FARMACEUTSKI FAKULTET SARAJEVO

KATEDRA ZA FARMACEUTSKU ANALITIKU

Miroslav Šober, Ervina Bečić, Belma Imamović, Mirza Dedić

PRAKTIKUM IZ KONTROLE LIJEKOVA II

-Za internu upotrebu-

Sarajevo; 2018. godina.

 PRAKTIKUM IZ KONTROLE LIJEKOVA II
je interna skripta namijenjena studentima Farmaceutskog fakulteta u Sarajevu
za vježbe iz predmeta Kontrola lijekova II
 SADRŢAJ

Polarimetrija .................................................................................................................................... 1
Vježba br. 1 OdreĎivanje specifičnog ugla zakretanja vinske i askobinske kiseline .............. 3
Hromatografske metode .................................................................................................................. 5
Hromatografija na tankom sloju (Thin Layer Chromatography-TLC) ...................................... 7
Vježba br. 2 Identifikacija komponenti analgoantipiretičke smjese ................................... 11
Srodne supstance (Related Substances) .................................................................................... 14
Vježba br. 3 Identifikacija srodnih supstanci i produkata razgradnje acetilsalicilne kiseline
hromatografijom na tankom sloju ......................................................................................... 16
Vježba br. 4 Ekstrakcija –hromatografija na tankom sloju ................................................. 18
Gasna hromatografija (Gas Chromatography-GC) ................................................................... 21
Vježba br. 5 OdreĎivanje kofeina u tabletama gasnom hromatografijom ............................ 26
Tečna hromatografija visokih performansi (High Performance Liquid Chromatography-
HPLC) ....................................................................................................................................... 28
Vježba br. 6 OdreĎivanje sadržaja diazepama u ampulama metodom HPLC (USP 40) ..... 35
Vježba br. 7 Kvalitativna i kvantitativna analiza metil parabena u kremama za zaštitu od
sunca (HPLC-metoda eksternog standarda) .......................................................................... 37
Volumetrijske (titrimetrijske) metode ........................................................................................... 46
Acidimetrija i alkalimetrija ....................................................................................................... 46
Vježba br. 8 OdreĎivanje sadržaja acetilsalicilne kiseline u tabletama ................................ 48
Kompleksometrijske titracije .................................................................................................... 50
Vježba br. 9 Standardizacija 0.01m EDTA sa standardnim rastvorom CaCO3 .................... 54
Vježba br. 10 Kompleksometrijsko odreĎivanje kalcijuma u tabletama .............................. 56
Vježba br. 11 Kompleksometrijsko odreĎivanje magnezijum sulfata .................................. 58
Titracije u nevodenoj sredini ..................................................................................................... 60
Vježba br. 12 OdreĎivanje sadržaja kofeina u tabletama titracijom u nevodenoj sredini ..... 62
Vježba br. 13 Potenciometrija – prireĎivanje pufera i odreĎivanje ph vrijednosti ............... 64
Validacija analitičke metode ......................................................................................................... 66
Vježba br. 14 Validacija analitičke metode - kvalitativna i kvantitativna analiza
cijanokobalamina (Bitamin B12)............................................................................................ 69

1
 POLARIMETRIJA

Polarimetrija je optička metoda kojom se odreĎuje specifični ugao zakretanja ravni polarizovane
svjetlosti. Specifični ugao zakretanja je konstanta koja služi za kontrolu ispravnosti
farmaceutskih preparata.
Brojna organska jedinjenja koja imaju osobinu da zakreću ravan polarizovane svjetlosti nazivaju
se optički aktivna jedinjenja, a pojava se naziva optička aktivnost ili optička izomerija. Optička
izomerija se javlja kod jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom i može se javiti u dva
različita oblika koji se odnose kao predmet i lik u ogledalu- asimetrične ili hiralne molekule.
Oblici istog molekula koji se odnose kao predmet i lik u ogledalu su stereoizomeri i nazivaju se
optički antipodi ili enantiomeri. Enantiomeri imaju iste fizičke i hemijske osobine, ali se
razlikuju po smjeru skretanja ravni polarizovane svjetlosti.

Polarizovana svjetlost nastaje ako se svjetlost odreĎene talasne dužine iz vidljivog dijela
elektromagnetnog spektra propusti kroz sistem Nicolovih prizmi. Svjetlost iz vidljivog dijela
spektra sastoji se iz svjetlosnih zraka koje osciliraju u različitim ravnima. Polarizovana svjetlost
osciluje samo u jednoj ravni, okomito na ravan prostiranja zraka. Veličina i pravci ugaone
rotacije, koju pretrpi polarizovana svjetlost pri prolazu kroz poznatu debljinu sloja optički
aktivne supstance ovisi od:

 rotacione moći optički aktivne supstance,

 debljine sloja,
 temperature,
 talasne dužine polarizovane svjetlosti
 koncentracije optički aktivne supstance.

Mjerenja ugla zakretanja polarizovane svjetlosti obično se provode na temperaturi od 20ºC uz

korištenje svjetlosti natrijumove D linije (589, 3 nm) ili rjeĎe svjetlosti živine zelene linije (546,
1 nm) u cilindru za uzorke odreĎenih dimenzija.
Specifična rotacija je karakteristika optičkih aktivnih supstanci tj.onih koji u svojoj strukturi
imaju asimetričan C atom. Poznavanje specifičnog ugla rotacije neke supstance, može poslužiti
za njenu identifikaciju, odreĎivanje sadržaja i za odreĎivanje stepena čistoće.
Specifična rotacija [α]D20 je rotacija koja predstavlja rotaciju u ugaonim stepenima koju pretrpi
ravan polarizovane svjetlosti talasne dužine D linije, na temperaturi od 20ºC, koja prolazi kroz
cilindar sa rastvorom optički aktivne supstance dužine 1dm, u kojem je rastvor sa
koncentracijom g/ml.

Rastvori i same optički aktivne tečnosti zavise od:

 α- izmjereni ugao u stepenima
 l- debljina sloja rastvora koji se mjeri
 c- odvaga preparata g/100ml
 d- relativna gustina preparata

1
 Čvrste optički aktivne supstance

 20D    100
l c

Optički aktivne tečnosti:

 20D    100
l d c

Skretanje ravni polarizovane svjetlosti se mjeri polarimetrom. Polarimetar se sastoji iz:

 Izvora svjetlosti
 Polarizacione prizme
 Cilindra za stavljanje uzorka,
 analizatorske prizme koja je povezana sa kružnom skalom
 Okular gdje se očitava ugao zakretanja.

Prije mjerenja polarimetar se baždari sa rastvorom čiste saharoze koja ima specifični ugao
skretanja +66,52º, a podaci kako se prireĎuje rastvor dati su u farmakopejama.
Na tačnost mjerenja upotrebom polarimetra utiču razni faktori kao: polarnost rastvarača,
prisustvo nekih neorganskih soli, uree, aminokiselina i drugih onečišćenja.
U nepolarnim rastvaračima velika koncentracija polarne supstance dovodi do asocijacije
molekula rastvorene supstance, što rezultira u smanjenju skretanja ravni polarizovane svjetlosti.

