ZELULEN BIOLOGIA

LABORATEGIKO PRAKTIKEN
GIDA

Biologiako Gradua
Biokimika eta Biologia Molekularreko Gradua
Bioteknologiako Gradua

ZOOLOGIA ETA ANIMALIA ZELULEN BIOLOGIA SAILA

 AURKIBIDEA

SARRERA 3
LABORATEGIKO PRAKTIKAK (GL)
GL 1. Mikroskopioa 6
GL 2. Zelula eukariotoen ezaugarri orokorrak 13
GL 3. Mintz plasmatikoa eta bere berezitasunak 19
GL 4. Zelularen kanpo matrizea eta zelulen loturak 20
GL 5. Zitosola eta zitoeskeletoa 22
GL 6. Nukleo interfasikoa eta zelulen zatiketa 24
GL 7.Organulu zitoplasmatikoak eta zitosiak 27
GELAKO PRAKTIKAK (GA)
GA 1. Zelula eukariotoaren egitura orokorra 30
GA 2. Zelularen mintza 31
GA 3. Zelularen kanpo matrizea eta zitoeskeletoa 31
GA 4. Proteinen sintesia eta garraioa 32
GA 5. Endolisosoma-sistema 33
GA 6. Ultraestrukturaren bateratzea 34
MINTEGIAK
S1. Zelula motak: ultraestruktura eta funtzioaren arteko erlazioa 35
S2. Gelako praktiken ebaluazioa 36
S3. Autoebaluazioa: ME eta AM 37

2
 SARRERA
Zelulen Biologia, zelula eukariotoen ezaugarri morfofuntzionalak aztertzen
dituen bizi zientzien atala da.

Ikasgai honetako laborategiko praktiketan, teknika mikroskopikoaren

eta gertakuntza zito-histologikoaren oinarrizko kontzeptuak ezagutuko dira
eta behaketa mikroskopikoan trebezia eskuratuko da. Horrela, ikasgaiaren
helburua litzateke, ikasleek zelula mota ezberdinak eta berauen egitura eta
berezitasunak identifikatzea, laburtzea, deskribatzea eta ulertzea.

Praktika bakoitzean, lortu beharreko helburuak adierazten dira, horretarako

ikasleek, gida honetan adierazten diren helburuen arabera, egindako
marrazki-eskemetan ikusitakoa etiketatuko dute eta galderak erantzungo
dituzte.

Irakasleak gainbegiratuko ditu ikasleek egindako lanak, irakasgaiaren

gidaliburuan ezarritako irizpide eta metodologiaren arabera ebaluatuko
direnak.

Praktikak egiteko NAHITAEZKOA da ikasleak:

- aurrez aurreko saioetara praktiken gidaliburu hau inprimatuta ekartzea eta
saioari dagokion praktika-gidoia irakurrita ekartzea.
- praktika burutzeko egokitzat jotzen duten beste edozein material ekartzea
praktika saiora, hala nola, saio praktikoan landu beharreko gaiari dagozkion
klase teorikoen oharrak, marrazkiak egiteko koloreetako margoak, etab.
- bata eta segurtasun betaurrekoak erabiltzea.

3
Zelulen egituren albuma: jardueraren aurkezpena

Jarduera honetan, ikasleek mikroskopio elektronikoarekin eskuratutako

mikrografien album bat osatu beharko dute, transmisio-mikroskopio
elektronikoarekin eskuratutako irudiak lehenetsita. Albumean, zelula
eukariotoaren ultraestruktura mailako ezaugarriak erakutsiko dira,
mikroskopio optikoan dagokion irudiarekin lagunduta.

Honako hauek dira jarduera honen helburuak (berariazko gaitasunak):

- Zelula eukariotoaren egitura eta ultraestruktura ezagutzea:

- Zelularen organuluak eta bestelako egiturak ezagutzea
- Zelularen organulu eta bestelako egitura ezberdinen kokapena
ezagutzea
- Egitura-kokapen-funtzio erlazioak ulertzea
Honako zeharkako gaitasun hauetan ere ekarpena egin nahi da:
- Zelulen Biologian erabilgarriak diren informazio iturriak ezagutzea eta
kudeatzea
- Taldean lan egitea

Jarduera hau garatzeko, honakoak bete beharko dira:

- GL taldean 5 kidetako lan taldeak osatu
- Praktika bakoitzaren aurretik (GL3-GL7), talde bakoitzak lan ez-
presentziala antolatu beharko du: materiala bildu eta aurrez hautatu
(mikroskopio optikoa eta ultraestrukturako mikrografiak dagokion
praktikako gidoian zerrendatutako helburu zehatzei dagozkienak). Helburu
bakoitzerako, mikroskopio optikoan eskuratutako irudi bat
aukeratuko da intereseko egitura erakusten duena; horrekin batera,
transmisio-mikroskopio elektronikoan lortutako irudi bat erantsiko
da gutxienez, intereseko egituraren xehetasunak erakusten dituena.
- Aukeratutako mikrografiak etiketatu egin behar dira edo adierazten
diren helburuak eta erreferentzia edo iturria zeintzuk diren zehazten
dituen oina gehitu beharko da.
- Gainera, mikroskopio optikoko irudien kasuan, erabilitako tindaketa
zehaztu beharko da. Kasu guztietan, eskala-barra duten irudiak
hautatzea gomendatzen da edo, hori ezinezkoa bada, mikrografia
zein handipenekin burutu den adieraztea.
- Aurrez aurreko saioetan (GL3-GL7) irakasleari erakutsiko zaio lana nola ari
den antolatzen eta nola ari diren betetzen helburu zehatzak. Irudiak euskarri
informatikoan egongo direnez, talde bakoitzak ordenagailu
eramangarri bat ekarri beharko du gutxienez.
- 13. asteko ostiralerako (abenduak 4) albuma osatuko da, hautatutako
irudi guztiak eta iturri bibliografikoak behar bezala antolatuta izan beharko
dituena:

-Irudi bakoitzari dagokio erreferentzia bibliografikoa osorik egongo

da eta albumeko erreferentzia denek eredu berdina jarraituko dute.
Autoreak agertu behar dira, publikazio urtea, izenburua eta esteka (web orria
bada) edo editoriala (liburua bada).

