Professional Documents
Culture Documents
FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET
Zavod za analitiku i kontrolu lijekova
Biljana Nigović
Renata Jurišić Grubešić
Jadranka Vuković Rodriguez
Ana Mornar Turk
Miranda Sertić
Zagreb, 2014.
Recenzenti
dr. sc. Biserka Cetina-Čižmek
prof. dr. sc. Nikola Kujundžić
Lektorica
Petra Gašparac, prof.
Nakladnik
Farmaceutsko-biokemijski fakultet
Sveučilišta u Zagrebu
ISBN 978-953-6256-74-7
8. Literatura 139
1. UVOD U ANALITIKU LIJEKOVA
Analitika lijekova ima važnu ulogu u istraživanju, razvoju, proizvodnji te kontroli kakvoće
lijekova. Analitička ispitivanja lijekova obuhvaćaju identifikaciju, ispitivanje čistoće i
određivanje sadržaja farmaceutskih sirovina, ispitivanje stabilnosti farmaceutskih dozirnih
oblika, ispitivanje oslobađanja aktivnih tvari iz ljekovitih oblika, otkrivanje i određivanje
onečišćenja nastalih tijekom sinteze, kao i razgradnih produkata, određivanje koncentracije
lijekova i njihovih metabolita u biološkim tekućinama te utvrđivanje kakvoće lijekova u
prometu, odnosno njihovog kvalitativnog i kvantitativnog sastava koji se deklarira u postupku
dobivanja odobrenja za stavljanje gotovog lijeka u promet (registracija lijeka).
U svrhu stavljanja lijeka u promet svaki lijek mora biti ispitan radi utvrđivanja njegove
kakvoće, sigurnosti primjene i djelotvornosti. Kliničkim ispitivanjima dokazuje se
djelotvornost lijeka, toksikološko-farmakološkim ispitivanjima utvrđuje se neškodljivost, dok
se farmaceutskim ispitivanjem utvrđuje i provjerava njegova kakvoća. Kakvoća lijeka je skup
prihvatljivih fizičkih, kemijskih, bioloških i farmaceutsko-tehnoloških svojstava lijeka.
Provjera kakvoće lijekova u analitičkim laboratorijima obavlja se prema važećim
farmakopejskim propisima1. Pod provjerom kakvoće lijeka podrazumijeva se postupak
prilikom kojeg se utvrđuje je li kakvoća lijeka sukladna s postavljenim zahtjevima, a temeljen
je na laboratorijskoj provjeri, provjeri opremanja i označivanja te provjeri dokumenata koji se
odnose na uzorak lijeka. Agencija za lijekove i medicinske proizvode kontrolira i ocjenjuje
kakvoću lijeka prije njegovog stavljanja u promet postupcima koji se propisuju zakonom2 i
odgovarajućim pravilnicima3.
Za kakvoću gotovog lijeka odgovoran je proizvođač. Farmaceutska industrija je jedna od
najbolje reguliranih industrija u svijetu zbog zaštite pučanstva i njegove opskrbe
kontroliranim i kvalitetnim lijekovima. Kakvoću magistralnog ili galenskog pripravka, kao i
kakvoću ljekovitih i pomoćnih tvari koje se koriste u njegovoj pripremi, provjerava
Laboratorij za provjeru kakvoće galenskih pripravaka i identifikaciju ljekovitih tvari,
sukladno pravilima dobre laboratorijske prakse4, a prema farmakopejskim i drugim
međunarodno prihvaćenim normama.
Ljekovite i pomoćne tvari koje ulaze u sastav lijekova moraju odgovarati farmakopejskim
zahtjevima kakvoće s obzirom na kvalitativan i kvantitativan sastav. U okviru praktikuma iz
1
European Pharmacopoeia, 8th ed., Council of Europe, Strasbourg, 2013.
2
Zakon o lijekovima (Narodne novine br. 76/13).
3
Pravilnik o davanju odobrenja za stavljanje lijeka u promet (Narodne novine br. 83/13).
4
Pravilnik o dobroj laboratorijskoj praksi (Narodne novine br. 73/12).
1
Analitike lijekova studenti će usvojiti znanja iz područja analitičkog ispitivanja farmaceutskih
uzoraka koje je usklađeno s metodologijom Europske farmakopeje. Analitička ispitivanja
obuhvaćaju identifikaciju i ispitivanje čistoće ljekovitih i pomoćnih tvari, određivanje
sadržaja farmaceutskih tvari i njihovih onečišćenja, analizu ljekovitih oblika, te upoznavanje
farmakopejskih monografija. Identifikacija ljekovitih i pomoćnih tvari prema propisima
Europske farmakopeje provest će se spektroskopskim i kromatografskim metodama,
kemijskim reakcijama potvrde identiteta te određivanjem fizikalnih konstanti. Čistoća
farmaceutskih tvari ispitat će se tankoslojnom, tekućinskom i plinskom kromatografijom, UV-
Vis spektrofotometrijom, utvrđivanjem graničnih vrijednosti anorganskih iona, određivanjem
fizikalnih konstanti (poput specifičnog optičkog zakretanja), mjerenjem pH vrijednosti,
ispitivanjem obojenosti, bistrine i stupnja zamućenja te kiselosti/lužnatosti otopine. Sadržaj
ljekovitih i pomoćnih tvari određivat će se tekućinskom kromatografijom visoke
djelotvornosti, UV-Vis spektrofotometrijom i titrimetrijskim metodama analize. Identifikacija
i kvantitativna analiza ljekovitih tvari u farmaceutskim oblicima provest će se najčešće
primjenjivanom tehnikom u analitici lijekova, tekućinskom kromatografijom visoke
djelotvornosti te tankoslojnom kromatografijom. Studenti će se u okviru praktikuma također
upoznati s validacijom analitičkih postupaka.
Pri tumačenju spomenutih analitičkih tehnika, osim opisanih postupaka koji će se izvesti u
okviru vježbi praktikuma, navode se i drugi primjeri analize farmaceutskih tvari iz Europske
farmakopeje. Oni studenta upućuju na monografije farmakopeje koje propisuju određene
analize lijekova, omogućavaju mu šire sagledavanje i rješavanje analitičkih problema te
proširuju znanje što će mu pomoći u usvajanju ispitnog gradiva.
2
2. EUROPSKA FARMAKOPEJA
Farmakopeja je skup propisa koji utvrđuju zahtjeve i postupke za izradu i provjeru kakvoće
lijekova. Kako bi se osigurala optimalna kakvoća za zdravlje ljudi svi sastojci lijekova, kao i
metode njihove analize, moraju biti standardizirani. Europsku farmakopeju (European
Pharmacopoeia, Ph. Eur.) objavljuje Europsko ravnateljstvo za kakvoću lijekova i zdravstvenu
skrb (European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare, EDQM) koje djeluje
pri Vijeću Europe u Strasbourgu. Europska farmakopeja postavlja zajedničke i obvezne
standarde kojima jamči kakvoću lijekova u svim zemljama potpisnicama Konvencije o izradi
Europske farmakopeje. Norme kakvoće za tvari iz monografijskog fonda Europske
farmakopeje obvezne su za sve lijekove proizvedene u Hrvatskoj ili uvezene u Hrvatsku.
Agencija za lijekove i medicinske proizvode (HALMED) je hrvatsko nacionalno tijelo za
pitanja farmakopeje.
Europska farmakopeja utemeljena je 1964. godine s ciljem usklađivanja proizvodnje i
kontrole kakvoće lijekova na europskom tržištu radi javnog zdravlja i slobodnog transporta
lijekova. Budući da je tržište lijekovima postalo globalno, Europska farmakopeja je u procesu
usklađivanja s Japanskom farmakopejom (Japanese Pharmacopoeia, JP) i Američkom
farmakopejom (United States Pharmacopoeia, USP).
Osmo izdanje Europske farmakopeje stupilo je na snagu 1. siječnja 2014. godine i obuhvaća
gotovo 2300 monografija ljekovitih i pomoćnih tvari, te oko 300 općih metoda za ispitivanje
identiteta i čistoće te za određivanje sadržaja farmaceutskih tvari. Europska farmakopeja i
njezini dodaci objavljuju se na engleskom i francuskom jeziku, a dostupni su kao knjige, CD-
ROM i online verzija.
Standardi Europske farmakopeje predstavljeni su u općim monografijama koje obuhvaćaju
skupinu ljekovitih pripravaka ili vrstu dozirnih oblika, te u pojedinačnim monografijama
farmaceutskih sirovina. Opće monografije definiraju zajedničke propise za pojedine skupine,
stoga ljekovite i pomoćne tvari s pojedinačnim monografijama moraju odgovarati i
zahtjevima općih monografija. Određene monografije u ispitivanjima zahtijevaju upotrebu
kemijskih poredbenih tvari (Chemical Reference Standard, CRS), bioloških poredbenih
preparata (Biological Reference Preparations, BRP) te poredbenih spektara koje je utemeljila
Komisija Europske Farmakopeje, a primjenjuju se prilikom utvrđivanja odgovara li ispitivana
tvar zahtjevima monografije. Ispitivanja opisana u farmakopejskim monografijama službene
su metode na kojima su postavljeni standardi Europske farmakopeje. Alternativne metode
3
analize mogu se koristiti u svrhu kontrole u dogovoru s regulatornim tijelima, pod uvjetom da
dokažu da, ukoliko se primijene kao službene, proizvod može zadovoljiti opće prihvaćene
standarde. Farmaceutska supstancija mora udovoljiti svim zahtjevima navedenima u
monografiji da bi postigla kakvoću koju propisuje farmakopeja. Monografije Europske
farmakopeje moraju se obnavljati kako bi se prilagodile proizvodima na tržištu, znanstvenom
napretku i razvoju zakonske regulative u području lijekova. Već objavljene monografije
farmaceutskih sirovina podliježu reviziji. Kroz njih se uvode ispitivanja na srodne tvari i daje
popis specifičnih i drugih onečišćenja koja se mogu otkriti u ispitivanoj tvari. To osigurava
potrebnu čistoću farmaceutskih sirovina odobrenih za upotrebu na europskom tržištu.
Mreža europskih kontrolnih laboratorija (Official Medicine Control Laboratories, OMCL)
djeluje u okviru EDQM-a te pridonosi zaštiti javnog zdravstva provođenjem nezavisnih
laboratorijskih analiza lijekova. Laboratoriji uključeni u OMCL mrežu međusobno priznaju i
prihvaćaju podatke i rezultate provedenih analiza pojedinih lijekova.
4
3. MONOGRAFIJE EUROPSKE FARMAKOPEJE
Naslov
Naslovi monografija su na engleskom ili francuskom, a podnaslovi na latinskom jeziku. Naziv
kemijske tvari definiran je kao međunarodno nezaštićeno ime (International Nonproprietary
Name, INN) preporučeno od Svjetske zdravstvene organizacije.
Definicija
U ovom se odjeljku navodi kemijsko ime farmaceutske sirovine prema IUPAC1-u. Propisan je
raspon koncentracija unutar kojega se mora kretati sadržaj tvari čije su granice utvrđene
metodama navedenima u Određivanju sadržaja (Assay).
Monografije kiralnih spojeva definiraju enantiomer s naznačenom apsolutnom konfiguracijom
R/S na asimetričnim centrima, ili racemat, a monografije hidrata ili solvata daju stupanj
hidratacije ili solvatacije. Kada tvar postoji u bezvodnom obliku i u obliku hidrata ili solvata s
različitim udjelom vode ili otapala, a svi ti oblici se koriste, definira se kao zasebna tvar i ima
posebnu monografiju (na primjer, natrijev karbonat).
Neke kemijske tvari, posebice one dobivene iz prirodnih izvora ili fermentacijom, imaju samo
naznačenu definiciju glavnog sastojka (na primjer, neomicin sulfat) ili ukupan opis smjese od
nekoliko sastojaka (na primjer, nistatin). Također se navodi i podrijetlo tvari, odnosno ime i
rod organizma od kojega je dobivena.
Za terapeutike koji su kombinacija dobro definiranih kemijskih tvari (na primjer, teofilin-
etilendiamin) navodi se kemijska struktura i udio svakog sastojka.
Proizvodnja
Obično se navode podaci o proizvodnji ljekovitih tvari prirodnoga podrijetla. Oni se odnose
na izvor materijala, proces proizvodnje te njegovu validaciju i kontrolu, ispitivanje konačnog
produkta i slično.
1
Međunarodna unija za čistu i primijenjenu kemiju (International Union of Pure and Applied Chemistry)
5
Značajke
Pod značajkama su definirani izgled (boja i fizikalni oblik), miris, topljivost, stabilnost
(odnosno nestabilnost) na zraku, svjetlu i vlazi, higroskopnost, kristaliničnost (kristalan ili
amorfan karakter) i polimorfizam (različiti kristalni oblici).
Topljivost
Izrazi koji se koriste u opisu topljivosti odnose se na ispitivanja pri temperaturama između
15 °C i 25 °C (Tablica 1).
Izraz djelomično topljiv koristi se za opisivanje smjese koja sadrži samo neke topljive
sastojke. Izraz može se miješati koristi se za opisivanje tekućine koja se miješa s navedenim
otapalom u svim omjerima.
Identifikacija
Ispitivanje identiteta nema za svrhu davanje potpune potvrde kemijske strukture ili sastava
tvari, nego s određenim stupnjem sigurnosti potvrđuje da ispitivana tvar odgovara opisu na
etiketi. Određene monografije imaju podjelu na Prvu identifikaciju i Drugu identifikaciju, čija
su značenja detaljnije objašnjena u 4. poglavlju, Identifikacija.
Ispitivanja
Ispitivanja čistoće opisana u monografijama imaju svrhu utvrđivanja onečišćenja koja mogu
nastati tijekom proizvodnje ili tijekom čuvanja farmaceutskih sirovina unutar propisanog roka
valjanosti. Ispitivanja čistoće najčešće obuhvaćaju: provjeru izgleda otopine tvari (obojenost,
bistrinu ili zamućenje); provjeru kiselosti/lužnatosti otopine ili mjerenje pH vrijednosti;
određivanje optičkog zakretanja za ispitivanje enantiomerne čistoće; utvrđivanje graničnih
vrijednosti onečišćenja anionima, kationima ili teškim metalima; utvrđivanje graničnih
vrijednosti ili kvantitativnu analizu srodnih tvari koje se javljaju kao onečišćenja, primjenom
6
kromatografskih ili spektroskopskih metoda; određivanje ostatnih otapala; određivanje
sadržaja vode ili gravimetrijsko ispitivanje čistoće (gubitak sušenjem ili sulfatni ostatak).
Određivanje sadržaja
Farmaceutske sirovine opisane u monografijama nikad nisu potpuno čiste već sadrže
ograničeni udio onečišćenja. Sadržaj ispitivane tvari mora se nalaziti unutar granica koje
propisuje monografija. Propisane granice temelje se na podacima dobivenima u analitičkoj
praksi, uzimajući u obzir moguće analitičke pogreške i prihvatljiva odstupanja u proizvodnji.
U slučaju antibiotika koji se određuju mikrobiološkom analizom, sadržaj aktivne tvari
izražava se u internacionalnim jedinicama. Sadržaj se najčešće određuje nespecifičnim, ali
preciznim, titracijskim metodama analize. Od instrumentalnih metoda za određivanje sadržaja
koriste se UV-Vis spektrofotometrija i kromatografske metode, kao što su tekućinska
kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) i, rjeđe, plinska kromatografija (GC).
Čuvanje
Radi zaštite kakvoće farmaceutske tvari, farmakopejske monografije posebno navode
određene uvjete pohranjivanja. Kada se preporučuju posebni uvjeti čuvanja, uključujući vrstu
spremnika i temperaturne granice, oni su posebno naznačeni u monografiji. Izraz hermetički
spremnik označava da je tvar zaštićena od gubitka sastojaka ili unosa onečišćenja. Nizak
sadržaj vlage može se postići upotrebom sredstva za sušenje u spremniku koje sprečava
izravan dodir tvari s vlagom. Izraz zaštićen od svjetla govori da je tvar pohranjena u
spremniku izrađenom od materijala koji apsorbira svjetlo (štiti preparat od promjena
izazvanih dnevnim svjetlom), da može biti smještena u posebno zaštićenom spremniku ili
pohranjena na tamnom mjestu.
Označavanje
Označavanje lijekova je predmet nacionalne regulative i međunarodnih dogovora. Iz tog
razloga oznake nisu opširne, a za farmakopejske su svrhe važne samo one koje pokazuju
slaganja ili neslaganja s monografijom. Ako se izraz oznaka koristi u farmakopeji, to je u
slučaju da se pojavljuje na spremniku, pakiranju ili certifikatu koji prati preparat.
Onečišćenja
Navedena su imena i kemijske strukture poznatih i mogućih onečišćenja u farmaceutskim
sirovinama koja je potrebno kontrolirati.
7
3.2. PRIMJER MONOGRAFIJE ACETILSALICILNE KISELINE
ACETILSALICILNA KISELINA
Acidum acetylsalicylicum
COOH
O
O CH3
C9H8O3 Mr = 180,2
DEFINICIJA
2-(Acetiloksi)benzojeva kiselina.
Sadržaj: 99,5% do 101,0% (izračunato prema suhoj tvari).
ZNAČAJKE
Izgled: bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali.
Topljivost: teško topljivi u vodi, lako topljivi u etanolu (96%).
Talište: oko 143 ºC.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: B, C, D.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (2.2.24.)1. Dobiveni se spektar usporedi sa
spektrom acetilsalicilne kiseline CRS.
B. U 0,2 g ispitivane tvari doda se razrijeđena otopina natrijeva hidroksida R2 i kuha 3 minute.
Ohladi se i doda 5 mL razrijeđene sumporne kiseline R. Nastane kristaliničan talog. Profiltrira
se, talog ispere i suši na 100 ºC do 105 ºC. Talište (2.2.14.)3 je od 156 ºC do 161 ºC.
C. U epruveti se pomiješa 0,1 g ispitivane tvari s 0,5 g kalcijeva hidroksida R. Smjesa se grije te
se nastalim parama izloži filtar papir impregniran s 0,05 mL otopine nitrobenzaldehida R. Na
papiru se razvije zelenoplava ili zelenožuta boja. Papir se navlaži otopinom razrijeđene
klorovodične kiseline R. Boja postane plava.
D. Oko 20 mg taloga dobivenog u ispitivanju B otopi se grijanjem u 10 mL vode R i ohladi.
Otopina daje reakciju (a) na salicilate (2.3.1.)4.
1
Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
2
Reagensi, poglavlje u Ph. Eur.
3
Talište − kapilarna metoda, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
4
Identifikacija iona i funkcionalnih skupina, poglavlje u Metodama analize, Ph. Eur.
8
ISPITIVANJA
Izgled otopine. Otopi se 1,0 g ispitivane tvari u 9 mL alkohola R. Otopina je bistra (2.2.1.)1 i bezbojna
(2.2.2, metoda II)2.
Srodne tvari. Tekućinska kromatografija (2.2.29.)3. Otopine se pripreme neposredno prije upotrebe.
Ispitivana otopina. Otopi se 0,10 g ispitivane tvari u acetonitrilu za kromatografiju R i dopuni istim
otapalom do 10,0 mL.
Poredbena otopina (a). Otopi se 50,0 mg salicilne kiseline R u mobilnoj fazi i dopuni do 50,0 mL
mobilnom fazom. Potom se 1 mL te otopine razrijedi do 100,0 mL mobilnom fazom.
Poredbena otopina (b). Otopi se 10,0 mg salicilne kiseline R u mobilnoj fazi i dopuni do 10,0 mL
mobilnom fazom. U 1 mL te otopine doda se 0,2 mL ispitivane otopine i razrijedi do 100,0 mL
mobilnom fazom.
U kromatografskom postupku se primijeni:
- čelična kolona duljine 0,25 m, unutrašnjeg promjera 4,6 mm i punjena oktadecilsilil
silikagelom za kromatografiju R (5 µm);
- mobilna faza brzine protoka 1 mL/min koja se dobije miješanjem 2:400:600 volumnih dijelova
fosforne kiseline R, acetonitrila za kromatografiju R i vode R;
- spektrofotometrijski detektor na 237 nm.
Injektira se po 10 µL svake otopine. Kromatografija ispitivane otopine provodi se sedam puta duže od
vremena zadržavanja acetilsalicilne kiseline. Ispitivanje nije valjano dok u kromatogramu poredbene
otopine (b) razlučivanje između dva glavna pika ne iznosi barem 6.
Na kromatogramu ispitivane otopine površina bilo kojeg pika, osim glavnih pikova, nije veća od
površine glavnog pika u kromatogramu poredbene otopine (a) (0,1%); zbroj površina svih pikova nije
veći od 2,5 puta površine glavnog pika na kromatogramu poredbene otopine (a) (0,25%). Odbace se svi
pikovi površine manje od 0,25 puta površine glavnog pika na kromatogramu poredbene otopine (a).
Teški metali (2.4.8.)4. Otopi se 1,0 g ispitivane tvari u 12 mL acetona R i dopuni do 20 mL vodom R;
12 mL te otopine udovoljava ispitivanju graničnih vrijednosti (metoda B) za teške metale (20 ppm).
Pripremi se poredbena otopina olova (1 ppm Pb) na način da se razrijedi poredbena otopina olova
(100 ppm Pb) R smjesom koja sadrži 6 volumnih dijelova vode R i 9 volumnih dijelova acetona R.
Gubitak sušenjem (2.2.32.)5. Nije veći od 0,5%, što se odredi na 1,000 g ispitivane tvari sušenjem u
vakuumu.
Sulfatni ostatak (2.4.14.)6. Nije veći od 0,1%, što se odredi na 1,000 g ispitivane tvari.
1
Bistrina i stupanj zamućenja tekućina, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
2
Stupanj obojenosti tekućina, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
3
Tekućinska kromatografija, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
4
Teški metali, poglavlje u Ispitivanju graničnih vrijednosti (Limit tests), Ph. Eur.
5
Gubitak sušenjem, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
6
Sulfatni ostatak, poglavlje u Ispitivanju graničnih vrijednosti (Limit tests), Ph. Eur.
9
ODREĐIVANJE SADRŽAJA
U tikvici s čepom otopi se 1,000 g ispitivane tvari u 10 mL alkohola R. Doda se 50,0 mL 0,5 M
natrijeva hidroksida. Tikvica se začepi i ostavi stajati 1 sat. Uzme se 0,2 mL otopine fenolftaleina R
kao indikatora i titrira s 0,5 M klorovodičnom kiselinom. Izvede se i slijepi pokus.
1 mL 0,5 M natrijeva hidroksida odgovara 45,04 mg C9H8O4.
ČUVANJE
Čuva se u hermetičkom spremniku.
ONEČIŠĆENJA
HOOC R
OH
A. R = H: 4-hidroksibenzojeva kiselina;
B. R= COOH: 4-hidroksibenzen-1,3-dikarboksilna kiselina (4-hidroksiizoftalna kiselina);
C. salicilna kiselina;
COOH
O R
O
O
O O O CH 3
O
O
O CH 3
10
3.3. OPĆE UPUTE
Količine
U ispitivanjima graničnih vrijednosti, kao i u kvantitativnim analizama, naznačena je
približna količina tvari koja se uzima u ispitivanje. Stvarna se količina, koja može odstupati
najviše do 10% od navedene, precizno izvaže ili izmjeri, a rezultat se računa prema stvarnoj
količini. U ispitivanjima koja se temelje na usporedbi s poredbenom tvari u istim uvjetima
uzima se točno naznačena količina. Reagensi se koriste u propisanim količinama.
Količine se važu s točnošću koja odgovara naznačenom stupnju preciznosti. U slučaju
vaganja točnost odgovara ±5 jedinica nakon zadnje naznačene znamenke (primjerice, 0,25 g
znači 0,245 g − 0,255 g).
Pri mjerenju volumena, ako je znamenka nakon decimalnog zareza nula ili završava nulom
(na primjer, 10,0 mL ili 0,50 mL), volumen se mjeri pipetom, odmjernom tikvicom ili
biretom, već prema prikladnosti. Ako naznačeni volumen ne predstavlja decimalni broj,
koristi se menzura ili graduirana pipeta. Volumen izražen u mikrolitrima mjeri se
mikropipetom ili mikroštrcaljkom.
Aparature i postupci
Volumetrijsko stakleno posuđe odgovara A klasi zahtjeva odgovarajućeg međunarodnog
standarda koji propisuje Međunarodna organizacija za normiranje (International
Organisation for Standardisation, IOS).
Osim ako nije drugačije propisano, analitički postupci se izvode na temperaturi između 15 °C
i 25 °C.
Vodena kupelj
Izraz vodena kupelj podrazumijeva kupelj s kipućom vodom, osim ako nije navedena neka
druga temperatura vode. Mogu se koristiti i neki drugi načini zagrijavanja, ali se pri tome
mora paziti da temperatura ne prelazi 100 °C ili propisanu temperaturu.
11
Reagensi
Pravilna provedba analitičkih postupaka opisanih u farmakopeji, kao i pouzdanost dobivenih
rezultata, ovise jednim dijelom o kakvoći upotrebljavanih reagensa. Oznaka R uz naziv
supstancije u farmakopejskim monografijama označava reagens čiji su sastav i način pripreme
opisani u općem dijelu Europske farmakopeje. Broj uz oznaku R (R1, R2, itd.) označava
reagens koji se prema propisu priprema iz pripadajućeg reagensa R. Podrazumijeva se
korištenje reagensa analitičkog stupnja čistoće. Za neke se reagense u specifikaciju uključuju
ispitivanja njihove prikladnosti.
