Tema 8

martes, 28 de abril de 2020 12:42

OBTENCIÓ DEL PRODUCTE D'EXPRESSIÓ D'UN GEN RECOMBINANT

Utilitzem altres organismes per expressar el DNA. És per això que quan hem utilitzat mostres diferents d'on hem tret el gen parlem d'expressió
heteròloga.

Treballarem sobretot amb Ecoli.

No podem utilitzar qualsevol ori: en tenim d'astringents i multicòpis dels quals ens interessa els multicòpia per tenir moltes copies del gen i
d'aquesta manera assegurar una bona expressió. S'ha de tenir en compte el polilinker on clonarem el gen i tots els elements que marquen el
ìnici de la trasncripció o traducció estan a 5' i la finalització a 3'. A banda i a banda del polilinker trobem flanquejant un codó ATG i STOP que a
priori pareix extrany perquè el gen té el seu propi codó ATG i STOP però a voltes es pot donar alguna utilitat com per exemple un codó
polilinker marcat en verd i ATG en groc ens pot servir per a que quan clonem amb el polilinker la traducció no tinga lloc en ATG sinó que abans
de manera que introduirà una seq útil. El codó STOP pot ser interessant ja que no s'utilitzen de la mateix manera en totes les sp i tambe
difereixen. Per exmple, el codó UAG s'utilitza el 24% en homosapiens però mai en Ecoli. Si hem clonat un gen humà en un plasmidi ens podem
trobar que Ecoli no pot aturar la terminació perquè no té el terminador UAG.

Biomol página 1
trobar que Ecoli no pot aturar la terminació perquè no té el terminador UAG.

Podem utilitzar el RBS o senyal d'ancoratge del ribosoma per iniciar la traducció. Quan comparem les diferents RBS hi han diferències i es
trauen consens seran RBS forts que es reconeixeran amb facilitat pel Ribosoma mentre que les que s'allunyen molt de la seq consens
l'expressio del gen serà menor. Normalment els plasmidis bons tindran RBS fortes molt similars a la seq consens.

Hi han elements per l'expressió de trasncripció: un promotor serà fort si té una seq similar a la consens per ser més fàcil. Si es diferent serà
menys reconegut i la seva expressió menor. Dins els promotors hi han constitutius que s'expressen sempre i regulables que requereixen d'un
determinat moment. Induir el clon guardar vols que l'expressió estiga reprimida i induir-la quan vols per a que les cels no tinguen uns a despesa
inútil i evita que el gen, el seu producte siga tòxic per a la cèl·lula i perds el clon abans de la bona expressió per mort cel·lular. Si el promotor és
regulable es requereix d'un operador per determinar quan s'expressa i quan no dins el plasmidi i tenir el gen del repressor per assegurar que hi
haurà prou còpies d'aquest per reprimir el gen. El terminador és important per finalitzar la transcripcio i evitar una despesa inútil de mRNA que
al final acabarà sense necessitar.

Més important és el promotor i hi han diferents tipus:

Hi ha el nom, gen, com s'induiex i quin nivell d'expressió aconseguiexes. Sols interessen els de la fletxa.

El problema amb lac és que Ecoli utilitza la lactosa per obtenir glucosa o energia metabòlica i el inductor ens desapereix poc a poc i com a
solució és no afegir lactosa sinò l'anàleg IPTG que també s'uneix al operador i Ecoli no la pot aprofitar. Amb arabinosa funciona similar a lac i
tindriem el mateix problema i per això no es posa Darabinosa sino Larabinosa que és pobrament utilitzada per Ecoli. El promototr de rec A és
bona per molècules mutagèniques com l'àcid nalixidic que quan acaba la prot recombinant en purificació aquesta molècula mutagènica no ens

Biomol página 2
bona per molècules mutagèniques com l'àcid nalixidic que quan acaba la prot recombinant en purificació aquesta molècula mutagènica no ens
interessa. Preferim traure coses com phoa que s'elimina quan llevem fosfat del medi i el trp s'induirà quan llevem trp al medi amb medis de
cultiu però ens pot donar problemes: si no hi ha trp hi ha un dèficit metabòlic. Ecoli té els gens per sintetitzar trp però inibeix l'expressio del gen
recombinant.