4
 -Iturri bibliografikoek, maila akademiko egokia bermatu behar dute
eta konfiantzazkoak izan beharko dute. Hortaz web, blog pertsonal etab-ak
ekidingo dira.
-Irudiak Researchgate moduko sare sozialen bidez edo
ScienceDirect, Scopus edo Pubmed bezelako datu-baseen bidez aurkitu
direnean, aurreko puntuetan azaldu bezala, jatorrizko autoreak aipatuko
dira.

-Azken lana eGela plataformara igo beharko da horretarako egokituko den

tokian eta adieraziko diren argibideei jarraituz. Ez bidali mezu
elektronikoz irakasleari!!!

5
 GL 1. MIKROSKOPIOA

SARRERA
Zelulen tamaina txikia dela eta, zelula gehienen behaketak ihes egiten dio
giza begiaren bereizmen ahalmenari. Hori dela eta, zelulen egituren
definizio hobea ematen duten tresnak erabili behar dira, hala nola,
mikroskopioak.

Mikroskopio mota ezberdinek erakuts ditzaketen zelulen xehetasunak,

bereizmen potentziaren (d) menpe daude. Bereizmen potentzia, bi
objekturen artean egon behar duen gutxieneko distantzia da, bi egiturok
bereizi gisa ezberdindu ahal izateko eta zuzenean dago erabilitako energia-
uhinaren luzeraren menpe.

Mikroskopio optikoak oinarrizko tresnak dira zelulen azterketan, baina

lortzen den bereizmena mugatua da, laginak aztertzeko fotoi azaoak
erabiltzen baitituzte energi-iturri gisa. Mikroskopio optikoaren bereizmen
muga (200 nm) gizakiaren begiarena (200 µm) baino 1000 aldiz handiagoa da.
Hortaz, argi mikroskopioarekin zelulen morfologia eta berezitasun gutxi
batzuk (nukleoa, zilioak, e.a.) baino ezin ditugu aztertu.

Mikroskopio optiko mota ezberdinak daude. Praktika hauek garatzeko

erabiliko den mikroskopio motari eremu argikoa deritzo. Zelularen zenbait
egitura zehatz aztertzeko, ordea, zitoeskeletoa esate baterako,
fluoreszentziazko mikroskopioa oso erabilgarria izaten da.

Zelula eta ehunen egituren bereizmen handiagoa lortzeko, mikroskopio

elektronikoak erabiltzen dira, mikroskopio optikoek baino bereizmen-
potentzia handiagoa baitute. Mikroskopio elektronikoaren "optika"
mikroskopio optikoaren antzekoa da baina elektroi azaoak erabiltzen dira
argi azaoen ordez. Elektroi azao hauek, mikroskopio optiko baten beirazko
lenteen funtzio bera betetzen duten lente elektromagnetikoak zeharkatzen
dituzte. Mikroskopio elektronikoaren abantaila nagusia, optikari
dagokionez, elektroi azaoaren uhin-luzera fotoiena baino 2000 aldiz
txikiagoa dela da, eta horrek bereizmena 103 –ko faktorean handitzen du.

Aplikazio biologikoetarako oinarrizko bi mikroskopio elektroniko daude,

transmisio-mikroskopio elektronikoa eta ekortze-mikroskopio
elektronikoa.

HELBURUAK:
1.- Mikroskopioen inguruko oinarrizko kontzeptuak ezagutzea
2.- Mikroskopio optikoak eta mikroskopio elektronikoak eskaintzen duten
informazioa bereiztea.
3.- Mikroskopio optiko eta elektronikoaren bidez behatzen diren gertakin
zitohistologikoen prestaketaren oinarrizko kontzeptuak ezagutzea eta
urrats bakoitzaren zergatia ulertzea.

6
Materiala:
- Mikroskopio optiko eta elektronikoaren bidez eskuratutako irudiak.

Ariketak:
1.- Fitxako mikrografia bakoitza lortzeko erabili den mikroskopio mota
identifikatu eta zergatia azaldu laburki.
2- Konparatu mikroskopio mota bakoitzak eskaintzen duen informazioa.
Komenigarria da hainbat ezaugarriri erreparatzea, hala nola:
- argazkiaren handipena
- argazkiaren ikuspegi orokorra
- beha daitezkeen berezitasun zehatzak (organuluak, zelularen mintza, etab.)

LAN EZ-PRESENTZIALA:
Praktika honi dagokion lan ez-presentziala, praktika bukatutakoan
eta GL 2 praktikaren aurretik burutuko da.
Begiratu interneten erabilgarri aurki daitezkeen gomendatutako bideo
hauek edo zuk zeuk aurkitutako beste batzuk. Testu liburuen kontsulta ere
gomendagarria da.
- Conocimiento, manejo y aplicaciones del microscópico óptico de
campo claro (10 min 58 s);
https://www.youtube.com/watch?v=9o5Nbn1VYK4
- Microscopio electrónico de barrido del ITM (6 min 57 s);
https://youtu.be/Xx0PJtRTIYQ
- Microscopio electrónico (6 min 4 s); https://youtu.be/zuruUE_lOeo
- Parte 1: Procesamiento histológico de muestras biológicas
(procesamiento estándar: inclusión en parafina y tinción con
hematoxilina/eosina) (8 min 36 s); https://youtu.be/KyO3TT2NaKk
- Procesamiento de muestras para Microscopía Electrónica (14 min 36
s); https://youtu.be/TfbOez7gHXA
- Fluorescence Microscopy Animation. (2 min 18 s);
https://youtu.be/PCJ13LjncMc

Beste bideo batzuk (aukeran):

- Parte 2: Procesamiento histológico de muestras biológicas
(procesamiento rápido para biopsias intraoperatorias) (5 min 20 s);
https://youtu.be/EMXpQzwOc_Q
- Técnicas histológicas - Un abordaje práctico. M. da Saúde Fiocruz, - U.
Miguel Hernández. (1 h 11 min); https://youtu.be/1eGq3aZDlhU
- Técnica histológica. (1 h 5 min); https://youtu.be/cSrHwQO1YK4

Erantzun ondorengo galderak:

- Mikroskopio mota ezberdinen egitura, ezaugarriak eta aplikazioak jasotzen
dituen taula konparatiboa egin: eremu argiko mikroskopio optikoa,
transmisio-mikroskopio elektronikoa eta ekortze-mikroskopio
elektronikoa. Kontuan hartu ezaugarri hauek: argi-iturria, bereizmen-

7
potentzia, leiar motak, laginaren tindaketa eta lortutako irudiaren
ezaugarriak.
- Eremu argiko mikroskopio optikoan eta transmisio-mikroskopio
elektronikoan animalia ehunak behatzeko jarraitu beharreko
prozesamendua laburbiltzen duen taula konparatiboa egin.
- Zerrendatu lagin biologikoen prozesamendurako ikusi dituzun materialak
eta erlazionatu material horien ezaugarriak erabiltzen direneko urratsean
betetzen duten funtzioarekin.