Otapala
Ako ime otapala nije navedeno, izraz otopina odnosi se na vodenu otopinu. U analitičkim
postupcima u kojima je navedeno korištenje vode za pripremu reagensa, voda treba
ispunjavati zahtjeve propisane u monografiji pročišćene vode. Izraz destilirana voda označava
vodu pročišćenu destilacijom. Voda bez ugljikova dioksida označava vodu prokuhanu
nekoliko minuta i zaštićenu od atmosferskog utjecaja tijekom hlađenja i čuvanja.
Izraz etanol bez opisa označava apsolutni etanol. Izraz alkohol bez opisa označava 96%
etanol. Druga razrjeđenja etanola označena su izrazom alkohol iza kojega slijedi volumni
postotak etanola.
Izražavanje sadržaja
Sadržaj se izražava u postocima kroz maseni udio (% m/m, broj grama tvari u 100 grama
uzorka) i volumni udio (% V/V, broj mililitara tvari u 100 mililitara uzorka).
Izraz milijunti dio (ppm) odnosi se na masu tvari u masi uzorka, osim ako nije drugačije
navedeno.
Temperatura
Ako je u analitičkom postupku navedena temperatura bez pobliže oznake, to općenito znači:
- u dubokom zamrzavanju: ispod − 15 °C
- u hladnjaku: od 2 °C do 8 °C
- hladno: od 8 °C do 15 °C
- sobna temperatura: od 15 °C do 25 °C.
Miris
Na satnom stakalcu promjera od 6 cm do 8 cm rasporedi se u tankom sloju 0,5 g do 2,0 g
ispitivane tvari. Nakon 15 minuta odredi se miris ili potvrdi odsutnost mirisa.
12
4. IDENTIFIKACIJA
13
Neka ispitivanja čistoće u monografijama mogu biti namijenjena i potvrdi identiteta pa se u
tim slučajevima upućuje na podatke u poglavlju Ispitivanja (Tests), primjerice, kada
razlikovanje dviju sličnih supstancija ovisi o svojstvima koja se ispituju u kontroli čistoće
(sadržaj vode u različitim hidratima, optičko zakretanje različitih izomera ili viskoznost
homologa polimera i dr.).
ACETATI
a) Ispitivana tvar se zagrije s jednakom količinom oksalne kiseline R. Oslobađaju se
kisele pare karakterističnog mirisa octene kiseline koje daju kiselu reakciju1.
b) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 3 mL vode R ili se upotrijebi 3
mL propisane otopine. Postupno se dodaje 0,25 mL otopine lantanova nitrata R, 0,1
mL 0,05 M otopine joda i 0,05 mL razrijeđene otopine amonijaka R2. Pažljivo se
zagrije do vrenja. U idućih nekoliko minuta nastane plav talog ili tamnoplava boja.
Zbog adsorpcije joda na bazični lantanov acetat, soli lantana s jodom i acetatima
stvaraju tamnoplav talog ili boju u pH području od 9 do 11.
1
Odnos između reakcije otopine približnog pH i boje odgovarajućih indikatora, poglavlje u Fizikalnim
i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
Ukoliko nije drugačije propisano, u 10 mL ispitivane otopine doda se 0,1 mL otopine indikatora i
promatra boja (Tablica 2).
Tablica 2. Izbor prikladnog indikatora za ispitivanje kiselina.
14
ACETIL
U epruvetu se doda 15 mg ispitivane tvari ili propisana količina tvari i 0,15 mL fosforne
kiseline R. Epruveta se zatvori čepom kroz čiju sredinu prolazi mala epruveta koja sadrži vodu
R te služi kao hladilo. Na vanjski dio male epruvete nanese se kap otopine lantanova nitrata
R. Osim za tvari koje teško podliježu hidrolizi, aparatura se uroni u vodenu kupelj 5 minuta te
se potom izvadi manja epruveta. Kap se ukloni i pomiješa s 0,05 mL 0,01 M otopine joda R
na satnom staklu. Uz rub satnog stakla doda se 0,05 mL razrijeđene otopine amonijaka R2.
Nakon 1 do 2 minute razvije se plava boja na mjestu dodira dviju kapi. S vremenom boja
postaje intenzivnija i ostaje postojana kratko vrijeme. Za tvari koje teško podliježu hidrolizi
smjesa se polagano grije do vrenja iznad otvorenog plamena, te se dalje postupa kako je
navedeno u propisu.
ALKALOIDI
Otopi se nekoliko miligrama (vrh špatule) ispitivane tvari ili propisana količina tvari u 5 mL
vode R, doda razrijeđena klorovodična kiselina R do kisele reakcije otopine1 i 1 mL otopine
kalijeva tetrajodobizmutata R. Odmah nastaje narančast ili narančastocrven talog.
ALUMINIJ
Otopi se oko 15 mg ispitivane tvari u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL propisane otopine.
Doda se oko 0,5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R i oko 0,5 mL tioacetamidnog reagensa
R. Ne nastane talog. Doda se nekoliko kapi razrijeđene otopine natrijeva hidroksida R. Nastane
bijel želatinozan talog koji se otapa nakon što se doda razrijeđena otopina natrijeva hidroksida
R. Postupnim dodavanjem otopine amonijeva klorida R ponovo nastane bijel želatinozan talog.
1
Odnos između reakcije otopine približnog pH i boje odgovarajućih indikatora, vidjeti: Identifikacija,
Acetati.
15
Ar-NH2 + NaNO2 + 2 HCl (Ar-N N) Cl + NaCl + 2 H2O
N=N-Ar
OH OH
+ (Ar-N N) Cl + NaOH + HCl + H2O
AMONIJEVE SOLI
Propisanoj otopini doda se mala količina (vrh špatule) magnezijeva oksida R. Na otvor
epruvete stavi se filtar papir navlažen smjesom koja se sastoji od 1 mL 0,1 M otopine
klorovodične kiseline i 0,05 mL otopine metilnog crvenila R. Boja indikatora mijenja se u
žutu. Kad se zatim u otopinu doda 1 mL svježe pripremljene otopine natrijeva
heksanitrokobaltata(III) R (100 g/L), nastane žut talog.
2 NH4+ + Na3[Co(NO2)6] → (NH4)2Na[Co(NO2)6] + 2 Na+
ANTIMON
Blagim zagrijavanjem otopi se oko 10 mg ispitivane tvari u otopini dobivenoj otapanjem 0,5 g
natrijeva kalijeva tartarata R u 10 mL vode R, te se ostavi hladiti. U 2 mL te otopine ili
1
Odnos između reakcije otopine približnog pH i boje odgovarajućih indikatora, poglavlje u Fizikalnim
i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
Ukoliko nije drugačije propisano, u 10 mL ispitivane otopine doda se 0,1 mL otopine indikatora i
promatra boja (Tablica 3).
Tablica 3. Izbor prikladnog indikatora za ispitivanje lužina.
16
u 2 mL propisane otopine doda se nekoliko kapi otopine natrijeva sulfida R. Nastane
narančastocrven talog koji se otapa u razrijeđenoj otopini natrijeva hidroksida R.
2 Sb3+ + 3 S2- → Sb2S3
Sb2S3 + 2 OH- → [SbS2]- + [SbOS]- + H2O
ARSEN
Zagrije se 5 mL propisane otopine na vodenoj kupelji s jednakim volumenom hipofosfornog
reagensa R. Nastane smeđ talog.
H H H
O O
O N O N L L N
2 + Co2+ + 4 CH3OH O N Co N O
R1 N
H R1 L L R1
R2
O R2 O O R2
L = CH3OH
BENZOATI
a) U 1 mL propisane otopine doda se 0,5 mL otopine željezova(III) klorida R1. Nastane
tamnožut talog.
7 C6H5COO- + 3 Fe3+ + 2 OH- → Fe3[(C6H5COO)6(OH)2]C6H5COO
b) U epruvetu se stavi mala količina ispitivane tvari (vrh špatule), prema potrebi prethodno
obrađene u skladu s propisom. Navlaži se s 0,2 mL do 0,3 mL razrijeđene sumporne kiseline
R. Lagano se zagrije dno epruvete. Na unutrašnjoj stijenci epruvete nastane bijel sublimat.
c) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Dodatkom nekoliko kapi klorovodične kiseline R nastane talog.
17
BIZMUT
a) U malu količina ispitivane tvari (vrh špatule) doda se 2 mL razrijeđene klorovodične
kiseline R ili se upotrijebi 2 mL propisane otopine. Zagrije se do vrenja i nastavi grijati 1
minutu. Ohladi se i filtrira ako je potrebno. U 1 mL dobivene otopine doda se 20 mL
vode R. Nastane bijel ili svijetložut talog koji postane smeđ kad se doda 0,05 mL do 0,1
mL otopine natrijeva sulfida R.
2 Bi3+ + 3 S2- → Bi2S3
b) U malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) doda se 2 mL razrijeđene dušične kiseline
R ili se upotrijebi 2 mL propisane otopine. Zagrije se do vrenja i nastavi grijati 1 minutu.
Ohladi se i filtrira ako je potrebno. U otopinu (filtrat) doda se 0,5 mL otopine tiouree R
(100 g/L). Nastane žućkastonarančasta boja ili narančast talog. Doda se 1 mL otopine
natrijeva fluorida R (25 g/L). Otopina se neće obezbojiti idućih 30 minuta.
Bi3+ + 3 SC(NH2)2 → [Bi(SC(NH2)2)3]3+
BROMIDI
a) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Zakiseli se razrijeđenom dušičnom kiselinom R i doda 0,4 mL otopine
srebrova nitrata R1. Protrese se i ostavi stajati. Nastane gust svijetložut talog. Postupak se
izvodi što je brže moguće pri slabom svjetlu, pri čemu otopina iznad taloga može biti mutna.
Br- + Ag+ → AgBr
b) U epruvetu se stavi mala količina ispitivane tvari (vrh špatule), doda 0,25 mL vode R,
mala količina (vrh špatule) olovova(IV) oksida R te 0,25 mL octene kiseline R i lagano
protrese. Osuši se gornji unutrašnji dio epruvete filtar papirom i ostavi stajati 5 minuta.
Pripremi se traka filtar papira odgovarajuće veličine. Filtar papir impregnira se uranjanjem
njegova vrha u kap bezbojene otopine fuksina R i odmah potom uroni u epruvetu. U idućih
10 sekundi pri vrhu epruvete može se opaziti ljubičasta boja koja se znatno razlikuje od
crvene boje fuksina, vidljive na malom području na vrhu impregniranog dijela filtar papira.
Br
NH2
Br
Br R = CH3
+
H2N R = Br
Br
R
NH2
Br
18
CINK
Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 0,1 mL otopine koncentriranog natrijeva hidroksida R. Nastane
bijel talog. Nakon što se ponovo doda 1 mL otopine koncentriranog natrijeva hidroksida R,
talog se otapa. Potom se doda 5 mL otopine amonijeva klorida R. Otopina ostane bistra.
Nakon dodatka 0,1 mL otopine natrijeva sulfida R nastane pahuljast bijel talog.
Zn2+ + 2 OH- → Zn(OH)2
Zn(OH)2 + 2 OH- → [Zn(OH)4]2-
[Zn(OH)4]2- + 4 NH4+ → [Zn(NH3)4]2+ + 4 H2O
Zn2+ + S2- → ZnS
CITRATI
U 5 mL vode R otopi se količina ispitivane tvari koja odgovara masi od oko 50 mg limunske
kiseline (vrh špatule) ili se upotrijebi 5 mL propisane otopine. Doda se 0,5 mL sumporne
kiseline R i 1 mL otopine kalijeva permanganata R. Otopina se grije do obezbojenja
permanganata. Doda se 0,5 mL otopine natrijeva nitroprusida R (100 g/L) u razrijeđenoj
sumpornoj kiselini R i 4 g sulfamske kiseline R. Zaluži se dodatkom nekoliko kapi
koncentriranog amonijaka R, dok se sulfamska kiselina potpuno ne otopi. Kad se doda
koncentrirani amonijak R u suvišku, nastane ljubičasta boja koja prelazi u ljubičastoplavu.
CH2-COOH CH2-COOH CH3
oksidacija
HO-C-COOH O=C O=C
- CO2 - 2 CO2
CH2-COOH CH2-COOH CH3
ESTERI
U malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule ili 0,1 mL ispitivane otopine) doda se 0,5 mL
otopine hidroksilamin hidroklorida R (70 g/L) u metanolu R i 0,5 mL otopine kalijeva
hidroksida R (100 g/L) u alkoholu R. Zagrije se do vrenja, ohladi i zakiseli razrijeđenom
klorovodičnom kiselinom R. Tome se doda 0,2 mL deset puta razrijeđene otopine
željezova(III) klorida R1. Nastane plavkastocrvena ili crvena boja.
NHOH
RCOOR' + H2N-OH RC + R'OH
O
19
NHOH NHO
3 RC + Fe3+ RC Fe + 3 H+
O O
3
FOSFATI (ORTOFOSFATI)
a) U 2 mL propisane otopine, prema potrebi neutralizirane, doda se 2 mL otopine srebrova
nitrata R1. Nastaje žuti talog čija se boja ne mijenja zagrijavanjem, a otapa se dodatkom
amonijaka R. Nastane žut talog.
2 HPO42- + 3 Ag+ → Ag3PO4 + H2PO4-
b) Pomiješa se 0,5 mL propisane otopine s 1 mL molibdovanadijeva reagensa R. Nastane
žuta boja.
7 HPO42- + 10 Mo7O246- + 14 VO3- + 35 NH4+ + 53 H+ → 7 (NH4)5[PV2Mo10O40] + 30 H2O
JODIDI
a) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Zakiseli se razrijeđenom dušičnom kiselinom R i doda 0,4 mL otopine
srebrova nitrata R1. Protrese se i ostavi stajati. Nastane grudičast blijedožut talog.
Postupak se izvodi što je brže moguće i pri slabom svjetlu, pri čemu otopina iznad taloga
može biti mutna.
I- + Ag+ → AgI
b) U 0,2 mL propisane otopine doda se 0,5 mL razrijeđene sumporne kiseline R, 0,1 mL
otopine kalijeva dikromata R, 1 mL vode R i 1 mL kloroforma R. Mućka se nekoliko
sekundi i ostavi stajati. Sloj kloroforma oboji se ljubičasto ili ljubičastocrveno.
6 I- + Cr2O72- + 14 H+ → 3 I2 + 2 Cr3+ + 7 H2O
KALCIJ
a) U 0,2 mL neutralne propisane otopine doda se 0,5 mL otopine glioksal-hidroksianila R u
alkoholu R (2 g/L), 0,2 mL razrijeđene otopine natrijeva hidroksida R i 0,2 mL otopine
natrijeva karbonata R. Promućka se s 1 mL kloroforma R i doda 1 mL vode R. Sloj
kloroforma oboji se u crveno.
H H
O
OH HO O O
2 H2O
+ Ca2+ Ca + 2 H+
N N N N
O
20 H H
b) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 2 mL octene kiseline R. Doda se 0,5
mL otopine kalijeva heksacijanoferata(II) R. Otopina ostane bistra. Doda se mala količina
(vrh špatule) amonijeva klorida R. Nastane bijel kristaliničan talog.
Ca2+ + [Fe(CN)6]4- + 2 NH4+ → (NH4)2[CaFe(CN)6]
KALIJ
a) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 1 mL otopine natrijeva karbonata R i zagrije. Ne nastane
talog. U vruću otopinu se doda 0,05 mL otopine natrijeva sulfida R. Ne nastane talog.
Ohladi se u ledenoj vodi i doda 2 mL otopine vinske kiseline R (150 g/L). Stajanjem
nastane bijel kristaliničan talog.
K+ + HOOC(CHOH)2COOH → KOOC(CHOH)2COOH + H+
b) Otopi mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 1 mL vode R ili se upotrijebi 1 mL
propisane otopine. Doda se 1 mL razrijeđene octene kiseline R i 1 mL svježe pripremljene
otopine natrijeva heksanitrokobaltata(III) R (100 g/L). Odmah nastane žut ili
narančastožut talog.
2 K+ + Na3[Co(NO2)6] → K2Na[Co(NO2)6] + 2 Na+
KARBONATI I HIDROGENKARBONATI
Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) pomiješa se s 2 mL vode R u aparatiću za
razvijanje plinova ili se upotrijebi 2 mL propisane otopine. Doda se 2 mL razrijeđene octene
kiseline R. U otopini ili suspenziji nastaju mjehurići i oslobađa se plin bez boje i mirisa.
Dobiveni plin se uvodi u 3 mL otopine barijeva hidroksida R. Nastane bijel talog koji se
otapa dodatkom klorovodične kiseline R1 u suvišku.
CO32- + 2 H+ → CO2 + H2O
Ba(OH)2 + CO2 → BaCO3 + H2O
KLORIDI
a) U 2 mL vode R otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Zakiseli se razrijeđenom dušičnom kiselinom R i doda 0,4 mL otopine
srebrova nitrata R1. Promućka se i ostavi stajati. Nastane grudičast bijel talog. Postupak se
izvodi što je brže moguće i pri slabom svjetlu, pri čemu otopina iznad taloga može biti zamućena.
Cl- + Ag+ → AgCl
21
b) U epruvetu se stavi količina ispitivane tvari koja odgovara masi od oko 15 mg klorida
(Cl-) ili propisana količina tvari. Doda se 0,2 g kalijeva dikromata R i 1 mL sumporne
kiseline R. Na otvor epruvete stavi se traka filtar papira impregnirana s 0,1 mL otopine
difenilkarbazida R. Traka filtar papira poprimi ljubičastocrvenu boju. Impregnirani papir
ne smije doći u dodir s kalijevim dikromatom.
H H
N N N N
O + Cr6+ O + Cr3+ + 2 H+
N N N N
H H H H
KSANTINI
U malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) doda se 0,1 mL otopine koncentriranoga
vodikova peroksida R i 0,3 mL razrijeđene klorovodične kiseline R. Grije se u porculanskom
lončiću do žutocrvenog suhog ostataka. Doda se 0,1 mL razrijeđenog amonijaka R2. Boja
ostatka mijenja se u ljubičastocrvenu.
O H O O
OH
H N H H
2 N H2O2, HCl N O N
O N N
O N O O N O
H H H
NH3
O O
H H
N N N
NH4+
O N O -O N O
H H
LAKTATI
Količina ispitivane tvari koja odgovara masi od oko 5 mg mliječne kiseline otopi se u 5 mL
vode R ili se upotrijebi 5 mL propisane otopine. Doda se 1 mL bromne vode R i 0,5 mL
razrijeđene sumporne kiseline R. Grije se na vodenoj kupelji do obezbojenja uz povremeno
miješanje staklenim štapićem. Doda se 4 g amonijeva sulfata R i promiješa. Potom se bez
miješanja doda kap po kap 0,2 mL otopine natrijeva nitroprusida R (100 g/L) u razrijeđenoj
22
sumpornoj kiselini R. Zatim se bez miješanja doda 1 mL koncentriranog amonijaka R. Ostavi
se stajati 30 minuta. Na dodirnoj površini dviju tekućina nastane tamnozelen prsten.
CH3 CH3
Br2 H
HO-CH O=C H3C-C=O
- CO2
COOH COOH
CH3COCH3 + [Fe(CN)5NO]2- + 2 OH- [Fe(CN)5ON=CHCOCH3]4- + H2O
MAGNEZIJ
Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 1 mL razrijeđenog amonijaka R1. Nastane bijeli talog koji se
otapa dodatkom 1 mL otopine amonijeva klorida R. Doda se 1 mL otopine dinatrijeva
hidrogenfosfata R. Nastane bijel kristaliničan talog.
Mg2+ + HPO4 2- + NH4+ → MgNH4PO4 + H+
NATRIJ
a) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 2 mL otopine kalijeva karbonata R (150 g/L) i zagrije do
vrenja. Ne nastane talog. Potom se doda 4 mL otopine kalijeva heksahidrokso-
antimonata(V) R i zagrije do vrenja. Ostavi se hladiti u ledenoj vodi. Ukoliko je potrebno,
staklenim štapićem se trlja po unutrašnjoj stijenci epruvete. Nastane gust bijel talog.
b) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 0,5 mL vode R ili se upotrijebi 0,5
mL propisane otopine. Doda se 1,5 mL metoksifenilacetatnog reagensa R i hladi u ledenoj
vodi 30 minuta. Nastane voluminozan bijel kristaliničan talog. Potom se stavi u vodu na
20 °C i miješa 5 minuta. Talog ne nestane. Doda se 1 mL razrijeđenog amonijaka R1.
Talog se potpuno otopi. Nakon dodavanja 1 mL otopine amonijeva karbonata R ne
nastane talog.
Na+ + 2 C6H5CH(OCH3)COOH→ [C6H5CH(OCH3)COONa × C6H5CH(OCH3)COOH] + H+
NITRATI
Smjesi od 0,1 mL nitrobenzena R i 0,2 mL sumporne kiseline R doda se količina praškaste
tvari koja odgovara masi od 1 mg nitrata (NO3-) ili propisana količina otopine. Nakon 5
minuta stajanja ohladi se u ledenoj vodi i polako doda 5 mL vode R uz miješanje i zatim 5 mL
23
otopine koncentriranoga natrijeva hidroksida R. Doda se 5 mL acetona R, protrese i ostavi
stajati. Gornji se sloj oboji tamnoljubičasto.
NO2 NO2
O
OH-
+ HNO3 + H3C-C-CH3
NO2
O
H3C-C-CH2 NO2 O NO2
H
oks H3C-C-C
H
O O
N N
O O
OLOVO
a) Otopi se 0,1 g ispitivane tvari u 1 mL octene kiseline R ili se upotrijebi 1 mL propisane
otopine. Doda se 2 mL otopine kalijeva kromata R. Nastane žut talog koji se otapa
dodatkom 2 mL otopine koncentriranoga natrijeva hidroksida R.
Pb2+ + CrO42- → PbCrO4
SALICILATI
a) U 1 mL propisane otopine doda se 0,5 mL otopine željezova(III) klorida R1. Nastane
ljubičasta boja koja se ne mijenja ni nakon dodavanja 0,1 mL octene kiseline R.
3 C6H4(OH)COO- + Fe3+ → [Fe(C6H4(O)COO)3]3- + 3 H+
b) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Dodatkom 0,5 mL klorovodične kiseline R nastane talog.
SILIKATI
Propisana količina ispitivane tvari pomiješa se bakrenom žicom u olovnom ili platinastom
lončiću za žarenje s oko 10 mg natrijeva fluorida R i nekoliko kapi sumporne kiseline R, pri
čemu nastane tanak sloj guste tekućine. Lončić se pokrije tankom, prozirnom, plastičnom
24
pločom na čijoj se donjoj površini nanese kap vode R, te se blago zagrije. Unutar kratkog
vremena nastane bijel prsten oko kapi vode.
4 HF + SiO2 → SiF4 + 2 H2O
3 SiF4 + n H2O → SiO2(H2O)n-2 + 2 H2[SiF6]
SREBRO
Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 0,1 mL klorovodične kiseline R1. Nastane grudičast bijel talog
koji se otapa dodatkom 1 mL razrijeđenog amonijaka R1.
Ag+ + Cl- → AgCl
SULFATI
a) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 0,5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R i 0,5 mL otopine
barijeva klorida R1. Nastane bijel talog.
SO42- + Ba2+ → BaSO4
b) Smjesi dobivenoj u postupku a) doda se 0,1 mL 0,05 M otopine joda R. Smjesa ostane
žute boje (razlučna reakcija od sulfita i ditionita) i obezboji se dodatkom nekoliko kapi
otopine kositrova klorida R (razlučna reakcija od jodata). Smjesa se zagrije do vrenja. Ne
nastane obojen talog (razlučna reakcija od selenata i volframata).
TARTARATI
a) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R ili se upotrijebi 2 mL
propisane otopine. Doda se 0,05 mL otopine željezova(II) sulfata R (10 g/L) i 0,05 mL
razrijeđene otopine vodikova peroksida R. Nastane prolazna žuta boja. Nakon nestanka
boje doda se nekoliko kapi otopine razrijeđenoga natrijeva hidroksida R. Nastane
intenzivna plava boja.
Br2
Br Br
HO OH+
Br Br
OH O
O
ŽELJEZO
a) Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 1 mL vode R ili se upotrijebi 1 mL
propisane otopine. Doda se 1 mL kalijeva heksacijanoferata(III) R. Nastane plavi talog
koji se ne otapa dodatkom 5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R.
3 Fe2+ + 2 [Fe(CN)6]3- → Fe3[Fe(CN)6]2
c) Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 1 mL vode R ili se upotrijebi 1 mL
propisane otopine. Doda se 1 mL otopine kalijeva heksacijanoferata(II) R. Nastane plav
talog koji se ne otapa dodatkom 5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R.
4 Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4- → Fe4[Fe(CN)6]3
ŽIVA
a) Stavi se oko 0,1 mL ispitivane otopine na bakrenu foliju. Nastane tamnosiva mrlja koja
trljanjem postane sjajna. Folija se osuši i zagrije u epruveti. Mrlja nestane.
b) Propisanoj otopini doda se otopina razrijeđenoga natrijeva hidroksida R do jako lužnate
reakcije. Nastane čvrst žut talog.
Hg2+ + 2 NaOH → HgO + 2 Na+ + H2O
26
4.2. INFRACRVENA APSORPCIJSKA SPEKTROFOTOMETRIJA
27
Tehnike pripreme uzorka
Za snimanje infracrvenog apsorpcijskog spektra tvari tehnika pripreme uzorka ovisi o
agregatnom stanju uzorka.
Tekućine
Tekući se uzorak pripremi u obliku filma između dviju pločica od materijala koji propušta
infracrveno zračenje (pločice NaCl ili KCl) ili u kiveti prikladne debljine (optički put 0,02-0,1
mm) i načinjene od NaCl, AgCl, ZnSe ili CaF2.