Skretanje ravni polarizovane svjetlosti koristi se kao konstanta za ispitivanje ispravnosti

preparata i vrijednosti za ispravan preparat moraju se kretati u propisanim granicama.

2
 VJEŢBA BR. 1
ODREĐIVANJE SPECIFIČNOG UGLA ZAKRETANJA VINSKE I ASKOBINSKE
KISELINE

1. OdreĎivanje specifičnog optičkog zakretanja rastvora vinske kiseline

Rastvori se 5.00 g vinske kiseline u vodi (R) i razrijedi do 25 ml sa vodom do oznake. Specifični
ugao zakretanja mora biti u granicama od +12 do +12.8.

2. OdreĎivanje specifičnog optičkog zakretanja rastvora askorbinske kiseline

Rastvori se 2.5 g askorbinske kiseline u vodi (R) i razrijedi do 25 ml vodom do oznake.

Specifični ugao zakretanja mora biti u granicama od +20.5 do +21.5.

3
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: OdreĎivanje specifičnog ugla zakretanja vinske i askorbinske kiseline

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

4
 HROMATOGRAFSKE METODE

Hromatografija je analitička metoda koja služi za prečišćavanje i odvajanje organskih i

neorganskih supstanci. Pogodna je za razdvajanje kompleksnih smjesa, za izolaciju nestabilnih
supstanci i razdvajanje veoma bliskih spojeva po strukturi, kao što su izomeri. Hromatografija je
proces separacije pojedinih supstanci iz analizirane smjese na dodirnoj površini izmeĎu dvije
faze, pri kontinuiranom protoku jedne faze preko druge. Separacija komponenti iz smjese
zasniva se na njihovom različitom afinitetu prema fazama. Kod svih vrsta hromatografije jedna
faza je nepokretna i naziva se stacionarna faza, a druga faza je pokretna i naziva se mobilna
faza. U hromatografskom procesu mobilna faza se kontinuirano kreće preko stacionarne faze.
Stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna, na osnovu čega se hromatografije dijeli u dvije
osnovne grupe. Hromatografija kod koje je stacionarna faza čvrsta, a mobilna gas ili tečnost
naziva se adsorpciona hromatografija. Hromatografija kod koje je stacionarna faza tečnost, a
mobilna gas ili tečnost naziva se podiona ili particiona hromatografija. To znači da se kod
adsorpcione hromatografije separacija vrši raspodjelom komponenti izmeĎu čvste i gasovite ili
tečne faze, dok se kod podione hromatografije raspodjela vrši izmeĎu dvije tečne faze ili tečne i
gasovite faze. Pored ove dvije vrste hromatografije postoje i druge, kao što su: ekskluziona,
afinitetna i jonoizmjenjivačka hromatografija.
Prednost hromatografije kao analitičke metode je u tome što se mogu razdvojiti supstance koje
se meĎusobno minimalno razlikuju po strukturi, pa prema tome imaju vrlo bliska hemijska i
fizička svojstva. Dovoljno je da se meĎusobno razlikuju u onim svojstvima koja odreĎuju način i
brzinu kretanja

5
 ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA
(čvrsta nepokretna faza)

tečno-čvrsta gasno-čvrsta

1. hromatografija na koloni 1. gasna hromatografija

2. hromatografija na tankom sloju

3. jonoizmjenjivačka hromatografija

4. gel filtracija

5. hromatografija pod visokim pritiskom

PODIONA HROMATOGRAFIJA
(tečna nepokretna faza)

tečno-čvrsta gasno-čvrsta

1. hromatografija na na papiru 1. gasna hromatografija

2. hromatografija pod visokim pritiskom

6
 HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU
(THIN LAYER CHROMATOGRAPHY-TLC)

Hromatografija na tankom sloju (TLC) koristi se za razdvajanje, kvalitativnu i kvantitativnu

analizu. Kao stacionarna faza služi čvrsta materija (adsorbens) ili na adsorbens vezana tečnost, a
kao mobilna faza tečnost (otapalo ili smjesa otapala). Do razdvajanja dolazi usljed adsorpcije ili
preraspodjele izmeĎu mobilne i stacionarne faze. Za rad su potrebne minimalne količine uzorka
(0,5-5µg) i mala količina adsorbensa koji se u tankom sloju nanosi na staklene ploče.
Hromatografiranje traje obično od 30 do120 min.

Za izvoĎenje hromatografije na tankom sloju bitna su sljedeća 4 koraka:

 Izbor adsorbensa i sistema za razvijanje

 Nanošenje supstance
 Razvijanje ploče
 Detekcija

Izbor adsorbensa

1. Silikagel
Ako se prije nanošenja na staklene ploče potopi u otopinu kiseline može se koristiti za
ispitivanje baznih i neutralnih spojeva.

2. Aluminijum-oksid kieli neutralni i bazni

3. Kiselguhr
4. Dijatomejska zemlja
5. Sprašena celuloza
6. Poliamidi

Adsorbensima se dodaje vezivni sredstvo CaSO4 (kao vezivno sredstvo) u odreĎenom procentu,
da se naneseni sloj na hromatografskoj ploči zadrži. Ukoliko je dodano vezivno sredstvo onda se
taj silikagel označava oznakom «G». Ukoliko je dodan indikator koji će pod UV lampom
izazvati fluorescenciju označava se sa još jednom oznakom «F254».
Za prireĎivanje ploča na tankom sloju adsorbens se pomiješa sa odreĎenom količinom vode i u
tankom sloju nanese na staklene ploče. Za 5 ploča dimenzija 20 x 20 potrebno je pomiješati 25 g
silikagela sa 50 ml vode, dobro homogenizirati i nanijeti na ploče (debljina sloja 0,25-2mm).
Ploče se aktiviraju sušenjem na 100- 1100C u trajanju od 30-35 min.
Ako se ploče ne upotrebljavaju odmah, obavezno se čuvaju se u eksikatoru.

7
Nanošenje uzorka

Na pripremljene ploče pomoću kapilare nanose se uzorci otopljeni u pogodnom otapalu.

Koncentracija otopine bi trebala da bude oko 1%. Poželjno je da se volumen uzorka kreće od
0,01-0,1 ml (10-100μl) zavisno od koncentracije otopljene supstance. Supstanca se nanosi na
zamišljenu startnu liniju 1,5 cm od ruba ploče u razmaku od 2-2,5 cm, nastojeći da prečnik mrlje
ne preĎe 4 mm. Uzorci se mogu nanositi u formi tačke (mrlje) ili u formi trake.

obliku tačke (a) uske trake (b)

Slika 1. Načini nanošenja uzorka u TLC-u

a) b)
Slika 2. a) kapilare za ručno nanošenje uzorka, b) ureĎaj za poluautomatsko nanošenje uzorka

UreĎaji za nanošenje mogu biti manualni (kapilare), semimanualni (kapilare na držaču) ili
automatizirani. Nanošenje u formi trake je posebno pogodno za kvantitativnu analizu i provodi
se automatski. Nakon svakog nanošenja sačeka se da se mrlja osuši, ili se oprezno suši fenom.
8
Razvijanje ploče