8
 1.1 ERANSKINA: MIKROSKOPIO OPTIKORAKO
LAGINEN PRESTAKETA

Zelulen Biologian, ikasleak organoen edo ehunen ebaki finekin egingo du

lan. Ebaki hauek, portaobjektuetan egoten dira tindatuta eta estalki batekin
babestuta. Egitura hauei gertakin zitohistologiko deritzegu eta hiru atal
bereiz diezaiekegu:

- PORTAOBJEKTUA
- EBAKIA EDO EHUNA
- ESTALKIA

Gertakinen ulermen egoki eta kritikorako zein ager daitezkeen arazo

teknikoak ezagutzeko, ikasleak teknika histologikoen oinarriak barneratu
behar ditu.
Zelula zein animalia eta landareen ehun gehienak lodiegiak eta
zeharrargiak dira mikroskopioan zuzenean behatu ahal izateko. Horregatik,
material biologikoaren aldez aurretiko prestaketa berezia behar da ebaki fin,
egonkor eta ikusgarriak lortzeko.

Laburbilduz, material biologikoaren prestaketak hurrengo urratsak

jarraitu behar ditu:
- Laginaren lorpena (disekzioa): animalia zein landareetatik edo
zelulen hazkuntzetatik.
- Fixapena: zelulen eta ehunen itxura mantentzeko. Argi
mikroskopioan erabiltzen den fixatzaile arruntena %10eko formola
da.
- Inklusioa: mikrotomoan ebakiak lortu ahal izateko laginari behar
duen trinkotasuna ematen dio. Inklusiorako erabiltzen diren
konposatuak hidrofobikoak dira, hortaz, fixatu ondoren, lagina
alkohol ezberdinekin deshidratatzen da. Ondoren, alkoholarekin eta
inklusiorako erabiliko den konposatuarekin nahaskorrak diren likido
organikoak erabiltzen dira. Gertakuntza zitohistologiko arrunterako
gehien erabiltzen den inklusiorako konposatua parafina da. Zenbait
kasutan erretxina sintetikoak ere erabiltzen dira.
- Mikrotomia: mikroskopioan behatu daitezkeen laginen ebaki finak
lortzea. Argi mikroskopioan erabiltzen diren ebakien ohiko lodiera 3-
10 mm bitartekoa da.
- Tindaketa: zelularen egiturek mikroskopioan behatu ahal izateko
beharrezkoa duten kontrastea eskaintzen dien prozesua. Egitura
egoki mantenduz, kolorea emateko gai den edozein sustantziari
tindatzaile deritzogu. Tindaketa metodo ezberdinen erabilerak
egituren arteko ezberdintasunak areagotzen ditu, behaketa

9
 mikroskopikoaren bereizmena emendatuz. Tindaketa ingurune
urtsuan egin ohi denez, tindatu aurretik, lagina hidratatu egin behar
da. Argi mikroskopioan, tindaketa teknika arruntekin tindaturiko
zelula eukariotoen behaketa egitean, gutxienez nukleoa eta
zitoplasma bereizi ditzakegu. Zelularen atal bakoitzak bere izaera
kimikoagatik, tindatzaile ezberdinekiko afinitate ezberdina erakusten
du.
- Muntaia: tindatu ondoren, lagina berriro deshidratatzen da modu
iraunkorrean mantendu ahal izateko eta estalkia jarri ahal izateko.
Estalkia itsasteko medio ezberdinak daude (Kanada baltsamoa, DPX,
glizerina gelatinatsua, e.a.). Muntaiarako medioak urarekin
nahaskorrak izan daitezke; kasu horietan, ez da beharrezkoa
tindaketa ondorengo deshidratazioa burutzea eta gertakinak
zuzenean muntatu daitezke estalkiarekin. Estalkiak lagina babesten
du eta mikroskopioan behaketa egiteko ezinbestekoa da.

10
 1.2 ERANSKINA: MIKROSKOPIO
ELEKTRONIKORAKO LAGINEN PRESTAKETA

Mikroskopio elektronikorako laginen prestaketa neketsua izan daiteke;

prestaketa hau, lortu nahi diren helburuen arabera eta erabiliko den
mikroskopio motaren arabera aldatuko da.
Laburbilduz, transmisio-mikroskopio elektronikorako (TME) lagin
biologikoen prestaketak ondoren deskribatzen diren pausuak jarraitzen
ditu:
Laginaren lorpena: animalia zein landareetatik edo zelulen hazkuntzetatik.
Fixapena: zelula eta ehunen itxura mantentzeko. Fixatzaile arruntena %2.5
glutaraldehidoa da. Fixatu ondoren, laginak indargetzaile batekin garbitzen
dira eta jarraian, fixapen ondorengo tratamendua egiten da, osmio
tetroxidotan, zelularen egiturei elektrodentsitate handiagoa emateko.
Inklusioa: ebakiak lortu ahal izateko laginari beharrezkoa duen trinkotasuna
ematen dio. Laginaren deshidratazioa alkohol ezberdinekin egiten da.
Jarraian, alkoholarekin eta inklusiorako erabiliko den konposatuarekin
nahaskorrak diren likido organikoak erabiltzen dira. TMErako gehien
erabiltzen den inklusio konposatua erretxina da.
(Ultra)mikrotomia: (ultra)mikrotomo baten laguntzaz mikroskopioan
behatzeko laginen ebaki (ultra)meheak lortzea. Mikroskopio elektronikoan
erabiltzen diren ebakien lodiera 25-100 nm tartean egoten da eta gertakinak
sarexka metalikoen gainean jartzen dira.
Kontrastea: mikroskopio elektronikoan lortzen den irudia elektroien
sakabanaketaren ondorioa da. Egitura biologikoak osatzen dituzten
atomoek zenbaki atomiko txikia dute eta beraz, elektroien sakabanaketa
urria eragiten dute, ondorioz, irudi eskasak lortuko dira. Horregatik, egitura
biologikoak behatu ahal izateko, pisu handiko atomoak gehitu behar dira,
hala nola, berun edo uranio gatzak. Metalok, argi mikroskopioan erabiltzen
diren tindakarien antzera dihardute, laginaren egitura zehatzei lotu eta
ikusgarriak bihurtuz.