Krutine
a) Kruti uzorak se izmiješa s praškastim i osušenim kalijevim bromidom ili kalijevim
kloridom. Ukoliko nije drugačije propisano, pomiješa se 1 mg do 2 mg ispitivane tvari s 300
mg do 400 mg fino usitnjenog kalijeva bromida ili kalijeva klorida. Te su količine obično
dostatne za izradu pločica promjera 13 mm i za dobivanje spektra zadovoljavajućeg
intenziteta. Smjesa se pažljivo homogenizira, prenese i jednoliko rasporedi u odgovarajući
kalup, te preša pod vakuumom primjenom tlaka od 800 MPa. Nekoliko čimbenika može
uzrokovati nastanak neodgovarajućih pločica, primjerice, nedovoljno ili predugo
homogeniziranje, vlažnost ili druga onečišćenja disperzijskog sredstva ili nedovoljna
usitnjenost čestica. Pločica nije dobro pripremljena ako vizualno ispitivanje pokazuje
nejednaku prozirnost ili ako je transmisija na približno 2000 cm-1 u odsutnosti specifične
apsorpcijske vrpce manja od 75%.
b) Kruti uzorak se pomiješa s tekućim parafinom ili kojim drugim propisanim otapalom u
homogenu smjesu. Obično je dovoljno upotrijebiti 5 mg do 10 mg ispitivane tvari. Suspenzija
se nanese između dviju pločica NaCl propusnih za infracrveno zračenje te u obliku vrlo
tankog filma. Tekući parafin (Nujol) apsorbira u području oko 3000 cm-1 i 1400-1500 cm-1.
Uzorci se pripreme s tekućim parafinom u ispitivanjima različitih polimorfnih oblika.
28
Identifikacija pomoću poredbene tvari
Ispitivana i poredbena tvar se pripreme na isti način, snime im se spektri pod istim uvjetima
između 4000 cm-1 i 670 cm-1, te se međusobno usporede. Apsorpcijski maksimumi spektra
ispitivane tvari moraju položajem i intenzitetom odgovarati apsorpcijskim maksimumima
poredbene tvari. IR-spektri mogu pokazivati razlike i kada se radi o istim tvarima ukoliko one
dolaze u različitim kristalnim oblicima. Stoga, ako se spektri ispitivane i poredbene krute tvari
razlikuju u položaju apsorpcijskih maksimuma, potrebno je prekristalizirati ispitivanu i
poredbenu tvar na isti način, ili postupati kako je propisano u monografiji, te zatim ponovo
snimiti i usporediti spektre. Na taj se način odbacuju mogući uzroci razlikovanja spektara
zbog različitih polimorfnih oblika.
29
Primjeri
Identifikacija askorbinske kiseline
Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom askorbinske kiseline CRS. Uzorak se pripremi u
obliku pločice koja sadrži 1 mg ispitivane tvari.
Identifikacija cimetidina
Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom cimetidina CRS. Ako spektar čvrste tvari pokazuje
razlike u odnosu na poredbenu tvar, odvojeno se otope ispitivana i poredbena tvar u 2-
propanolu R, upare do suha i ponovo snime spektri.
Interpretacija IR-spektra
Infracrveni spektri molekula lijekova obično su previše složeni za cjelokupnu analizu pa se
odabiru i tumače samo karakteristične apsorpcijske vrpce (Slika 1). Korisni podaci mogu se
dobiti iz apsorpcijskih vrpci karakterističnih za pojedine funkcionalne skupine. Utvrđivanje
svojstvenih skupinskih frekvencija provodi se usporedbom infracrvenih spektara velikog
broja spojeva. U prvoj fazi analize IR-spektara odrede se položaji i intenziteti karakterističnih
apsorpcijskih vrpci. Iz tablica1,2,3 karakterističnih infracrvenih apsorpcijskih vrpci utvrdi se
kojim funkcionalnim skupinama i vrstama vibracija odgovaraju određene vrpce u molekulama
lijekova (Tablica 5). Pri tome se osobito pažljivo analizira dio infracrvenog spektra koji se
1
E. Pretsch, T. Clerc, J. Seibl, W. Simon, Tablice za određivanje strukture organskih spojeva spektroskopskim
metodama, SKTH/Kemija u industriji, Zagreb, 1982.
2
R. M. Silverstein, Spectrometric Identification of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York,
1998.
3
K. Nakanishi, P. H. Solomon, Infrared Absorption Spectroscopy, Emerson Adams Pr Inc., Boca Raton, 1998.
30
naziva područje funkcionalnih skupina. Taj je dio spektra (od 3600 cm-1 do 1500 cm-1)
koristan za određivanje prisutnosti značajnih funkcionalnih skupina molekula lijekova.
Prisutnost određene apsorpcijske vrpce u području funkcionalnih skupina gotovo je uvijek
značajna naznaka prisutnosti pojedine funkcionalne skupine u ispitivanoj molekuli lijeka.
Izostanak signala u nekom svojstvenom dijelu tog područja znači da nije prisutna skupina
koja bi u njemu trebala apsorbirati.
U području ispod 1500 cm-1 pojavljuje se velik broj vrpci uslijed rastezanja jednostrukih veza
C-C, C-N, C-O, C-halogen te maksimuma koji odgovaraju deformacijskim vibracijama
molekule. Obično je prisutno previše vrpci te ih nije moguće pouzdano pripisati određenim
vrstama vibracija. Jednostruke su veze istog reda čvrstoće i obično su vezane kumulativno,
što je posljedica šireg područja pojavljivanja apsorpcijskih maksimuma i velike osjetljivosti
položaja maksimuma, čak i na vrlo male promjene u strukturi. Ovo područje IR-spektra koje
ocrtavaju sve vrpce zajedno, karakteristično je za određeni spoj pa se zove područje otiska
prsta (engl. fingerprint), jer svaki spoj ima svoju specifičnu sliku.
ν (cm-1)
3400 i 3500 primarni amini R−NH2 Primarni amini daju dvije vrpce.
Ar−NH2
3310-3350 sekundarni amini R−NH−R Sekundarni amini pokazuju jednu vrpcu.
3450 Ar−NH−R
3490 Piroli, indoli Prilično oštra i karakteristična vrpca.
3300-3400 C=NH
3030-3300 −NH4+ Amonijeve soli
3000 −NH3+ Široka, jaka vrpca.
3400 i 3500 −CONH2 Amidi
Amidi pokazuju vrlo oštre apsorpcije. Primarni amidi
3300-3440 −CONHR− daju dvije razdvojene vrpce.
3150 S
C N Tioureidi (tiolaktami)
3250-3340 ≡C−H Acetilenska skupina
Jaka, oštra vrpca.
3010-3100 =C−H Alkeni (aromatska i etenska)
Srednja, često više vrpci.
2840-2950 Alkani
C H Intenzitet promjenjiv, često više vrpci.
2500-3550 O Karboksilna kiselina
C OH Asocirana COOH, široka vrpca, često više vrpci.
2720-2830 −HC=O Aldehidi
Često dvije vrpce kod 2720 cm-1 i 2820 cm-1.
2550-2600 − S− H Tioli
Slabija od OH vrpce.
2350-2440 − P− H Oštra vrpca srednjeg intenziteta.
32
3. Područje dvostruke veze
ν,cm -1
Kromofor Opaska
Karbonilne skupine
Jake vrpce. Konjugacija smanjuje valni broj za 30-50
1800-1850 i O O cm-1.
1740-1790 R C O C R Kiselinski anhidridi
O Pojavljuju se dvije vrpce razmaknute za 60 cm-1.
1770-1820 R C X Kiselinski halogenidi
O
1730-1770 R C OR Esteri
O
1710-1760 R C OH Karboksilne kiseline
O
1690-1730 R C H Aldehidi
O
1705-1725 R C R Ketoni
O Amidi – C=O rastezna vibracija (Amid I).
1650-1690 R C N Pokazuju još jaku vrpcu na 1530-1630 cm-1 uslijed
N−H deformacijske vibracije (Amid II).
O H O
1670-1740 R C N C R Imidi
H O H
1660 R N C N R Ureidi
O
1690-1740 R O C N Uretani
Ciklički karbonili
~1840 4-člani prsten
~1770 C O Laktoni 5-člani prsten
~1735 O 6-člani prsten
~1775 4-člani prsten
~1750 C O Ketoni 5-člani prsten
~1715 6-člani prsten
a) 1,2-kinon
1675 a) O b) O O b) 1,4-kinon
O
~1745 4-člani prsten
C O Laktami 5-člani prsten
~1700
~1650 N 6-člani prsten
O Heterociklički spojevi
1560-1610 Furan
1475-1510
H
1560-1590 N Pirol
1500-1540
1515-1535 S Tiofen
1410-1455
33
3. Područje dvostruke veze (nastavak)
ν,cm -1
Kromofor Opaska
Ostale dvostruke veze
1635-1680 C C Alkeni – slaba vrpca pri visokoj simetriji, jaka pri N-C=C
i O-C=C.
1550-1660 i O
N Nitro-spojevi – jake vrpce.
1260-1390 O
1500-1585 C N O Nitrozo-spojevi – vrlo jake vrpce.
1430-1500 N N O
1610-1680 O N O
1650-1685 C N OH Oksimi
1400-1500 N N Azo-spojevi
4. Supstituirani aromati
690-710 i Monosupstituirani benzen
730-770
735-770 Orto-disupstituirani benzen
680-725,
750-810 i Meta-disupstituirani benzen
860-900
690-730,
800-860 i Asim-trisupstituirani benzen
860-900
685-720 i tri susjedna H Vic-trisupstituirani benzen
770-800
840-900 izolirani H Pentasupstituirani benzen
34
5. Područje jednostruke veze
ν,cm -1
Kromofor Opaska
Većina jakih apsorpcijskih vrpci jednostrukih veza
smještena je u području otiska prsta.
Alkoholi i fenoli
1050-1260 Vibracije C–O rastezanja Jaka vrpca, često dublet.
1050 –CH2–OH
1100 CH OH
1150 C OH
1200 aromatski C–OH
1250-1400 O–H deformacijske vibracije Srednja apsorpcijska vrpca.
O
1180-1300 R C O Esteri
~1185 viši alifatski esteri Dvije vrpce: vrlo jaka pri višem valnom broju asimetričnog
~1240 acetati rastezanja i jaka pri nižem valnom broju simetričnog
vinilesteri i fenolesteri rastezanja.
~1210
~1180 γ– i δ–laktoni
1050-1270 C O C Eteri
Jaka, ponekad rascijepljena vrpca asimetričnog rastezanja.
1070-1150 alifatski i ciklički eteri
1200-1275 =C–O–C
Ketali i acetali
1040-1200 C–O–C–O–C Grupa od 4 do 5 apsorpcijskih vrpci.
Peroksidi
1100-1200 C–O–O Jaka, oko 20 cm-1 niže nego za odgovarajuće alkohole.
Kiselinski anhidridi
900-1050 C–O–C Jaka, u lancima ~1040 cm-1, u prstenima ~920 cm-1.
O Amidi
1260-1300 R C NH R Apsorpcijska vrpca C–N rastezne vibracije (Amid III).
Alifatski amini
1150-1250 C N Dvije vrpce kod tercijarnih amina.
500-750 C X Alkil-halogenidi
35
4.3. ULTRALJUBIČASTA I VIDLJIVA APSORPCIJSKA SPEKTROFOTOMETRIJA
T = I /I0 ,
I0 − intenzitet ulaznog monokromatskog svjetla,
I − intenzitet izlaznog monokromatskog svjetla.
Izmjerena apsorbancija (A) proporcionalna je duljini puta svjetlosti kroz otopinu (b) i
koncentraciji (c) tvari u otopini, sukladno Beerovom zakonu:
A=ε×c×b
1%
U farmakopejskim monografijama koristi se izraz A1cm koji predstavlja specifičnu
36
provodi usporedbom valne duljine maksimuma apsorpcije (λmax) ili specifične apsorbancije
1%
( A1cm ) ispitivane tvari s propisanim vrijednostima u monografiji.
λ (nm)
37
odstupanja specifične apsorbancije ovisi o izmjerenoj apsolutnoj vrijednosti apsorbancije.
Kada je u spektru prisutno više od jednog maksimuma, omjeri njihovih apsorbancija mogu se
zamijeniti određivanjem specifične apsorbancije.
Instrument
Spektrofotometar prikladan za mjerenje u ultraljubičastom i vidljivom području spektra sadrži
optički sustav za stvaranje monokromatskog svjetla od 200 nm do 800 nm i odgovarajući
detektor za mjerenje apsorbancije. Ispravnost instrumenta ispituje se kalibracijom skale valnih
duljina i apsorbancije.
Kontrola apsorbancije
Skala apsorbancije provjerava se mjerenjem apsorbancije otopine kalijeva dikromata R.
Točne vrijednosti specifičnih apsorbancija na određenim valnim duljinama i dozvoljene
granice odstupanja navedene su u Tablici 6. Dopušteno odstupanje apsorbancije je ±0,01.
Za kontrolu apsorbancije koristi se otopina kalijeva dikromata pripremljena tako da se 57,0
mg do 63,0 mg kalijeva dikromata R, prethodno osušenog do konstantne mase na 130 oC,
otopi u 0,005 M sumpornoj kiselini i dopuni istom kiselinom do 1000,0 mL. Apsorbancije
otopine kalijeva dikromata, koja sadrži točno 60,06 mg K2Cr2O7 u 1000,0 mL 0,005 M
sumporne kiseline kroz duljinu sloja od 1 cm, navedene su u Tablici 6.
38
Razlučivanje
U nekim slučajevima identifikacije pomoću apsorpcijskih spektara u UV-Vis području,
razlučivanje instrumenta može biti kritičan čimbenik u dobivanju traženih spektralnih
značajki. Razlučivanje spektrofotometra kontrolirano je širinom pukotine. Kada je u
monografiji propisano minimalno potrebno razlučivanje za kvalitativnu analizu, širina
pukotine kontrolira se snimanjem spektra otopine toluena R u heksanu R (0,02% V/V).
Najmanja vrijednost omjera apsorbancije maksimuma na 269 nm i minimuma na 266 nm
definirana je u monografiji.
Kivete
Dozvoljeno odstupanje debljine sloja u kiveti je ±0,005 cm. Kivete napunjene istim otapalom
u kojima će se mjeriti ispitivana tvar trebaju imati istu transmisiju. Ako to nije slučaj,
potrebno je izvršiti korekciju. Kivete trebaju uvijek biti čiste.
Primjeri
Identifikacija paracetamola
Otopi se 0,1 g tvari u metanolu R i razrijedi do 100,0 mL istim otapalom. U 1,0 mL otopine
doda se 0,5 mL klorovodične kiseline R (10,3 g/L) i razrijedi do 100,0 mL metanolom R.
Otopina se zaštiti od utjecaja svjetlosti i odmah se izmjeri apsorbancija na apsorpcijskom
maksimumu od 249 nm. Specifična apsorbancija na 249 nm iznosi od 860 do 980.
Identifikacija furosemida
Otopi se 50,0 mg tvari u otopini natrijeva hidroksida R (4 g/L) i razrijedi do 100,0 mL istom
alkalnom otopinom. Potom se 1,0 mL te otopine dopuni do 100,0 mL otopinom natrijeva
hidroksida R (4 g/L). Ispitana između 220 nm i 350 nm, otopina pokazuje tri apsorpcijska
maksimuma: na 228 nm, 270 nm i 333 nm. Omjer apsorbancija, mjerenih na maksimumu pri
270 nm i na maksimumu pri 228 nm, iznosi od 0,52 do 0,57.
39
Identifikacija kreme ekonazol nitrata
Količina kreme koja odgovara 40,0 mg ekonazol nitrata miješa se s 20 mL smjese od 1
volumnog dijela 1 M sumporne kiseline R i 4 volumna dijela metanola R. Doda se 50 mL
ugljikova tetraklorida R, promućka i organski sloj odbaci. Vodeni sloj se zaluži s 2 M
amonijakom R te ekstrahira s 40 mL kloroforma R dva puta. Organski ekstrakti se spoje te
promućkaju s 5 g bezvodnog natrijeva sulfata R. Smjesa se filtrira, a filtrat razrijedi do 100,0
mL kloroformom R. Upari se 50,0 mL te otopine do suha. Ostatak se otopi u 50,0 mL smjese
koja se sastoji od 1 volumnog dijela 0,1 M klorovodične kiseline R i 9 volumnih dijelova 2-
propanola R. Dobivena otopina, ispitana između 240 nm i 350 nm, pokazuje tri apsorpcijska
maksimuma: na 265 nm, 271 nm i 280 nm. Omjer apsorbancija mjerenih na maksimumima
pri 271 nm i 280 nm iznosi od 1,55 do 1,77. Ispitivanje nije valjano ukoliko omjer
apsorbancija, dobiven u ispitivanju razlučivanja spektrofotometra, nije najmanje 2.
40
tvari, dok se identifikacija farmaceutskih tvari tankoslojnom kromatografijom može provesti i
na temelju karakteristične boje produkta nastalog reakcijom ispitivane tvari s odgovarajućim
reagensom u postupku detekcije.
Spregnute tehnike sustava tekućinske ili plinske kromatografije s masenom spektrometrijom
(LC-MS i GC-MS) još nisu implementirane u monografije Europske farmakopeje u rutinsku
kontrolu kakvoće lijekova. Te moćne i skupe analitičke tehnike nužne su u istraživanju i
razvoju lijekova za određivanje nepoznatih struktura aktivnih farmaceutskih tvari i njihovih
pratećih onečišćenja kada je za analizu dostupna mala količina uzorka te za određivanje
strukture metabolita i metaboličkih putova lijekova.
Aparatura
1. Ploče na kojima se izvodi kromatografsko odjeljivanje prethodno su presvučene slojem
odgovarajuće stacionarne faze. Ukoliko je potrebno, prije izvođenja postupka ploče se isperu
otapalom, impregniraju ili aktiviraju zagrijavanjem na 100 oC do 105 oC, u trajanju od 1 sata.
2. Kromatografske komore su ravnog dna ili dvostrukog žlijeba, načinjene od inertnog,
prozirnog materijala, odgovarajuće veličine i poklopca koji čvrsto prianja.
3. Mikropipete, mikroštrcaljke, kalibrirane kapilare i drugi pribor za pravilno nanošenje
uzoraka na ploču.
4. Lampe za detekciju mjerenjem fluorescencije.
5. Reagensi za vizualizaciju odijeljenih sastojaka smjese.
Postupak
Stijenke kromatografske komore prekriju se filtar papirom. U komoru se ulije tolika količina
mobilne faze da nakon impregnacije filtar papira ostane dovoljno otapala za razvijanje ploče.
Komora se poklopi i ostavi stajati 1 sat na 20 oC do 25 oC kako bi se zasitila.
Nanese se propisan volumen otopine u dovoljno malim obrocima da se postigne mrlja
promjera od 2 mm do 5 mm. Otopine se nanesu na liniju usporednu s donjim rubom ploče i na
međusobnoj udaljenosti od najmanje 10 mm od središta mrlja. Postupak se istodobno provodi
s ispitivanom i poredbenom otopinom.
Nakon što otapalo nanesene otopine ispari, ploča se postavi okomito, pazeći pritom da mrlje
nanesenih otopina budu iznad površine mobilne faze. Kromatografska se komora zatvori
poklopcem i ostavi na 20 oC do 25 oC. Ploča se izvadi kada mobilna faza prijeđe propisanu
41
udaljenost. Izmjeri se duljina puta mobilne faze. Ploča se osuši i provede dokazivanje na
propisani način.
Pri dvodimenzionalnoj kromatografiji je potrebno osušiti ploču nakon prvog razvijanja te
potom provesti drugo razvijanje u smjeru okomitom na smjer prvoga.
Identifikacija ispitivane tvari provodi se na temelju vizualne usporedbe boje (ili
fluorescencije) i veličine glavne kromatografske mrlje dobivene s ispitivanom otopinom te
odgovarajuće mrlje poredbene otopine i usporedbom faktora zadržavanja, odnosno Rf
vrijednosti, ispitivane i poredbene tvari.
Rf vrijednost je definirana kao omjer duljine puta ispitivane, odnosno poredbene tvari (a), i
duljine puta mobilne faze (b).
Primjeri
Identifikacija kloramfenikola
Kao stacionarna faza koristi se silikagel GF254 R. Ispitivana otopina pripremi se otapanjem
0,10 g ispitivane tvari u acetonu R i dopuni se istim otapalom do 10,0 mL. Poredbena otopina
dobije se otapanjem 0,10 g kloramfenikola CRS u acetonu R i razrjeđivanjem istim otapalom
do 10,0 mL. Odvojeno se na ploču nanese po 1 µL ispitivane i poredbene otopine.
Kromatogram se razvije do 15 cm duljine ploče primjenom mobilne faze koja se sastoji od 1
volumnog dijela vode R, 10 volumnih dijelova metanola R i 90 volumnih dijelova kloroforma
R. Ploča se osuši na zraku i kromatogram promatra pod ultraljubičastim svjetlom na 254 nm.
Duljina puta i veličina mrlje ispitivane otopine na kromatogramu odgovara položajem i
veličinom mrlji dobivenoj s poredbenom otopinom.
42
Identifikacija kapsula nifedipina
Kao stacionarna faza koristi se silikagel GF254 R. Ispitivana otopina pripremi se mućkanjem
količine uzorka koji odgovara 20 mg nifedipina s 10 mL smjese otapala od jednakih volumnih
dijelova diklormetana R i metanola R. U istom se otapalu pripremi poredbena otopina
otapanjem 20,0 mg nifedipina CRS i razrjeđivanjem do 10,0 mL. Mobilna faza je smjesa od
40 volumnih dijelova etil acetata R i 60 volumnih dijelova cikloheksana R. Na ploču se
odvojeno nanese po 5 µL ispitivane i poredbene otopine i razvije do ¾ duljine ploče. Potom
se ploča osuši na zraku, a dokazivanje provede pod ultraljubičastim svjetlom na 254 nm.
Glavna mrlja na kromatogramu dobivena s ispitivanom otopinom odgovara položajem,
vidljivošću na 254 nm i veličinom glavnoj mrlji dobivenoj s poredbenom otopinom.
Kiselost ili lužnatost vodene otopine pokazuje pH vrijednost, definirana kao negativan
logaritam aktiviteta vodikovih iona u vodenoj otopini. Potenciometrijsko određivanje pH
vrijednosti temelji se na mjerenju razlike potencijala između staklene, mjerne elektrode
(radne, indikatorske) i referentne elektrode (na primjer, zasićene kalomelove elektrode), koje
su uronjene u ispitivanu otopinu. Mjerna je elektroda osjetljiva na promjenu aktiviteta
vodikovih iona. Danas se za potenciometrijsko određivanje pH koristi kombinirana staklena
elektroda. U farmakopejskoj kontroli kakvoće lijekova potenciometrijsko određivanje pH
upotrebljava se za potvrdu identiteta farmaceutskih sirovina, a još češće za ispitivanje čistoće,
odnosno ograničavanje kiselih ili lužnatih onečišćenja koja potječu iz proizvodnje ili
razgradnje ispitivane tvari.
pH vrijednost ispitivane tvari mjeri se u odnosu na pH vrijednost poredbene tvari prema
sljedećem izrazu:
E − Es
pH = pHs −
k
pHs − pH vrijednost standardne otopine;
E − potencijal (izražen u voltima) ispitivane otopine;
Es − potencijal (izražen u voltima) standardne otopine poznatog pH;
k − konstanta, 2,3026 RT/F, ovisna o temperaturi (Tablica 7).
43
Tablica 7. Vrijednosti k na različitim temperaturama.
Temperatura (°C) k (V)
15 0,0572
20 0,0582
25 0,0592
30 0,0601
35 0,0611
Postupak
Za mjerenje pH vrijednosti otopine koristi se voltmetar (pH-metar) koji omogućava mjerenja
s točnošću od najmanje 0,05 pH jedinica. Ukoliko nije drugačije propisano u monografiji, sva
se mjerenja provode pri istoj temperaturi od 20 oC do 25 °C. Prije mjerenja pH-metar se
kalibrira otopinom kalijeva hidrogenftalata kao primarnog standarda i otopinom drugog
pufera različitog pH, ovisno u kojem pH području se mjeri ispitivana otopina (preporučuju se
puferi prikazani u Tablici 8). Očitana pH vrijednost trećeg pufera, čija je pH vrijednost
između prethodna dva, ne smije se razlikovati za više od 0,05 pH jedinica od očekivane pH
vrijednosti pufera. Mjerenje pH ispitivane otopine provodi se pod jednakim uvjetima kao i za
standardne puferske otopine. Sve ispitivane otopine i standardne otopine pufera pripremaju se
s vodom bez ugljikova dioksida.
Primjeri
Identifikacija kinin hidroklorida
Otopi se 1,0 g tvari u vodi bez ugljikova dioksida R i dopuni istim otapalom do 50 mL. Potom
se 10 mL te otopine razrijedi do 20 mL vodom bez ugljikova dioksida R. Izmjerena pH
vrijednost te otopine iznosi od 6,0 do 6,8.
44
Identifikacija bizmutova subnitrata
U volumetrijsku posudu od 20 mL stavi se 1,00 g ispitivane tvari i doda 2,0 mL dušične
kiseline bez olova R. Ako je potrebno, na kraju se blago zagrije kako bi se ispitivani uzorak
potpuno otopio. Doda se 10 mL vode R i promućka. Tome se, u malim obrocima, doda 4,5
mL amonijaka bez olova R, ponovo se promućka i ostavi da se krutina slegne. pH vrijednost
bistrog supernatanta nije veća od 2,0.
Talište je temperatura pri kojoj kruta faza ispitivane tvari u kapilari potpuno prelazi u tekuću.
