6/12/2022

DPPH
1. Chuẩn bị 6ml dd DPPH 0.6mM : Cân 0.00142g DPPH (394,32 g/mol) trên giấy alumium foil, hòa tan trong beaker chứa 6ml ethanol to
~ 5 beaker
3. Pha chất đối chứng dương ascorbic acid:
 Cân 1mg Ascorbic acid hòa tan vào 10ml water, thu được stock nồng độ 100 microgram/ml (100ppm). (1 beaker)
dissolve DPPH. (Cần 6ml ethanol) (Tương ứng với mỗi cách fermen gồm 2 flasks) (Pha trong ngày hoặc trước ngày đo 1 ngày) (1 beaker)  Chuẩn bị 5 bđm 5ml label theo thứ tự: 0.5ml, 1ml, 1.5ml, 2ml, 2.5ml. (Cần 5 bđm 5ml)
2. Pha mẫu cần phân tích:  Hút stock sample chuyển vào từng bdm theo thể tích tương ứng, add water đến vạch. Ta được dãy nồng độ

 Chuẩn bị 65ml 99% methanol: Cho 64.35ml absolute methanol vào 0.65ml distilled water. (Cần 1 bđm, 1 beaker 100ml) tương ứng: 10;20;30;40;50 ppm (microgram/ml).

 Cân 0.4mg trà bột trong 10ml methanol 99, sealed nắp bằng aluminum foil và cuộn seal, shake in water bath at room temperature

trong 2.5 hours. (Cần lượng methanol 99% là 20ml) (Nếu có thể thì extract bằng 2 test tube cho 2 flasks) (Tube rack)
Nồng độ stock là 100 ppm -> hút 1ml từ stock vào bdm 10ml và định mức bằng solvent : 100 * 0.5/5 = 10 ppm
Nồng độ stock là 40 ppm -> hút 2 ml từ stock vào bdm 10ml và định mức bằng solvent : 100 * 1/5 = 20 ppm
 Sau 2.5h, chuyển dd qua ống centrifuge, centrifuge 15 phút (6000-8000 rpm). Filter the top solution qua giấy lọc để thu được extract

solution (nồng độ 40 microgram/ml = 40 ppm) (ống sample stock). (Cần 2 ống ly tâm) (2 beakers để lọc lấy extract) (giấy lọc)

 Chuẩn bị 5 bđm 5ml label theo thứ tự: 0.5ml, 1ml, 1.5ml, 2ml, 2.5ml. Hút stock sample chuyển vào từng bdm theo thể tích tương

ứng, add methanol 99% đến vạch. Ta được dãy nồng độ tương ứng: 4;8;12;16;20 ppm (microgram/ml). (Cần lượng methanol 99% là

35ml – cho cả 2 flasks của cùng 1 loại ferment) (Cần 5 bđm 5ml)

Nồng độ stock là 40 ppm -> hút 1ml từ stock vào bdm 10ml và định mức bằng solvent : 40 * 0.5/5 = 4 ppm
Nồng độ stock là 40 ppm -> hút 2ml từ stock vào bdm 10ml và định mức bằng solvent : 40 * 1/5 = 8 ppm

1 2

Cover bằng aluminum foil, để phản ứng 30 phút trong tối, đo mật độ quang tại bước sóng 750nm Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ±SD

Mẫu đối Mẫu đối

Mẫu phân tích Mẫu trắng chứng dương chứng âm Có 60 ô cần methanol: 1. Phần trăm gốc tự do DDPH ‫﮲‬được tính theo công thức:
Cần 6ml methanol 99%
Nồng độ 1 SCDPPH : ‫﮲‬Khả năng bắt gốc tự do DDPH(%) ‫﮲‬
Nồng độ 1 của standard: Có
Nồng độ 2 3 ô thì cần 0.3ml ascorbic As : Độ hấp thu quang của mẫu phân tích
Ab : Độ hấp thu quang của mẫu trắng
Flask 1 Nồng độ 3 Khi thêm các thành phần phản
ứng vào đĩa 96 hoặc ống An : Độ hấp thu của mẫu đối chứng âm
Nồng độ 4
nghiệm, dung dịch DPPH cần
Nồng độ 5 được thêm sau cùng.
2. Tính giá trị IC50 của mẫu thử và mẫu đối chứng dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ và % hoạt tính
bắt gốc tự do của chúng, theo công thức sau:
Mẫu trắng của Flask 2 Nồng độ 1 của sample: Có
Mẫu phân tích của Flask 2
Flask 2 6 ô thì cần 0.6ml sample
IC50 : Nồng độ mẫu thử, chuẩn có thể bắt được 50% gốc tự do DDPH‫﮲‬
Có 60 ô cần DPPH: a, b : Lần lượt là độ dốc và hệ chắn của phương trình tuyến tính giữ
Cần 6ml DPPH
100 μl 100 μl DPPH 100 μl DPPH + nồng độ và % bắt gốc tự do.
Natural 100 μl DPPH methanol
+ 100 μl + 100 μl 100 μl
99% + 100 μl ascorbic acid Methanol 99%
Inoculated làm tương tự sample
1. Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958;181(4617):1199.
sample 2. Kedare SB, Singh R. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of food science and technology. 2011;48(4):412-422.