11
Lagin biologikoak transmisio-mikroskopio elektronikoan behatzeko
burutu beharreko prestaketaren laburpena

12
 GL 2. ZELULA EUKARIOTOEN EZAUGARRI
OROKORRAK

SARRERA
Izaki zelulanitzetan, zelulek, ehunetan eta organoetan betetzen
dituzten funtzioen arabera, itxura eta egitura ezberdinak erakusten dituzte.
Berezitasun funtzional hauengatik zelulek ezaugarri espezifikoak dituzte.
Hala ere, zenbait orokortasun komun ikus daitezke:

Zelulen tamaina
Hematiek 7 µm dituzte, hepatozitoek 20 µm, espermatozoideek 53 µm,
obuluek 150 µm eta zenbait neurona metro bat neurtzera iritsi daitezke.
Poleen aleek 200-300 µm neurtu ditzakete eta hegaztien arraultzek
zentimetro 1 (galeperra) eta 7 cm (ostruka) bitarteko diametroa izan
dezakete.

Zelulen forma
Zelulek ezaugarri morfologiko ezberdinak dituzte; zelula batzuk ez
dute forma egonkorrik.
Medio likidotan isolatuta dauden zelula askok itxura esferikoa hartzen
dute gainazal-tentsioaren legeen ondorioz. Itxura hau da orokorrean,
odoleko zelula mugikorrek (linfozitoak, granulozitoak, monozitoak, e.a.)
dutena. Ehunen zelulen taldekapen handietan, zelulak azalera minimodun
poliedroetan antolatzen dira, gune interstizial urriko masak eratuz, eta
itxura ezberdinak agertuz: fusiformea, kubikoa, prismatikoa, multipolarra,
e.a.
Zelula mota bakoitzaren nukleoak morfologia zehatza izaten du,
nahiz eta zelularen eta nukleoaren morfologia, zelularen egoera
funtzionalaren arabera eta zelularen zikloaren arabera aldatu.
Zelulak mikroskopioan behatzean, hiru dimentsiotako egiturak direla
kontuan hartu behar da eta orientazio ezberdina duten ebakietan aztertu
behar dira.

Zelulen tindaketaren ezaugarriak

Ikuspuntu orokor batetik, tindatzaile basikoekin (kationikoak) lotzen
diren zelulen egiturei basofilo deritze. Aldiz, tindatzaile azidoekin
(anionikoak) lotzen direnei azidofilo deritze.
Zelulan, tindaketaren ezaugarriak, nukleoa eta zitoplasma osatzen
dituzten osagaien menpe daude. Mitokondrioak eta zenbait proteina
azidofiloak dira; kromatina, nukleoloa, eta erretikulu endoplasmatiko
pikortsua ordea, basofiloak dira.

13
 Nukleoak oso itxura aldakorra izaten du zelula motaren eta egoera
funtzionalaren arabera. Nukleoaren osagai nagusiek tindatzaile basikoekiko
afinitatea erakusten dute, hau da, basofiloak dira. Nukleoaren tindaketa
mailak bere osagaien (kromatinaren) kondentsazio maila erakusten du.
Proteinen sintesian diharduten nukleoak handiak eta gutxi tindatuta
agertzen dira, kromatina oso sakabanatuta egoten baita. Nukleoloa ageri da
egoera hauetan. Zelula inaktiboetan ordea, nukleoa txikia da eta oso
tindatuta agertzen da, kromatina gehiena kondentsatuta baitago. Ez da
nukleolorik ageri edo oso txikia izaten da.
Zelula oso aktiboen zitoplasma erretikulu endoplasmatiko
pikortsutan aberatsa da, proteinen sintesi maila altua baita eta tindatzaile
basikoekin koloreztatuta agertzen da.

Zelulen osagaiak beraien ezaugarri kimiko orokorren arabera

(basofilia, azidofilia) bereiztea ahalbidetzen duten tindatzaileei tindatzaile
topografiko deritze. Talde honetan ohiko tindatzailea da hematoxilina
(koloratzaile basikoa) eta eosina (koloratzaile azidoa) koloratzaileen
konbinazioa. Hiru kolorazioren konbinazioak egiten direnean, tindaketa
topografikoetaz ari gara.

Tindatzaile espezifikoagoak diren beste tindatzaile batzuk,

biomolekula mota ezberdinak, hala nola, proteinak, lipidoak,
karbohidratoak eta azido nukleikoak bereiztea ahalbidetzen duten
tindatzaile histokimikoak dira. Tindatzaile histokimikoen artean
entzimen histokimikak ere badaude, eta, horiei esker, zenbait jarduera
entzimatiko in situ koka daitezke, beraz, holakoetan zelularen
konpartimentu zehatzak adierazi daitezke.

HELBURUAK:
1.- Eremu argiko argi mikroskopioa ondo erabiltzen ikastea (2.2 eranskina
begiratu)
2.- Tindaketa motak ezberdintzen jakitea (2.3 eranskina begiratu)
3.- Eremu argiko argi mikroskopioan zelula mota ezberdinak aztertzea
arreta berezia erreparatuz:
- Zelularen forma eta tamainari: esferikoa, fusiformea, zilindrikoa,
izarkara…etab.
- Nukleoaren forma eta kopuruari: esferikoa, obalatua, nukleorik
gabea, nukleo bakarduna, nukleo ugariduna; nukleoloaren
agerpenari.
- Nukleo eta zitoplasmaren tindaketari

Materiala:
- Zelula eukarioto ezberdinen ezaugarriak eta tindaketa mota ezberdinak
aztertzeko gertakin histologikoak:
- Odola
- Muskulu leuna

14
 - Muskulu ildaskatua
- Mihingaina
- Zerebeloa
- Bizkar muina

Ariketak:
1.- Behatu dituzun gertakin ezberdinen marrazkia egin eta bertan
identifikatu:
- Zelulak eta beraien nukleoak
- Osagai ezberdinek tindatzaileekiko duten afinitatea
- Ebakiaren orientazioa (luzetara eta zeharka)
2.- Behatu dituzun bideoen gaineko galderak erantzun itzazu.