Ta je fizikalna konstanta značajna u identifikaciji organskih spojeva, ali samo kada je dobro
definirana i ako njezino određivanje nije praćeno razgradnjom tvari prilikom taljenja. Za
potvrdu identiteta nije dovoljno samo odrediti talište, niti odrediti ga uz potvrdu identiteta
samo kemijskim reakcijama. Stoga su u farmakopejskim monografijama za pouzdanu
identifikaciju, uz određivanje tališta, propisani drugi postupci za ispitivanje identiteta, poput
tankoslojne kromatografije ili određivanje specifične apsorbancije. U farmakopeji su
propisane granice unutar kojih se mora nalaziti talište farmaceutske sirovine da bi ona
odgovarala zahtjevima kakvoće.
Prema Europskoj farmakopeji talište se određuje u kapilari (kapilarna metoda) ili u metalnom
bloku (trenutačna metoda), a nudi se i mogućnost određivanja tališta termoanalitičkim
metodama, diferencijalnom pretražnom kalorimetrijom (DSC) i termalnom mikroskopijom
(engl. hot-stage microscopy).
Talište se može, prema Europskoj farmakopeji, odrediti i miješanjem jednakih dijelova
ispitivane i poredbene tvari, te određivanjem tališta te smjese. Ako ispitivana i poredbena tvar
nisu identične, smjesa se tali na nižoj temperaturi od temperature taljenja poredbene tvari.
Ukoliko je za farmaceutsku sirovinu pod značajkama u monografiji navedeno da pokazuje
polimorfizam, to treba uzeti u obzir pri određivanju tališta. U slučajevima kada je
monografijom dopušten samo jedan polimorfni oblik, određivanje tališta može pomoći u
isključivanju neželjenih kristalnih oblika.
Prisutnost onečišćenja u ispitivanoj tvari snižava talište i uzrokuje proširenje područja taljenja
pa se određivanje tališta ponekad koristi i u ispitivanju čistoće farmaceutskih sirovina
(primjerice, dienestrola, tiamfenikola ili propilenglikol monopalmitostearata).
45
Aparatura
1. Kapilare od tvrdog stakla koje ne sadrži alkalije, unutrašnjeg promjera od 0,9 mm do 1,1
mm, sa stijenkama debljine od 0,10 mm do 0,15 mm i zataljene na jednom kraju.
2. Uređaj za određivanje tališta s digitalnim prikazom temperature ili staklena tikvica s
tekućinom za zagrijavanje (voda, tekući parafin ili silikonsko ulje) koja se jednolično
zagrijava odgovarajućim izvorom topline i termometar graduiran na najviše 0,5 oC, s
oznakama koje omogućavaju nesmetano očitavanje temperature nakon uranjanja u tekućinu
za zagrijavanje. Raspon skale termometra ne smije biti veći od 100 oC.
Postupak
Ukoliko nije drugačije propisano, fino usitnjena tvar osuši se u vakuumu i iznad bezvodnog
silikagela R tijekom 24 sata. Odgovarajuća se količina unese u kapilaru tako da se dobije
visina stupca ispitivane tvari od 4 mm do 6 mm. Temperatura aluminijskog bloka u uređaju za
određivanje tališta ili tekućine za zagrijavanje u staklenoj tikvici podigne se do oko 10 °C
ispod očekivanog tališta te se brzina zagrijavanja prilagodi na 1 °C/min. Kada je temperatura
5 °C ispod očekivanog tališta, umetne se kapilara s ispitivanom tvari u zagrijani aluminijski
blok uređaja za određivanje tališta s digitalnim prikazom temperature ili u staklenu tikvicu s
tekućinom za zagrijavanje. Ukoliko se za određivanje tališta koristi staklena tikvica s
tekućinom za zagrijavanje, kapilaru treba postaviti tako da njezin zataljeni kraj bude blizu
sredine spremnika žive termometra, čija je oznaka uranjanja u razini s površinom tekućine.
Zabilježi se temperatura pri kojoj kruta tvar potpuno prijeđe u tekuću fazu.
Kalibracija aparature
Aparaturu je potrebno kalibrirati pomoću tališta poredbenih tvari, koje propisuje Svjetska
zdravstvena organizacija, ili drugih prikladnih tvari.
Primjeri
Identifikacija teofilina
Talište, određeno nakon sušenja na 100-105 °C, iznosi od 270 do 274 °C.
Identifikacija barbitala
Odredi se talište ispitivane tvari. Potom se pomiješaju jednaki dijelovi ispitivane tvari i
barbitala CRS te se odredi talište smjese. Razlika između dva tališta (oko 190 ºC) ne smije
biti veća od 2 ºC.
46
Identifikacija tableta karbamazepina
Količina smrvljenih tableta koja odgovara 0,2 g karbamazepina miješa se s 15 mL acetona R,
zagrije i vruće filtrira. Talog se ispere s 5 mL vrućeg acetona R dva puta. Sjedinjeni filtrati se
upare do 5 mL te smjesa ohladi u ledu. Talište kristala, dobivenih nakon ispiranja s acetonom
R i sušenja na 70 °C pri tlaku od 2 kPa tijekom 30 minuta, iznosi oko 191 °C.
Kut optičkog zakretanja opisuje za koliko stupnjeva optički aktivna tekućina ili otopina
optički aktivne tvari zakreće ravninu polarizacije, kada polarizirano svjetlo valne duljine D-
linije natrijeva spektra (λ = 589,3 nm), pri temperaturi 20±0,5 oC, prolazi kroz sloj tekućine
od 1 dm. Vrijednost kuta izražava se u stupnjevima.
Specifično optičko zakretanje je kut zakretanja ravnine polarizacije svjetlosti valne duljine D-
linije natrijeva spektra, pri temperaturi 20±0,5 oC i u sloju od 1 dm, otopine koja u 1 mL
sadrži 1 g optički aktivne tvari. Specifično optičko zakretanje označava se s [α ]D , a vrijednost
20
se, prema Europskoj farmakopeji, izražava bez jedinice i na jednu decimalu. Jedinica za
specifično optičko zakretanje je [(°) mL dm-1 g-1].
Određivanje specifičnog optičkog zakretanja više se primjenjuje u ispitivanju čistoće kiralnih
farmaceutskih sirovina nego u svrhu identifikacije. Ako se specifično optičko zakretanje
upotrebljava za potvrdu identiteta, u tim se slučajevima zahtijeva slaganje s podacima
navedenima u poglavlju ispitivanja čistoće. Monografije koje opisuju jedan od enantiomera
zahtijevaju ispitivanje optičkog zakretanja kako bi se potvrdila čistoća tvari. Monografije koje
opisuju racemate zahtijevaju određivanje specifičnog optičkog zakretanja samo u slučajevima
kada enantiomeri pokazuju veće izmjerene vrijednosti kutova optičkog zakretanja, kako bi se
one mogle značajno razlikovati od onih određenih za racemate. Iz izmjerenog kuta optičkog
zakretanja može se odrediti i sadržaj tvari (npr. za etambutol hidroklorid).
47
Postupak
Za mjerenje kuta optičkog zakretanja koristi se polarimetar s mogućnošću očitavanja na 0,01 °.
Polarimetar se prije mjerenja podesi na nulu s praznom polarimetrijskom cijevi za ispitivane
tekuće tvari, odnosno napunjenom otapalom za otopine optički aktivnih tvari. Suha
polarimetrijska cijev napuni se uzorkom ili otopinom uzorka te izmjeri kut optičkog
zakretanja. Specifično optičko zakretanje izračuna se pomoću sljedećih formula:
α
[α ]20D = (tekućine)
l ⋅d
Primjeri
Identifikacija noskapin hidroklorida
Otopi se 0,500 g ispitivane tvari u 0,01 M klorovodičnoj kiselini i dopuni istom kiselinom do
25,0 mL. Specifično optičko zakretanje, koje se izračuna prema suhoj tvari, iznosi od + 38,5
do + 44,0.
48
4.8. IDENTIFIKACIJA ANORGANSKIH TVARI
AMONIJEV KLORID
Ammonii chloridum
NH4Cl Mr = 53,49
DEFINICIJA
Amonijev klorid sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata amonijeva klorida, izračunato prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali. Lako topljivi u vodi.
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakcije klorida (4.1.).
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R; 2 mL te otopine daje reakciju amonijevih soli (4.1.).
BIZMUTOV SUBKARBONAT
Bismuthi subcarbonas
(BiO)2CO3 Mr = 509,97
DEFINICIJA
Bizmutov subkarbonat sadrži od 80,0% do 82,5% Bi (Ar = 209,0), što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel prašak. Gotovo netopljiv u vodi i alkoholu, otapa se u mineralnim kiselinama uz
snažno stvaranje mjehurića.
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakciju karbonata (4.1.).
B. Daje reakcije bizmuta (4.1.).
BORNA KISELINA
Acidum boricum
H3BO3 Mr = 61,8
DEFINICIJA
Borna kiselina sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata H3BO3.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, bezbojne sjajne pločice, masne na dodir, ili bijeli kristali. Topljivi u vodi i
alkoholu, lako topljivi u kipućoj vodi i glicerolu (85%).
49
IDENTIFIKACIJA
A. POKAZNA VJEŽBA: Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) laganim grijanjem
u 5 mL metanola R, doda 0,1 mL sumporne kiseline R te se otopina zagrije do vrenja. Izlazeće
pare gore plamenom zelena ruba.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL kipuće destilirane vode R. Otopina
je kiselina (4.1.).
CINKOV OKSID
Zinci oxidum
ZnO Mr = 81,4
DEFINICIJA
Cinkov oksid sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata ZnO, što se izračuna prema žarenoj tvari.
ZNAČAJKE
Lagan, bijel ili blijedo žućkastobijel, amorfan prašak, bez pjeskovitih čestica. Gotovo netopljiv u vodi
i alkoholu, otapa se u razrijeđenim mineralnim kiselinama.
IDENTIFIKACIJA
A. Jakim zagrijavanjem požuti, a hlađenjem žuta boja nestane.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 1,5 mL razrijeđene klorovodične
kiseline R i razrijedi do 5 mL vodom R. Otopina daje reakciju cinka (4.1.).
DEFINICIJA
Cinkov sulfat heptahidrat sadrži od 99,0% do 104,0% ekvivalenata ZnSO4, 7H2O.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni prozirni kristali praškaste površine. Vrlo lako topljivi u vodi,
gotovo netopljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R.
A. Otopina S daje reakcije sulfata (4.1.).
B. Otopina S daje reakciju cinka (4.1.).
50
KALCIJEV KARBONAT
Calcii carbonas
CaCO3 Mr = 100,1
DEFINICIJA
Kalcijev karbonat sadrži od 98,5% do 100,5% ekvivalenata CaCO3, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel prašak, gotovo netopljiv u vodi.
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakciju karbonata (4.1.).
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL razrijeđene octene kiseline R.
Kada se prestanu oslobađati mjehurići, otopina se kuha 2 minute, ohladi i, ako je potrebno,
filtrira kroz filtar od sinteriranog stakla; 0,2 mL te otopine daje reakcije kalcija (4.1.).
IDENTIFIKACIJA
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R. Otopina daje reakciju (a) klorida (4.1.).
B. Daje reakcije kalcija (4.1.).
KALIJEV BROMID
Kalii bromidum
KBr Mr = 119,0
DEFINICIJA
Kalijev bromid sadrži od 98,0% do 100,5% KBr, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali. Lako topljivi u vodi i glicerolu, teško topljivi u alkoholu.
51
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakciju (a) bromida (4.1.).
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 3 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R. Otopina daje reakcije kalija (4.1.).
KALIJEV DIHIDROGENFOSFAT
Kalii dihydrogenophosphas
KH2PO4 Mr = 136,1
DEFINICIJA
Kalijev dihidrogenfosfat sadrži od 98,0% do 100,5% ekvivalenata KH2PO4, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali. Lako topljivi u vodi, gotovo netopljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R.
A. Otopina S reagira slabo kiselo (4.1.).
B. Otopina S daje reakciju (b) fosfata (4.1.).
C. 0,5 mL otopine S daje reakciju (b) kalija (4.1.).
KALIJEV HIDROGENKARBONAT
Kalii hydrogenocarbonas
KHCO3 Mr = 100,1
DEFINICIJA
Kalijev hidrogenkarbonat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata KHCO3.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali. Lako topljivi u vodi, gotovo netopljivi u alkoholu.
Zagrijavanjem krutine ili otopine prelaze u kalijev karbonat.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R.
A. U 2 mL otopine S doda se 0,1 mL otopine fenolftaleina R. Stvara se blijedoružičasta boja.
Zagrijavanjem nastane plin i boja prelazi u crvenu.
B. Daje reakciju karbonata i hidrogenkarbonata (4.1.).
C. 1 mL otopine S daje reakciju (b) kalija (4.1.).
52
KALIJEV JODID
Kalii iodidum
KI Mr = 166,0
DEFINICIJA
Kalijev jodid sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata KI, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel prašak ili bezbojni kristali. Vrlo lako topljivi u vodi, lako topljivi u glicerolu, topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 10 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R.
A. Otopina S daje reakciju (a) jodida (4.1.).
B. Otopina S daje reakcije kalija (4.1.).
KALIJEV PERMANGANAT
Kalii permanganas
KMnO4 Mr = 158,0
DEFINICIJA
Kalijev permanganat sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata KMnO4.
ZNAČAJKE
Tamnoljubičast zrnat prašak, ili tamnoljubičasti ili gotovo crni kristali metalnog sjaja. Topljivi u hladnoj vodi,
lako topljivi u kipućoj vodi. Raspadaju se u dodiru s određenim organskim tvarima.
IDENTIFIKACIJA
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode R te doda 1 mL alkohola R i
0,3 mL razrijeđene otopine natrijeva hidroksida R. Nastane zeleno obojenje. Zagrije se do
vrenja. Nastane tamnosmeđ talog.
B. Filtrira se smjesa dobivena u postupku A. Filtrat daje reakciju (b) kalija (4.1.).
DEFINICIJA
Hidratni bazični magnezijev karbonat, sadrži od 40,0% do 45,0%, što se izračuna prema MgO (Mr = 40,30).
ZNAČAJKE
Bijel prašak. Gotovo netopljiv u vodi, otapa se u razrijeđenim kiselinama uz jako stvaranje mjehurića.
53
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakciju karbonata (4.1.).
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL razrijeđene dušične kiseline R i
neutralizira razrijeđenom otopinom natrijeva hidroksida R. Otopina daje reakciju magnezija
(4.1.).
DEFINICIJA
Magnezijev sulfat heptahidrat sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata MgSO4, izračunato prema
suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili sjajni bezbojni kristali. Lako topljivi u vodi, vrlo lako topljivi u kipućoj
vodi, gotovo netopljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakcije sulfata (4.1.).
B. Daje reakciju magnezija (4.1.).
NATRIJEV NITRIT
Natrii nitris
NaNO2 Mr = 69,0
DEFINICIJA
Natrijev nitrit sadrži od 98,5% do 100,5% ekvivalenata NaNO2, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bezbojni kristali ili žućkasti štapići, higroskopni. Lako topljivi u vodi, topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R.
A. U 0,1 mL otopine S doda se 1 mL otopine sulfanilne kiseline R1. Ostavi se stajati 2 do 3
minute. Potom se doda 1 mL otopine ß-naftola R (svježe pripremljene) i 1 mL otopine
razrijeđenog natrijeva hidroksida R. Nastane intenzivno crveno obojenje.
B. U 1 mL otopine S doda se 3 mL otopine fenazona R (20 g/L) i 0,4 mL razrijeđene sumporne
kiseline R. Nastane intenzivno zeleno obojenje.
C. Otopina S daje reakcije natrija (4.1.).
54
NATRIJEV SULFIT, BEZVODNI
Natrii sulfis anhydricus
Na2SO3 Mr = 126,0
DEFINICIJA
Bezvodni natrijev sulfit sadrži od 95,0% do 100,5% ekvivalenata Na2SO3.
ZNAČAJKE
Bijel prašak. Lako topljiv u vodi, vrlo teško topljiv u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 10 mL vode R.
A. Otopina S reagira slabo lužnato (4.1.).
B. U 5 mL otopine S doda se 0,5 mL 0,05 M joda. Otopina je bezbojna i daje reakciju (a) sulfata (4.1.).
C. Otopina S daje reakcije natrija (4.1.).
NATRIJEV TIOSULFAT
Natrii thiosulfas
Na2S2O3, 5H2O Mr = 248,2
DEFINICIJA
Natrijev tiosulfat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata Na2S2O3, 5H2O.
ZNAČAJKE
Prozirni bezbojni kristali praškaste površine na suhom zraku. Vrlo lako topljivi u vodi, gotovo
netopljivi u alkoholu. Otapaju se u svojoj kristalno vezanoj vodi na oko 49 °C.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R.
A. Obezboji jodiranu otopinu kalijeva jodida R.
B. U 0,5 mL otopine S doda se 0,5 mL vode R i 2 mL otopine srebrova nitrata R2. Nastane bijel
talog koji ubrzo poprima žućkastu, a potom crnu boju.
C. U 2,5 mL otopine S doda se 2,5 mL vode R i 1 mL klorovodične kiseline R. Nastane talog
sumpora i plin koji plavo oboji škrob-jod papir R.
D. 1 mL otopine S daje reakcije natrija (4.1.).
55
4.9. IDENTIFIKACIJA ORGANSKIH TVARI
ASKORBINSKA KISELINA
Acidum ascorbicum
C6 H 8 O 6 Mr = 176,1
DEFINICIJA
Askorbinska kiselina sadrži od 99,0% do 100,5 % ekvivalenata (5R)-5-[(1S)-1,2-dihidroksietil]-3,4-
dihidroksifuran-2-(5H)-ona.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, postaju bezbojni izlaganjem zraku i vlazi.
Lako topljivi u vodi, topljivi u alkoholu. Tale se, uz razgradnju, na oko 190 ºC.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B, C.
Druga identifikacija: A, C, D.
Otopina S. 1,0 g se otopi u vodi bez ugljikova dioksida R i dopuni do 20 mL istim otapalom.
A. Otopi se 10,0 mg u vodi R i odmah razrijedi do 10,0 mL istim otapalom. U 10 mL 0,1 M
klorovodične kiseline R doda se 1,0 mL prethodno pripremljene otopine i razrijedi do 100,0
mL vodom R. Odmah nakon otapanja mjeri se apsorbancija (4.3.) na maksimumu od 243 nm.
Specifična apsorbancija na maksimumu iznosi od 545 do 585.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
askorbinske kiseline CRS. Uzorak se pripremi u obliku pločice koja sadrži 1 mg ispitivane tvari.
C. pH vrijednost (4.5.) otopine S je od 2,1 do 2,6.
D. U 1 mL otopine S doda se 0,2 mL razrijeđene dušične kiseline R i 0,2 mL otopine srebrova
nitrata R2. Nastane siv talog.
56
AMOKSICILIN TRIHIDRAT
Amoxicillinum trihydricum
DEFINICIJA
Amoksicilin trihidrat sadrži od 95,0% do 102,0% ekvivalenata (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4-
hidroksifenil)acetil]amino]-3,3-dimetil-7-okso-4-tia-1-azabiciklo[3.2.0]heptan-2-karboksilne kiseline,
što se izračuna prema bezvodnoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, teško topljivi u vodi, vrlo teško topljivi u
alkoholu, gotovo netopljivi u masnim uljima. Otapaju se u razrijeđenim kiselinama i razrijeđenim
otopinama alkalijskih hidroksida.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A.
Druga identifikacija: B.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar usporedi se sa spektrom
amoksicilin trihidrata CRS.
B. Na malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) doda se kap vode R i doda 2 mL sumporna
kiselina-formaldehid reagensa R. Sadržaj se promiješa; otopina je gotovo bezbojna. Epruveta
se stavi u vodenu kupelj na 1 minutu; razvije se tamnožuta boja.
BARBITAL
Barbitalum
C8H12N2O3 Mr = 184,2
DEFINICIJA
Barbital sadrži od 99% do 110% ekvivalenata 5,5-dietilpirimidin-2,4,6(1H,3H,5H)-triona, što se
izračuna prema suhoj tvari.
57
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, slabo topljivi u vodi, topljivi u kipućoj vodi i alkoholu.
Tvore u vodi topljive spojeve s alkalijskim hidroksidima i karbonatima te s amonijakom.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (poglavlje 4.6.). Odredi se talište ispitivane tvari. Potom se pomiješaju jednaki
dijelovi ispitivane tvari i barbitala CRS te odredi talište smjese. Razlika između dva tališta (oko
190 ºC) nije veća od 2 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
barbitala CRS.
C. Kromatografija na tankom sloju (poglavlje 4.4.). Kao stacionarna faza koristi se silikagel GF254 R.
Ispitivana otopina: otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL alkohola R.
Poredbena otopina: otopi se mala količina (vrh špatule) barbitala CRS u alkoholu R. Na ploču se
kapilarom nanesu jednaki volumeni obiju otopina. Kromatogram se razvije primjenom 30 mL
mobilne faze koja se sastoji od 5 volumnih dijelova koncentriranog amonijaka R, 15 volumnih
dijelova alkohola R i 80 volumnih dijelova kloroforma R do 2/3 duljine ploče. Dokazivanje se provodi
neposredno nakon razvijanja pod ultraljubičastim svjetlom pri 254 nm. Duljina puta i veličina mrlje na
kromatogramu ispitivane otopine odgovaraju mrlji na kromatogramu poredbene otopine.
D. Daje reakciju barbiturata koji sadrže nesupstituirani dušik (4.1.).
BENZOJEVA KISELINA
Acidum benzoicum
C7 H6 O2 Mr = 122,1
DEFINICIJA
Benzojeva kiselina sadrži od 99% do 100,5% ekvivalenata benzenkarboksilne kiseline.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, bez mirisa ili vrlo slaba karakteristična mirisa. Teško
topljivi u vodi, topljivi u kipućoj vodi, lako topljivi u alkoholu i masnim uljima.
IDENTIFIKACIJA
A. Određivanje tališta (4.6.): od 121 ºC do 124 ºC.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL alkohola R. Otopina daje reakciju
(a) benzoata (4.1.).
58
BENZOKAIN
Benzocainum
C19H11NO2 Mr = 165,2
DEFINICIJA
Benzokain sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata etil-4-aminobenzoata, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, vrlo teško topljivi u vodi, lako topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 89 ºC do 92 °C.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar usporedi se sa spektrom
benzokaina CRS.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL alkohola R. Otopina daje reakciju
primarnih aromatskih amina (4.1.).
BIZMUTOV SUBGALAT
Bismuthi subgallas
C7H5BiO6 Mr = 394,1
DEFINICIJA
Spoj bizmuta i galne kiseline sadrži od 48,0% do 51,0% ekvivalenata Bi, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Žut prašak, gotovo netopljiv u vodi i alkoholu. Otapa se u mineralnim kiselinama uz razgradnju i u
otopinama alkalijskih hidroksida, dajući crvenkastosmeđu tekućinu.
IDENTIFIKACIJA
A. Pomiješa se mala količina (vrh špatule) ispitivane tvari s 5 mL vode R i 0,1 mL fosforne
kiseline R. Zagrijava se do vrenja i ostavi nastavi grijati 2 minute. Ohladi se i filtrira. U filtrat
se doda 1,5 mL otopine željezova(III) klorida R1. Nastane crnoplava boja.
B. Daje reakciju (b) bizmuta (4.1.).
59
BIZMUTOV SUBSALICILAT
Bismuthi subsalycilas
C7H5BiO4 Mr = 362,1
DEFINICIJA
Spoj bizmuta i salicilne kiseline sadrži od 56,0% do 59,4% ekvivalenata Bi (Ar = 209,0), što se
izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel prašak, gotovo netopljiv u vodi i alkoholu. Otapa se u mineralnim kiselinama uz razgradnju.
IDENTIFIKACIJA
A. U malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) doda se 10 mL klorovodične kiseline R1. Zagrijava
se na vreloj vodenoj kupelji 5 minuta. Ohladi se i filtrira. Filtrat se koristi za ispitivanje B.
Ostatak se ispere razrijeđenom klorovodičnom kiselinom R te potom vodom R. Zatim se ostatak
otopi u 0,5 mL do 1 mL otopine razrijeđenog natrijeva hidroksida R, doda 15 mL vode R i
neutralizira razrijeđenom klorovodičnom kiselinom R. Otopina daje reakciju (a) salicilata (4.1.).
B. Filtrat dobiven u ispitivanju A daje reakciju (b) na bizmut (4.1.).
DEKSTRIN
Dextrinum
DEFINICIJA
Dekstrin je kukuruzni ili krumpirov škrob te škrob vrsta roda Manihot, djelomice hidroliziran i
promijenjen grijanjem, uz prisutnost kiselina, lužina ili agenasa za kontrolu pH ili bez njih.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel, lako klizeći prašak. Vrlo lako topljiv u kipućoj vodi, pri čemu daje sluzavu
otopinu, polako se otapa u hladnoj vodi, gotovo netopljiv u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Suspendira se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode R, kuha 1 minutu i
ohladi. U 1 mL otopine doda se 0,05 mL otopine joda R1. Nastane tamnoplavo do
crvenkastosmeđe obojenje koje nestane zagrijavanjem.
B. Filtrira se suspenzija dobivena u postupku A. Filtratu se doda 1 mL razrijeđene otopine
natrijeva hidroksida R i dokapa se, uz mućkanje, 2 mL otopine bakrova sulfata R te kuha.
Nastane crveni talog.
C. Vrlo lako topljiv u kipućoj vodi R, pri čemu daje sluzavu otopinu.
60
EFEDRIN HIDROKLORID
Ephedrini hydrochloridum
C10H16ClNO Mr = 201,7
DEFINICIJA
Efedrin hidroklorid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenta (1R,2S)-2-(metilamino)-1-fenilpropan-1-
ol hidroklorida, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristalinični prašak ili bezbojni kristali, lako topljivi u vodi, topljivi u alkoholu
(96%). Talište: oko 219 °C.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B, C.