Nakon nanošenja uzorka ploča se unosi u specijalne četvrtaste posude (kade) za razvijanje u
kojima se nalazi željeni razvijač (mobilna faza, eluent), čija je visina najmanje 0,5 cm ispod
startne linije na ploči. Razdvajanje počinje kada mobilna faza pod dejstvom kapilarnih sila počne
da se kreće uzlazno. U hromatografiji kod koje je silikagel stacionarna faza do razdvajanja dolazi
na osnovu razlika u polarnosti. Nepolarne supstance se slabije zadržavaju i imaju veću Rf
vrijednost dok su polarne supstance duže zadržane tj. imaju nižu Rf vrijednost. Za
hromatografiranje nepolarnih supstanci je zbog toga potreban nepolaran eluent a za polarne
polaran eluent. U praksi se češće primjenjuje smjesa polarnog i nepolarnog eluenta tako da se
polarnost po potrebi može mijenjati

Kvalitativna analiza

Kvalitativna analiza (identifikacija) u hromatografiji na tankom sloju se provodi u nekoliko

koraka i to po odreĎenom redosljedu:

1. Posmatranjem pod UV lampom na 254 i 366 nm.

2. OdreĎivanje Rf vrijednosti- retencioni faktor. Definiše se kao odnos dužine preĎenog puta
svake od komponenti iz smjese i dužine preĎenog puta mobilne faze.

d1
Rf 
d2
d1-put supstance
d2-put mobilne faze (eluenta)

Rf vrijednosti kreću se u opsegu od 0-1 (0 < Rf < 1). Najveću Rf vrijednost imaće komponenta
koja se najbolje rastvara u mobilnoj fazi, odnosno ona komponenta koja je prešla najduži put.
Pored Rf vrijednosti imamo i hRf vrijednost koja predstavlja hRf x 100.

3. UporeĎivanjem boje razdvojenih supstanci ukoliko su obojene ili fluoresciraju, sa bojom

standardnih supstanci.

4. Supstance se odgovarajućom reakcijom mogu prevesti u obojeni ili fluorescentni oblik. To se

može postiči na dva načina:
Reagens za derivatizaciju se mogu nanijeti na start prije razvijanja.
Reagensi za derivatizaciju se mogu primijeniti nakon razvijana ploče.

9
Tabela 1. Reagensi za derivatizaciju u TLC-u

REAGENSI UPOTREBA
Pare joda Sa organskim supstancama daju smeĎu boju
Opšti reagens.
1% KMnO4 aceton/voda
Daje žute ili bijele mrlje na bijeloj podlozi.
0,1% ninhidrin Specifičan za sve aminokiseline.
1 i 0,5% dinitro benzojeva kis. u M NaOH Srčani glikozidi boje se crveno.
0,05% bromkrezol zeleno Sa org. kis. daje žute mrlje na zelenoj podlozi
Dragendorffov reagens Služi za identifikaciju alkaloida i amina
NaNO2 0,5 i 0,1% sa N-(1-naftil)etilen-
Sa sulfonamidima stvara crveno obojenje.
diaminom u M HCl.

Kvantitativna analiza

Kvantitativna analiza (odreĎivanje sadržaja) u hromatografiji na tankom sloju se može provesti

na nekoliko načina:

1. Procjenom intenziteta mrlje u poreĎenju s poznatim razblaženjem standarda.

2. Skidanjem tankog sloja koji sadrži ispitivanu supstancu, eluiranjem ispitivane supstance i
njenom daljom analizom (nekom odgovarajučom analitičkom tehnikom).

3. Spektrodenzitometrijski. U tu svrhu se koristi posebani ureĎaj koji se zove denzitometar

Primjena hromatografije na tankom sloju u farmaciji

Hromatografija na tankom sloju se kao jednostavna i brza metoda koristi u farmaceutskoj

analitici za ispitivanje identiteta i čistoće lijekova i pomoćnih ljekovitih sredstava, ispitivanje
stabilnosti lijekova, u kontroli kvaliteta u proizvodnji lijekova, u dokazivanju i identifikaciji
vlastitih i stranih produkata metabolizma (produkata biotransformacije), dokazivanje ljekovitih
materija u tjelesnim tečnostima u terapiji ili kod trovanja. Nedostaci u odnosu na druge
hromatografske metode su slabija granica detekcije, nedovoljna specifičnost i mogućnost
razdvajanja. Razvoj hromatografije na tankom sloju omogućio je razdvajanje smjese
enantiomera npr. aminokiselina. Razdvajanje se zasniva na razmjeni liganda na hidrofobnom
sloju silikagela, koji je impregniran sa jednom hiralnom supstancom (selektorom).

10
 VJEŢBA BR. 2
IDENTIFIKACIJA KOMPONENTI ANALGOANTIPIRETIČKE SMJESE

Priprema ploča

Staklene ploče (20 x 20 cm ili 10 x 20 cm) navlače se sa silika gelom koji u svom sastavu ima
CaSO4 i dodat fluorescentni indikator (silikagel GF254). Suspenzija adsorbensa se prireĎuje na
sljedeći način:
 25 g silika gela GF254 (dovoljno za 5 ploča 20 x 20 cm) pomiješa se sa 50 ml destilovane
vode i dobro homogenizira miješanjem.
 PrireĎena suspenzija nanese se na dobro očišćene ploče pomoću odgovarajućeg aplikatora.
Prosječna debljina sloja iznosi 0,2 mm, ako nije drugačije navedeno. Ploče se aktiviraju
sušenjem na 110oC u sušnici u trajanju od 30 min. Ako se ne upotrebljavaju odmah, ploče se
čuvaju u eksikatoru.

Nanošenje uzorka

Na pripremljene ploče, pomoću kapilare, se nanose uzorci otopljeni u pogodnom otapalu.

Poželjno je da se volumen uzorka kreće od 0,01-0,1 ml, zavisno od koncentracije otopljene
supstance.
Supstanca se aplicira na zamišljenu startnu liniju, 1,5 cm od ruba ploče u razmaku od 2-2,5 cm,
nastojeći da prečnik aplicirane mrlje ne preĎe 4 mm. Nakon svake aplikacije sačeka se da se
mrlja osuši.

Razvijanje ploče

Nakon aplikacije uzorka ploča se unosi u specijalne četvrtaste posude (kade) za razvijanje u
kojima se nalazi željeni razvijač (rastvarač ili smjesa rastvarača), čija je visina najmanje 0,5 cm
ispod startne linije na ploči. Kada se razvijač popne do željene visine (front), ploče se vade iz
posude za razvijanje, označi se linija fronta i suše na sobnoj temperaturi u horizontalnom
položaju.
Vizualizacija hromatografiranog materijala na pločama vrši se prskanjem ploča sa pogodnim
reagensom koji sa hromatografiranim supstancama razvija karakterističnu boju. Kod nekih
supstanci koje fluoresciraju ploče se predhodno posmatraju pod UV lampom, na 254 i 366 nm i
obilježe mjesta fluorescencije kao i boja koja se javlja pri fluorescenciji.