Podem vcanviar les condicions del medi o el pH. El promotor phoU es pot afegir sal donant nivells d'expressió alt i barat sempre i quan no
superem la osmolaritat cel·lular. Cad A s'induiex baixant el pH però té el problema que quan les cel estan en colònies les de dins ferementen
baixant el pH i tenint una expressió del gen quan no ens interessa i que no estiga prou reprimit.

3 ppals tipus de promotors més freqüents:

- sintètics o híbrids on es combina promotors naturals amb més eficàcia. Entre la caixa -10 i -35 hi ha els promotors més estudiats que són
els del operó lac i trp. En el cas de trp la caixa -35 és idèntica al promotor mentre que -10 és bastant diferent. Operó trp és moderat i no
té gran expressió per la caixa -10 i és difícil de reprimir i en lac és reprimit però molt més fàcil de fer-ho amb IPTG o lactosa. Els sintètics
combinen aquests dos promotors: -35 trp i -10 de lac. La diferència entre els promotors é sla distància de pb. Permeten una bona
repressió i ala vegada és molt més fort perquè la combinació de les 2 seq fa que es pareixquen al consens. PlacUV5 muta -10 de lac per a
que es torne en un promotor més fort. Com l'operador és de lac, tots els promotors seran induibles amb IPTG.

- Promotor pl del fag lambda que és molt

fort i té una variant del repressor mutat
en el residu 187 fent que siga un
repressor més inestable i fa que es
desnaturalitza a temperatures més
baixes com 42º el operador. La idea
d'aquest tipus de promotors és que a 5'
tens operador que es pot reprimir. Es
pot induir l'expressió canviant la tª del
cultiu fins 37 o 42 ºC i el operador es
desnaturalitza tornant molt fort
l'operador i tens molta expressió.
Promotor fort i fàcil d'induïr però
treballar a temperatures altes pot ser
que les cel es moren.

- Promotor del fagT7 que està sota el control d'aquest promotor que sols és reconegut per la RNApol del fag T7. Ha estat modificat per
tenir l'operador de l'operador lac per a que quan no hi ha IPTG el promotor es troba reprimit i no hi ha expressió. Quan l'introduim en
eColi el gen no pot ser induït perquè EColi no l'expressa i en cel normals no s'expressa. S'ha de posar el vector en cel especials com les
DE3 que tenen un fragment de T7 insertat en les cel que correspon al gen de les polimerases. Si poses IPTG s'uneix al repressor i deixant
els dos promotors accessible si es transcriu fent bona quantitat de polimerasa que es pot unir al seu propi promotor i expressar molta
proteïna del gen inertat i com el promotor del T7 és fort, tindràs molt de gen. Normalment es combienen amb un segon plasmidi amb un
ori compatible amb el vector on tenim clonat el gen que de manera constitutiva i baixes [] fa el lisozim del fag T7 que es pot unir al RNA