Druga identifikacija: A, C.
Otopina S. Otopi se 2,0 g ispitivane tvari u destiliranoj vodi R i razrijedi do 20,0 mL istim otapalom.
A. Odgovara ispitivanjima specifičnog optičkog zakretanja (4.7.): Uzme se 12,5 mL otopine S i
razrijedi do 25,0 mL istim otapalom. Specifično optičko zakretanje je -33,5 do -35,5
izračunato prema suhoj tvari.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar usporedi se s poredbenim
spektrom efedrin hidroklorida CRS.
C. U 2 mL otopine S doda se 2 mL vode R. Otopina daje reakciju (a) na kloride (4.1.).
FENOBARBITAL
Phenobarbitalum
C12H12N2O3 Mr = 232,2
DEFINICIJA
Fenobarbital sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 5-etil-5-fenilpirimidin-2,4,6(1H,3H,5H)-triona,
što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, vrlo teško topljivi u vodi, vrlo lako topljivi u alkoholu,
topljivi u eteru. S alkalijskim hidroksidima i karbonatima te s amonijakom stvara u vodi topljive spojeve.
61
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.). Odredi se talište ispitivane tvari. Potom se pomiješaju jednaki
dijelovi ispitivane supstancije i fenobarbitala CRS te se odredi talište smjese. Razlika između
tališta ispitivane supstancije i smjese (oko 176 °C) nije veća od 2 °C.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Spektar ispitivane supstancije se usporedi
sa spektrom fenobarbitala CRS.
C. Kromatografija na tankom sloju (4.4.). Kao stacionarna faza koristi se silikagel GF254 R.
Ispitivana otopina: otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u alkoholu R.
Poredbena otopina: mala količina (vrh špatule) fenobarbitala CRS otopi se u alkoholu R. Na
ploču se kapilarom nanesu jednaki volumeni ispitivane i poredbene otopine. Kromatogram se
razvije do 2/3 duljine ploče, koristeći kao mobilnu fazu 30 mL smjese od 5 volumnih dijelova
koncentriranog amonijaka R, 15 volumnih dijelova alkohola R i 80 volumnih dijelova
kloroforma R. Dokazivanje se provodi odmah pod ultraljubičastim svjetlom pri 254 nm.
Duljina puta i veličina kromatografske mrlje ispitivane otopine odgovaraju mrlji poredbene
otopine.
D. Daje reakcije barbiturata koji sadrže nesupstituirani dušik (4.1.).
FENOBARBITAL NATRIJ
Phenobarbitalum natricum
C12H11N2NaO3 Mr = 254,2
DEFINICIJA
Fenobarbital natrij sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata natrijevog derivata 5-etil-5-fenilpirimidin-
2,4,6-(1H,3H,5H)-triona, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, higroskopan, vrlo lako topljiv u vodi bez ugljikova dioksida (mali dio može
ostati neotopljen), topljiv u alkoholu, gotovo netopljiv u metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, D.
Druga identifikacija: B, C, D.
62
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar ostatka dobivenog u
identifikaciji A usporedi se s poredbenim spektrom fenobarbitala CRS. Ako se spektri
dobiveni ispitivanjem tvari u krutom stanju razlikuju, ispitivani ostatak i poredbena tvar otope
se odvojeno u etanolu R, upare i ispitivanje se ponovi.
B. Kromatografija na tankom sloju (4.4.). Kao stacionarna faza koristi se silikagel GF254 R.
Ispitivana otopina: mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 2 mL alkohola (50%,
V/V) R. Poredbena otopina: mala količina (vrh špatule) fenobarbitala CRS otopi se u 2 mL
alkohola (50%, V/V) R. Na ploču se odvojeno nanesu isti volumeni obiju otopina. Koristeći
kao mobilnu fazu 30 mL smjese od 5 volumnih dijelova koncentriranog amonijaka R, 15
volumnih dijelova alkohola R i 80 volumnih dijelova kloroforma R, kromatogram se razvije
do 2/3 duljine ploče. Dokazivanje se provodi odmah pod ultraljubičastim svjetlom pri 254 nm.
Duljina puta i veličina mrlje na kromatogramu ispitivane otopine odgovaraju mrlji na
kromatogramu poredbene otopine.
C. Daje reakciju barbiturata koji sadrže nesupstituirani dušik (4.1.).
D. Daje reakcije natrija (4.1.).
FUROSEMID
Furosemidum
C12H11ClN2O5S Mr = 330,7
DEFINICIJA
Furosemid sadrži od 98,5% do 101,0% ekvivalenata 4-kloro-2-[(furan-2-ilmetil)amino]-5-
sulfamoilbenzojeve kiseline, što se izračuna izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak, gotovo netopljiv u vodi, topljiv u acetonu, umjereno topljiv u
alkoholu, gotovo netopljiv u metilen kloridu. Otapa se u razrijeđenim otopinama alkalijskih
hidroksida. Tali se na oko 210 ºC uz raspadanje.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B.
Druga identifikacija: A, C.
A. Otopi se 5,0 mg tvari u otopini natrijeva hidoksida R (4 g/L) i razrijedi do 10,0 mL istom
alkalnom otopinom. Potom se 0,5 mL te otopine dopuni do 50,0 mL otopinom natrijeva
hidroksida R (4 g/L). Ispitana između 220 nm i 350 nm (4.3.), otopina pokazuje tri
63
apsorpcijska maksimuma, na 228 nm, 270 nm i 333 nm. Omjer apsorbancija mjerenih na
maksimumu pri 270 nm i na maksimumu pri 228 nm iznosi od 0,52 do 0,57.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
furosemida CRS.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL alkohola R. U 1 mL se doda 5 mL
vode R. U 0,2 mL te otopine ulije se 5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R i grije na
vodenoj kupelji 5 minuta. Nakon hlađenja doda se 10 mL 1 M natrijeva hidroksida i 0,5 mL
otopine natrijeva nitrita R (5 g/L). Pusti se odstajati 3 minute, a potom se doda 1 mL otopine
sulfamske kiseline R (25 g/L) i promućka. Nakon dodatka 0,5 mL otopine naftiletilendiamin
dihidroklorida R (5 g/L) razvije se ljubičastocrvena boja.
KALCIJEV PANTOTENAT
Calcii pantothenas
C18H32CaN2O10 Mr = 476,5
DEFINICIJA
Kalcijev pantotenat sadrži od 98,0% do 101,0% ekvivalenta kalcijevog derivata di[3-[[(2R)-2,4-
dihidroksi-3,3-dimetilbutanoil]amino]propanoata, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel prašak, slabo higroskopan, lako topljiv u vodi, umjereno topljiv u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se 2,5 g ispitivane tvari u vodi bez ugljikova dioksida R i razrijedi do 50,0 mL istim
otapalom.
D. Odgovara ispitivanjima specifičnog optičkog zakretanja (4.7.): od +25,5 do +27,5, određeno
na otopini S i izračunato prema suhoj tvari.
E. U 1 mL otopine S doda se 1 mL otopine razrijeđenog natrijevog hidroksida R i 0,1 mL
otopine bakrovog sulfata R. Otopina se oboji plavo.
F. Daje reakciju (a) kalcija (4.1.).
64
KALIJEV ACETAT
Kalii acetas
C2H3KO2 Mr = 98,1
DEFINICIJA
Kalijev acetat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata C2H3KO2, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, rastapaju se, lako topljivi u vodi i vrlo lako topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakciju (a) acetata (4.1.).
B. Daje reakciju (a) kalija (4.1.).
KALIJEV HIDROGENTARTARAT
Kalii hydrogenotartras
C4H5KO6 Mr = 188,2
DEFINICIJA
Kalijev hidrogentartarat sadrži od 99,5% do 100,5% ekvivalenata kalijeva hidrogen-(2R,3R)-2,3-
dihidroksibutan-1,4-dioata, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, teško topljivi u vodi i gotovo netopljivi u alkoholu.
Otapaju se u razrijeđenim mineralnim kiselinama i alkalijskim hidroksidima.
IDENTIFIKACIJA
A. Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) umiješa se u 10 mL vode R, kuha dok se ne otopi, te
potom ohladi (otopina A). U 5 mL otopine A doda se 0,1 mL otopine metilnog crvenila R.
Otopina je crvena.
B. Otopina A daje reakciju (a) tartarata (4.1.).
C. Otopina A daje reakciju (b) kalija (4.1.).
65
KINIDIN SULFAT
Chinidini sulfas
IDENTIFIKACIJA
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 3 mL razrijeđene sumporne kiseline R i
dopuni do 10 mL vodom R. Kada se promatra pod ultraljubičastim svjetlom na 366 nm, razvije
se intenzivna plava fluorescencija. Reakcija se izvodi uz slijepu probu.
B. Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 5 mL vruće vode R, ohladi, doda 1 mL
otopine srebrova nitrata R1 i protrlja staklenim štapićem. Nakon nekoliko minuta stvori se
bijel talog, koji se otapa dodatkom razrijeđene dušične kiseline R.
C. Daje reakciju (a) na sulfate (4.1.).
D. Odgovara ispitivanjima pH (4.5.): otopi se 0,25 g u vodi bez ugljikova dioksida R i dopuni
istim otapalom do 25 mL; pH otopine je 6,0 do 6,8.
KININ HIDROKLORID
Chinini hydrochloridum
66
ZNAČAJKE
Fine svilenkaste iglice, često u nakupinama, bezbojne, topljive u vodi, lako topljive u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 3 mL razrijeđene sumporne kiseline R i
dopuni do 10 mL vodom R. Kada se promatra pod ultraljubičastim svjetlom na 366 nm, pojavi
se intenzivna plava fluorescencija. Reakcija se izvodi uz slijepu probu.
B. Daje reakcije (a) klorida (4.1.).
C. Odgovara ispitivanju pH vrijednosti (4.5.): otopi se 0,25 g tvari u vodi bez ugljikova dioksida
R i dopuni istim otapalom do 25 mL; pH te otopine iznosi od 6,0 do 6,8.
KININ SULFAT
Chinini sulfas
DEFINICIJA
Kinin sulfat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata alkaloid monosulfata, što se izračuna prema
suhoj tvari kao bis[(R)-[(2S,4S,5R)-5-etenil-1-azabiciklo[2.2.2]okt-2-il](6-metoksikinolin-4-il)metanol] sulfat.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili fine bezbojne iglice, teško topljivi u vodi, umjereno
topljivi u kipućoj vodi i u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 3 mL razrijeđene sumporne kiseline R i
dopuni do 10 mL vodom R. Kada se promatra pod ultraljubičastim svjetlom na 366 nm, pojavi
se intenzivna plava fluorescencija, koja gotovo potpuno nestane dodatkom 1 mL klorovodične
kiseline R.
B. Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 5 mL razrijeđene klorovodične kiseline R.
Otopina daje reakciju (a) na sulfate (4.1.).
C. Odgovara ispitivanju pH (4.5.): otopi se 0,25 g tvari u vodi bez ugljikova dioksida R i dopuni
istim otapalom do 25 mL; pH vodene suspenzije iznosi od 5,7 do 6,6.
67
KLORAMFENIKOL
Chlorampenicolum
C11H12Cl2N2O5 Mr = 323,1
DEFINICIJA
Kloramfenikol je 2,2-dikloro-N-[(1R,2R)-2-hidroksi-1-(hidroksimetil)-2-(4-nitrofenil)etil]acetamid,
proizveden rastom određenih sojeva Streptomyces venezuelae u prikladnom mediju. Obično se dobiva
sintezom. Sadrži od 98,0% do 102,0% ekvivalenata C11H12Cl2N2O5, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel, sivobijel ili žućkast fino kristaliničan prašak ili kristali igličastih ili izduženih pločica. Teško su
topljivi u vodi, lako topljivi u alkoholu i propilenglikolu. Etanolna otopina je desnorotirajuća, a
otopina u etil acetatu lijevorotirajuća.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 149 ºC do 153 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
kloramfenikola CRS.
C. Tankoslojna kromatografija (4.4.), prema ispitivanju srodnih tvari, primjenom TLC ploče sa
silikagelom GF254 R. Ispitivana otopina dobije se otapanjem male količine ispitivane tvari (vrh
špatule) u 2 mL acetona R. Poredbena otopina dobije se otapanjem male količine (vrh špatule)
kloramfenikola CRS u 2 mL acetona R. Odvojeno se na ploču nanesu isti volumeni ispitivane i
poredbene otopine. Razvije se do 2/3 duljine ploče primjenom 30 mL mobilne faze koja se
sastoji od 1 volumnog dijela vode R, 10 volumnih dijelova metanola R i 90 volumnih dijelova
kloroforma R. Ploča se osuši na zraku i kromatogram promatra pod ultraljubičastim svjetlom
na 254 nm. Glavna mrlja na kromatogramu dobivena s ispitivanom otopinom podudara se
položajem i veličinom s glavnom mrljom dobivenom s poredbenom otopinom.
D. U porculanski lončić stavi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) i doda mala količina
(vrh špatule) bezvodnog natrijeva karbonata R. Zagrijava se oprezno na otvorenom plamenu
10 minuta te ohladi. Ostatak se pomiješa s 5 mL razrijeđene dušične kiseline R i filtrira. U 1
mL filtrata ulije se 1 mL vode R. Otopina daje reakciju (a) na kloride (4.1.).
68
KODEIN FOSFAT HEMIHIDRAT
Codeini phosphas hemihydricus
DEFINICIJA
Kodein fosfat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 7,8-didehidro-4,5α-epoksi-3-metoksi-17-
metilmorfinan-6α-ol fosfat hemihidrata, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili mali bezbojni kristali, lako topljivi u vodi, teško ili vrlo
teško topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B, D.
Druga identifikacija: A, C, D, E.
Otopina S. Otopi se 0,40 g ispitivane tvari u vodi bez ugljikova dioksida R, pripremljenoj iz destilirane
vode R, i razrijedi istim otapalom do 10,0 mL.
A. Razrijedi se 1,0 mL otopine S do 100,0 mL vodom R. U 25,0 mL te otopine doda se 25 mL
vode R, 10 mL 0,1 M natrijeva hidroksida i razrijedi do 100,0 mL vodom R. Ispitivana između
250 nm i 350 nm (4.3.), otopina pokazuje samo jedan apsorpcijski maksimum na 284 nm.
Specifična apsorbancija na maksimumu je oko 38, što se izračuna prema suhoj tvari.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Otopi se 0,20 g u 4 mL vode R. Doda se 1
mL smjese koja se sastoji od jednakih volumnih dijelova koncentrirane otopine natrijeva
hidroksida R i vode R te, ako je potrebno, potakne kristalizacija trljanjem staklenim štapićem o
stijenke epruvete i hlađenjem u ledenoj vodi. Talog se opere vodom R i suši na 100 °C do 105
°C. Ispita se suh talog pripremljen kao pločica s kalijevim bromidom R. Dobiveni se spektar
usporedi s poredbenim spektrom kodeina CRS.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 4 mL vode R. Doda se 1 mL smjese od
jednakih volumnih dijelova koncentrirane otopine natrijeva hidroksida R i vode R te započne
kristalizacija, ako je potrebno, trljanjem stijenke epruvete staklenim štapićem i hlađenjem u
ledenoj vodi.
D. Otopina S daje reakciju (a) na fosfate (4.1.).
E. Daje reakciju na alkaloide (4.1.).
69
KOFEIN
Coffeinum
C8H10N4O2 Mr = 194,2
DEFINICIJA
Kofein sadrži od 98,5% do 101,5% ekvivalenata 1,3,7-trimetil-3,7-dihidro-1H-purin-2,6-diona, što se
izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili svilenkasti bijeli kristali, lako sublimiraju, lako topljivi u kipućoj vodi,
teško topljivi u etanolu. Otapaju se u koncentriranim otopinama alkalijskih benzoata i salicilata.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 234 ºC do 239 °C.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Spektar ispitivane supstancije se usporedi
sa spektrom kofeina CRS.
C. U 2 mL zasićene otopine doda se 0,05 mL otopine jodiranog kalijeva jodida R. Otopina
ostane prozirna. Potom se doda 0,1 mL razrijeđene klorovodične kiseline R. Nastane smeđ
talog. Otapa se neutralizacijom s razrijeđenom otopinom natrijeva hidroksida R.
D. Daje reakciju ksantina (4.1.).
C6H8O7,H2O Mr = 210,1
DEFINICIJA
Limunska kiselina monohidrat sadrži od 99,5% do 100,5% ekvivalenata 2-hidroksipropan-1,2,3-
trikarboksilne kiseline, što se izračuna prema bezvodnoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, bezbojni kristali ili zrnca praškaste površine. Vrlo lako topljivi u vodi, lako
topljivi u alkoholu.
70
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B.
Druga identifikacija: A, C.
A. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R. Otopina reagira jako kiselo (4.1.).
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
limunske kiseline monohidrata CRS nakon sušenja ispitivane i poredbene supstancije na 100
ºC do 105 ºC tijekom 2 sata.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode R, neutralizira s 1 M otopinom
natrijeva hidroksida, doda 5 mL otopine kalcijeva klorida R i zagrije do vrenja. Nastane bijel talog.
METRONIDAZOL
Metronidazolum
C6 H9 N3 O3 Mr = 171,2
DEFINICIJA
Sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 2-(2-metil-5-nitro-1H-imidazol-1-il)etanola, što se izračuna
prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili žućkast kristaliničan prašak. Teško topljiv u vodi, acetonu, alkoholu i metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: C.
Druga identifikacija: A, B, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 159 ºC do 163 ºC.
B. Otopi se 10,0 mg ispitivane tvari u 0,1 M klorovodičnoj kiselini i dopuni do 25,0 mL istom
kiselinom. Potom se 2,5 mL te otopine razrijedi do 50,0 mL s 0,1 M klorovodičnom kiselinom.
Izmjeri se apsorbancija između 230 nm i 350 nm (4.3). Otopina pokazuje apsorpcijski maksimum
na 277 nm, a minimum na 240 nm. Specifična apsorbancija na maksimumu iznosi od 365 do 395.
C. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Uzorci se ispituju u obliku pločica, a
dobiveni se spektar usporedi sa spektrom metronidazola CRS.
D. U malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) doda se mala količina (vrh špatule) cinka u prahu
R, 1 mL vode R i 0,25 mL razrijeđene klorovodične kiseline R. Grije se na vodenoj kupelji 5
minuta i ohladi. Otopina daje reakciju primarnih aromatskih amina (4.1.).
71
MORFIN HIDROKLORID
Morphini hydrochloridum
DEFINICIJA
Morfin hidroklorid sadrži od 98,5% do 101,0% ekvivalenata 7,8-didehidro-4,5α-epoksi-17-
metilmorfinan-3,6α-diol hidroklorida, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak, ili bezbojne svilenkaste iglice, ili kockaste nakupine rascvale
u suhoj atmosferi, topljivi u vodi i glicerolu, teško topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, E.
Druga identifikacija: B, C, D, E.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Spektar ispitivane supstancije se usporedi
sa spektrom morfin hidroklorida CRS.
B. Otopi se 25,0 mg ispitivane tvari u vodi R i dopuni do 25,0 mL istim otapalom (otopina A).
Potom se 10,0 mL otopine A razrijedi do 100,0 mL vodom R. Ispitivana između 250 nm i
350 nm (4.3.), otopina pokazuje jedan apsorpcijski maksimum na 285 nm. Specifična
apsorbancija na maksimumu iznosi od 37 do 43. Zatim se 5,0 mL otopine A razrijedi do
50,0 mL 0,1 M otopinom natrijeva hidroksida R. Ispitivana između 250 nm i 350 nm (4.3.),
otopina pokazuje jedan apsorpcijski maksimum na 298 nm. Specifična apsorbancija na
maksimumu iznosi od 64 do 72.
C. Kada se u malu količinu ispitivane tvari (vrh špatule) u porculanskom lončiću doda 0,5 mL
sumporna kiselina-formaldehid reagensa R, razvije se ružičasta boja koja prelazi u
ljubičastu.
D. Daje reakciju na alkaloide (4.1.).
E. Daje reakciju (a) na kloride (4.1.).
72
NATRIJEV BENZOAT
Natrii benzoas
C7H5NaO2 Mr = 144,1
DEFINICIJA
Natrijev benzoat sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata natrijeva benzenkarboksilata, što se
izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan ili zrnat prašak, ili listići, slabo higroskopni, vrlo lako topljivi u vodi, teško topljivi
u alkoholu (90%, V/V).
IDENTIFIKACIJA
A. Daje reakcije (b) i (c) benzoata (4.1.).
B. Daje reakcije natrija (4.1.).
NATRIJEV SALICILAT
Natrii salycilas
C7H5NaO3 Mr = 160,1
DEFINICIJA
Natrijev salicilat sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata natrij-2-hidroksibenzenkarboksilata, što se
izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, ili mali bezbojni kristali, vrlo lako topljivi u vodi, teško topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, C.
Druga identifikacija: B, C.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
natrijeva salicilata CRS.
B. Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R,
pripremljene iz destilirane vode R. Otopina daje reakcije salicilata (4.1.).
C. Daje reakcije natrija (4.1.).
73
NIFEDIPIN
Nifedipinum
C17H18N2O6 Mr = 346,3
DEFINICIJA
Nifedipin sadrži od 98,0% do 102,0% ekvivalenata dimetil 2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil)-1,4-
dihidropiridin-3,5-dikarboksilata, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Žut kristaliničan prašak, gotovo netopljiv u vodi, lako topljiv u acetonu, umjereno topljiv u etanolu.
Kada je izložen dnevnom svjetlu ili umjetnom svjetlu određene valne duljine, odmah prelazi u derivat
nitrozofenilpiridina. Izloženost ultraljubičastom svjetlu dovodi do stvaranja derivata nitrofenilpiridina.
Otopine se pripremaju neposredno prije upotrebe, u tami ili pod dugovalnim svjetlom (> 420 nm) i
valja ih zaštititi od svjetlosti.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 171 ºC do 175 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
nifedipina CRS.
C. Tankoslojna kromatografija (4.4.), primjenom TLC ploča sa silikagelom GF254 R. Ispitivana
otopina dobije se otapanjem male količine ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL metanola R.
Poredbena otopina pripremi se otapanjem male količine (vrh špatule) nifedipina CRS u 2 mL
metanola R. Mobilnu fazu čini 30 mL smjese od 40 volumnih dijelova etil acetata R i 60
volumnih dijelova cikloheksana R. Na ploču se odvojeno nanesu jednaki volumeni ispitivane i
poredbene otopine i razvije do 2/3 duljine ploče. Potom se ploča osuši na zraku, a dokazivanje
provede pod ultraljubičastim svjetlom na 254 nm. Glavna mrlja na kromatogramu dobivena s
ispitivanom otopinom odgovara položajem, vidljivošću na 254 nm i veličinom glavnoj mrlji
dobivenoj s poredbenom otopinom.
D. U epruvetu se stavi mala količina ispitivane tvari (vrh špatule), doda 5 mL smjese koja se
sastoji od 1,5 volumnih dijelova klorovodične kiseline R, 3,5 volumnih dijelova vode R i 5
volumnih dijelova alkohola R, te se otopi uz lagano zagrijavanje. Doda se nekoliko zrnaca
cinka R i pusti da odstoji 5 minuta uz povremeno miješanje. Filtrira se u drugu epruvetu,
74
filtratu doda 2 mL otopine natrijeva nitrita R (10 g/L) i ostavi stajati 2 minute. Potom se doda
1 mL otopine amonijeva sulfamata R (50 g/L), snažno i oprezno protrese, te doda 1 mL
otopine naftiletilendiamin dihidroklorida R (5 g/L). Razvije se intenzivno crveno obojenje,
postojano barem 5 minuta.
NIKOTINAMID
Nicotinamidum
C6 H6 N2 O Mr = 122,1
DEFINICIJA
Nikotinamid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata piridin-3-karboksamida, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, lako topljivi u vodi i etanolu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 128 ºC do 131 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
nikotinamida CRS.
C. Do vrenja se zagrije mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) s 1 mL otopine razrijeđenog
natrijeva hidroksida R. Razvije se amonijak, što se prepozna po mirisu.
OKSITETRACIKLIN DIHIDRAT
Oxytetracyclinum dihydricum
PAPAVERIN HIDROKLORID
Papaverini hydrochloridum
C20H22ClNO4 Mr = 375,9
DEFINICIJA
Papaverin hidroklorid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 1-(3,4-dimetoksibenzil)-6,7-
dimetoksiizokinolin hidroklorida, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak, odnosno bijeli ili gotovo bijeli kristali, umjereno topljivi u
vodi, teško topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, C.
Druga identifikacija: B, C.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
papaverin hidroklorida CRS.
B. Tankoslojna kromatografija (4.4.), uz primjenu TLC ploče sa silikagelom GF254 R. Ispitivana
otopina dobije se otapanjem male količine ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL metanola R.
Poredbena otopina pripremi se otapanjem male količine (vrh špatule) papaverin hidroklorida
CRS u 2 mL metanola R. Na ploču se kapilarom nanesu jednaki volumeni obiju otopina.
Razvije se kromatogram do 2/3 duljine ploče, uz primjenu 30 mL mobilne faze koja se sastoji
od 10 volumnih dijelova dietilamina R, 20 volumnih dijelova etil acetata R i 70 volumnih
76
dijelova toluena R. Ploča se osuši na 100-105 °C, a potom promatra pod ultraljubičastim
svjetlom na 254 nm. Glavna mrlja na kromatogramu dobivena s ispitivanom otopinom
odgovara položajem i veličinom glavnoj mrlji dobivenoj s poredbenom otopinom.