11
Uzorci za ispitivanje:
Smjesa analgoantipiretika:
 Acetilsalicilna kiselina
 Kofein
 Kodein
 Paracetamol

Mobilna faza (eluent):

 Hloroform : Metanol : Mravlja kiselina = 7 : 1,5 : 0,5

Vizualizacija:
 UV (254, 366 nm)
 Željezo (III)-hlorid-jod reagens [5 g željezo (III) hlorida i 2 g joda rastvore se u smjesi od
50 ml acetona i 50 ml 20% vodenog rastvora vinske kiseline]
 1% vodeni rastor željezo (III) hlorida
 Dragendorf-ov reagens

12
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Identifikacija komponenti analgoantipiretičke smjese

Farmaceutski preparat:

Račun:
Naziv 254 nm 366 nm Rf hRf

Acetilsalicilna
kiselina

Paracetamol

Kofein

Kodein

Uzorak

Zaključak:

13
 SRODNE SUPSTANCE (RELATED SUBSTANCES)

Srodne supstance (nečistoće) se definiraju kao supstance koje su strukturno srodne aktivnoj
supstanci. Mogu biti degradacioni produkti ili nečistoće koje potiču iz procesa proizvodnje ili
nastaju u toku čuvanja aktivne supstance.

Dokazano je da nečistoće u gotovom proizvodu mogu izazvati neželjene efekte kod pacijenata.
Bez obzira na to da li izazivaju degradaciju aktivne ili pomoćnih supstanci ili stupaju u
interakcije i time dovode do degradacije aktivne supstance, nečistoće je potrebno definirati i
kvantificirati da bi se utvrdilo do koje je granice moguće i da li je uopšte moguće tolerisati
njihovo prisustvo.

Zbog svih navedenih razloga identifikacija i ispitivanje nečistoća zauzimaju veoma važno mjesto
u razvoju i ispitivanju lijekova.

Neophodno je navesti sve poznate i potencijalne nečistoće koje se očekuju s obzirom na put
sinteze, hemijske reakcije u toku sinteze i očekivane degradacione produkte. Od izuzetne je
važnosti navesti analitičke metode detekcije i identifikacije.

Tabela 2. Sadržaj degradacionih proizvoda u odnosu na ljekovitu supstancu, koji obavezuje

njihovu identifikaciju, kvalifikaciju i kvantifikaciju

Sadržaj degradacionih
Minimalna dnevna doza ljekovite
proizvoda u odnosu na
supstance
ljekovitu supstancu
< 1 mg 1,0 %
1mg-10 mg 0,5 %
Identifikacija
> 10 mg-2 g 0,2 %
>2g 0,1 %
≤ 1g 0,1 %
Kvalifikacija
>1g 0,05 %
< 10 mg 1,0 %
10 mg-100 mg 0,5 %
Kvantifikacija
> 100 mg-2 g 0,2 %
>2g 0,15 %

Za identifikaciju i kvantifikaciju neorganskih nečistoća ulavnom postoje farmakopejski propisi i

limiti a ako ne postoje, onda su dozvoljene i druge procedure. S obzirom da su i rezidualni
rastvatrači potencijalno toksični moraju se kvantificirati odreĎenom analitičkom metodom dok
limiti moraju biti u skladu s farmakopejom ili poznatim podacima u okviru doze, dužine
tretmana i načina primjene.

14
Smjernice koje daje CHMP (Committee For Medicinal Products for Human Use) i ICH (
International Conference on Harmonisation) koje se odnose na prisustvo nečistoća u aktivnoj
supstanci i gotovom proizvodu prihvatio je veliki broj zemalja ili je na njima bazirao vlastite
zahtjeve i propise.

Evropska farmakopeja (Ph.Eur) u poglavlju 5.10. daje osnovnu podjelu nečistoća, limite za
pojedine grupe i analitičke metode koje je moguće primijeniti za njihovo ispitivanje, te propisuje
kriterije prihvatljivosti za svaku grupu nečistoća.

Američka farmakopeja (USP) zahtijeva da se za svaki lijek mora odrediti vrsta nečistoće koja
se nalazi u aktivnoj supstanci sintetiziranoj odgovarajućim postupkom. Potrebno je da sve
nečistoće budu identificirane i kvantificirane odgovarajućim postupkom.

Prema ICH smjernicama 3QA(R2) nečistoće su podijeljene u 3 grupe:

 Organske nečistoće u koje se ubrajaju proizvodne i srodne supstance

 Neorganske nečistoće
 Rezidualni rastvarači

Organske nečistoće obuhvataju polazne supstance, meĎuprodukte, intermedijere, degradacione

produkte, reagense, ligande i katalizatore. Mogu nastati u toku proizvodnog procesa i /ili u toku
čuvanja supstance.

Neorganske nečistoće su uglavnom poznate supstance koje vode porijeklo iz procesa

proizvodnje. Tu spadaju teški metali, neorganske soli, ligandi, katalizatori i razni drugi materijali
koji se koriste u procesu proizvodnje.

U rezidualne rastvarače se ubrajaju organski i neorganski rastvarači koji se koriste u procesu

proizvodnje.

U.S.FDA. ( United States Food and Drug Administration) definira nečistoće sa dva aspekta:
hemijskog i sigurnosnog.

Hemijski obuhvata identifikaciju i kvantifikaciju nečistoća, proizvodne izvještaje, specifikacije

i sažetu diskusiju analitičkih postupaka dok drugi uključuje komparativne studije i genotoksične
testove.

15
 VJEŢBA BR. 3
IDENTIFIKACIJA SRODNIH SUPSTANCI I PRODUKATA RAZGRADNJE
ACETILSALICILNE KISELINE HROMATOGRAFIJOM NA TANKOM SLOJU

Metoda: TLC (HTS)

Stacionarna faza: Silikagel 60, GF254

Mobilna faza (eluent): hloroform : metanol : mravlja kiselina = 7 : 1,5 : 0,5

Postupak:

Otopina uzorka:
U odmjerni sud od 10 ml odvagati 1,0 g acetilsalicilne kiseline dodati 5 ml etanola promućkati i
dopuniti etanolom do oznake.

Poredbena otopina:
U odmjerni sud od 100 ml odvagati 1.0 g acetilsalicilne kiseline dodati 20 ml etanola promućkati
i dopuniti etanolom do oznake.

Poredbena otopina 1:
Od poredbene otopine odpipetirati 5 ml i prenijeti u odmjerni sud od 10 ml i dopuniti etanolom
do oznake.

Poredbena otopina 2:
Od poredbene otopine odpipetirati 1 ml, prenijeti u odmjerni sud od 10 ml i dopuniti etanolom
do oznake.
Na hromatografsku ploču nanijeti 10 μl otopine uzorka i 10 μl poredbene otopine, poredbene
otopine 1 i poredbene otopine 2. Razviti hromatogram do visine fronta 15 cm. Osušenu ploču se
posmatrati pod UV lampom na 254 nm.

16
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Identifikacija srodnih supstanci i produkata razgradnje acetilsalicilne kiseline

hromatografijom na tankom sloju

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

17
 VJEŢBA BR. 4
EKSTRAKCIJA –HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU

Odmjeri se odreĎena količina sprašenih tableta, kvantitativno prenese u lijevak za odlijevanje i

doda 10 ml 0,1 M NaOH i 10 ml hloroforma. Aspirin preĎe u natrijumovu so dobro topivu u
vodi, a kodein se nalazi u obliku baze teško topive u vodi, a dobro topive u hloroformu kao i
fenacetin. Hloroformski ekstrakti se isperu sa vodom i ekstrahiraju sa 1 M H2SO4 pri čemu
kodein prelazi u kodein sulfat i zaostaje u vodenom sloju, a fenacetin u hlorofomskom ekstraktu.
Vodeni sloj u kojem se nalazi kodein sulfat se dovede do bazne reakcije sa NaOH, pri čemu se
izdvoji kodein koji se ekstrahuje sa hloroformom. Dobiveni hloroformski ekstrakti se upare do 2
ml i nanesu na ploču koja je presvučena slilkagelom GF254.

