sulfat hóa nhưng chúng vẫn đem lại
hiệu quả về mặt trị liệu. Amidation có đề cập đến việc thay thế nhóm carboxyl C-
teminal của protein bằng nhóm amide (COOH → CONH2 ). PTM này thường là đặc
trưng của chuỗi peptide (chuỗi axit amin rất ngắn), trái ngược với polypeptide dài hơn,
nhưng một polypeptide trị liệu ( calcitonin cá hồi: Chương 11) được điều hòa và cần
thiết để chức năng hoạt động đầy đủ. Nhìn chung, chức năng của amidation không
được hiểu rõ. Mặc dù trong một số trường hợp, ít nhất nó dường như góp phần vào sự
ổn định và hoạt động của polypeptide.

Đọc thêm
Sách
Buxbaum, E. 2006. Nguyên tắc cơ bản về cấu trúc và chức năng của protein.
1.
Carey, P. 1996. Thiết kế và kỹ thuật protein. Báo chí học thuật.
2.
Cavanagh, J. Fairbrother, W.J., Palmer III, A.G., Skelton, NJ., Và Rance, M. 2006. Quang phổ protein NMR: Nguyên tắc và thực hành,
3.
phiên bản 2. Báo chí học thuật.

Creighton, T. 2006. Protein. Nhà xuất bản Đại học Oxford.

4.
Eidhammer, I., Jonassen, L. và Taylor, W.R. 2006. Tin sinh học protein. Wiley.
5.
Fersht, A. 1999. Cấu trúc và cơ chế trong khoa học protein. Người tự do.
6.
Higgins, D. 2000. Tin sinh học. Nhà xuất bản Đại học Oxford.
7.
Rehm, H. 2006. Sinh hóa protein và Proteomics. Báo chí học thuật.
8.
Walsh, C. 2005. Điều chỉnh hậu biến của protein. Nhà xuất bản Roberts & Company.
9.
Bài viết

Cấu trúc và nếp gấp của Protein

Al-Lazikani, B., Jung. J., Xiang, Z. và Honig, B. 2001. Dự đoán cấu trúc protein. Ý kiến hiện tại về Sinh học Chemi 5 (1), 51-56.
1.
Basharov, M. 2003. Protein gấp. Tạp chí y học tế bào và phân tử 7 (3), 223 - 237.
2.
Bonvin, A.M., Boelens, R. và Kaptein, R. 2005. Phân tích NMR về tương tác protein. Ý kiến hiện tại về Sinh học hóa học 9 (5), 501-508.
3.
Brannigan, J. và Wilkinson, A. 2002. Kỹ thuật protein 20 năm. Nhận xét tự nhiên: Sinh học tế bào phân tử 3 (12), 964 - 970.
4.
Chasse, G.A., Rodriguez, A.M., Mak, M.L., Deretey, E., Perczel, A., Sosa, C.P., Enriz, R.D., và Csizmadia L.G. 2001. Peptide và protein
5.
gấp. Tạp chí cấu trúc phân tử: 537, 319 - 361.

Fiser, A. 2004. Mô hình cấu trúc protein trong kỷ nguyên proteomics. Đánh giá của chuyên gia về Proteomics 1 (1), 97 - 110.
6.
Floudas, C.A., Fung, H.K., McAllister, S.R., Monnigmann, M., và Rajgaria, R. 2006. Những tiến bộ trong dự đoán cấu trúc protein và
7.
thiết kế protein de novo: đánh giá. Khoa học kỹ thuật hóa học 61 (3), 966 đến 988.

Gustafsson, Bosshard, H.R., Marti, D.N., và Jelearov, I. 2004. Ổn định protein bằng cầu muối: khái niệm, phương pháp thử nghiệm và
8.
làm rõ một số hiểu lầm. Tạp chí công nhận phân tử 17 (1), 1 - 16.

Chi, E.Y., Krishnan, S., Randolph, T.W., và Carpenter, J.F. 2003. Tính ổn định vật lý của protein trong dung dịch nước: cơ chế và động
9.
lực trong quá trình tổng hợp protein không liên kết.

10. Nghiên cứu dược phẩm 20 (9). 1325 - 1336.

11. Frokjaer, S và Otzen, D. 2005. Ổn định thuốc protein: một thách thức về công thức. Nhận xét về thiên nhiên: Discovery Discovery 4 (4),
298 - 306.

12. Imperiali, B. và O'Connor, S. 1999. Ảnh hưởng của glycosyl hóa liên kết N đến cấu trúc glycopeptide và glycoprotein.
13. Ý kiến hiện tại về Sinh học hóa học 3 (6), 643- 649.
14. Lee, B. và Vasmatis, G. 1997. Ổn định cấu trúc protein, Ý kiến hiện tại về Công nghệ sinh học 8, 423-428.
McLihnney, R. 1990. Chất béo của cuộc sống; tầm quan trọng và chức năng của acyl hóa protein. Xu hướng Khoa học sinh hóa 15, 3

T. 1999. Các kỹ thuật hiện tại trong phân tích glycosyl hóa protein - một hướng dẫn cho ứng dụng của họ. Acta Bio- chimica Polonica

46 (2), 303.

15. Parodi, A. 2000. Phản ứng glycosyl hóa protein và vai trò của nó trong việc gấp protein. Đánh giá hàng năm về Hóa sinh 69, 69-93.
16. Van den Burg, B. và Eijsink, V. 2002. Lựa chọn các đột biến để tăng tính ổn định của protein. Ý kiến hiện tại về Công nghệ sinh học 13

(4), 333 - 337,

17. Walsh, G. và Jefferis, R. 2006. Điều chỉnh hậu biến trong bối cảnh protein điều trị. Công nghệ sinh học tự nhiên.
18. Yan, J.X., Packer, N.H., Gooley, A.A., và Williams, K.L. 1998. Phosphoryl hóa protein; công nghệ xác định axit photphoinoin. Tạp chí

sắc ký A 808 (1 Vang2), 23 - 41.

19. C., Govindarajan S. và Minshull, J. 2003. Đưa kỹ thuật trở lại vào kỹ thuật protein: phương pháp tin học sinh học để thiết kế chất xúc tác.
Ý kiến hiện tại về Công nghệ sinh học 14 (4), 366 - 370.

20. Koing, S. 2005. Phân tích protein chức năng bằng phương pháp phổ khối. Hóa hữu cơ hiện tại 9 (9), 875-887.
21. Osguthorpe, D. 2000. Ab initio protein gấp. Ý kiến hiện tại về Sinh học cấu trúc 10 (2), 146 Bản 152.
22. Petrey, D. và Honig, B. 2005. Dự đoán cấu trúc protein: xâm nhập vào sinh học. Tế bào phân tử 20 (6), 811 - 819.
23. Radford, S. 2000. Protein gấp; tiến bộ thực hiện và hứa hẹn phía trước. Xu hướng Khoa học sinh hóa 25 (12), 611 - 618.
24. Wishart, D. 2005. Quang phổ NMR và xác định cấu trúc protein: ứng dụng để khám phá và phát triển thuốc. Công nghệ sinh học dược

phẩm hiện tại 6 (2), 105- 120. Ổn định protein và sửa đổi sau dịch mã

25. Bayle, J.H. và Crabtree, G.R. 1997. Phản ứng acetyl hóa protein; nhiều hơn sửa đổi chromatin để điều chỉnh phiên mã. Hóa học và Sinh
học 4 (12), 885-888.