15
 2.1 ERANSKINA: LAGINAK MIKROSKOPIOAN
BEHATZEAN, KONTUAN HARTU BEHARREAKOAK

Ebaketa planoaren araberako emaitza posibleak

Zelula eta ehun biologikoen ezagutza, gertakuntza histologikoen eta
mikroskopio elektronikoarekin lorturiko irudien behaketaren bidez lortzen
da. Lehenengo, behaturiko irudien analisia egiten jakin behar da.
Horretarako, zenbait faktore hartu behar dira kontuan:

1.- Errealitate dinamiko baten irudi egonkor bat ikusten ari garela.
2.- Ebaki bati dagokion plano bakarra ikusten dugula. Komenigarria
da zenbait ebaki aztertzea bi dimentsiotako irudietatik hiru dimentsiotako
itxura duen egitura aztertu ahal izateko.
3.- Orokorrean ebaketa zoriz egiten dela eta beraz, ez dagoela aldez
aurretiko orientaziorik.
4.- Laginak erakusten duen itxura zenbait aldagairen menpe dagoela:
- laginaren prestaketa (fixapena, inklusioa, mikrotomia, e.a.).- zelularen
fisiologia (metabolismoa, mugimendua, e.a.).
5.- Behatuko dugunaren aldez aurretiko iritziak alboratu behar direla,
bestela, ikusi nahi duguna ikusiko dugu soilik eta ez-ohikoak diren bestelako
egiturak, ez ditugu ikusiko.

16
 2.2 ERANSKINA: MIKROSKOPIOA BEHAR BEZALA
ERABILTZEKO OINARRIZKO ARGIBIDEAK

Mikroskopioaren erabilera egokirako, ondorengo jarraibideak bete

behar dira:
- Mikroskopioaren zorroa kendu.
- Porta, platinaren gainean jarri eta aztertu nahi dugun lagina, argiaren
pasabidearen erdian kokatu.
- Gertakina argiztatu, argiaren intentsitatea, aukeratu den
objektiboaren eta lagin motaren arabera egokituz.
- Handipen txikiena (x4) duen objektiboa erabiliz hasi eta irudia ondo
finkatuta dagoela ziurtatzean, objektiboen euskarria (errebolberra) biratu
“klik” entzun arte. Ez hasi inoiz handipen handiko objektiboekin!!!
Lagina zein objektiboaren leiarra apurtzeko arrisku handia dago handipen
handiekin hasiz gero.
- Mikroskopioaren burukoan dauden okularrak zure begi-ninien arteko
distantziara egokitu. Bi begiak eta bi okularrak erabiliz, irudi bakarra ikustea
lortu behar da.
- Lagina ahalik eta bereizmen gehienarekin fokatzeko, lehenengo
torloju makrometrikoa erabiltzen da eta ondoren, azkenengo fokatzea
torloju mikrometrikoarekin egiten da. Kontuz!!! Makrometrikoa
mugitzean, ziurtatu portak eta objektiboak ez dutela elkar ukitzen.
- Lagina orokorrean behatu eta interesgarria iruditzen zaizun eremua
aukeratu; aukeratutako eremua, platinaren erdialdean jarri.
- Errebolberra biratuz handipen handiagodun hurrengo objektiboa jarri
(x10, x40) eta lagina berfokatu mikrometrikoa bakarrik erabiliz.

Saioa bukatzean ondorengo pausuak jarraitu:

- Argia itzali.
- Handipen txikieneko objektiboa jarri.
- Porta platinatik kendu.
- Mikroskopioa zorroarekin estali.

17
 2.3 ERANSKINA: ARGI MIKROSKOPIORAKO
TINDAKETA TEKNIKAK
Tindaketa teknika arruntekin tindaturiko zelula eukariotoak eremu argiko
argi mikroskopioan behatzean, gutxienez, nukleoa eta zitoplasma bereiz
daitezke. Hala ere, zitoplasmako beste egituren (mitokondrioak, Golgi
aparatua inklusio zitosolikoak, etab.) behaketa ere, posible da tindaketa
espezifikoekin. Zelularen egitura bakoitzak, erakusten duen izaera
kimikoagatik, tindatzaile ezberdinekiko afinitate ezberdina erakusten du.

ZENBAIT TINDATZAILEREN EZAUGARRIAK

TINDATZAILEA- TINDATURIKO EGITURA BEHATURIKO

TINDAKETA EDO MOLEKULAK KOLOREA
Hematoxilina Nukleoak Urdina
Eosina Zitoplasma Gorri-arrosa
Masson-en trikromikoa Hainbat egitura Hainbat
kolore
Feulgen DNA Gorria
Gomori Zuntz erretikularrak Beltza
PAS Polisakaridoak Karmin-gorria
Sudan gorria Lipidoak Gorria

ZENBAIT ENTZIMAREN HISTOKIMIKA

ITU-ENTZIMA TINDATUTAKO EDO BEHATURIKO
DETEKTATUTAKO KOLOREA
EGITURA
Sukzinato Mitokondrioak Urdina
deshidrogenasa
Katalasa Peroxisomak Marroia
Fosfatasa azidoa Lisosomak Purpura
B-glukuronidasa Lisosomak Marroia

18
 GL 3. MINTZ PLASMATIKOA ETA BERE
BEREZITASUNAK

SARRERA
Zelula eukariotoek, kanpo mediotik isolatzen dituen eta zitoplasma
mugatzen dien mintza dute. Mikroskopio elektronikoari esker, zenbait
zelulen mintzean agertzen diren berezitasunak ikus daitezke. Egitura hauek,
prozesu fisiologiko berezituetan parte hartzen dute, hala nola, sustantzien
elkartrukean (zurgapena, iraizketa), mugimenduan, aingurapenean,
komunikazioan, e.a.

Mikroskopio elektronikoaren bereizmen ahalmen handiak mintzaren

hiru geruzadun egitura (egitura trilaminarra) ikustea ahalbidetzen du:
− Elektrodentsoak (ilunak) diren 2 kanpo geruza hidrofilikoak
− Argia den tarteko geruza lipofilikoa

Eremu argiko mikroskopioarekin ezin da bereiztu mintzaren egitura

trilaminarra baina egitura mailako zenbait berezitasun beha daitezke,
zilioak, estereozilioak eta mikrobiloskak esaterako.