Mobilna faza: hloroform:metanol:mravlja kiselina=7:1,5:0,5

Nakon hromatografiranja ploča se posmatra pod UV lampom i vrši identifikacija.

18
 SHEMA EKSTRAKCIJE

SMJESA (aspirin,fenacetin,kodein) + 10 ml 0,1 M NaOH + 10 ml

hhhChhloroforma hhhhlhhloroforma hloroforma

Vodeni sloj (gornji) Hloroformski sloj (donji)

1M H2SO4 (do pH 3) + kodein, fenacetin + 0,5M H2SO4

10 ml CHCl3
hloroformski sloj (donji)

filtriranje preko vodeni sloj horoformski

bezvodnog Na- sulfata sloj

uparavanje do 2 ml Kodein Fenacetin

+ 0,5 M NaOH + hloroform

filtriranje preko filtriranje preko

bezvodnog Na- sulfata bezvodnog Na- sulfata

uparavanje do 2 ml uparavanje do 2 ml

19
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Ekstrakcija-hromatografija na tankom sloju

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

20
 GASNA HROMATOGRAFIJA (GAS CHROMATOGRAPHY-GC)

Gasna hromatografija je hromatografska metoda kod koje se kao mobilna (pokretna faza)
upotrebljava gas. Vrlo je osjetljiva, brza i tačna metoda koja služi za razdvajanje komponenata iz
smjese. Može se primijeniti za razdvajanje i identifikaciju supstanci koje se mogu prevesti u
gasovito agregatno stanje.

Razdvajanje koje se dešava u hromatografskoj koloni može teći na dva načina:

1. Supstanca se adsorbuje na čvrsto punilo kolone, adsorbens (gasno-čvrsta hromatografija)
2. Supstanca se preraspodjeljuje izmeĎu dvije faze, gasa nosača koji nosi supstancu i tečne
nepokretne faze koja se nalazi u koloni (gasno-tečna hromatografija)

Brzina kojom će se supstanca kretati kroz kolonu zavisi od pritiska i brzine kojom mobilna faza–
gas, prolazi kroz kolonu, afiniteta supstance prema nepokretnoj (stacionarnoj) fazi, temperature i
drugih uslova.

Slika 3. Shema gasnog hromatografa

Osnovni princip gasne hromatografije: Uzorak se prevodi u isparljivo stanje i prolazi kroz
hromatografsku kolonu nošen od gasa nosača, pri čemu se vrši razdvajanje. Na izlasku iz kolone
nalazi se detektor koji registruje prisustvo supstance u uzorku, a automstski ureĎaj bilježi
rezultate u obliku gasnog hromatograma.
Za uspješno razdvajanje neke smjese potrebno je pravilno izabrati gas nosač, tip hromatografske
kolone, sistem za injiciranje, najpodesniji i najefikasniji detektorski sistem i osjetljiv sistem za
registraciju hromatografskih signala. Razdvajanje supstanci iz smjese zavisi od fizičko –
hemijskih osobina supstanci, fizičkih osobina stacionarne faze i efiksanosti kolone.

Gas nosač
Nosi uzorak kroz kolonu do detektorskog sistema. Gas nosč ne smije uticati na detektorski
sistem i mora biti vrlo visokog stepena čistoće. Bira se u zavisnosti od detektorskog sistema.
Najčešće se koriste: hidrogen, nitrogen, helijum, argon ili njihove smjese.

21
Kolone
U gasnoj hromatografiji se koriste tri različita tipa kolona: punjene, kapilarne i kolone na čijim je
zidovima nanesen gas nosač i nepokretna faza. Materijal od koga se izraĎuju kolone je staklo ili
nehrĎajući čelik.
Kolone mogu biti punjene – dimenzija 1-3 m, unutrašnjeg promjera 3-6 mm i kapilarne -
dužine 10-50 m i promjera oko 0,25 mm ili 0,32 mm. Postoje tkz. Wide bore kapilarne kolone
koje imaju promjer 0,53 mm. One su u pravilu kraće od kapilarnih kolona (tipična dužina 10 m) i
predstavljaju prelaz izmeĎu klasičnih kapilarnih i punjenih kolona.

Punilo za kolone
Zavisi od principa razdvajanja u koloni. Ako se radi adsorpciona hromatografija punilo je
aluminijum oksid ili aktivni ugalj.
Ako je princip preraspodjela punilo kolone je neisparljiva tečnost (tečna faza) nanesena na čvrsti
nosač (specijalno prireĎena dijatomejska zemlja, teflon, staklene kuglice, polimeri divinilbenzen,
etilvinilbenzen, stiren i dr.). Nabrojani materijali posebno obraĎeni i odgovarajućih dimenzija
čestica u prometu se nalaze pod različitim komercijalnim imenima.
Nepokretna tečna faza mora biti neisparljiva, hemijski stabilna, ne smije se oksidirati, mora biti
dobro rastvorljiva i mora imati sposobnost stvaranja finog omotača oko nosača. Može biti
polarna i nepolarna. Za hromatografiranje polarnih supstanci izabere se polarna nepokretna faza i
obrnuto za nepolarne supstance nepolarna nepokretna faza.
Na tržištu se nalaze pod komercijalnim imenima kao npr. Apolan L, Carbowax 20 M, OV-1, OV -
101, itd.

Hromatografska kolona je smještena u termostat koji se podešava na željenu temperaturu,

odnosno temperaturu na kojoj će se uzorak nalaziti u gasovitom stanju. Jednim krajem kolona je
priključena za injektor a drugim za detektorski sistem. Prije hromatografiranja kolona se
kondicionira, odnosno grije na odreĎenoj temperaturi 12-24 sata, uz protok samo gasa nosača.
Svrha kondicioniranja da se iz kolone odstrane eventualno prisutne nečistoće.

Sistem za unošenje uzoraka

Gasnom hromatografijom se mogu razdvajati uzorci u sva tri agregatna stanja pod uslovom da se
tečni i čvrsti uzorci prevedu u gasovito stanje. Gasoviti uzorci se unose pomoću specijalnih
kiveta odreĎene zapremine. Tečni uzorci se unose pomoću injekcionih šprica volumena 1-10 μl.
Za rastvaranje čvrstih uzoraka se koriste lako hlapljivi rastvarači - eter, hloroform, benzen,
alkoholi, ili se direktno unose kao čvrsti - tehnikom kapsule. Količina supstance koja se aplicira
je od 10-10-1015 g u volumenu 1-5 μl.