C. Daje reakciju (a) na kloride (4.1.).
PARACETAMOL
Paracetamolum
C8H9NO2 Mr = 151,2
DEFINICIJA
Paracetamol sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata N-(4-hidroksifenil)acetamida izračunato prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, djelomično topljiv u vodi, topljiv u alkoholu, vrlo slabo topljiv u metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, C.
Druga identifikacija: A, B.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 168 °C do 172 °C.
B. Otopi se 10,0 mg u metanolu R i razrijedi do 10,0 mL istim otapalom. U 0,1 mL otopine doda
se 0,1 mL klorovodične kiseline R (10,3 g/L) i razrijedi do 10,0 mL metanolom R. Otopina se
zaštiti od utjecaja svjetlosti i odmah se izmjeri apsorbancija (4.3.) na apsorpcijskom
maksimumu od 249 nm. Specifična apsorbancija na 249 nm iznosi od 860 do 980.
C. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Uzorak se pripremi u obliku diskova
(pločica). Spektar ispitivane supstancije usporedi se sa spektrom paracetamola CRS.
PROKAIN HIDROKLORID
Procaini hydrochloridum
C13H21ClN2O2 Mr = 272,8
DEFINICIJA
Prokain hidroklorid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 2-(dietilamino)etil-4-aminobenzoat
hidroklorida, što se izračuna prema suhoj tvari.
77
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, vrlo lako topljivi u vodi, topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B, D.
Druga identifikacija: A, C, D, E.
Otopina S. Mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) otopi se u 5 mL vode bez ugljikova dioksida R.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 154 °C do 158 °C.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Spektar ispitivane supstancije usporedi se
sa spektrom prokain hidroklorida CRS.
C. U 0,2 mL otopine S doda se 2 mL vode R i 0,5 mL razrijeđene sumporne kiseline R te
protrese. Doda se kap otopine kalijevog permanganata R (1 g/L). Boja odmah nestane.
D. Daje reakciju (a) klorida (4.1.).
E. 1 mL otopine S razrijedi se do 10 mL vodom R; 2 mL prethodno pripremljene otopine daje
reakciju primarnih aromatskih amina (4.1.).
PROPRANOLOL HIDROKLORID
Propranololi hydrochloridum
C16H22ClNO2 Mr = 295,8
DEFINICIJA
Propranolol hidroklorid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata (2RS)-1-[(1-metiletil)amino]-3-
(naftalen-1-iloksi)propan-2-ol hidroklorida, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel prašak, topljiv u vodi i alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: B, C.
Druga identifikacija: A, C.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 163 ºC do 166 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
propranolol hidroklorida CRS.
C. Daje reakciju (a) na kloride (4.1.).
78
REZORCINOL
Resorcinolum
C6 H6 O2 Mr = 110,1
DEFINICIJA
Rezorcinol sadrži od 98,5% do 101,0% ekvivalenata benzen-1,3-diola, što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bezbojan ili slabo ružičastosiv, kristaliničan prašak ili kristali, izloženi svjetlosti i zraku postaju
crveni. Vrlo lako topljivi u vodi i alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
A. Određivanje tališta (4.6.): od 109 °C do 112 °C.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 1 mL vode R, doda 1 mL otopine
koncentriranog natrijeva hidroksida R i 0,1 mL kloroforma R, zagrije i ohladi. Nastane
intenzivno tamnocrveno obojenje koje nakon dodavanja blagog suviška klorovodične
kiseline R prelazi u blijedožuto.
C. Dobro se izmiješa mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) s jednakom količinom kalijeva
hidrogenftalata R. Oprezno se grije iznad otvorenog plamena do pojave narančastožutog
obojenja. Ohladi se, doda 1 mL razrijeđene otopine natrijeva hidroksida R, 10 mL vode R i
mućka dok se potpuno ne otopi. Otopina pokazuje intenzivnu zelenu fluorescenciju.
SALICILNA KISELINA
Acidum salicylicum
C7 H6 O3 Mr = 138,1
DEFINICIJA
Salicilna kiselina sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata 2-hidroksibenzenkarboksilne kiseline, što
se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel kristaliničan prašak, bijeli ili prozirni, tanki, igličasti kristali. Teško topljivi u vodi, lako topljivi u
alkoholu i umjereno topljivi u metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 158 ºC do 161 ºC.
79
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
salicilne kiseline CRS.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL 0,05 M natrijeva hidroksida R i,
ukoliko je potrebno, neutralizira; 1 mL te otopine daje reakciju (a) salicilata (4.1.).
SULFANILAMID
Sulfanilamidum
C6 H8 N2 O2 S Mr = 172,2
DEFINICIJA
Sulfanilamid sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 4-aminobenzensulfonamida, što se izračuna
prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijeli ili žućkastobijeli kristali, teško topljivi u vodi, lako topljivi u acetonu, umjereno topljivi u
alkoholu, gotovo netopljivi u metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
A. Određivanje tališta (4.6.): od 164,5 °C do 166,0 °C.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Spektar ispitivane tvari usporedi se sa
spektrom sulfanilamida CRS. Uzorci za ispitivanje pripreme se u obliku pločica.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) 5 mL 1 M klorovodične kiseline. Razrijedi
se 1 mL te otopine do 10 mL vodom R. Tako pripremljena otopina, bez daljnjeg
zakiseljavanja, daje reakciju primarnih aromatskih amina (4.1.).
SULFATIAZOL
Sulfathiazolum
C9 H 9 N 3 O 2 S 2 Mr = 255,3
DEFINICIJA
Sulfatiazol sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 4-amino-N-(tiazol-2-il)benzensulfonamida, što
se izračuna prema suhoj tvari.
80
ZNAČAJKE
Bijel ili slabo žućkast kristaliničan prašak, gotovo netopljiv u vodi, teško topljiv u alkoholu. Otapa se
u razrijeđenim otopinama alkalijskih hidroksida i razrijeđenim mineralnim kiselinama.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, B.
Druga identifikacija: A, C, D.
A. Određivanje tališta (4.6.): od 200 ºC do 203 ºC. Taljenje se može pojaviti na oko 175 ºC,
nakon čega dolazi do skrućivanja i ponovnog taljenja između 200 ºC i 203 ºC.
B. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar ispitivane tvari usporedi
se s poredbenim spektrom sulfatiazola CRS. Uzorci se ispituju pripremljeni u obliku pločica.
Ukoliko dobiveni spektri pokazuju razlike, ispitivana i poredbena tvar se odvojeno otope u
alkoholu R, upare do suha u vakuumu i snime se spektri ostatka nakon uparavanja.
C. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u smjesi sastavljenoj od 10 mL vode R i 2
mL 0,1 M natrijeva hidroksida, te se doda 0,5 mL otopine bakrova sulfata R. Nastane
sivkastoplav ili grimizan talog.
D. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL 1 M klorovodične kiseline.
Razrijedi se 1 mL te otopine do 10 mL vodom R. Tako pripremljena otopina, bez daljnjeg
zakiseljavanja, daje reakciju primarnih aromatskih amina (4.1.).
TANINSKA KISELINA
Tanninum
DEFINICIJA
Taninska kiselina mješavina je estera glukoze s galnom i 3-galoilgalnom kiselinom.
ZNAČAJKE
Žućkastobijel ili svijetlosmeđ, amorfan, lagan prašak ili sjajne pločice. Vrlo lako topljivi u vodi, lako
topljivi u acetonu, alkoholu i glicerolu (85%), gotovo netopljivi u metilen kloridu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL vode bez ugljikova dioksida R.
A. Razrijedi se 0,1 mL otopine S do 5 mL vodom R. Doda se 0,1 mL otopine željezova(III)
klorida R1. Nastane crnoplavo obojenje koje postane zeleno nakon dodatka 1 mL razrijeđene
otopine sumporne kiseline R.
B. U 1 mL otopine S doda se 3 mL otopine želatine R (1 g/L). Smjesa se zamuti i nastane
grudičast talog.
C. Razrijedi se 0,1 mL otopine S do 5 mL vodom R. Doda se 0,3 mL otopine barijeva hidroksida
R. Nastane zelenkastoplav talog.
81
TEOBROMIN
Theobrominum
C7 H8 N4 O2 Mr = 180,2
DEFINICIJA
Teobromin sadrži od 99,0% do 101,0% ekvivalenata 3,7-dimetil-3,7-dihidro-1H-purin-2,6-diona, što
se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel prašak, vrlo teško topljiv u vodi i etanolu, teško topljiv u amonijaku. Otapa se u razrijeđenim
otopinama alkalijskih hidroksida i u mineralnim kiselinama.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, C.
Druga identifikacija: B, C.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni se spektar usporedi sa spektrom
teobromina CRS.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 2 mL razrijeđenog amonijaka R1 uz
umjereno grijanje i potom ohladi. Kada se doda 2 mL otopine srebrova nitrata R2, otopina
ostane bistra. Zagrijavanjem otopine do vrenja i kuhanjem nekoliko minuta, stvara se bijel,
kristaliničan talog.
C. Daje reakciju ksantina (4.1.).
TIAMIN HIDROKLORID
Thiamini hydrochloridum
C12H18Cl2N4OS Mr = 337,3
DEFINICIJA
Tiamin hidroklorid sadrži od 98,5% do 101,0% ekvivalenata 3-[(4-amino-2-metilpirimidin-5-il)metil]-
5-(2-hidroksietil)-4-metiltiazol klorid hidroklorida, što se izračuna prema bezvodnoj tvari.
82
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali, vrlo lako topljivi u vodi, topljivi u
glicerolu, teško topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Prva identifikacija: A, C.
Druga identifikacija: B, C.
A. Infracrvena apsorpcijska spektrofotometrija (4.2.). Dobiveni spektar se usporedi sa spektrom
tiamin hidroklorida CRS.
B. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 5 mL vode R, doda se 0,5 mL razrijeđene
octene kiseline R i 1 mL 1 M natrijeva hidroksida, grije na vodenoj kupelji 30 minuta i potom
ohladi. Doda se 1 mL razrijeđene otopine natrijeva hidroksida R, 2 mL otopine kalijeva
heksacijanoferata(III) R, 2 mL butanola R i snažno mućka 2 minute. Gornji alkoholni sloj
pokazuje intenzivnu svijetloplavu fluorescenciju, posebice pod ultraljubičastim svjetlom pri
365 nm. Ispitivanje se ponovi primjenom 0,9 mL 1 M natrijeva hidroksida i 0,2 g natrijeva
sulfita R umjesto 1 mL 1 M natrijeva hidroksida. Fluorescencija gotovo da nije uočljiva.
C. Daje reakciju (a) klorida (4.1.).
VINSKA KISELINA
Acidum tartaricum
C4 H6 O6 Mr = 150,1
DEFINICIJA
Vinska kiselina sadrži od 99,5% do 101,0% ekvivalenata (2R,3R)-2,3-dihidroksibutandioične kiseline,
što se izračuna prema suhoj tvari.
ZNAČAJKE
Bijel ili gotovo bijel kristaliničan prašak ili bezbojni kristali. Vrlo lako topljivi u vodi, lako topljivi u alkoholu.
IDENTIFIKACIJA
Otopina S. Otopi se mala količina ispitivane tvari (vrh špatule) u 3 mL destilirane vode R.
A. Otopina S reagira jako kiselo (4.1.).
B. Daje reakcije tartarata (4.1.).
83
4. 10. IDENTIFIKACIJA AKTIVNIH TVARI U LJEKOVITOM OBLIKU
84
4.10.2. TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI
85
na kromatografskim pikovima dobivenim analizom ispitivane i poredbenih otopina, te uvidom
u Registar lijekova RH, utvrdi se identitet ispitivanog ljekovitog oblika.
m AU
700
600
500
400
300
200
100
0 1 2 3 4 m in
m AU
1000
800
600
400
200
0 1 2 3 4 m in
Slika 4. Kromatogram poredbene otopine acetilsalicilne kiseline CRS i askorbinske kiseline CRS
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
86
5. ISPITIVANJE ČISTOĆE FARMACEUTSKIH TVARI
1
International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline on Impurities in New Drug Substances
Q3A, 2006.
2
International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline on Impurities in New Drug Products
Q3B, 2006.
87
Europska farmakopeja u općim tekstovima donosi posebno poglavlje o Kontroli onečišćenja
u tvarima za farmaceutsku primjenu (Control of impurities in substances for pharmaceutical
use). Postavljene granice za onečišćenja u ljekovitim tvarima ovise o namjeni ispitivane
farmaceutske tvari, primjerice, o načinu primjene, količini i učestalosti doziranja (odnosno
dnevnoj dozi). Farmaceutski zahtjevi i analitički postupci ispitivanja pojedinih onečišćenja
koja je potrebno kontrolirati opisani su u monografijama Europske farmakopeje, u poglavlju
Ispitivanja (Tests). Postupci ispitivanja najčešće obuhvaćaju: provjeru izgleda otopine
(obojenost, bistrinu ili zamućenje), kiselosti/lužnatosti otopine ili mjerenje pH vrijednosti,
određivanje optičkog zakretanja, ispitivanje graničnih vrijednosti onečišćenja stranim
anionima, kationima ili teškim metalima, ispitivanje graničnih vrijednosti ili kvantitativnu
analizu onečišćenja srodnim tvarima primjenom kromatografskih ili spektroskopskih metoda,
određivanje ostatnih otapala plinskom kromatografijom, određivanje sadržaja vode te
gravimetrijsko ispitivanje čistoće (gubitak sušenjem ili sulfatni ostatak).
Ispitivanja čistoće mogu biti specifična i nespecifična. Specifična ispitivanja čistoće vrlo su
karakteristična za pojedino onečišćenje ili grupu onečišćenja (primjerice, ispitivanje
onečišćenja oksalnom kiselinom u askorbinskoj kiselini, apoatropina u atropin sulfatu, 4-
aminofenola u paracetamolu, klorida u kalijevu karbonatu, kalcija u mliječnoj kiselini, itd.).
Nespecifična ispitivanja su, primjerice, ispitivanje kiselosti/lužnatosti benzokaina, lako
karbonizirajućih i reducirajućih tvari u benzojevoj kiselini, teških metala u teofilinu, itd.
U farmakopejskim monografijama organskih farmaceutskih tvari postupci ispitivanja
organskih onečišćenja opisani su u odjeljku Srodne tvari (Related substances), a popis
specifičnih onečišćenja naveden je u poglavlju Onečišćenja (Impurities).
U poglavlju Onečišćenja na kraju monografije navedena su imena i kemijske strukture svih
onečišćenja podijeljenih u dvije skupine pod naslovima: Specificirana onečišćenja (Specified
impurities) i Ostala onečišćenja koja se mogu dokazati (Other detectable impurities).
Specificirana onečišćenja su poznata, stvarna onečišćenja koja su identificirana, s poznatom
kemijskom strukturom ili, pak, neidentificirana onečišćenja koja se definiraju isključivo
kvalitativnim analitičkim svojstvima, na primjer, kromatografskim vremenom zadržavanja.
Ukoliko su organska onečišćenja u farmaceutskim tvarima čija je maksimalna dnevna doza ≤
2 g/dan prisutna u količini većoj od 0,1%, potrebna je karakterizacija njihove strukture. Za
dnevne doze aktivne tvari koje su veće od 2 g/dan dopuštena granica se pomiče na 0,05%.
Onečišćenja koja imaju farmakološki učinak moraju biti na granici nižoj od 0,1%. Ostala
onečišćenja koja se mogu dokazati su moguća onečišćenja koja nisu pronađena niti u jednom
ispitivanom uzorku tijekom izrade farmakopejske monografije, ali je njihov sadržaj po ICH
88
smjernicama ograničen. Ta onečišćenja mogu nastati u proizvodnom postupku ili stajanjem
(starenjem), a mogu (ali i ne moraju) biti prisutna u ispitivanoj ljekovitoj tvari.
Ako se promijeni postupak proizvodnje ljekovitih tvari već dostupnih na tržištu, u njima se
mogu naći nova onečišćenja. U tom slučaju, nova onečišćenja se moraju specificirati i uvrstiti
u listu onečišćenja. Tijekom revizije postojećih monografija, u tekst istih unosi se opis
postupka ispitivanja na srodne tvari i poglavlje Onečišćenja dopunjuje popisom specificiranih
i ostalih onečišćenja koja se mogu dokazati u ispitivanoj farmaceutskoj tvari. Kako bi se
osigurala sigurnost i kakvoća lijeka, onečišćenja uključena u specifikaciji farmaceutske tvari
moraju se pojedinačno navesti, a njihov sadržaj ograničiti.
89
5.2. IZGLED OTOPINE
Bezbojne farmaceutske tvari koje sadrže ili se raspadaju na obojena onečišćenja kontroliraju
se ispitivanjem obojenosti otopine te tvari. Potrebna nijansa i intenzitet boje za usporedbu
dobivaju se miješanjem propisane količine obojenih primarnih poredbenih otopina soli: žute
otopine željezova(III) klorida R, crvene otopine kobaltova(II) klorida R, te plave otopine
bakrova(II) sulfata R i klorovodične kiseline R (Tablica 9). Točna koncentracija primarnih
poredbenih otopina određuje se redoks titracijom s 0,1 M natrijevim tiosulfatom.
Razrjeđivanjem primarnih poredbenih otopina navedenih u Tablici 9 odgovarajućim
volumenom klorovodične kiseline R, dobiva se devet različitih koncentracija za smeđu
otopinu te po sedam za ostale boje otopina. Razrijeđene otopine pripremaju se neposredno
prije upotrebe1.
Za farmaceutske tvari namijenjene parenteralnoj uporabi i za jako obojene otopine prednost se
daje mjerenju apsorbancije na odgovarajućoj valnoj duljini (obično između 400 i 450 nm),
definiranjem granične vrijednosti apsorbancija.
1
Stupanj obojenosti tekućina, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
90
Tablica 9. Priprema primarnih poredbenih otopina za ispitivanje obojenosti
Postupak
Ukoliko se zahtijeva potpuno bezbojna otopina, ispitivanje obojenosti otopine provodi se
jednom od dvije propisane metode usporedbom s odgovarajućom poredbenom otopinom ili
vodom (otapalom). Ako se nijansa boje mijenja ovisno o uzorku, navode se dvije ili više
poredbenih otopina istog stupnja obojenja.
Farmaceutski uzorak odgovara propisu ako boja otopine ispitivane tvari nije jačeg intenziteta
od boje poredbene otopine.
Metoda I
Promatranjem sloja otopine duž osi epruvete od bezbojnog stakla, unutrašnjeg promjera 12
mm, iznad bijele podloge, usporedi se intenzitet boje 2,0 mL ispitivane otopine s 2,0 mL vode
(otapala) ili odgovarajuće poredbene otopine navedene u monografiji ispitivane tvari.
Metoda II
Promatranjem sloja otopine debljine 40 mm duž osi epruvete od bezbojnog stakla, ravnog dna
i unutrašnjeg promjera od 15 do 25 mm naspram bijele podloge, usporedi se intenzitet boje
ispitivane otopine i vode (otapala) ili odgovarajuće poredbene otopine navedene u
monografiji ispitivane tvari.
Ispitivanje bistrine i stupnja zamućenja provodi se za bezbojne ili blago obojene otopine
usporedbom s poredbenim suspenzijama koje se dobiju miješanjem otopine hidrazin sulfata R
i otopine heksametilentetramina R. Za jako obojene otopine stupanj zamućenja ispituje se
instrumentalnim metodama poput turbidimetrije (mjerenje propuštene svjetlosti) i
nefelometrije (mjerenje raspršene svjetlosti).
91
Postupak
Promatranjem sloja otopine debljine 40 mm duž osi epruvete od bezbojnog stakla, ravnog dna
i unutrašnjeg promjera od 15 do 25 mm naspram tamne podloge, usporedi se ispitivana
otopina s odgovarajućom poredbenom otopinom navedenom u monografiji. Uzorak odgovara
propisu ako zamućenje otopine ispitivane tvari nije jačeg intenziteta od poredbene otopine.
Ukoliko se zahtijeva potpuno bistra otopina, ispitivanje se provodi usporedbom s vodom
odnosno otapalom.
Otopina heksametilentetramina
Otopi se 2,5 g heksametilentetramina R u 25,0 mL vode R u tikvici od 100 mL.
Primarna suspenzija
U tikvicu s otopinom heksametilentetramina doda se 25,0 mL otopine hidrazin sulfata,
promiješa i ostavi stajati 24 sata.
Poredbene suspenzije
Razrijedi se 1,5 mL primarne suspenzije vodom R do 100,0 mL. Priprema se svježa suspenzija
koja se može pohraniti najduže 24 sata. Poredbene suspenzije pripreme se miješanjem s
vodom prema Tablici 10 te se promiješaju prije upotrebe.
Vježbe
Ovim nespecifičnim ispitivanjima se pokazuje razina kiselih ili lužnatih onečišćenja koja
potječu iz proizvodnje ili razgradnje farmaceutskih tvari. Ispitivanje protolitičkih onečišćenja
prema Europskoj farmakopeji može se provesti potenciometrijskim mjerenjem pH vrijednosti
ili ispitivanjem kiselosti i/ili lužnatosti otopine farmaceutske tvari polukvantitativnom
titracijom uz odgovarajući indikator.
93
Postupak
U monografiji je propisan postupak pripreme ispitivane otopine, vrsta indikatora, te su
navedene količine i koncentracije klorovodične kiseline, odnosno natrijeva hidroksida, koje je
potrebno dodati pri praćenju promjene boje indikatora. Otopine ispitivanih tvari pripremaju se
u vodi bez ugljikova dioksida.
Ukoliko ispitivana farmaceutska tvar ima svojstva pufera, propisano je potenciometrijsko
mjerenje pH vrijednosti1. Ako dodatak kiseline ili lužine uzrokuje razgradnju ili taloženje u
ispitivanoj otopini, također je propisano mjerenje pH.
Vježbe
1
Potenciometrijsko određivanje pH, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur. ili vidjeti
poglavlje 4.5.
94
Ispitivanje kiselosti otopine kofeina
Priprema otopine S. Uz zagrijavanje se otopi 0,10 g kofeina u 10 mL vode bez ugljikova
dioksida R pripremljene iz destilirane vode R, ohladi i dopuni do 10 mL istim otapalom.
U 10 mL otopine S doda se 1 kap otopine bromtimol plavoga R1. Otopina je zeleno ili žuto
obojena. Za promjenu boje indikatora u plavu mora biti dovoljno 0,2 mL 0,01 M natrijeva
hidroksida. U protivnom, otopina kofeina sadrži suvišak kiselina.
95
tvari topljivih u vodi1. U kontroli čistoće organskih tvari koje mogu biti onečišćene i s više
stranih aniona najčešće je dovoljno provesti ispitivanje na kloride i/ili sulfate, odnosno na
najprisutniji anion. Pojedini kationi su toksični pa je njihova prisutnost strogo ograničena, što
se kontrolira posebnim postupkom ispitivanja teških metala. Ukoliko nema posebnog razloga
za ograničavanje pojedinih kationa, većina ih se kontrolira određivanjem sulfatnog ostatka.
Kod anorganskih ljekovitih i pomoćnih tvari provodi se mnogo veći broj ispitivanja na strane ione.
Postupak
Kloridi
Značajka ispitivanja
Nakon što odstoji 5 minuta zaštićeno od svjetla zamućenje ispitivane otopine ne smije biti jače od
zamućenja poredbene otopine.
Sulfati
Sve otopine u graničnom ispitivanju sulfata pripremaju se s destiliranom vodom R.
15 mL poredbene otopine
1 15 mL ispitivane otopine
sulfata (10 ppm SO4) R 2
U 4,5 mL poredbene otopine sulfata (10 ppm SO4) R1 doda se 3 mL otopine barijeva klorida
2
R (250 g/L), promiješa i ostavi stajati 1 minutu.
U 2,5 mL otopine iz koraka 2 doda se 15 mL ispitivane otopine (odnosno 15 mL poredbene
3
otopine) i 0,5 mL octene kiseline R.
4 Otopine se usporede promatranjem duž osi epruvete naspram tamne podloge.
Značajka ispitivanja
Nakon 5 minuta zamućenje ispitivane otopine ne smije biti jačeg intenziteta od zamućenja poredbene
otopine.
1
Utvrđivanje graničnih vrijednosti, poglavlje u Metodama analize, Ph. Eur.
2
Poredbena otopina se priprema neposredno prije upotrebe prema propisu iz Europske farmakopeje.
96
Kalcij
Značajka ispitivanja
Zamućenje ispitivane otopine ne smije biti jače od zamućenja poredbene otopine.
Vježbe
2
Poredbena otopina se priprema neposredno prije upotrebe prema propisu iz Europske farmakopeje.
97
Razrijedi se 10 mL otopine S do 15 mL octenom kiselinom R. Ta otopina odgovara ispitivanju
graničnih vrijednosti za sulfate i ne smije sadržavati više od 150 ppm sulfata. Poredbena
otopina sadrži smjesu od 7,5 mL poredbene otopine sulfata (10 ppm) R i 7,5 mL destilirane vode R.
Ispitivanje enantiomerne čistoće lijekova dobiva sve veći značaj u farmaceutskoj kontroli
kakvoće1. Europska farmakopeja u najvećem broju monografija propisuje određivanje
specifičnog optičkog zakretanja, ali sve češće se čistoća kiralnih ljekovitih tvari određuje
kromatografskim metodama na kiralnim stacionarnim fazama. Cirkularni dikroizam je, kao
optička tehnika za dokazivanje i određivanje kiralnih spojeva, opisan u poglavlju Fizikalne i
fizikalno-kemijske metode, no još uvijek nije implementiran u monografije Europske
farmakopeje u rutinskoj kontroli kakvoće.