HELBURUAK:
Bilatu eta kokatu mintz plasmatikoaren erpinaldeko berezitasunak:
mikrobiloxkak, glukokaliza eta zilioak

Materiala:
- Mintzen zenbait berezitasun aztertzeko gertakin zitohistologikoak:
- Ziliodun epitelioa
- Hestea (Mammal intestine composite)

Ariketak:
- Mintzaren berezitasunak behatu gertakin zitohistologikoetan.
- Gertakin zitohistologikoen marrazki eta eskemak egin handipen
ezberdinetan. Marrazkietan, praktikaren helburuak identifikatu eta adierazi
identifikatzeko erabilitako ezaugarri aipagarrienak.

19
 GL 4. ZELULAREN KANPO MATRIZEA ETA
ZELULEN LOTURAK

SARRERA
Zelulen kanpo matrizea makromolekula konplexudun egitura bat da.
Zelulen mintz plasmatikoaren kanpo aldean edo/eta ehun bat osatzen duten
zelulen arteko tarteetan kokatzen da. Orokorrean, zelulen kanpo
matrizearen osagaiak, zelulan ekoizten dira. Kanpo matrizeak, zelulak
biziraupenerako, ugalketarako eta funtzio arruntak betetzeko behar duen
ingurunea eratzen du. Animali ehunen kanpo matrizean hurrengo osagaiak
daude:

-Oinarrizko sustantzia: batez ere, glikosaminoglikano eta

proteoglikanoen moduko molekula konplexuak. Sortzen duten egituraren
trinkotasuna aldakorra da ehun motaren arabera.
-Zuntzak: kolagenoa eta elastina bezalako egitura-proteinak.
Kolagenoak erresistentzia eskaintzen die ehunei eta elastinak malgutasuna.
-Glikoproteina atxikikorrak: fibronektina eta laminina bezalako
glikoproteinak. Zelulen matrizeko osagai ezberdinak beraien artean eta
zelularekin lotzeko.

Animalia ehunetan, kanpo matrizeko osagaien proportzioa aldatu

egiten da ehunaren funtzioaren arabera. Landare ehunetan, kanpo
matrizeari zelula pareta deritzogu eta nagusiki zelulosaz eratutako lodiera
aldakorreko egitura eratzen du.

Zenbait animalia ehunen kanpo-matrizea berezitua da, eta

oinaldeko xafla deritzogu; besteak beste, epitelio guztien oinaldean eta
muskulu-zelula, adipozito eta Schwann zelulen oinaldean aurki daitekeen
xafla mehea (40-120 nm) da. Egiturazko funtzioez gain, funtzio
erabakigarriak ditu zelularen prozesu askotan.

Ehunetan, animalia zelulak elkarrekin eta kanpo-matrizearekin

daude lotuta, zelulen loturak deritzen egitura oso berezituen bidez. Lotura
hauek funtzioaren arabera (lotura hertsiak, atxikidura loturak eta
komunikazio loturak), kokapenaren arabera (alboetan edo oinaldean) eta
zitoskeletorekin (aktina edo piru ertainak) duten erlazioaren arabera
sailkatzen dira.

HELBURUAK:
- Animalien ehunen kanpo matrizea bereiztea.
- Landare zelulen zelula pareta ezagutzea.
- Ehun ezberdinen zelulak eta zelularen kanpo matrizea bereiztea osagai
bakoitzaren kantitatearen eta erakusten duen itxuraren arabera.

20
Materiala:
- Zelulen kanpo matrizea aztertzeko gertakin zitohistologikoak:
- Mihingaina
- Trakea eta hestegorria (2 tindaketa)
- Arteria, zaina eta nerbioa

Ariketak:
- Kanpo matrizea behatu gertakin zitohistologikoetan.
- Gertakin zitohistologikoen marrazki eta eskemak egin handipen
ezberdinetan. Marrazkietan, praktikaren helburuak identifikatu eta adierazi
identifikatzeko erabilitako ezaugarri aipagarrienak.

21
 PL 5. ZITOSOLA ETA ZITOESKELETOA

SARRERA
Zelula eukarioto baten mintza eta organuluak kentzean, zitosola
geratuko litzateke. Zelula askotan, zitosola da konpartimendu handiena eta
bakterioetan, zitosola, zelularen konpartimentu bakarra da. Zitosolak, gel
itxura du nagusiki eta tamaina ezberdineko hainbat molekula agertzen ditu.
Zitosolean, zelularentzat ezinbestekoak diren erreakzio kimiko ugari
gertatzen dira, esate baterako, proteinen sintesia. Proteinak sintetizatzen
dituzten egiturak erribosomak dira eta mikroskopio elektronikoan, partikula
txiki gisa ikusten dira.

Zitosolean, erreserba material gisa metatzen diren zenbait egitura agertzen

dira ere, inklusioak, hain zuzen ere:

- Karbohidratoak: glukogenoa adibidez. Glukogenoak mintzik gabeko

partikulak dira. Partikula hauek isolatuta (beta partikulak, 15-30 nm)
edo tamaina aldakorreko erroseta itxurako taldeetan (alfa partikulak)
ager daitezke. Argi mikroskopio bitartez, tindaketa bereziak erabiliz
beha daitezke (PAS histokimika).
- Lipidoak: lipido neutroak adibidez. Tanta esferikoak eratzen dituzte.
Mikroskopio elektronikoan hartzen duten itxura, gantz-azidoen
asetasun mailaren araberakoa da. Argi mikroskopioan
hematoxilina/eosina tindaketarekin hutsune zuri gisa beha daitezke,
tindaketa histokimikoen bitartez ordea, zehazki beha daitezke (Sudan
beltza, Red oil O).

Mikroskopio elektronikoaren laguntzaz eta fluoreszentziazko argi

mikroskopioaren laguntzaz, zelula eukariotoetan piru proteiko fin eta luzeak
ikus daitezke. Piru hauek, mintz plasmatikoaren aldere zehatzen batean
ainguratuta ager daitezke edo/eta zelularen erdi aldean, nukleotik gertu
hedatuta.

Piru sistema honek zitoeskeleto izena jasotzen du: Piru proteikoz eratuta
dago, hiru dimentsiotako sare bat eratzen du eta zitosol osoan zehar
hedatzen da. Zitoeskeletoak, zelulari, duen itxura, mugitzeko gaitasuna eta
beste zelula batzuei lotzeko ahalmena eskaintzen dizkio. Zitoeskeletoaren
osagai nagusiak:
- Mikrotubuluak: 22-24 nm-ko diametroa duten hodi itxurako egiturak
dira. Zeharkako ebakietan eraztun itxura dute eta luzerako ebakietan
bi lerro paralelo ikusten dira.

