KẾ HOẠCH LÀM VIỆC (3/6/2021 -6/2022)

Nội dung thí nghiệm:

1. Cách tạo màng alginate – CMC
2. Phân lập chủng lactic, bacillus
3. Màng alginate – CMC kết hợp vi khuẩn đối kháng
Tuần 1 -2
Phần 1 Tạo màng CMC và alginate Phân lập vi khuẩn lactic
B1: Pha alginate nồng độ lần lượt B1:
(0-3,0%) và pha nồng độ CMC lần
 Tìm kiếm/ mua môi trường
lượt (0-1,5).
(có sẵn – cách pha).
Nồng độ alginate đã được chọn làm
cơ sở của các thí nghiệm sàng lọc  Tiệt trùng dụng cụ.
ban đầu. Natri dung dịch alginat  Chuẩn bị dụng cụ thí
[1,0%, 2% và 3,0% (w / v)] được
chuẩn bị bằng cách trộn 10, 20 và nghiệm.
30g alginat với 1000mL nước cất B2: Pha môi trường nuôi cấy lỏng
và khuấy ở nhiệt độ được kiểm soát
rồi đem tiệt trùng, thêm nguyên
là 70 ◦ C cho đến khi hỗn hợp trở
nên rõ ràng. liệu vào môi trường như sữa chua,
CMC tương tự kim chi,….Để tủ ấp 37oC - 1 đêm.

B2: Kết hợp alginate với CMC qua B3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
từng nồng độ 0 – 1, 0 – 1,5, …. 3 – như: MRS, TSA, sữa tươi không
1,5.
đường,…
B3: Đánh giá chất lượng màng theo
B4. Sau khi để qua 1 đêm xuất
các chỉ tiêu:
hiện vi khuẩn, kiểm tra hình thái
Tốc độ hô hấp, sự thay đổi màu
sắc, tỷ lệ nhiễm bệnh của trái, mức khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn
độ tổn thương do bệnh, tổn thất lactic (hình dạng khuẩn lạc trắng
khối lượng, độ cứng của trái , đánh
giá cảm quan. đục, không màu, bờ láng, lồi, bìa
nguyên hoặc chia thùy) dưới kính
 Lựa chọn, sử dụng màng bao
alginate – CMC có nồng đố tốt nhất hiển vi.
B4: Lấy vi khuẩn đúng hình thái.
Đem đi tăng sinh vi khuẩn trong
 môi trường lỏng. Kiểm tra đúng
hình thấy vi khuẩn lactic rồi dùng
đũa tam giác cấy vi khuẩn vào môi
trường đã chuẩn bị trước đó 
Thử nghiệm sinh hóa.
B5: Khảo sát và chọn lọc các dòng
vi khuẩn lactic có tính kháng
khuẩn cao, tăng sinh khối.

Phần 2 Kết hợp màng bao alginate – CMC với vi khuẩn đối kháng

Cách 1: Xoài phủ 1 lớp màng alginate -CMC  để khô  phủ 1 lớp dd
lactic  để khô  phủ 1 lớp màng alginate -CMC  để khô  phủ 1
lớp dd lactic  để khô.
Cách pha Dd chứa vi khuẩn lactic (dd lactic): Pha dung dịch muối vô
trùng (0,9%)  tiệt trùng  thêm vi khuẩn lactic vào dd muối  đem

đo quan 106 cfu/mL

.
Cách 2: Pha loãng 10 lần màng alginate - CMC vào dung dịch dd lactic
và được đo bằng phương pháp liệt kê đĩa phẳng sử dụng NYDA, và ủ ở
28◦C. Tất cả các phân tích được thực hiện trong ba lần.
 Đem đi khảo sát

2.3. Thiết kế thử nghiệm

 Màng alginate (0-3,0%) và CMC (0-1,5)
Mô tả phân lâp vi khuẩn đối kháng
2.2.1 Thu thập mẫu
X
Sữa chua Vinamilk, Yakult, Kefir và các mẫu sản phẩm lên men bao gồm kim chi,
dưa cải muối chua, nem
  chua được thu thập tại siêu thị Coopmart. Sản phẩm men tiêu
hoá đôngĐánh
khôgiá màng qua các chỉ
Lactominplus, tiêu:
Bioacimin, Zincibio, Antibio, Probio và Probactil được thu
Tốc độ hô hấp
thập tại nhà thuốc tây.
Sự thay đổi Nước tàu hủ được thu mẫu tại Thu
màu sắc cở thập mẫuxuất
sở sản VK lactic,
nước bacillus
tàu hủ ở thành
Tỷ lệ nhiễm bệnh của trái
phố Vĩnh Long.
Mức độ tổn thương do bệnh
Tổn thất khối lượng
2.2.2 Phân lậpĐộ
vi cứng
khuẩncủalactic
trái từ men tiêu hóa và thựcPhân
phẩmlập lên menbacillus
VK lactic,
Đánh giá cảm quan
Sản phẩm men tiêu hoá đông khô và các mẫu thực phẩm được đồng hóa, hòa tan vào
môi trường MRS broth và ủ ở 37o C trong 24 giờ. Sau khi ủ, dung dịch mẫu được cấy
Khảo sát và chọn lọc các dòng vi
chuyển qua môi trường MRS agar. Quá trình cấy chuyển trên
khuẩn có tínhđĩa môi
kháng trường
khuẩn cao thạch được