Ispitivanje optičkog zakretanja primjenjuje se u prosudbi čistoće optički aktivnih tvari
izračunavanjem specifičnog optičkog zakretanja ili za ograničavanje prisutnosti optički
aktivnih onečišćenja u optički neaktivnoj tvari (racematu ili racemičnoj smjesi). U drugom
slučaju, izmjerena vrijednost kuta optičke rotacije nalazi se u rasponu od + 0,10° do – 0,10°.
Ispitivanje optičkog zakretanja nije pogodno za jako obojene ili zamućene otopine. Metoda je
manje osjetljiva od kiralne tekućinske kromatografije.
1
E. Francotte, W. Linder, Chirality in Drug Research, Wiley-VCH, New York, 2006.
98
Postupak
U monografiji ispitivane tvari definirana je vrsta otapala i koncentracija ispitivane tvari koja
mora biti dovoljno visoka kako bi omogućila pouzdano određivanje kuta zakretanja.
Specifično optičko zakretanje [α ]D izračunava se prema ispitivanoj suhoj tvari (poglavlje
20
Vježbe
99
5.6. ONEČIŠĆENJA SRODNIM TVARIMA
Srodne tvari su poznata onečišćenja, često srodne kemijske strukture, koja mogu biti
identificirana ili neidentificirana. Uključuju međuprodukte i nusprodukte proizvodnog
postupka u sintetičkim organskim tvarima, razgradne produkte, te ekstrahirane tvari iz
prirodnih produkata1. Srodne tvari ne uključuju ostatke organskih otapala, vodu, anorganska
onečišćenja, ostatke stanica i mikroorganizama niti medija iz postupka fermentacije.
Srodna onečišćenja mogu se kontrolirati različitim kromatografskim i spektroskopskim
metodama ili njihovom kombinacijom, ali u većini farmaceutskih tvari se ispituju tehnikama
odjeljivanja, poput tankoslojne kromatografije, tekućinske kromatografije visoke
2,3
djelotvornosti te plinske kromatografije . U Europskoj farmakopeji se srodne tvari
kontroliraju UV-Vis spektrofotometrijom samo u manjem broju monografija, kada srodno
onečišćenje pridonosi mjerenoj apsorbanciji na određenoj valnoj duljini.
Neovisno o tehnici koja se primjenjuje u kontroli onečišćenja, poznavanje putova sinteze i
razgradnje tvari temelj je razvoja ispitivanja srodnih tvari, kojima će se one moći odvojiti od
ispitivane tvari te međusobno dobro razlikovati. Opisane analitičke metode u odjeljku Srodne
tvari poglavlja Ispitivanja kontroliraju većinu onečišćenja različitih putova sinteze u
proizvodnji ljekovitih tvari.
određenoj valnoj duljini ili omjer dviju apsorbancija. U odjeljku Apsorbancija u poglavlju
Ispitivanja u farmakopejskim monografijama navode se ispitivanja čistoće UV-Vis
spektrofotometrijom (primjerice, za cefaleksin, benzilpenicilin natrij, oksitetraciklin, laktozu,
itd.). Ispitivanje čistoće može se također definirati specifičnim imenom onečišćenja koje se
1
S. Ahuja, S. Scypinski (Eds.), Handbook of modern pharmaceutical analysis, Academic Press, San Diego, 2010.
2
S. Ahuja, K. M. Alsante (Eds.), Handbook of Isolation and Characterisation of Impurities in Pharmaceuticals,
Academic Press, San Diego, 2003.
3
L. Ohannesian, A. J. Streeter (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Anlysis (Drugs and the Pharmaceutical
Sciences: a Series of Textbooks and monographs), Marcel Dekker, 2002.
4
H. Perkampus, Uv-Vis Spectroscopy and Its Applications, Springer, London, 2012.
100
nadzire za to propisanim ispitivanjem (primjerice, slobodni kloramfenikol u kloramfenikol
palmitatu, reducirajuće tvari u ergokalciferolu, oksidacijski produkti u rezerpinu, itd.).
Kada je propisana u monografiji, specifična apsorbancija se mora kretati unutar propisanih
vrijednosti da bi ispitivani uzorak odgovarao postavljenim kriterijima čistoće, ili se zahtijeva
da ne prelazi određenu vrijednost. Primjerice, količina apohioscina u hioscin hidrobromidu
ograničena je specifičnom apsorbancijom na 245 nm, koja smije najviše iznositi 3,6, a to
odgovara prisutnosti najviše 0,5% apoatropina.
Ako je za ispitivanje onečišćenja propisana apsorbancija, najčešće se zahtijeva da ne prijeđe
određenu vrijednost. Apsorbancija se mjeri na određenoj valnoj duljini na kojoj ispitivani
uzorak ne apsorbira, a onečišćenje pokazuje maksimum apsorpcije. U manjem broju
ispitivanja čistoće propisano je da apsorbancija ne smije biti veća od apsorbancije poredbene
otopine koja sadrži gornju dozvoljenu količinu onečišćenja (na primjer, 0,2% reducirajućih
šećera u betadeksu).
Kao kriterij za ispitivanje onečišćenja može se propisati omjer apsorbancija na dvije različite
valne duljine, od kojih je jedna najčešće apsorpcijski maksimum onečišćenja, a druga
apsorpcijski maksimum ispitivane tvari. Da bi farmaceutski uzorak odgovarao zahtjevima
čistoće, omjer apsorbancija ne smije prijeći određenu vrijednost.
Osim izravnim mjerenjem, apsorbancija ispitivane otopine može se mjeriti nakon provedene
kemijske reakcije. Dodani reagens s onečišćenjem stvara produkt koji apsorbira na valnoj
duljini na kojoj ispitivana tvar ne apsorbira. Primjer derivatizacije onečišćenja je reakcija
salicilne kiseline (moguće onečišćenje u karbasalat kalciju) sa željezovim(III) kloridom, pri
čemu nastaje obojeni kompleksni spoj pa se apsorbancija mjeri u vidljivom području na 525
nm (najveća dozvoljena koncentracija salicilne kiseline u karbasalat kalciju je 0,5%).
Također, reakcijom formaldehida i kromotropne kiseline nastaje obojeni produkt koji
apsorbira na 567 nm te se mjerenjem apsorbancije na toj valnoj duljini kontrolira čistoća
makrogola (najveća dozvoljena koncentracija formaldehida je 15 ppm).
Postupak
U propisu se navodi priprema ispitivane otopine, a kad je potrebno i postupak njezinog
razrjeđivanja te valna duljina na kojoj se apsorbancija mjeri. Apsorbancija ispitivane otopine
mjeri se na prethodno kalibriranom instrumentu1. Ako je specifična apsorbancija propisana kao
kriterij ispitivanja čistoće farmaceutske tvari, izračunava se iz izmjerene vrijednosti apsorbancije.
1
UV-Vis spektrofotometrija, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur. ili vidjeti
poglavlje 4.3.
101
Primjeri
Ispitivanje čistoće betakarotena
Priprema otopine A. Otopi se 25,0 mg ispitivane tvari u 5 mL kloroforma R i razrijedi odmah
do 50,0 mL cikloheksanom R. Potom se razrijedi 0,5 mL te otopine do 10,0 mL
cikloheksanom R.
Priprema otopine B. Razrijedi se 1,0 mL otopine A do 10,0 mL cikloheksanom R.
Izmjeri se apsorbancija otopine B na 455 nm i otopine A na 340 nm. Omjer apsorbancija na
455 nm i 340 nm ne smije biti manji od 1,5.
Vježbe
103
Kao stacionarna faza u tankoslojnoj kromatografiji najčešće se primjenjuje silikagel za
kromatografiju, koji se sa svojim značajkama navodi u popisu reagensa. Silikagel s oznakom G
kao vezivo sadrži 13% kalcijeva sulfata hemihidrata, dok silikagel GF254 osim veziva sadrži i
1,5% fluorescentnog indikatora s optimalnim intenzitetom fluorescencije na 254 nm. Silikagel
H je silikagel bez veziva, veličine čestica 15 µm. Od organskih stacionarnih faza najčešće se
upotrebljava celuloza. Rjeđe se zahtijeva upotreba modificiranog adsorbensa dobivenog
silanizacijom silikagela ili obradom s odgovarajućim otapalom prije nanošenja ispitivane i
poredbene otopine na kromatografsku ploču.
Tankoslojna kromatografija je našla široku primjenu u rutinskoj analizi farmaceutske kakvoće
kao jeftina i jednostavna tehnika analize gotovo svih nehlapljivih onečišćenja.
Postupak
U monografiji farmaceutske tvari propisana je priprema ispitivane otopine te jedne ili više
poredbenih otopina, potom vrsta stacionarne i sastav mobilne faze, volumeni otopina koji se
nanose na ploču, vrijeme razvijanja kromatograma i način dokazivanja odijeljenih sastojaka.
Ispitivana i poredbena otopina nanose se u jednakim i malim volumenima (poglavlje 4.4.), kako
bi se kromatografske mrlje mogle valjano uspoređivati. Osim kromatografske mrlje ispitivane
tvari, nakon razvijanja kromatograma i provedenog dokazivanja utvrđuje se i mrlja onečišćenja.
Ona se prema intenzitetu uspoređuje s kromatografskom mrljom poznatog onečišćenja na istoj
ploči ili s mrljama dobivenim pomoću propisno razrijeđene ispitivane otopine.
Primjer
Ispitivanje čistoće kalcijeva pantotenata
3-aminopropionska kiselina. Ispituje se tankoslojnom kromatografijom uz upotrebu silikagela G
R kao stacionarne faze. Ispitivana otopina (a) pripremi se tako da se 0,2 g ispitivane tvari otopi u
vodi R te razrijedi do 5 mL istim otapalom. Ispitivana otopina (b) dobije se razrjeđivanjem 1 mL
ispitivane otopine (a) do 10 mL vodom R. Poredbena otopina (a) pripremi se tako da se otopi 20
mg kalcijeva pantotenata CRS u vodi R te razrijedi do 5 mL istim otapalom. Poredbena otopina
(b) dobije se tako da se 10 mg 3-aminopropionske kiseline R otopi u vodi R i razrijedi do 50 mL
istim otapalom.
Na kromatografsku ploču nanese se po 5 µL svake otopine. Kromatogram se razvija do duljine
puta mobilne faze od 2/3 duljine ploče, a kao mobilna faza primjenjuje se smjesa od 35 volumnih
dijelova vode R i 65 volumnih dijelova etanola R. Ploča se osuši u struji zraka i prska otopinom
ninhidrina R1, te se zagrije na 110 °C tijekom 10 minuta. Mrlja dobivena na kromatogramu
104
ispitivane otopine (a), koja odgovara 3-aminopropionskoj kiselini, ne smije biti intenzivnija od
mrlje dobivene na kromatogramu poredbene otopine (b) (dozvoljeno je najviše 0,5% 3-
aminopropionske kiseline u kalcijevu pantotenatu).
Vježbe
105
ultraljubičastim svjetlom na 254 nm. Bilo koja mrlja različita od glavne mrlje na
kromatogramu dobivenom s 20 µL ispitivane otopine mora biti manjeg intenziteta od mrlje
dobivene s poredbenom otopinom (b) (najviše 0,5% onečišćenja u kloramfenikolu).
1
S. Ahuja, M. Dong (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Academic press, San Diego, 2005.
2
Y. Kazekevich, R. LoBrutto, HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley & Sons Inc., New Jersey, 2007.
106
Mobilnu fazu najčešće čini smjesa otapala različite polarnosti. Izbor optimalne mobilne faze
važan je u ispitivanju profila čistoće lijeka. U kromatografskom postupku može se primijeniti
izokratična eluacija nepromijenjenim sastavom mobilne faze ili gradijentna eluacija tijekom
koje se mijenja sastav mobilne faze. Prije kromatografskog postupka nužno je iz mobilne faze
ukloniti otopljene plinove i profiltrirati je, kako bi se odstranile čestice veće od 0,45 µm.
Vrsta uzorka, njegova polarnost i topljivost određuju izbor stacionarne faze i kromatografske
tehnike. Dobar izbor stacionarne faze i polarnosti otapala za određeni farmaceutski uzorak
osigurat će dobru djelotvornost kolone koja se izražava brojem teorijskih tavana
2
t
N = 5,54 R
w1 / 2
gdje je tR vrijeme zadržavanja tvari na koloni, a w1/2 širina pika na polovici maksimalne
visine.
Faktor kapaciteta ili omjer distribucije mase opisuje brzinu gibanja tvari u koloni, a definira
se kao
tR − tM
k'=
tM
gdje je tM vrijeme prolaska sastojka koji se ne zadržava na koloni, odnosno vrijeme potrebno
da molekule mobilne faze prođu kroz kolonu.
Ostali parametri koji određuju djelotvornost kolone i dobro odjeljivanje sastojaka uzorka su
koeficijent selektivnosti i razlučivanje.
Koeficijent selektivnosti ili relativno zadržavanje kolone za dva sastojka smjese može se
izraziti kao
t R 2 − t M k '2
α= = .
t R1 − t M k '1
1,18(t R 2 − t R1 )
Rs = .
w1 / 2 2 + w1 / 2 1
Razlučivanje veće od 1,5 odgovara odjeljivanju dvaju susjednih pikova na osnovnoj liniji. Pri
razlučivanju od 1,5 preklapanje susjednih pikova iznosi svega 0,3%.
Ispitivanje prikladnosti kromatografskog sustava čini sastavni dio metode. Ono osigurava
valjano provođenje kromatografskog postupka u uvjetima koji su prikladni za ispitivanje
čistoće tvari, odnosno u kojima su pikovi mogućih onečišćenja odijeljeni od pika ispitivanog
107
spoja. U najvećem broju monografija Europske farmakopeje opisani kromatografski postupci
propisuju da ispitivanje čistoće farmaceutske tvari nije valjano ako razlučivanje između
pikova ispitivane tvari i onečišćenja ne doseže određenu propisanu vrijednost. Razlučivanje se
može definirati i prema nekoj drugoj tvari koja je kemijski slična ispitivanoj tvari. Primjerice,
u kromatografskoj metodi za ispitivanje čistoće kortizona razlučivanje se određuje
hidrokortizonom, za benzilpenicilin natrij feniloctenom kiselinom, a za cefaleksin
cefradinom.
Ukoliko ispitivanjem prikladnosti sustava nisu dobivene propisane vrijednosti za razlučivanje,
opis kromatografskog postupka dozvoljava male promjene odgovarajućih uvjeta ispitivanja
(najčešće sastava mobilne faze), kako bi se postigle propisane vrijednosti i ispitivanje provelo
u skladu sa zahtjevima.
Kao poredbene otopine u tekućinskoj kromatografiji za ispitivanje srodnih onečišćenja
upotrebljavaju se otopine određenih kontroliranih onečišćenja u točno propisanim
koncentracijama (primjerice, poredbena otopina salicilne kiseline u kontroli čistoće
acetilsalicilne kiseline, poredbena otopina diklofenaka za ispitivanje čistoće aceklofenaka,
poredbena otopina metilnitrozoindolina u kontroli indapamida, itd.). Može se primijeniti i
razrijeđena otopina ispitivane tvari (primjerice, u ispitivanju čistoće budezonida, kokain
hidroklorida, mikonazol nitrata, piroksikama, itd.). Da bi se smanjile nepravilnosti pikova,
ispitivana i poredbena otopina pripremaju se upotrebom mobilne faze kao otapala.
Kvantitativna analiza prisutnih onečišćenja temelji se na usporedbi površina pikova
ispitivanih onečišćenja i površine odgovarajućeg pika poredbene tvari1. U ispitivanju čistoće
tekućinskom kromatografijom primjenjuje se i metoda ukupne površine. Postotak sadržaja
jednog ili više sastojaka ispitivane tvari (cx) izračunava se iz omjera površine pika ili više
pikova i ukupne površine svih pikova
Ax / f x
cx =
∑ ( An / f n )
gdje je Ax površina ispitivanog pika, fx faktor odgovora detektora, a Σ(An/fn) ukupna površina
svih pikova. Metodom ukupne površine moguće je odrediti onečišćenja ukoliko je faktor
odgovora detektora ispitivanih onečišćenja približno isti.
1
D. Lee, M. L. Webb (Eds.), Pharmaceutical Analysis, Blackwell Publishers, 2008.
108
Postupak
U monografiji farmaceutske tvari propisana je priprema ispitivane te jedne ili više poredbenih
otopina, navedene su značajke kolone (kao što su dužina i unutrašnji promjer), vrsta
stacionarne faze te veličina zrnaca i pora, sastav i brzina protoka mobilne faze, temperatura
kolone (ako je drugačija od sobne), kao i način dokazivanja odijeljenih sastojaka. Injektiraju
se propisani jednaki volumeni ispitivane i poredbene otopine te se provodi postupak
odjeljivanja propisano vrijeme, koje se najčešće utvrđuje prema vremenu zadržavanja
ispitivane tvari. Opisom metode obuhvaćeno je i ispitivanje prikladnosti kromatografskog
postupka određivanjem razlučivanja pojedinih pikova.
Kao kriterij za ispitivanje onečišćenja propisuje se zahtjev da na kromatogramu ispitivane
tvari površina bilo kojeg pika, osim glavnog, ne smije biti veća od površine odgovarajućeg
pika na kromatogramu poredbene otopine. Nadalje, zbroj površina pikova svih onečišćenja ne
smije biti veći od određene površine glavnog pika na kromatogramu poredbene otopine. U
tom slučaju propisana je granica za površinu pikova koji se ne uključuju u računanje ukupnog
zbroja površine svih pikova onečišćenja. Primjerice, niti jedan pik na kromatogramu s
površinom manjom od 1/10 površine pika poredbene otopine ne smije biti uključen u
zbrajanje površina pikova onečišćenja.
Primjeri
109
Poredbena otopina (d) dobiva se tako da se 20,0 mg 4-nitrofenola R otopi u metanolu R te
razrijedi do 50,0 mL istim otapalom. Potom se 1,0 mL te otopine razrijedi do 20,0 mL
mobilnom fazom.
Stacionarna faza je kolona od nehrđajućeg čelika, dugačka 0,25 m, unutrašnjeg promjera 4,6
mm i napunjena oktadecilsilil silikagelom za kromatografiju R (5 µm). Temperatura kolone je
35 °C. Mobilna faza je smjesa od 375 volumnih dijelova otopine dinatrijeva hidrogen fosfata
R (17,9 g/L), 250 volumnih dijelova otopine natrijeva dihidrogenfosfata R (7,8 g/L) i 250
volumnih dijelova metanola R, koji sadrži 4,6 g/L otopine tetrabutilamonijeva hidroksida R
(400 g/L). Brzina protoka mobilne faze je 1,5 mL/min. Dokazivanje se provodi na 245 nm.
Injektira se po 20 µL od svake otopine. Vrijeme trajanja analize je 12 puta duže od vremena
zadržavanja paracetamola (oko 4 minute). Relativno vrijeme zadržavanja u odnosu na
paracetamol za onečišćenje K je oko 0,8, za onečišćenje F oko 3, a za onečišćenje J oko 7.
Prikladnost sustava ispituje se primjenom poredbene otopine (c). Razlučivanje između pikova
onečišćenja K i paracetamola mora biti najmanje 0,4. Odnos signala i šuma mora biti
najmanje 50 za pik onečišćenja J.
Granične vrijednosti:
Onečišćenje J (kloroacetanilid): površina pika kloroacetanilida ne smije biti veća od 0,2 puta
površine odgovarajućeg pika na kromatogramu poredbene otopine (c) (najviše 10 ppm
kloroacetanilida).
Ostala onečišćenja: površina bilo kojeg pika onečišćenja na kromatogramu poredbene otopine
(a) ne smije biti veća od polovice površine osnovnog pika na kromatogramu poredbene
otopine (a) (najviše 0,05% pojedinačnih ostalih onečišćenja).
110
Ispitivanje čistoće teofilina
111
Vježba
Poredbena otopina (a) dobiva se tako da se otopi 10,0 mg salicilne kiseline R u mobilnoj fazi
i razrijedi do 10,0 mL mobilnom fazom. Zatim se 100 µL te otopine razrijedi do 10,0 mL
mobilnom fazom.
Poredbena otopina (b) pripremi se tako da se 10,0 mg salicilne kiseline R otopi u mobilnoj
fazi i razrijedi do 10,0 mL mobilnom fazom. U 100 µL te otopine doda se 20 µL ispitivane
otopine te razrijedi do 10,0 mL mobilnom fazom.
Stacionarna faza je kolona od nehrđajućeg čelika, dugačka 0,25 m, unutrašnjeg promjera 4,6
mm i napunjena oktadecilsilil silikagelom za kromatografiju R (5 µm). Mobilna faza je smjesa
od 2 volumna dijela fosforne kiseline R, 400 volumnih dijelova acetonitrila za kromatografiju
R i 600 volumnih dijelova vode R. Brzina protoka mobilne faze je 1 mL/min. Dokazivanje se
provodi na 237 nm.
112
5.10. ISPITIVANJE HLAPLJIVIH ONEČIŠĆENJA PLINSKOM
KROMATOGRAFIJOM
1
R. L. Grob, E. F. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography, Wiley & Sons Inc., New Jersey, 2004.
2
International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline on Impurities: Guideline for Residual
Solvents Q3C, 2011.
113
specifičnu površinu i najčešće je to dijatomejska zemlja, impregnirana tankim slojem tekuće
stacionarne faze različite polarnosti (makrogol, polietilenglikol, polisiloksani). U kapilarnim
kolonama nalaze se različito supstituirani siloksani kemijski vezani na silanolne grupe
izvučenog kvarca kao stijenke kolone.
U izboru polarnosti stacionarne faze i vrste poredbenih otopina, te u ispitivanju prikladnosti
sustava, vrijede ista pravila i postupci kao i za tekućinsku kromatografiju.
U plinskoj kromatografiji temperatura je važan čimbenik koji utječe na uspješnost odjeljivanja
sastavnica uzorka. Iz tog razloga je kolona smještena u termostatiranom prostoru. Optimalna
temperatura ovisi o vrelištima sastojaka ispitivanog uzorka. U kromatografskom postupku može
se primijeniti izotermalno termostatiranje kolone konstantnom temperaturom ili programirano
povišenje temperature, koje se mijenja kontinuirano ili skokovito tijekom eluacije.
Kvantitativna analiza se često temelji na metodi s unutrašnjim standardom. Unutrašnji
standard je čista tvar koja se u poznatoj količini dodaje ispitivanoj otopini i otopini poredbene
tvari. Primjerice, u ispitivanju čistoće kolhicina kao unutrašnji standard za ispitivanje
onečišćenja etilacetatom se upotrebljava etanol, dok se propanol primjenjuje kao unutrašnji
standard za ispitivanje etanola u deksametazon natrijevu fosfatu. Koncentracija ispitivanog
onečišćenja određuje se usporedbom omjera površine pika ispitivane tvari i unutrašnjeg
standarda s omjerom površine pika poredbene tvari i unutrašnjeg standarda.
Postupak
U monografiji farmaceutske tvari navodi se priprema ispitivane te jedne ili više poredbenih
otopina, a često i otopina unutrašnjeg standarda. Propisane su značajke kolone, poput duljine i
unutrašnjeg promjera, vrste i debljine sloja stacionarne faze, vrste i brzine protoka inertnog
plina nositelja, temperature mjesta na koje se unosi uzorak, temperature kolone i detektora, te
načina dokazivanja odijeljenih sastojaka. Injektiraju se propisani jednaki volumeni ispitivane i
poredbene otopine te provodi postupak odjeljivanja propisano vrijeme, definirano najčešće u
odnosu na vrijeme zadržavanja ispitivane tvari. U opisu metode sadržano je i ispitivanje
prikladnosti kromatografskog postupka određivanjem razlučivanja pojedinih pikova.
Kao kriterij u ispitivanju onečišćenja utvrđuje se da površina bilo kojeg pika, osim glavnog,
na kromatogramu ispitivane tvari ne smije biti veća od površine odgovarajućeg pika na
kromatogramu poredbene otopine. Nadalje, zbroj površina pikova svih onečišćenja ne smije
biti veći od određene površine glavnog pika na kromatogramu poredbene otopine. U tom
slučaju je propisana granica za površinu pikova koji se ne uključuju u računanje ukupnog
zbroja površine svih pikova onečišćenja.
114
Primjeri
Srodne tvari ispituju se plinskom kromatografijom. Ispitivanu otopinu predstavlja etil acetat.
U kromatografskom postupku primjenjuje se staklena kolona duga 2 m, unutrašnjeg promjera
2 mm i napunjena etilvinilbenzen-divinilbenzen kopolimerom R (136 µm do 173 µm). Kao
plin nosač upotrebljava se dušik za kromatografiju R uz protok od 30 mL/min. Dokazivanje se
izvodi plameno-ionizacijskim detektorom podizanjem temperature za 8 °C/min, počevši od 90
°C do 240 °C. Idućih 8 minuta temperatura se održava na 240 °C, a temperatura injektora i
detektora na 240 °C.
115
Vježba
Granične vrijednosti:
Polovica površine pika metanola na kromatogramu ispitivane otopine (a) ne smije biti veća od
odgovarajućeg pika na kromatogramu poredbene otopine (a) (dozvoljeno je najviše 200 ppm
bezvodnog metanola, V/V).
Ukupna površina pikova ostalih onečišćenja na kromatogramu ispitivane otopine (b) ne smije
biti veća od površine pika 4-metilpentan-2-ola na kromatogramu ispitivane otopine (b) (najviše 300
ppm). Zanemaruju se svi pikovi s površinom manjom od 0,03 puta površine pika 4-
metilpentan-2-ola na kromatogramu ispitivane otopine (b) (najviše do 9 ppm svih
onečišćenja).