Detektori u gasnoj hromatografiji

U gasnoj hromatografiji se koriste dvije vrste detektorskih sistema:

a) Detektori koji registruju razlike u fizičkim karakteristikama izmeĎu samog gasa nosača
i gasa nosača u kome je prisutan uzorak (detektor toplinske provodljivosti)

Detektor toplinske provodljivosti

Detektor toplinske provodljivosti registruje razliku u toplinskoj provodljivosti čistog gasa i gasa
sa eluiranom supstancom nakon izlaska iz kolone. Žičani otpornici u mjernoj i referentnoj ćeliji
22
spojeni su sa otpornicima u Wheatstonov most, pa svaka razlika u provodljivosti gasova,
odnosno u otporu niti pokazuje otklon na instrumentu za registraciju ili pisaču.
b) Detektori koji mjere samo svojstva uzorka (detektori sa jonizirajućim
karakteristikama)

Plamenojonizacioni detektor (FID)

Plamenojonizacioni detektor (FID) ima veliku primjenu u analitici lijekova. Koristi se za
organske supstance koje predstavljaju najveći broj aktivnih supstanci u lijekovima. Ne može se
koristiti za neorganske supstance i vodu. Kod plamenojonizacionog detektora supstanca koja
izlazi iz kolone sa gasom nosačem mješa se sa hidrogenom i vazduhom i sagorijeva u plamenu.
Prilikom sagorijevanja supstance, dolazi do stvaranja jona i naglog protoka struje (kada iz kolone
izlazi samo gas nosač, postoji vrlo mali protok struje) što se registruje kao hromatografski signal
u onom momentu kada je supstanca napustila kolonu. Odgovor plamenojonizacionog detektora
zavisi od broja C – atoma u molekuli i slabiji je ako su prisutni kisik i nitrogen.

Elektron-privlačeći detektor (ECD)

Elektron-privlačeći detektor (ECD) je specifičan detektor namijenjen za identifikaciju i
kvantifikaciju supstanci koje sadrže atome ili atomske grupe sa velikim afinitetom za elektrone,
kao što su spojevi sa halogenim elementima, nitro ili karbonilnom grupom. Rad elektron-
privlačećeg detektora zasniva se na principu reakcije slobodnih elektrona koji nastaju
jonizacijom gasa nosača i supstance koja ima afinitet prema elektronima. Jonizacija gasa nosača
provodi se sa radioizotopom 63Ni ili 3H, pri čemu se oslobaĎaju elektroni i pozitivno
naelektrisane čestice. Pri prolazu gasa nosača, uspostavi se standardni tok struje kroz detektor.
Pri prolasku gasa nosača sa uzorkom smanjuje se protok struje, i to smanjenje se registruje kao
signal.

Plameno-fotometrijski detektor
Plameno-fotometrijski detektor koristi se za identifikaciju i kvantifikaciju organskih spojeva koji
sadrže fosfor i sumpor. Detektuje emisiju karakterističnog zračenja koje nastaje sagorijevanja
supstance u plamenu. Nastalo zračenje se selektira pomoću odgovarajućih filtera i njegov
intenzitet registruje fotoćelija.

Spektrometar masa
Danas se u rutinskoj analitici sve više koristi vezani sistem gasna hromatografija –
spektrometrija masa (GC-MS), gdje se spektrometar masa koristi kao detektor kojim se
pojedinačno svaka razdvojena supstanca odreĎuje na osnovu izabranog karakterističnog
masenog broja. Tokom analize dobija se veliki broj podataka, koji se potom obraĎuju primenom
odgovarajućih softvera.

Registracija signala – gasni hromatogram

Registrovani signali koji dolaze sa detektora na sistem za registarciju predstavljaju gasni
hromatogram sa pikovima na y osi i vremenom zadržavanja na x osi.

Kvalitativna i kvantitativna analiza u gasnoj hromatografiji

Kvalitativna analiza

23
Identifikacija komponenti koje se razdvoje u toku hromatografiranja, obično se vrši poreĎenjem
vremena zadržavanja ispitivane supstance sa vremenom zadržavanja standarda supstance.

Parametri koji se koriste u postupku identifikacije (kvalitativne analize) su:

a) vrijeme zadrţavanja (tR)- je vremenski period od momenta injiciranja uzorka do
momenta kada je pik ispitivane supstance dostigao svoj maksimum (izražava se u
sekundama ili minutama),

b) reducirano vrijeme zadrţavanja (t'R)- je razlika vremena zadržavanja ispitivane supstane

(tR) i nezadržane komponente (vazduha),

c) relativno vrijeme zadrţavanja (tRA/B)- predstavlja odnos vremena zadržavanja ispitivane

supstance i vremena zadržavanja standardne supstance.

Priprema derivata
Kada neka supstanca ima mali napon para što otežava hromatografiranje, pripremaju se pogodni
lako isparljivi derivati. Stvaranjem derivata obično se blokiraju polarne grupe te dolazi do boljeg
razdvajanja, pojave oštrijih pikova i povećane osjetljivosti, što omogućava rad sa malim
količinama uzorka. Najčešće se koriste slijedeći derivati:
a) Schiffove baze
b) Ditiokarbamati i izotiocijanati
c) Oksazolidini
d) Karbinolamini
e) Siliniziranje sa trimetil silicijumom

Kvantitativna analiza
Kvantitativna analiza u gasnoj hromatografiji se radi mjerenjem površine ispod hromatografskog
signala (pika). Za mjerenje površine ispod signala postoji više načina, a to su: mjerenje površine
ispod pika metodom triangulacije, elektronskog integratora itd.
Prema metodi triangulacije površina hromatografskog pika odreĎuje se množenjem visine pika
(h) izmjerene u mm, sa širinom pika na polovini visine pika (Wh) takoĎer izmjerene u mm.

P= h • Wh

Proizvod ove dvije veličine daje oko 94% ukupne površine pika. Metoda triangulacije može se
koristiti kada su pikovi simetrični.

Kvantitativnu analizu je najpouzdanije provesti uz prisustvo unutrašnjeg (internog) standarda.

Pik unutrašnjeg standarda mora biti dobro odvojen od ispitivanog pika, a koncentracija
unutrašnjeg standarda približna koncentraciji supstance koja se ispituje. Kod kvantitativne
analize potrebno je pripremiti kalibracionu krivu tako što se naprave različite koncentracije
rastvora standarda i u svaki dodaje tačno poznata koncentracija unutrašnjeg (internog) standarda
i vrši hromatografiranje. Na ordinatu se nanosi odnos površina pikova standarda i internog
standarda a na apscisu koncentracija standarda. Koncentracije supstance u uzorku odredi se tako

24
što se kod pripreme u uzorak doda ista koncentracija internog standarda, uzorak hromatografira,
očita odnos površina, nanese na ordinatu i sa apscise očita koncentracija.

25
 VJEŢBA BR. 5
ODREĐIVANJE KOFEINA U TABLETAMA GASNOM HROMATOGRAFIJOM

1 tableta sadrţi 250 mg kofeina

Mora sadrţavati od 90-110% kofeina

Kalibraciona kriva
Od osnovnog standarda kofeina konc. 10 mg/ml napraviti seriju razblaženja konc. 0,5, 1,0 i 1,5
mg/ml. U svako rablaženje dodati po 1,0 ml internog standarda difenilhidramin hlorida
koncentracije 25 mg/100 ml i dopuniti destilovanom vodom do 10 ml. Uz dodatak 0,5 ml 5 mol/l
KOH ekstrahirati tri puta sa po 3 ml rastvora eter : izopropanol (9:1 v/v). Organski sloj odvojiti i
upariti do suha. Suhi ostatak rastvoriti u 500 μl etilacetata i hromatografirati.