Biomol página 3
ori compatible amb el vector on tenim clonat el gen que de manera constitutiva i baixes [] fa el lisozim del fag T7 que es pot unir al RNA
pol inhibint la bombolla de replicació. Si no hi ha IPTG la quantitat de RNApol és molt baixa perquè el repressor de l'operador lac ens
impedeix la seva exprresió. Tot i axò sempre pot haver la mínima expressió del gen i aquest gen la proteïna expressada s'unirinrà al
lisozim que ha generat la propia cel impedint que la polimerasa expresse el gen. Si poses IPTG la quantitat de RNA pol és molt i molt gran
que la petita quantitat de lisozim T7 i la capacitat d'inhibir d'aquest serà xicoteta i tindràs molta expressió. Quan un repressor està unir al
operador no é suna unió covalent i sempre hi ha un petit instant que el repressor se'n va i es còpia el gen. Al quantitat d'expresió depen
de 'afinitat del repressor, RNA T7 la seva quantitat ja que si hi ha molta si salta el repressor hi ha expressió i si hi ha poca la probabilitat
d'unió bixa. Si no hi ha IPTG no hi ha RNApol que a més a més està inhbinda pel lisozim i no expressa el gen ja que la poca RNApol no
inhibida puga fer l'expressió --> inhibició molt gran. Lac sols està controlat per l'afinitat del repressor al operador i la inhibició en
tepressió no serà tan bona. Si induïm la expressió el promotor t7 é smolt fort i hi haurà moltíssima quantitat de RNApol on l'efecte de
lisozim serà baixa amb molta expresió i el promotor lac no serà tan i tant gran.

Com optimitzar la soca hoste, seq del gen i modifocar les condicions de cultiu en el moment de l'expressió

Optimització de la seq del gen

Biomol página 4
 Optimització de la seq del gen

1. Optimització estructura UTR 5' mRNA (on hi ha la RBS i la zona a traduir) per a que estiga ben exposada i es no es trobe autoaparellada
per a estar ben accessible al ribosoma i asegurem una bona traducció del mRNA. Hi han programes d'ordinador per fer prediccions de
l'estructura del RNAm i haurem de mirar com aparella entre si. Mires com es troba i si està molt parellat predir les modificacions per
desaparellar i que estiga accessible. La seq de nuclèotids del mRNA es pot canviar com la 5' UTR excepte RBS i AUG que no codifiquen per
al mRNA i es poden modificar. Si RBS i AUG ho feren en zones codificants encara tindries una opció ja que el codi és degenerat i les
terceres bases es poden canviar sense afectar l'ús de codó.
2. Optimització ús de codó: quan introduïm un gen d'un organisme a un diferent, els usos de codó dels organismes és diferent. Modifiques
la seq del gen per optimitzar al codó que s'expressa més i això es diu gen sintètic. Altres opcions és utilitzar plasmidis compatibles al
plasmidi que conté el gen que volem expressar i que expressen els plasmidis tRNAs rars continguts en la seq que volem expressr i
eliminem el problema.

Optimitzar la soca hoste

Exemple de soques derivades d'una soca típica la BL21 que és deficient en dos proteases que fan que no puguen degradar la prot
recombinant i a partir d'ahí apareixen altres soques:

Condicions de cultiu

Biomol página 5
 ALTRES ESTRATÈGIES PER MILLORAR L'OBTENCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS

En el citosol de la cèl·lula

Les dos estratègies tenen avantatges i inconveninets

Expressió citosòlica:
- Les construccions plasmídiques són senzilles amb vectors d'expressió que permeten rendiments elevats de producció que s'expresen sota
el control de promotors forts fent molta proteïna que fa agregats insolubles (cosos inclusió de la prot recombinant que formen zones més
denses en els bacteris). L'avantatge dels cossos és que són relativament fàcil d'aïllar amb lisi cel·lular i centrifugació i purificar la prot. Dins
els cosos d'inclusió està desplegada i tota junta. Al estar desplegada pareix més fàcil que siga atacada per proteases però com fa agregats
està protegida de proteases. Esta prot és inactiva donat un altre avantatge ja que si fem prots tòxiques no mataran al bacteri ja que estan
inactivades però per altra banda en la expressió citosòlica els cosos d'inclusió són agregats que eper poder purificar la prot implica que
s'ha de desnaturalitzar amb agents desnaturalitzants i fer protocols de purificació relativament llargs i complexos amb urea o altres,
eliminar-los i tornar-la a naturalitzar. En els agregats els ponts disulfur estan fets malament o no estan i hi h aque posar agents que
trenquen estos ponts mal formats i afegir al final del protocol de purificació algun agent que ajude a les Cys a fer pots disulfur bons.
Pasem d'un estat reduï de Cys a oxidat que fa el pont disulfur. Un altre desavantatge és que els proc quan traduiexen fan una met
modificada (formilmetionina) i si expresses un aprot eucariota en el hoste procariota no tindrà el Nterminal sino que tindrà la formil
metionina. Altre sdesavantatge és que per la solubilització i purificació es poden produïr trencaments per proteòlisis i podem perdre la
prot per proteaes tot iq ue es posen agents que les inhibeixen. Comentar que en el citosol hi ha un ambient reductor que no afavoreix el
sponts disulfur i hi ha qu eposar agents que ho permetin-> oxifdar les cadenes laterals de la cys. Podem fer construccions de tal manera
que la prot es faça en el periplasma o vaiga al espai extra cel·lular.
- Periplasma: si la expressió és aquí la purificació és molt més fàcil ja que soles es a en el espai periplasmàtic i a més hi ha menys protesses
i un mabient més oxidat amb millors ponts disulfur i no caldran els protocols del citotoplasma. La proteïna no serà modificada i tindrà el
Nterminal. Hi han soques d'eColi que es modifiquen per ser mlt eficients a voltes tenen problemes amb la exportació i el increment de
prot baixa. Tot i que hi ha que esperar a que estiga correctament plegada es poden fer cosos d'inclusió com en el citosol i no guanyes res

Biomol página 6
prot baixa. Tot i que hi ha que esperar a que estiga correctament plegada es poden fer cosos d'inclusió com en el citosol i no guanyes res
si acabes amb protocols complexos. Un altre és que la expressió periplasmàtica dona un rendiment menor que el del citosol.

La tria d'una o un altra depèn de les soques i del moment.

La construcció per a que s'exprese al periplasma o a l'exterior cel·lular s'ha d'introduir davant el gen que codifica per a la nostra proteïna
és d'afegir en fase una seq que codifica per un pèptid senyal (pèptids que porten les prot per ser expulsades a l'espai periplasmàtic). Són
reconegudes per la maquinària d'exportació i davant el gent tot a la prot anirà a eixir cap al periplasma. En aquest pas hi ha un aproteasa
en la mmebrana interna que talla el pèptid senyal amb el Nterminal que li correspon (un dels avantatges que té). També hi han proteïnes
de fució on es fusiona el gen amb el gen que codifica per proteïnes com colicina o hemolisina que els seus dominis permeten que la prot
pase la membrana extracel·lular ja siga en 2 pasos o com les hemolisines que fan un canal directe de l'interior a l'exterior cel·lular.

PROTEÏNES DE FUSIÓ
Fusió de proteïnes: incloem en un mateix marc de lectura els gens que codifiquen per 2 proteïnes: un per la prot recombinant i l'altre un
altra prot amb característique sinteressants. Entre el primer i el segon gen no ha d'aver STOP perquè es fan conjunt com una sola prot.

Etiquetatge d eprot: unim al gen d'una prot una petita seq que codifica per un pèptid que dotarà de noves propietats la prot recombinnat
buscada.

Aquestes construccions s'assemblen molt a com fas tu que la prot vaja al citoplasma o al citosol i el que fas és tenir clonat el gen de la

Biomol página 7
Aquestes construccions s'assemblen molt a com fas tu que la prot vaja al citoplasma o al citosol i el que fas és tenir clonat el gen de la
prot recombinant que vols expressar i li fusiones un gen o un fragment per noves propietats els quals són bescanviables. El punt de fusió
dels gens é sla part interessant ja que a nivell de prot ens ha de permetre dos coses: plagament correcte de les dos prot amb un linker
(seq curta d'aa com Lys o Ser que tenen molta mobilitat sense estructura secundària permetent el màxim el seu plegament complet) i per
seprar les prot, al final del linker es posa un a diana reconegura per una proteasa o una diana d'un producte químic mitjançant posant a
l'extrem del linker un triplet que codifique per metionina la qual és reconeguda per un reactiu com el bromur de cianogen que la trenca
per l'extrem Cterminal o posar una seq IEGR reconeguda per la proteasa F10 (factor) que talla per l'extrem Cterminal. En els dos casos en
el tall el que aconsegueixes és la prot amb el N terminal de la prot fusionada. Per seprara la etiqueta o les dos prot, é simportant que la
prt no porte cap diana per químics o proteses ja que la tallaries i no la tindries sancera.