116
6. ODREĐIVANJE SADRŽAJA FARMACEUTSKIH TVARI
1
The United States Pharmacopoeia, 36th ed., USP Convention Inc., Rockville, 2013.
2
British Pharmacopoeia, Stationery Office, London, 2013.
117
kompleksometrijsko određivanje magnezija te plinska kromatografija za određivanje sastava
masnih kiselina. Ukoliko se u propisu navodi da se sadržaj izračunava prema suhoj tvari,
ispitivana tvar se suši na propisanoj temperaturi do konstantne mase.
118
hidroklorid). Povratnom neutralimetrijskom titracijom određuju se esteri dodatkom lužine u
suvišku, pri čemu dolazi do saponifikacije. Suvišak lužine određuje se povratnom titracijom
klorovodičnom kiselinom (metilsalicilat, etofenamat, acetilsalicilna kiselina). U postupcima
povratnih titracija propisuje se i titracija slijepog uzorka. Povratnom neutralimetrijskom
titracijom mogu se odrediti alkoholi (benzilni alkohol), soli amina (kinin hidroklorid, kodein
hidroklorid, cimetidin hidroklorid), kao i neki derivati purina i pirimidina (teobromin, teofilin,
amobarbital) koji nisu dovoljno kiseli da bi se mogli izravno titrirati u vodenom mediju. U
određivanju njihovog sadržaja prvo se provede taloženje srebrovim nitratom, pri čemu se
oslobodi ekvivalentna količina protona, koja se potom titrira natrijevim hidroksidom.
Sadržaj vrlo slabih baza u obliku soli, poput hidroklorida i hidrobromida organskih baza te
kvarternih amonijevih spojeva, određuje se titracijom u nevodenom mediju perklornom
kiselinom nakon dodatka živinog acetata kojim se uklanja anionska komponenta prije titracije.
119
Hg(CH3COO)2 + 2 Cl- ↔ HgCl2 + 2 CH3COO-
CH3COO- + CH3COOH2+ ↔ 2 CH3COOH
Farmaceutske tvari koje su vrlo slabe kiseline ne mogu se titrirati u vodi jer je njihov kiseli
karakter potisnut kiselo-bazičnim svojstvima vode. U farmakopejskim postupcima
dimetilformamid je najupotrebljavanije otapalo za određivanje sadržaja slabih kiselina. Kao
titrimetrijska otopina upotrebljava se tetrabutilamonijev hidroksid, a u manjem broju propisa
koristi se natrijev ili litijev metoksid. Otopine metoksida moraju se standardizirati neposredno
prije upotrebe jer reagiraju s vodom i ugljikovim dioksidom iz atmosfere, pri čemu dolazi do
potrošnje titranta.
Taložne se titracije primjenjuju za analizu sadržaja spojeva koji u svojem sastavu imaju
anione koji se talože u obliku teško topljivih srebrovih soli. Izravnom taložnom titracijom
srebrovim nitratom u Europskoj farmakopeji određuje se sadržaj nekih alkaloida koji se
javljaju u obliku soli (primjerice, homatropin metilbromida, hioscin butilbromida), te sadržaj
spojeva s organski vezanim klorom koji se oslobađa prije titracije hidrolizom u lužnatom
mediju (primjerice, određivanje lomustina, metrifonata i tiamfenikola). Povratnom taložnom
titracijom određuje se sadržaj anorganskih farmaceutskih tvari koje se javljaju u obliku
klorida i bromida (primjerice, amonijev bromid, kalijev bromid, kalijev klorid, natrijev
bromid, natrijev klorid), zatim sadržaj klorida u otopini za dijalizu, kao i sadržaj nekih
organskih spojeva s vezanim klorom (primjerice, klorobutanol, ciklofosfamid). Srebrov nitrat
se dodaje u suvišku, a povratnom se titracijom njegov suvišak titrira amonijevim tiocijanatom
uz željezov amonijev sulfat kao indikator:
120
metalnih indikatora koji s metalnim ionom u otopini stvaraju manje stabilan kompleks od
kompleksa metala s EDTA. Dodatkom titrimetrijske otopine istiskuje se metal iz kompleksa s
indikatorom:
Indikator + Men+ ↔ [Me-indikator]
[Me-indikator] + H2EDTA2- ↔ [MeEDTA]n-2 + indikator + 2 H+
121
I2 + 2 e- ↔ 2 I -
I2 + 2 S2O32- → 2 I- + S4O62-
+ NO2- + 2 H+ + 2 H2O
NH2 N N
Primjeri
122
Određivanje sadržaja cimetidina
Otopi se 0,200 g cimetidina u 60 mL bezvodne octene kiseline R. Titrira se potenciometrijski s
0,1 M perklornom kiselinom (poglavlje Potenciometrijsko određivanje pH u Fizikalnim i
fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.).
1 mL 0,1 M perklorne kiseline odgovara 25,23 mg cimetidina (C10H16N6S).
Prema Europskoj farmakopeji cimetidin sadrži od 98,5% do 101,5% 2-cijano-1-metil-3-[2-
[[(5-metil-1H-imidazol-4-il)metil]sulfanil]etil]gvanidina, što se izračuna prema suhoj tvari.
123
1 mL otopine škroba R kao indikatora pri kraju titracije. Usporedo se provodi titracija slijepog
uzorka.
1 mL 0,05 M joda odgovara 9,41 mg fenazona (C11H12N2O).
Prema Europskoj farmakopeji fenazon sadrži od 99,0% do 100,5% ekvivalenata 1,5-dimetil-
2-fenil-1,2-dihidro-3H-pirazol-3-ona, što se izračuna prema suhoj tvari.
Vježba
124
Određivanje sadržaja natrijeva klorida u kapima za oči
Volumen kapi za oči koji sadrži 0,1 g natrijeva klorida (10,0 mL uzorka) titrira se s 0,1 M
srebrovim nitratom uz primjenu 1-2 kapi otopine kalijeva kromata R kao indikatora do pojave
narančaste boje.
1 mL 0,1 M srebrova nitrata odgovara 5,844 mg natrijeva klorida (NaCl).
125
reakcije. Postupak određivanja sadržaja analita nakon derivatizacije odlikuje se nižim
stupnjem točnosti.
U najvećem broju farmakopejskih monografija kvantitativna analiza farmaceutskih tvari UV-
Vis spektrofotometrijom temelji se na određivanju sadržaja pomoću specifične apsorbancije
ispitivane tvari (npr., kloramfenikol, deksametazon, estriol, hidrokortizon), a rjeđe na
usporedbi apsorbancije ispitivane i poredbene otopine ili pomoću kalibracijske krivulje
dobivene mjerenjem niza poredbenih otopina različitih koncentracija kod kojih je odnos
između apsorbancije i koncentracije linearan.
Postupak
U propisu je opisana priprema ispitivane otopine, a ako je potrebno i postupak njezina
razrjeđivanja. Apsorbancija ispitivane otopine mjeri se na prethodno kalibriranom
instrumentu, na određenoj valnoj duljini apsorpcijskog maksimuma, a sadržaj se izračunava
pomoću specifične apsorbancije (poglavlje 4.3.) definirane u monografiji ispitivane tvari.
Ako je propisano određivanje sadržaja pomoću poredbene otopine usporedbom izmjerene
apsorbancije ispitivane otopine i otopine poredbene tvari poznate koncentracije, u propisu je
opisana priprema ispitivane i poredbene otopine.
Primjeri
Određivanje sadržaja betametazona
Otopi se 0,010 g betametazona u alkoholu R i razrijedi do 10,0 mL istim otapalom. Zatim se
1,0 mL te otopine razrijedi do 50,0 mL alkoholom R. Mjeri se apsorbancija na apsorpcijskom
maksimumu pri 238,5 nm.
Izračuna se sadržaj betametazona (C22H29FO5) uzimajući specifičnu apsorbanciju 395.
Prema Europskoj farmakopeji betametazon sadrži od 97,0% do 103,0% ekvivalenata 9-fluoro-
11β,17,21-trihidroksi-16β-metilpregna-1,4-dien-3,20-diona, što se izračuna prema suhoj tvari.
126
Određivanje sadržaja diazepama u tabletama
Izvaže se i usitni 20 tableta. U količinu praška koja sadrži 10 mg diazepama doda se 5 mL
vode R, pomiješa i ostavi stajati 15 minuta. Doda se 70 mL 0,5% (V/V) otopine sumporne
kiseline R u metanolu R, mućka 15 minuta, nadopuni istim otapalom do 100,0 mL i filtrira.
Razrijedi se 10,0 mL filtrata do 50,0 mL istim otapalom te izmjeri apsorbancija otopine na
maksimumu pri 284 nm. Sadržaj diazepama (C16H13ClN2O) u tableti izračuna se pomoću
specifične apsorbancije. Specifična apsorbancija diazepama na 284 nm iznosi 450.
Prema Britanskoj farmakopeji tablete ibuprofena moraju sadržavati od 92,5% do 107,5%
deklariranog sadržaja.
Vježba
127
Sadržaj ketoprofena (C16H14O3) u kapsuli izračuna se pomoću specifične apsorbancije.
Specifična apsorbancija ketoprofena na 258 nm iznosi 662.
Prema Britanskoj farmakopeji kapsule ketoprofena moraju sadržavati od 92,5% do 107,5%
deklariranog sadržaja.
1
Kromatografske tehnike odjeljivanja, poglavlje u Fizikalnim i fizikalno-kemijskim metodama, Ph. Eur.
128
U kromatografskom postupku za određivanje sadržaja zahtijevaju se određene vrijednosti za
razlučivanje pikova te parametri koji opisuju preciznost određivanja, omjer signala i šuma i
relativno standardno odstupanje za određeni broj ponovljenih mjerenja. Razlučivanje se
najčešće definira prema tvari koja je kemijski slična ispitivanoj (na primjer, za određivanje
sadržaja simvastatina razlučivanje se određuje lovastatinom).
Postupak
Monografija farmaceutske tvari navodi pripremu ispitivane i poredbene otopine te propisuje
značajke kolone (poput duljine i unutrašnjeg promjera i vrste stacionarne faze), vrstu i brzinu
protoka mobilne faze, temperaturu i način dokazivanja odijeljenih sastojaka. Propisani
volumeni ispitivane i poredbene otopine se injektiraju te se određeno vrijeme provodi
postupak odjeljivanja. Opis metode najčešće uključuje ispitivanje razlučivanja pojedinih
pikova, omjer signala i šuma, te relativno standardno odstupanje za određeni broj ponovljenih
mjerenja.
Sadržaj ispitivane farmaceutske tvari izračunava se iz površine pikova ispitivane i poredbene
tvari te deklariranog sadržaja poredbene tvari. Ukoliko se primjenjuje unutrašnji standard,
sadržaj ispitivane tvari izračunava se iz omjera površine pika ispitivane tvari i unutrašnjeg
standarda, omjera površine pika poredbene tvari i unutrašnjeg standarda te deklariranog
sadržaja poredbene tvari.
Primjeri
Određivanje sadržaja amoksicilin trihidrata
Sadržaj se određuje tekućinskom kromatografijom.
Ispitivana otopina (a) pripremi se tako da se 15,0 mg ispitivane tvari otopi u mobilnoj fazi A i
razrijedi do 25,0 mL istom mobilnom fazom.
Ispitivana otopina (b) dobiva se tako da se 15,0 mg ispitivane tvari otopi u mobilnoj fazi A i
razrijedi do 10,0 mL istom mobilnom fazom.
Poredbena otopina (a) pripremi se tako da se 15,0 mg amoksicilin trihidrata CRS otopi u
mobilnoj fazi A i razrijedi se do 25,0 mL s istom mobilnom fazom.
Poredbena otopina (b) dobije se tako da se 4,0 mg cefadroksila CRS otopi u mobilnoj fazi A i
razrijedi do 50,0 mL istom mobilnom fazom. U 5,0 mL te otopine doda se 5,0 mL poredbene
otopine (a) i razrijedi do 100,0 mL istom mobilnom fazom.
Poredbena otopina (c) pripremi se tako da se 1,0 mL poredbene otopine (a) razrijedi do 20,0
mL mobilnom fazom A. Zatim se 1,0 mL te otopine razrijedi do 50,0 mL mobilnom fazom A.
129
Poredbena otopina (d) dobije se tako da se 2,0 mL poredbene otopine (a) razrijedi do 20,0 mL
mobilnom fazom A. Zatim se 5,0 mL te otopine razrijedi do 20,0 mL mobilnom fazom A.
Za kromatografski postupak upotrijebi se kolona od nehrđajućeg čelika, dugačka 0,25 m,
unutrašnjeg promjera 4,6 mm i napunjena oktadecilsilil silikagelom za kromatografiju R (5 µm).
Mobilne faze brzine protoka 1,0 mL/min su mobilna faza A (smjesa od 1 volumnog dijela
acetonitrila R i 99 volumnih dijelova pufera pH 5,0) i mobilna faza B (smjesa od 20 volumnih
dijelova acetonitrila R i 80 volumnih dijelova pufera pH 5,0). Otopina pufera pripremi se na
način da se u 250 mL 0,2 M kalijeva dihidrogenfosfata R dodaje razrijeđena otopina natrijeva
hidroksida R dok se ne postigne pH 5,0, te se razrijedi do 1000,0 mL vodom R. Dokazivanje se
provodi spektrofotometrijski na 254 nm.
Kolona se uravnoteži mobilnom fazom čiji omjer A:B iznosi 92:8. Injektira se 50 µL
poredbene otopine (b). Analiza nije valjana ukoliko razlučivanje između pikova amoksicilina
i cefadroksila nije najmanje 2,0. Ako je potrebno, podesi se omjer A:B mobilne faze. Omjer
faktora kapaciteta za prvi pik (amoksicilin) je od 1,3 do 2,5. Zatim se injektira 50 µL
poredbene otopine (c). Sustav se podesi na način da se dobije pik s omjerom signal-šum
najmanje 3. Potom se injektira 50 µL poredbene otopine (a) 6 puta. Ispitivanje nije valjano
ako je relativno standardno odstupanje za površinu glavnog pika veće od 1,0%. Injektiraju se
naizmjenično ispitivana otopina (a) i poredbena otopina (a).
Prema Europskoj farmakopeji amoksicilin trihidrat sadrži od 95,0% do 102,0% ekvivalenata
(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4-hidroksifenil)acetil]amino]-3,3-dimetil-7-okso-4-tia-1-
azabiciklo[3.2.0]heptan-2-karboksilne kiseline, što se izračuna prema bezvodnoj tvari.
130
Poredbena otopina (d) dobije se tako da se 1,0 mL poredbene otopine (c) razrijedi do 25,0
mL mobilnom fazom A.
Za kromatografski postupak upotrijebi se kolona od nehrđajućeg čelika, dugačka 0,25 m,
unutrašnjeg promjera 4,6 mm i napunjena oktadecilsilil silikagelom za kromatografiju R (5
µm). Mobilnu fazu brzine protoka 1,0 mL/min čine mobilna faza A (smjesa od 0,5 mL
razrijeđene octene kiseline R, 50 mL 0,2 M kalijeva dihidrogenfosfata R i 50 mL acetonitrila
R razrijeđena do 1000 mL vodom R) i mobilna faza B (smjesa od 0,5 mL razrijeđene octene
kiseline R, 50 mL 0,2 M kalijeva dihidrogenfosfata R i 400 mL acetonitrila R razrijeđena do
1000 mL vodom R). Dokazivanje se provodi spektrofotometrijski na 254 nm.
Kolona se uravnoteži mobilnom fazom čiji omjer A:B iznosi 85:15. Injektira se 50 µL
poredbene otopine (b). Analiza nije valjana ako razlučivanje između pikova ampicilina i
cefradina nije najmanje 3,0. Ako je potrebno, podesi se omjer A:B mobilne faze. Omjer
faktora kapaciteta za prvi pik (ampicilin) je od 2,0 do 2,5. Injektira se 50 µL poredbene
otopine (d). Sustav se podesi tako da se dobije pik s omjerom signal-šum najmanje 3. Injektira
se 50 µL poredbene otopine (a) 6 puta. Ispitivanje nije valjano ako je relativno standardno
odstupanje za površinu glavnog pika veće od 1,0%. Injektiraju se naizmjenično ispitivana
otopina (a) i poredbena otopina (a). Izračuna se sadržaj (%) ampicilina.
Prema Europskoj farmakopeji amipicilin trihidrat sadrži od 96,0% do 100,5% ekvivalenata
(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-fenilacetil]amino]-3,3-dimetil-7-okso-4-tia-1-azabiciklo[3.2.0]
heptan-2-karboksilne kiseline, što se izračuna prema bezvodnoj tvari.
Vježba
Ispitivana otopina pripremi se tako da se 12,5 mg ispitivane tvari otopi u vodi R i razrijedi do
25,0 mL istim otapalom.
Poredbena otopina (a) dobije se tako da se 12,5 mg cefaleksin monohidrata CRS otopi u vodi
R i razrijedi do 25,0 mL istim otapalom.
Poredbena otopina (b) pripremi se tako da se 5,0 mg cefradina CRS otopi u 10,0 mL
poredbene otopine (a) i razrijedi do 50,0 mL vodom R.
131
µm). Mobilnu fazu brzine protoka 1,5 mL/min čini smjesa od 2 volumna dijela metanola R, 5
volumnih dijelova acetonitrila R, 10 volumnih dijelova 13,6 g/L otopine kalijeva
dihidrogenfosfata R i 83 volumna dijela vode R. Volumen injektiranja je 20 µL, a dokazivanje
se provodi spektrofotometrijski na 254 nm.
Prikladnost sustava ispituje se primjenom poredbene otopine (b). Ispitivanje nije valjano ako
razlučivanje između pikova cefaleksina i cefradina ne iznosi najmanje 4,0.
132
terapijskih sustava s polimernim nosačima. Uzorak ljekovitog oblika ekstrahira se s otopinom
koja sadrži unutarnji standard. U tom slučaju kalibracijski pravac predstavlja ovisnost omjera
površina poredbene otopine i unutarnjeg standarda o koncentraciji poredbene otopine. Sadržaj
aktivne tvari određuje se pomoću dobivene kalibracijske krivulje interpolacijom iz omjera
površine pika ispitivane aktivne tvari dobivene u kromatogramu otopine ljekovitog oblika i
unutrašnjeg standarda dodanog prije postupka ekstrakcije.
Primjer
Određivanje sadržaja ampicilin trihidrata u kapsulama
Sadržaj ampicilin trihidrata u kapsulama ispituje se tekućinskom kromatografijom.
Otopina (1). Tijekom 15 minuta mućka se pomiješani sadržaj 20 kapsula koji sadrži 60 mg
ampicilina s 80 mL mobilne faze A. Potom se razrijedi do 100,0 mL istim otapalom, filtrira i
5,0 mL te otopine razrijedi do 50,0 mL mobilnom fazom A.
Otopina (2). Otopina sadrži 0,006% (V/V) bezvodnog ampicilina CRS u mobilnoj fazi A.
Otopina (3). Otopina sadrži 0,025% (V/V) bezvodnog ampicilina CRS i 0,002% (V/V)
cefradina CRS u mobilnoj fazi A.
Mobilna faza A. Smjesa od 1 volumnog dijela razrijeđene octene kiseline R, 100 volumnih
dijelova 0,2 M kalijeva dihidrogenfosfata R i 100 volumnih dijelova acetonitrila R razrijedi se
vodom R do 2000 volumnih dijelova.
Mobilna faza B. Smjesa od 1 volumnog dijela razrijeđene octene kiseline, 100 volumnih
dijelova 0,2 M kalijeva dihidrogenfosfata i 800 volumnih dijelova acetonitrila razrijedi se
vodom R do 2000 volumnih dijelova.
Ispitivanje nije valjano ako na kromatogramu otopine (3) razlučivanje između pikova
ampicilina i cefradina ne iznosi najmanje 3,0. Ukoliko je potrebno, sastav mobilne faze treba
prilagoditi tako da se postigne traženo razlučivanje.
133
Vježba
Određivanje sadržaja ibuprofena u tabletama
Sadržaj ibuprofena određuje se tekućinskom kromatografijom.
Poredbena otopina dobije se tako da se 50,0 mg ibuprofena CRS otopi u vodi R i razrijedi do
25,0 mL mobilnom fazom.
134
7. VALIDACIJA ANALITIČKOG POSTUPKA
1
International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline on Validation of Analytical Procedures:
Text and Methodology Q2(R1), 2005.
2
International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline on Good Manufacturing Practice Guide
for Active Pharmaceutical Ingredients Q7, 2000.
3
Pravilnik o dobroj laboratorijskoj praksi (Narodne novine br. 73/12).
135
Analitičke značajke postupka validacije
Preciznost analitičke metode pokazuje slaganje između niza ponovljenih mjerenja dobivenih
višestrukim uzorkovanjem istog homogenog uzorka pod propisanim uvjetima. Preciznost se
može iskazati kao ponovljivost (engl. repeatability), srednja preciznost (engl. intermediate
precision) i obnovljivost (engl. reproducibility). Ponovljivost izražava podudaranje rezultata
dobivenih istom metodom pod istim uvjetima u kratkom vremenskom intervalu. Srednja
preciznost iskazuje odstupanje rezultata dobivenih pod različitim uvjetima u istom
laboratoriju (različiti dani, analitičari, instrumenti), dok obnovljivost označava odstupanje
rezultata dobivenih u različitim laboratorijima. Preciznost se izražava statističkim veličinama
kao standardno odstupanje, relativno standardno odstupanje (RSD, %) ili raspon pouzdanosti
oko srednje vrijednosti. Ispituje se kroz najmanje pet do šest određivanja uz primjenu dvije do
tri različite koncentracije.
Radno područje mjerenja označava raspon između gornje i donje koncentracije analita u
uzorku, uključujući i granične vrijednosti, unutar kojega primijenjena analitička metoda ima
zadovoljavajuću točnost, preciznost i linearnost.
136
Točnost analitičke metode pokazuje slaganje srednje vrijednosti dobivenih rezultata i stvarnih
ili prihvaćenih referentnih vrijednosti. Za utvrđivanje točnosti provode se najmanje tri
mjerenja uzorka za najmanje tri koncentracije u radnom području metode. Odstupanje od
stvarne vrijednosti najčešće se iskazuje kao analitički prinos (engl. recovery)
x
R= ⋅ 100
xˆ
gdje je x srednja izmjerena vrijednost, a x̂ stvarna vrijednost analita u uzorku. Točnost se
određuje u radnom području metode nakon ispitivanja selektivnosti, linearnosti i preciznosti.
Granica dokazivanja (engl. limit of detection, LOD) je najniža koncentracija analita koja se
može dokazati, ali ne i odrediti, prema zadanim uvjetima metode. Granica određivanja
(engl. limit of quantitation, LOQ) je najniža koncentracija analita u uzorku i moguće ju je
odrediti s prihvatljivom točnošću i preciznošću pri propisanim uvjetima metode. LOD i LOQ
se određuju razrjeđivanjem ispitivane otopine, a predstavljaju omjer signala i šuma (LOD =
3:1 ili 2:1; LOQ = 10:1), ili iz standardnog odstupanja signala i nagiba kalibracijskog pravca
3,3 ⋅ σ 10 ⋅ σ
LOD = i LOQ =
a a
gdje je σ standardno odstupanje rezultata odgovarajućeg broja mjerenja signala slijepog
uzorka, ostatno standardno odstupanje regresijskog pravca, ili standardno odstupanje y-
odsječka regresijskog pravca, dok je a nagib kalibracijskog pravca.
Vježba
UV-spektrofotometrijski postupak određivanja sadržaja kloramfenikola
Standardna otopina kloramfenikola pripremi se u odmjernoj tikvici od 50,0 mL otapanjem
10,0 mg kloramfenikola u vodi R i nadopuni se istim otapalom do oznake. Odgovarajući
137
volumen standardne otopine kloramfenikola (0,5 mL, 1,0 mL, 2,5 mL, 3,5 mL, 5,0 mL i 6,0
mL, što odgovara 0,1 mg, 0,2 mg, 0,5 mg, 0,7 mg, 1,0 mg i 1,2 mg kloramfenikola) ulije se u
odmjernu tikvicu od 50,0 mL i nadopuni vodom R do oznake. Potom se mjeri apsorbancija
uzoraka na 278 nm u kiveti debljine sloja 1 cm. Za svaku koncentraciju otopine mjerenje
apsorbancije ponovi se tri puta. Tako dobiveni podaci koriste se za daljnja izračunavanja i
prosudbu validacijskih parametara.
Linearnost metode utvrđuje se iz mjerenja apsorbancija na šest koncentracijskih razina analita
u triplikatu te grafičikim prikazom ovisnosti apsobancije o koncentraciji kloramfenikola.
Linearnost metode se izražava jednadžbom pravca i koeficijentom korelacije regresijskog
pravca.
Preciznost se ispituje u radnom području mjerenjem apsorbancije na dvije koncentracijske
razine. Za svaku koncentraciju otopine mjerenje apsorbancije ponovi se šest puta. Izračuna se
srednja vrijednost mjerenja, a preciznost se izražava kao standardno, odnosno relativno
standardno odstupanje od srednje vrijednosti mjerenja.
Točnost metode ispituje se mjerenjem apsorbancije standarda u triplikatu na tri
koncentracijske razine u radnom području metode (0,1 mg, 0,5 i 1,2 mg kloramfenikola).
Sadržaj kloramfenikola izračunava se upotrebom jednadžbe regresijskog pravca dobivene kod
ispitivanja linearnosti. Točnost se izražava kao analitički prinos.
Granice dokazivanja i određivanja se ispituju mjerenjem apsorbancije slijepog uzorka u
triplikatu. Iz pripadajućeg standardnog odstupanja izmjerenih apsorbancija slijepog uzorka te
nagiba pravca dobivenog regresijskom analizom izračuna se LOD i LOQ.
138
8. LITERATURA
139