Test otopina
Odvagati količinu tabletne mase koja sadrži 120 mg kofeina i rastvoriti u 50 ml vode. Od toga
uzeti 5 ml, prenijeti u odmjerni sud od 10 ml, dodati 1 ml internog standarda, dopuniti vodom do
oznake i profiltrirati. Uz dodatak 0,5 ml 5 mol/l KOH ekstrahirati tri puta sa po 3 ml rastvora eter
: izopropanol (9:1 v/v). Organski sloj odvojiti i upariti do suha. Suhi ostatak rastvoriti u 500 μl
etilacetata i hromatografirati.

Uslovi hromatografiranja:

Instrument: Gasni hromatograf 7890A Agilent Technologies

Kolona: Kapilarna kolona DB-35MS, 30m x 0,32 mm, 0,25μm

Injektor. 2500C

Detektor: 3000C

Očekivano vrijeme zadržavanja za kofein: 13.395 min.

Očekivano vrijeme zadržavanja za i.s.: 7.655 min

26
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: OdreĎivanje kofeina u tabletama gasnom hromatografijom

Račun:

Zaključak:

27
 TEČNA HROMATOGRAFIJA VISOKIH PERFORMANSI (HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY-HPLC)

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) je hromatografska metoda koja se danas
najviše koristi u analitici lijekova (u kontroli farmaceutksih proizvoda za identifikaciju i
odreĎivanje aktivnih i pomoćnih supstanci, ispitivanju degradacionih produkata i metabolita,
analitici tjelesnih tečnosti itd.). HPLC omogućava analizu termolabilnih molekula, polarnih
molekula i molekula velike molekulske mase koje se ne mogu analizirati gasnom
hromatografijom. Trajanje analize, u odnosu na druge hromatografiske metode je znatno kraće.
Analiza traje od 5-30 min. Moguće je direktno injiciranje (bez prethodne ekstrakcije) bioloških
tečnosti: seruma, urina, likvora. Osnovni cilj ove hromatografske metode je da se dobije
zadovoljavajuće razdvajanje komponenti analizirane smjese u što kraćem vremenu.

Kada se analizira uzorak sa više komponenti, svaka komponenta će provesti isto vrijeme u
mobilnoj fazi, ali će, pod uslovom da se razdvajaju, svaka komponenta provesti različito vrijeme
u stacionarnoj fazi, na osnovu čega se i vrši njihovo razdvajanje.
Izborom odgovarajuće stacionarne faze i sastava mobilne faze postiže se izuzetna specifičnost
kontrolom interakcija analit /mobilna faza /stacionarna faza. Efikasnost HPLC kolona je znatno
manja od efikasnosti GC kolona, ali je specifičnost analize puno veća. Dodatno se povećava kroz
različite tipove interakcija (dipol-dipol, elektrostatske, hidrogenove veze, stvaranje jonskih
parova, hidrofilno-lipofilne interakcije i dr.)
Prvi signal koji se javlja u hromatogramu nakon injiciranja predstavlja rastvarač, a njegovo
vrijeme zadržavanja tM odgovara vremenu koje supstance uzorka provedu u mobilnoj fazi.

Razlika vremena zadržavanja zadržane komponente i nezadržanog rastvarača predstavlja vrijeme

koje molekule supstance provedu u stacionarnoj fazi i naziva se reducirano vrijeme
zadrţavanja - t'R.

(t'R=tR-tM)

Vrijeme zadrţavanja tR je vremeski period od momenta injiciranja uzorka do momenta kada

signal isptivane komponente uzorka dostigne maksimum i parametar je na osnovu kojeg se vrši
kvalitativna i kvantitativna analiza.

28
Sistem za HPLC

Osnovne komponente sistema čine: sistem za obezbjeĎenja protoka mobilne faze, dio za
unošenje uzorka, hromatografska kolona, detektorski sistem i sistem za obradu rezultata.
Sistem za obezbjeĎenje protoka mobilne faze čine: rezervoari za rastvarače, pumpa, filter i
mjerač pritiska.

Slika 4. Shema HPLC aparata

Mobilna faza se iz rezervoara pumpom uvodi u kolonu na kojoj se odvija razdvajanje. Pošto
rastvoreni gasovi mogu znatno ometati analizu, prije ulaska u kolonu izvrši se degasifikacija
mobilne faze. Uzorak se unosi posebnim injektorskim sistemom koji osigurava trenutno i
reproducibilno unošenje. Kolona je smještena u termostatiranom prostoru što osigurava
reproducibilnost analize. Na izlazu iz kolone se nalazi detektorski sistem sa kojeg signal odlazi
na sistem za obradu rezultata analize. Sve komponente sistema su spojene uskim cijevima
(promjer 0,1 mm), kako bi se smanjio mrtvi volumen i izbjegla difuzija analita u mobilnoj fazi.

Pumpe

Svaki sistem za HPLC mora imati barem jednu pumpu koja omogućava protok mobilne faze
kroz vrlo sitne čestice stacionarne faze u koloni. Zbog velikog otopora, obično se javlja visok
unutrašnji pritisak, koji zavisi od veličine čestica stacionarne faze, gustine punjenja, kao i od
viskoznosti mobilne faze.

29
Izokratski i gradijentni rad

Obično se koriste sistemi koji mogu istovremeno raditi sa više različitih mobilnih faza (do 4).
Ukoliko se sastav mobilne faze ne mijenja tokom analize, govori se o izokratskom radu. Ako se
sastav mobilne faze mijenja tokom analize, takav rad se naziva gradijentni rad. Gradijenti rad se
koristi ako se u istom uzorku razdvajaju supstance različite polarnosti.
Ukoliko sistem ima samo jednu pumpu, komora za miješanje se nalazi izmeĎu rezervoara
mobilnih faza i pumpe i tada se govori o niskotlačnom gradijentu. Ako svaka mobilna faza ima
svoju pumpu, govori se o visokotlačnom gradijentu, a mobilne faze se miješaju nakon izlaska iz
pumpi. Zbog visokih pritisaka i korozivnih otapala, unutrašnjost cilindra pumpe i klipa je
izraĎena od safira, ahata ili specijalnih legura.

Injektori

U HPLC se uzorak unosi isključivo u obliku rastvora. Tipični volumeni uzorka su 5-50 µl.
Precizno odmjerenu zapreminu uzorka je potrebno što brže nanijeti na vrh kolone, kako bi se
izbjegao uticaj na protok mobilne faze. Najjednostavniji način injiciranja uzorka je putem
injektora tipa ventila. Danas se obično upotrebljavaju injektori čiji je rad automatiziran, tzv.
autosempleri koji sami injiciraju zadati volumen uzorka u hromatografsku kolonu.