3 4
1
 6/12/2022

~ 2 beaker
Bố trí thí nghiệm: @Sample
Total Polyphenol (96-well plates) • Dry tea (0.1g) đã nghiền nhỏ, được cho vào ống tube 5ml. (Cần 2 ống tube cho 2 flaks) (Motar)
• Nâng nhiệt của ống tube bằng cách đặt trong bể ổn nhiệt ở 70oC (1 phút)
 Cần total 30ml Methanol 70% để chuẩn bị sample (của 2 flasks): Pha 21ml
• Thêm 2.5ml dd 70% methanol đã được ổn nhiệt ở 70oC trong 30 phút.
MeOH vào 9ml nước, thu được MeOH 70%. (Pha trong ngày) (Cần beaker)

 Cần 2.4ml dd F-C 10%: Pha 0.0576ml dd F-C vào 2.4ml nước, thu được dd F-C
Vortex
10%. (Pha trong ngày) (Cần beaker)

 Cần 1.92ml dd Na2CO3 7.5% cho mỗi một ngày đo (2 flasks), đo 4 lần tất cả thì
cần 1.92*4= 7.68ml: Pha 0.6g Na2CO3 vào 8ml nước, thu được 8ml Na2CO3 Tiếp tục trích ly trong 5 phút ở 70oC
(Trong quá trình trích ly, tiến hành lắc đều ở phút 2.5 phút và phút thứ 5)
7.5% (pha 1 lần dung trong 1 tháng) (Cần test tube có nắp)

5 6

Cooled down to RT Bố trí thí nghiệm: @Standard

 Dung dịch chuẩn ~ 1000 rpm: Bằng cách add 0.01g gallic acid ngậm 1
Centrifuge (3500 rpm) (10 phút) (Cần centrifuge tube) phân tử nước vào bđm 10ml, định mức đến vạch. (Cần 6 bđm 10ml)
 Hút lần lượt 0.1 ; 0.2 ; 0.3 ; 0.4 ; 0.5 ml vào bđm 10ml, định mức
 Lấy phần dịch chiết, cho vô bđm 5ml đến vạch (Thu được dãy nồng độ 10 20 30 40 50 rpm tương ứng)
 Phần bã tiếp tục trích ly lần 2

Bố trí thí nghiệm: @Blank

Gộp 2 dịch chiết lại, cho 70% Methanol đến vạch chuẩn 5ml • 20 microlit nước
• 100 microlit F-C 10%
• 80 microlit Na2CO3
Hút 0.1ml dịch chiết vào bđm 10ml. Định mức đến vạch bằng MeOH
70% (Thu được dịch chiết pha loãng)

7 8
2
 6/12/2022

Bố trí thí nghiệm đo: @735nm

Sample Standard Blank Color Estimation
Sample 1
20 microlit sample/ standard/ nước . 90ml H2O Để 45 phút (10 phút
Ground
100 microlit F-C (10%) Sample 2 at 100oC tea shake 1 lần) Extract will be transfer to
Filtered
sample Obtain residue 100ml volumetric flask.
Add into
(0.6g)
Có 24 ô cần F-C 10%
(cho 2 flasks):
Duran
Filtered
Cần 2.4ml dd F-C 10%
Có 24 ô cần Na2CO3 Washed 2-3 times by pure
(cho 2 flasks): boiling water
Cần 1.92ml Na2CO3

Đo ở 735nm 5 nồng độ của dãy So sánh L* ; a* ; b*:

Incubate (5 phút)
standard curve • L giảm: color darker
• a tăng: tea soup gradually became red
80 microlit Na2CO3
• b tăng: tea soup gradually become yellow
Incubate (30 phút)
Shake well nhẹ
(Darkness RT)

9 10