lặp lại nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định.
Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic. Những dòng vi khuẩn
được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng
nguyên
Màng nồng độ tốt nhất
hoặc  chia thùy. Khuẩn
+
Định danh cấp không
đục, độ giống màu,
của những
bờ dòng
láng, lồi, bìa
vi khuẩn đã chọn lọc
lạc này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với
những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ. Sau khi được tách ròng, những dòng phân
lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Tiến
hành nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, nhuộm bào tử và kiểm tra khả năng phân
giải CaCO3.
Vi khuẩn lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que,
không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải được
CaCO3.
2.2.3 Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao
Tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai phương pháp chuyển đổi từ phương pháp
“agar spot” (nhỏ giọt) và “well diffusion agar” (khuếch tán trên giếng thạch) của Herna
´ndez et al. (2004). Vi khuẩn chỉ thị trong thí nghiệm này là Bacillus subtilis đã được
phân lập thuần từ Biosubtyl II.
Phương pháp “nhỏ giọt”
 Những dòng vi khuẩn lactic phân lập được nuôi trong 5ml MRS lỏng ở 30 o C trong
16 giờ. Lấy 10µl dung dịch nhỏ giọt trên đĩa có chứa 10ml MRS agar để khô. Tiến hành ủ
các mẫu đã nhỏ giọt vi khuẩn lactic ở 30 o C trong 18 giờ. Trộn và phủ môi trường bán
đặc chứa vi khuẩn chỉ thị B. subtilis lên đĩa đã có chứa những dòng vi khuẩn lactic phát
triển. Những đĩa này được ủ trong 48 giờ ở 35 o C. Quan sát và ghi nhận kích thước vùng
sáng vô khuẩn xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn lactic.
Phương pháp “khuếch tán trên giếng thạch”
Chuẩn bị dịch huyền phù của dòng chỉ thị B. subtilis đã được nuôi cấy qua 24 giờ với
mật số 109 tế bào/ml. Chủng 10% dung dịch vi khuẩn này vào môi trường nước mắm -
peptone 2% agar ở 50o C và tiến hành đổ đĩa. Những giếng nhỏ có đường kính 6mm được
tạo ra trên mặt môi trường bằng thanh kim loại vô trùng.
Những dòng vi khuẩn lactic đã phát triển trong 2ml MRS lỏng dưới điều kiện yếm
khí trong 48 giờ, ly tâm 8.000rpm trong 15 phút ở 4 o C. Lấy phần nước trong của dung
dịch sau ly tâm. Điều chỉnh dung dịch về pH 6,5 bằng NaOH 0,1N và trữ lạnh ở 4 o C.
Thu được dung dịch có khả năng có bacteriocin thô. Lấy 80µl dung dịch bacteriocin thô
nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã chứa dòng chỉ thị. Tiến hành ủ mẫu ở 4 o C trong 15
phút cho dung dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó, đĩa được ủ ở 35 o C cho vi khuẩn chỉ
thị phát triển.
Xác định và chọn lọc tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic
Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn lactic phân lập được tính bằng
đường kính vòng vô khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa. Tính
kháng khuẩn được biểu hiện khi đường kính vòng vô khuẩn rộng hơn 2mm. So sánh khả
năng kháng khuẩn của các dòng và chọn lọc nhũng dòng vi khuẩn lactic có tính kháng
khuẩn cao.
2.2.4 Định danh cấp độ giống của những dòng vi khuẩn lactic đã chọn lọc
Vi khuẩn lactic được xác định ở mức độ giống dựa vào phương pháp hình thái học
của Axelsson (2004) và một số phản ứng sinh hóa đặc trưng. Kiểm tra khả năng sinh khí
CO2 khi lên men đường glucose, khảo sát sự phát triển của vi khuẩn ở 10 và 45 o C; pH
4,4 và pH 9,6; 6,5% NaCl và 18% NaCl, trong môi trường MRS agar bổ sung thêm
0,02% và 0,04% natri azide, 40% manitol và phản ứng sinh indole.

Mô tả Kết hợp màng với vi khuẩn đối kháng

Thực hiện đếm số lượng tế bào sống sót được bọc trong màng của chất tổ hợp tốt
nhất, được chuẩn bị theo quy trình trên.bằng cách pha loãng 10 lần màng vào dung dịch
muối vô trùng (0,85%) và được đo bằng phương pháp liệt kê đĩa phẳng sử dụng NYDA,
và ủ ở 28◦C. Tất cả các phân tích được thực hiện trong ba lần.
 Xoài

Làm sạch

Ngâm nước muối 2% (2-3 phút)

_ Khối lượng.
Để khô (1 phút)
_ Tổng chất rắn hòa tan.
Xác định các thông số hóa lý
_ Hàm lượng đường khử.
_ Hàm lượng polyphenol tổng.

Màng alginate-CMC kết hợp với

vi khuẩn Lactic hay vi khuẩn Bacillus

o Tốc độ hô hấp
o Hoạt tính chống oxy hóa o Sự thay đổi màu sắc
(DPPH)
Để khô (1 phút)
o Tỷ lệ nhiễm bệnh của trái
o Hàm lượng chlorophyll
Xác định các chỉ tiêu o Mức độ tổn thương do bệnh
o Hàm lượng tổng carotenoids
o Tổn thất khối lượng, độ cứng
o Hàm lượng vitamin C
của trái
o Hàm lượng tổng phenolics o Hàm lượng acid tổng, hàm
lượng chất khô hòa tan

Thời gian bảo quản