Professional Documents
Culture Documents
CHNG 2 Sao Chep DNA
CHNG 2 Sao Chep DNA
Số tiết: 3
Nội dung
I. Sự bền vững của DNA với thời gian và qua nhiều thế hệ
1. DNA bị biến đổi ngay cả không sao chép
DNA là những phân tử rất dài, nhưng mảnh (đường kính: 20 A o), lại
thường xuyên chịu tác động môi trường bên trong và bên ngoài tế bào nên
dễ có những đứt gãy, biến đổi ngay cả khi không có sao chép.
31
Người ta tính ra rằng DNA của tế bào người mỗi ngày mất 5000
purin do quá trình mất purin (depurination): dưới tác dụng của nhiệt liên kết
N-glycosil bị thủy phân.
Quá trình biến đổi làm mất amin (desamination): biến cytosin thành
uracin. Mỗi ngày tế bào người có khoảng 100 biến đổi như vậy.
Con người cũng thường xuyên chịu tác động của tia tử ngoại làm tạo
ra các dimer thymine.
Hình 2.2 Sự hình thành dimer thymine dưới tác dụng của tia tử ngoại
2. Trình tự nucleotid được duy trì với mức chính xác rất cao qua nhiều thế
hệ
Dùng các nucleotid và các enzyme DNA polymerse để tổng hợp
DNA in vitro. Sai sót trong trường hợp này là 10-5. Như vậy sao chép trong
ống nghiệm có mức chính xác cao, nhưng đối chiếu lên các sinh vật thì mức
sai sót này hãy còn quá lớn.
32
Bằng cách đánh giá tần số các đột biến mới xuất hiện trong quần thể
lớn và theo dõi biến đổi enzyme nào đó trong nuôi cấy mô tế bào, người ta
tính được rằng trong cơ thể sinh vật sai sót trong khi sao chép in vivo là
1.10-9.
Đánh giá tốc độ biến đổi trong tiến hóa cũng khẳng định mức chính
xác rất cao trong sao chép in vitro.
Hình 2.3 Sửa sai bằng cắt bỏ và tổng hợp lại đoạn bị hỏng
33
+ Sửa sai nhờ cơ chế tái tổ hợp
Ngay cả khi không có sao chép vẫn có hệ thống bảo vệ: do DNA có
hai mạch, khi sai hỏng trên một mạch, có thể dựa vào mạch còn lại để tổng
hợp đoạn sai hỏng.
Một số enzyme đặc hiệu phát hiện sự bắt cặp sai, như trong trường
hợp mất purin. Có khoảng 50 enzyme chuyên phát hiện và sửa các sai hỏng
trên phân tử DNA.
34
5. Hệ thống SOS
Ở tế bào vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote bị sai hỏng nặng do chiếu
tia UV, tia X hoặc do tác dụng của các hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa
sai khẩn cấp được khởi động, tăng cường sửa sai. Ở E.coli, hệ thống này có
liên quan với 2 protein được mã hóa bởi gene LexA và RecA. Protein LexA
là một chất ức chế, nó gắn vào hộp SOS, chồng lấp các promotor của các
gene SOS, ngăn cản sự mã nhóm các gen của hệ thống SOS. Một vài sản
phẩm của DNA bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa protease recA. Protein recA
bị hoạt hóa sẽ cắt bỏ protein lexA, cho phép các gen của hệ thống SOS
phiên mã. Phẩn ứng của hệ thống SOS xảy ra trong thời gian ngắn nhưng
phức tạp. Nó bao gồm các quá trình làm tăng hoạt tính tái tổ hợp, thay đổi
trong khởi sự sao chép, ức chế nuclease và kích thích phục hồi sao chép và
chuyển sai hỏng thành sửa sai úp sấp (error-prone replication). Tế bào bây
giờ sẽ xảy ra sự sao chép nhanh hơn bình thường.
+ Nếu sửa sai kịp, tế bào ổn định, sinh trưởng trở lại
+ Nếu không sửa sai kịp thì tế bào phải chấp nhận hoặc chết hoặc bị
đột biến
35
II. Cơ chế phân tử của sao chép DNA
1. Nguyên tắc chung
- DNA sao chép theo khuôn.
Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính
xác hơn
+ Tiết kiệm được ezyme
+ Đạt hiệu quả nhanh
- Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử
DNA mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới
tổng hợp
- Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer)
- Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5 - 3.
Hình 2.6 Sao chép DNA theo nguyên tắc bán bảo toàn
36
2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA
Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong
quá trình tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid
triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít
DNA làm khuôn mẫu.
3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn
Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn.
Nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N 15.
Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14
bình thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N14 nhẹ,
mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết
tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại
DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra.
37
Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một
lần phân chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N 15
và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới
chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số phân tử
DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng định giả
thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái
làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung.
38
+ Mở xoắn:
Ở E.coli quá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm
khởi sự sao chép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt
đó. Tiếp theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo
xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển
động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase
tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP
làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau.
+ Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein)
gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không
cho chập lại hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng.
+ Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá trình kéo dài chuỗi là
DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi
thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể
là DNA hoặc ARN.
39
polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ mồi ARN, lắp các
nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5 ’-3’.
Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2 đầu, chỗ hở được nối nhờ
enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ ba sao chép hướng ra
ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand).
Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể
đạt đến 50.000 nucleotid/phút.
Hình 2.9 Sao chép DNA từ một điểm về 2 phía và về một phía
40
2. Sao chép nhiễm sắc thể ở tế bào eukaryote
Tế bào nhân thực có số lượng DNA lớn hơn nhiều so với tế bào tiền
nhân, tạo nên nhiều nhiễm sắc thể mà mỗi cái gồm một sợi DNA thẳng kết
hợp với protein. Do đó sao chép DNA của tế bào nhân thực phức tạp hơn và
tốc độ chậm hơn (khoảng 50 nucleotid/giây).
41
Điểm khác căn bản là DNA của tế bào nhân thực có nhiều replicon
Ví dụ: Saccharomyces cerevisiae có tới 500 replicon, tức có 500 điểm xuất
phát sao chép. Quá trình sao chép cũng bắt đầu từ ori rồi lan về 2 phía. Tế
bào có cơ chế kiểm soát nghiêm ngặt quá trình sao chép, điểm ori nào đã
sao chép qua một lần rồi thì không lặp lại trước khi toàn bộ DNA được sao
chép hoàn toàn.
Ở các eukaryote có 5 loại DNA polymerase được ký hiệu là pol α,
pol β, pol γ, pol δ, pol ε. Các loại DNA polymerase này không đồng nhất về
phân tử lượng và một số đặc tính hóa học. Pol γ phân bố trong ty thể và
tham gia tái bản DNA ở ty thể, các DNA polymerase còn lại ở trong nhân.
Trong nhân, DNA polymerase δ và DNA polymerase ε là 2 enzyme chính
tham gia tổng hợp trên sợi khuôn dẫn đầu và sợi chậm. Pol β và tiểu đơn vị
bé của pol δ có hoạt tính đọc sửa.
42
Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin,
William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An
introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers.
Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone
and Bartlett Publshers. Toronto, Canada.
Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of
genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.
43