22
 - Aktinazko piruak (mikropiruak): 6 nm-ko diametroa dute eta egitura
lineal homogeneoak eratzen dituzte. Zeharkako ebakietan puntuak
ikusten dira eta luzerako ebakietan lerro hutsak.
- Piru ertainak: 8-10 nm-ko diametroa dute eta egitura lineal
homogeneoa dute. Zeharkako ebakietan puntu gisa ikusten dira eta
luzerako ebakietan lerroak ikusten dira. Tamaina ezberdineko
azaoetan taldekatzen dira.

Eremu argiko mikroskopioan ezin dira ezberdindu zitoeskeletoko piruak

baina bai piru hauek eratzen dituzten egiturak, hala nola, zilioak,
mikrobiloskak, ardatz mitotikoa, muskulu zelulen sarkomeroak…

HELBURUAK:
- Lipidoak metatzen dituzten eta metatzen ez dituzten zelulen zitosola
behatu mikroskopio optikoan.
- Zitoeskeletoko osagaiek eratutako egiturak behatu.

Materiala:
- Zitosola eta zitoeskeletoa aztertzeko gertakin zitohistologikoak:
- Muskulu ildaskatu eskeletikoa
- Gibel zelulak, glukogeno metaketa
- Gantzen metaketa
- Ehun adipotsu zuria eta arrea

Ariketak:
- Zitosola eta zitoeskeletoaren gertakin zitohistologikoak behatu.
- Gertakin zitohistologikoen marrazki eta eskemak egin handipen
ezberdinetan. Marrazkietan, praktikaren helburuak identifikatu eta adierazi
identifikatzeko erabilitako ezaugarri aipagarrienak.

23
 GL 6. NUKLEO INTERFASIKOA ETA ZELULAREN
ZATIKETA
SARRERA
NUKLEO INTERFASIKOA

Nukleo interfasikoa oso organulu dinamikoa da, konpartimentu ugari

aurkezten dituena eta aldaketa handiak jasaten dituena zelularen zatiketa
prozesuan zehar

Interfasean, material genetikoa nukleoan zehar sakabanatzen da, eta

beraz, nukleoak itxura ezberdina aurkezten du zelularen egoera
funtzionalaren arabera. Nukleo berdinean honakoak aurki ditzakegu:
- kromatina zabaldua (eukromatina, 10 nm-ko zuntzak eratuz)
transkripziorako eskuragarri dagoena
- kromatina kondentsatua (heterokromatina), jarduerarik gabekoa.
Nukleoaren gaineztadurari lotuta edo nukleoplasman zehar taldekapen
elektrodentsoak eratzen agertzen dena.

Era berean, jarduera funtzionalaren arabera nukleoloak ikus daitezke.

RNA erribosomikoa sintetizatzen duten eskualde hauek, handiagoak eta
ugariagoak dira proteinak sintetizatzen diharduten zeluletan. Jarduera
urriko nukleoetan ordea, ez dira ikusten. Nukleoloak, nukleo barruan
agertzen diren egitura elektrodentsoak dira eta kromatina izaten dute
asoziaturik (nukleoloari elkarturiko kromatina).

Nukleoaren gaineztadurak nukleoa mugatzen du eta bi mintzek osatzen

dute. Mintz hauen artean gune perinuklearra kokatzen da. Gaineztaduraren
eskualde zehatzetan bi mintzak (kanpokoa eta barnekoa) fusionatu egiten
dira nukleoaren poroa izeneko irekiguneak eratuz. Nukleoaren poroek
nukleoplasmaren eta zitoplasmaren arteko komunikazioa eta garraioa
ahalbidetzen dute. Nukleoaren poroaren inguruan, ez dago nukleoaren
gaineztadurari loturiko kromatinarik.

ZELULAREN ZATIKETA

Zelularen zatiketa, organismoen biziraupenerako oinarrizko prozesua

da. Gizaki batean, milioika zelula zatitzen dira segunduoro, hiltzen diren
zelulak ordezkatzeko. Organismo zelulanitz baten bizitzan zehar, bilioika
zatiketa gertatzen dira, horrela organismoaren garapen normala eta
kanpoko erasoen (zauriak, zoldurak, e.a.) aurkako erantzun egokia
bermatzen da.

24
 Zelularen zatiketa, zelularen zikloko fase bat da. Zelularen zikloa
hurrengo faseetan banatzen da: Interfasea (G1, S eta G2 faseak) eta M fasea
edo Zelularen Zatiketa (Mitosia-Meiosia- eta Zitokinesia). S fasean zehar,
zelulak bere DNA edukia bikoizten du (sintesia edo bikoizketa fasea).
Zitokinesiaren ondoren sorturiko zelula berriak interfasearen G1 fasean
sartzen dira.

Zelularen zatiketa, prozesu dinamikoa da eta zenbait fasek osatzen

dute: nukleoaren zatiketa edo mitosia (profasea, prometafasea, metafasea,
anafasea eta telofasea) eta zitoplasmaren zatiketa edo zitokinesia.

Zatiketan zehar, zelulak bere edukia modu egokian antolatzen du,

sortuko diren zelula berrietan antzeko banaketa ahalbidetzeko. DNA
kromosometan antolatzen da, bi kromatida eta zentromero batez eratuta,
eta mikrotubuluek ardatz mitotikoa eratzen dute.
Zatitzen dauden zeluletan, zatiketaren fase ezberdinak bereiz daitezke:

-Profasea. Nukleoa oraindik agerikoa da eta kromosomak

kondentsatuta daude nukleo barruan.
-Prometafasea. Nukleoa desagertzen da eta kromosomak
zitoplasman zehar sakabanatzen dira. Ardatz mitotikoa ikus daiteke.
-Metafasea. Ardatz mitotikoa guztiz eratuta dago eta kromosomak
ardatzaren ekuatore aldean kokatzen dira.
-Anafasea. Kromosomak bitan bereiztu eta kromatida ahizpek
poloetarako migrazioa burutzen dute.
-Telofasea. Kromatidak ardatz mitotikoaren poloetan metatzen dira
eta nukleo bakoitzaren gaineztadura berria eratzen hasten da.
-Zitokinesia. Sortu berri diren bi zelula ezberdintzen dira nahiz eta
elkarlotuta egon daitezkeen oraindik.