Objectius

F és fusió
E és etiquetatge

S'uneix covalentment al pèptid aquest i es lleva per cromatografia.

Sol prot unida a GST es queda fins que es posa un tampó amb excès de tamó de la GSH
fent que competisquen i es seprara.

Biomol página 8
Poden fer enllaços de coordinació amb metalls divalents la qual cosa el que crearem o aconseguirem purificar la prot ambb
crotamatografia d'afnaitat IMAC. Li posem un agnet calant unint primerament el metall que s'unirà a aquest agent apliquem l'estracte
celular de le sprot de fusió que porten la cua d'His faran enllaços amb el Ni, farem un bon rentat per llevar prot que no tenen his i per
eluir es baixarà el pH o un agent calant que s'amporta el metall i la proteïna en conseqüencia o posant un excès de His per a que tinga
que competir i que finalemnt caiga la prot.

Biomol página 9
Tenim una prot problema x i volem saber amb quines prots pot interactuar. Dins le s cel on hem fet la genoteca en el genoma porten el
gen reporter com le gen lacz que en aquest hoste no s'expressarà a no ser que hi hagin unes condicions com transcativadors que fan que
hi s'atraiga la polimerasa. Un altre gen reporter pot ser la GFP que quan s'expressa dona color fluorescent. A banda de la genoteca i
utilitzat l'hoste amb el gen reporter, amb el sistema del doble hibrid construirem proteïnes de doble expressió on els dominis del
transactivador (regulador en trans d'eucariotes amb 2 dominis: 1 al DNA que reconeix unes determinades seq i un d'activacióq ue
interacciona amb altres prot --> controla expressió dels gens on els dominis són separables). El que fem és en un vector d'expressió sobre
un promotor tenim el gen de la prot x que volem saber quines prot de la genoteca de cDNA del vector d'expressió poden iteraccionar
amb aquesta prot. En aquest vector fixemn-os que la prot està fusionada al domini d'unió al DNA (BD) d'un transcativador que
reconeixera seq del promotor que regulen l'expressió del reporter. Per altre costat tenim la genoteca amb l'altra part del transactivador
formant una colònia i el que fem es cotransformar-les per fusionar el domini amb el gen. Un cop feta la cotransformació dins de cada
colonia tendras un plasmidi que codifica per una prot que no saps quina es unida al domini d'activació del trasnactivador i obviament
tindrem la nostra prot unida al domini d'unió al DNA. A partir d'aquí expressarem (cada un té un marcadaor de selecció diferent.>
gastarem 2 antibiòtics) permetem que s'expressen els clons de la genoteca del domini d'activació com el gen a tractar i tindrem
construccions de la nostra prot x amb el domini i construccions que seran cada una de les prot de la genoteca unides al transactivador. Si
es fa una interacció entre la prot x i una dels clons, el que ñes el domini d'unió de DNA de la prot reconeixerà el promotor del gen
reporter i si interacciona amb una de les prt dels clons com que x interacciona amb y1 el que fem é sreconstruir el transactivador tenint
expressió del gen reporter i la prot interacciona mab el clon i podem traure clons de prot que interaccionene amb la nostra.

Biomol página 10
 Per fer proteïnes eucariotes

Les glicosilacions dels eucariotes inferiors són

diferents als dels eucariotes superiors i el que fan
és introduir glicosilacions a lo bèstia i no és activa
com a desavantatge.

Moltes prots eucariotes es fan amb cel animals en farmacologia.

Biomol página 11