Zelularen zatiketaren ondorioz (mitosia), elkarren berdinak diren bi zelula

berri eratzen dira. Zelula berrietako bakoitzak kromosoma bikote bana
azaltzen du.

HELBURUAK:
- Interfasean eta zatiketan dauden zelulak ezberdintzea.
- Interfasean eta zatiketan dauden zelulen nukleoko osagaiak behatzea.
- Zelularen zatiketaren faseak behatzea.

Materiala:
- Nukleoa eta mitosia aztertzeko gertakin zitohistologikoak:
- Tipularen sustraia (Onion mitosis)
- Arrainaren morula (Whitefish mitosis)

25
 - Hestea

Ariketak:
- Nukleoaren eta mitosiaren inguruko gertakin zitohistologikoak behatu.
- Gertakin zitohistologikoen marrazki eta eskemak egin handipen
ezberdinetan. Marrazkietan, praktikaren helburuak identifikatu eta adierazi
identifikatzeko erabilitako ezaugarri aipagarrienak.

26
 GL 7. ORGANULU ZITOPLASMATIKOAK ETA
ZITOSIAK

SARRERA
Zelula eukariotoak barne mintzen bidez daude banatuta. Mintz hauek
konpartimentu itxiak sortzen dituzte zelularen funtzio espezifikoetan
bereizten direnak. Animalia edo landare zelula baten zeharkako ebakia
mikroskopio elektronikoan aztertzean, mintzez inguraturiko hainbat
konpartimentu bereiz daitezke. Konpartimentu hauek guztiak mintzez
inguraturiko organuluak dira.

Zelula eukariotoetan agertzen diren organulu nagusiak:

* Erretikulu endoplasmatikoa (EE) zelulan zehar barreiaturik dauden
elkarloturiko zaku eta hodi mintzakarez eraturiko sistema da. EEko zenbait
eskualdetan erribosomak itsatsita agertzen dira eta erretikulu
endoplasmatiko pikortsua (EEP) deritzo. Zelula gehienetan, erretikulu
endoplasmatiko leuna (EEL) urriagoa da.
* Golgi Aparatua nukleoaren inguruan kokatzen da eta animalia
zeluletan, arrunta izaten da zentrosomaren edo zelularen erdialdean
agertzea ere. Erpin zabalezko zisterna zapalez eraturik dago, diktiosoma
izeneko taldekapenetan antolatuta daudenak. Zelula motaren arabera
diktiosomen kopurua aldakorra da. Diktiosomen erpinetako zisternak hodi
eta besikulekin daude konektatuta.
* Lisosomak digestio entzimak dituzten organuluak dira. Mikroskopio
elektronikoan gorputz elektrodentso moduan ikusten dira. Itxura eta
tamaina oso aldakorra erakusten dute. Barnealdea homogeneoa edo
heterogeneoa izan daiteke tamaina ezberdineko pikor dentsoekin.
Zenbaitetan kristalak edo xaflaskez osaturiko sistema kontzentrikoak eduki
ditzakete. Lisosomak direla baieztatzeko, fosfatasa azidoaren edo beste
entzima hidrolitikoren baten histokimika egin behar da. Lisosomek digeritu
gabeko material kopuru handiak meta ditzakete eta hondakin gorputz izena
jaso.
* Peroxisomak mintz bakunez inguraturik daude eta erreakzio
oxidatzaileetan parte hartzen duten hainbat entzima dituzte. Beraien
tamaina 0.2-1 µm ingurukoa da eta eduki pikortsu fina erakusten dute.
Zenbait peroxisomen barruan egitura kristalino dentsoak (nukleoideak) ikus
daitezke.
* Mitokondrioek tamaina eta itxura oso aldakorra dute. Oso
moldagarriak dira eta oso erraz aldatzen dute morfologia. Kanpo mintz
leuna eta barne mintz tolestua (mitokondrioaren gangarrak eratuz) dituzte.
Kanpo eta barne mintzen artean mintzen arteko gunea dago. Mitokondrioen
barnealdea fluido batez dago eratuta, mitokondrioaren matrizea.
* Kloroplastoak landare zeluletan agertzen diren organuluak dira.
Kloroplastoetan fotosintesia burutzen da. Bi mintz dituzte, barnealdean
estroma izeneko barrunbea agertuz. Kloroplastoen barnealdean mintz
27
sistema berezia agertzen da tilakoideak eratuz. Tilakoideak mintzez
inguraturiko xaflaskak dira eta luzeraka taldekatzen dira grana eratuz.
Tilakoideen mintzak, tilakoidearen gunea mugatzen du. Hainbat auken
kloroplastoek granulu bat erakusten dute, pirenoide izenekoa, erreserba
materialez eratuta dagoena (adibidez almidoia).
Zelulak kanpo-ingurunearekin komunikatu eta erlazionatu behar dira.
Horretarako, mintz plasmatikoan hartzaileak daude. Molekula txikiak
barneratzea erraza den bitartean, molekula edo egitura handiak
barneratzeak mekanismo berezien beharra eskatzen du. Prozesu hauek
zitosi izenarekin ezagutzen dira. Hortaz, zitosiak zelula eta kanpo-
medioaren arteko truke-prozesuak dira, zelulak kanpotik elementuak
barneratzeko (endozitosiak, fagozitosiak) edo elementuak kanporatzeko
(exozitosiak) erabiltzen dituena. Zitosi prozesuetarako, zelulek besikulen
garraiorako sistema garatuak dituzte, ondo ezarritako zitoeskeletoa
adibidez. Besikulak endozitosi ala exozitosi besikula izan daitezke.
Fagozitosi prozesua, zelula espezializatuetan ematen da eta organismo
arrotz bat barneratu ondoren, fagosoma (besikula erraldoiak) eratzen da.

HELBURUAK:
- Zelularen organulu ezberdinak behatzea mikroskopio optikoan.

Materiala:
- Zelularen organuluak aztertzeko gertakin zitohistologikoak:
- Gibel edo giltzurrun zelulen mitokondrioak
- Golgi aparatua eta gongoilak

Ariketak:
- Zelularen organuluen gertakin zitohistologikoak behatu.
- Gertakin zitohistologikoen marrazki eta eskemak egin handipen
ezberdinetan. Marrazkietan, praktikaren helburuak identifikatu eta adierazi
identifikatzeko erabilitako ezaugarri aipagarrienak.

28