Kolona

Kolona je čelična cijev, dužine 3-15 cm, ranije su se koristile i kolone do 25 cm. Danas su u
upotrebi kolone promjera 2-4 mm, 1-2 mm ili manjim od 1 mm, uz protoke koji mogu biti svega
nekoliko ml/min. Stacionarna faza je u koloni smještena izmeĎu dva porozna diska koji se nalaze
na krajevima kolone. Da bi se produžio vijek kolone, obično se ispred nje stavlja predkolona. To
je kratka kolona dužine 4-10 mm punjena istom fazom kao i kolona. Predkolona zadržava
nečistoće iz uzorka i nakon nekoliko injiciranja se zamjenjuje. Kolona se smješta u termostat
čime se postiže reproducibilnost u radu. Tipična radna temperatura je nešto viša od temperature
okoline. S porastom temperature se smanjuje viskoznost mobilne faze i ubrzava se eluiranje sa
stacionarne faze.

Stacionarne faze

Silika gel je osnovno punilo, bilo čist ili modificiran kovalentnim vezivanjem organskih radikala.
Još se često koristi i aluminijum-oksid, kao i cirkonij oksid koji je stabilan u visokom području
pH.

30
S obzirom na vrstu stacionarne faze u koloni, razlikuju se četiri osnovna tipa razdvajanja:

1. Tečno- čvrsta (adsorpciona) hromatografija - razdvajanje se zasniva na ponavljanju

ciklusa adsorpcije i desorpcije

2. Tečno- tečna (podiona) hromatografija - razdvajanje se zasniva na na podjeli prema

rastvorljivosti ispitivanih supstanci izmeĎu mobilne i stacinarne faze

3. Ekskluziona (gel-permeaciona) hromatografija - razdvajanje supstanci iz uzorka vrši se

na osnovu veličine njihovih molekula. Najčešće korištena stacionarna faza su gelovi tipa
divinilbenzena.

4. Jonoizmjenjivačka hromatografija - stacionarnu fazu predstavljaju čestice sa jonskim

naelektrisanjem suprotnog naboja od onog koje posjeduju supstance uzorka. Anionske
jonoizmjenjivače obično čine nosači sa vezanim kvarternim amonijum grupama, dok
kationske izmjenjivače predstavljaju nosači sa vezanim grupama sulfitnih kiselina.

Mobilne faze

Mobilna faza ima aktivnu ulogu u procesu razdvajanja u HPLC-u. Kao mobilna faza može se se
koristiti jedan rastvarač ili smjesa više rastvarača. Sastav mobilne faze tokom analize može ostati
nepromjenjen (izokratsko eluiranje) ili se može mijenjati procentualni sastav mobilne faze
(gradijentno eluiranje).

Kod gradijentnog eluiranja je potrebno da aparat sadrži više odvojenih rezervoara za različite
rastvarače, te da ima poseban dio u kojem će se vršiti doziranje odreĎenih količina rastvarača i
njihovo miješanje.

Gradijentno eluiranje se obično primjenjuje kada komponente uzorka imaju različitu polarnost,
pa je promjena polarnosti mobilne faze tokom analize potrebna da bi se omogućilo razdvajanje
komponenti koje kasnije izlaze iz kolone.

Rastvarači koji se koriste kao mobilna faza mogu se nabaviti na tržištu pod oznakom HPLC
čistoće, što podrazumjeva da u njima ne smije biti nikakvih hemijskih primjesa koje bi mogle
predstavljati smetnju prilikom prolaska mobilne faze kroz ćeliju detektora. Ovi rastvarači moraju
ispunjavati sljedeće uslove:
 Ne smiju sadržavati čestice organskog ili neorganskog porijekla
 Svi rastvoreni gasovi se moraju odstraniti
 Ne smiju sadržavati mikroorganizme

Prema prirodi nepokretne faze, HPLC se dijeli se na:

 Hromatografiju na „normalnim“ fazama, ako je stacionarna faza polarna - u tom slučaju
koristi se nepolarna mobilna faza.

31
  Hromatografiju na „obrnutim fazama“, ako je stacionarna faza nepolarna ili blago polarna -
u tom slučaju koristi se polarna mobilna faza (najčešće voda sa dodatkom metanola ili
acetonitrila).

Najčešće korišteni rastvarači u HPLC analizi su: acetonitril, metanol, voda, tetrahidrofuran,
izopropil alkohol i dr.

Eluotropna snaga otapala

Miješanjem različitih otapala može se modificirati polarnost i eluotropna snaga. Različiti sastavi
smjese otapala imaju tazličitu viskoznost, pa prema tome i pritisak u koloni. Ako je potrebno
modificirati polarnost mobilne faze onda se to radi sa vodom, alkoholima ili hloriranim
ugljikovodonicima.

Postoje 4 tipa interakcija mobilne faze i analita

Dipol-dipol interakcije, kada i molekula analita i otapalo imaju dipolni moment. Disperzne
interakcije, nastaju zbog meĎusobnog privlačenja molekula. Dielektrične interakcije,
karakteristične su za jone u polarnom otapalu. Hidrogenove veze izmeĎu molekule analita i
otapala.

Priprema uzorka

HPLC analizom moguće je analizirati samo tečne uzorke. Poželjno je da uzorak bude rastvoren u
mobilnoj fazi ili u jednoj od komponenata mobilne faze. Uzorak ne smije da sadrži
suspendovane čestice, da ne bi došlo do začepljenja kolone, te se zbog toga koriste predkolone.
Značajna karakteristika tečne hromatografije je u tome što je razdvajanje u većin slučajeva
moguće bez prethodnih transformacija molekule. U nekim slučajevima potrebna je derivatizacija
uzorka da bi se dobili derivati koji će fluorescirati ili će imati intenzivniju apsorpciju u UV
području. Derivatizacija se može provoditi prije ulaska u kolonu ili po izlasku iz kolone, tzv.
predkolonska i postkolonska derivatizacija.

Detektori

Zadatak HPLC nije da odredi sve komponente smjese, nego samo supstance od interesa.
Detektori koji se koriste mogu biti specifični i univerzalni.
Najčešće se koriste:
 Spektrofotometrijski/UV/Vis detektor
 Fluorescentni detektor
 Detektor indeksa refrakcije
 Elektrohemijski (konduktometrijski, potenciometrijski, kulometrijski) detektor
 Nebulizacijski detektor
 Vezani sistemi sa MS i NMR detekcijom

32
Spektrofotometrijski detektor

Detekcija se provodi na osnovu Lambert-Beerovog zakona.

Može se provoditi:
 Monohromatska detekcija (detekcija na jednoj valnoj dužini) primjenom monohromatora
ili izvora koji emitira samona jednoj valnoj dužini.
 Polihromatska detekcija (primjena detektora sa fotodiodama, tzv. „diode array“ detektor)

Fluorescentni detektor

Koristi se za detekciju organskih spojeva koji fluoresciraju ili se derivatizacijom mogu prevesti u
fluorescentne derivate i nakon toga odreĎivati. Osjetljivost ovog detektora je oko 1000 puta veća
od spektrofotometrijskog detektora.

Detektor indeksa refrakcije

Kontinuirano mjeri razliku u indeksu refrakcije čiste mobilne faze i mobilne faze koja izlazi iz
kolone. Ubraja se u univezalne detektore, jer je indeks refrakcije fizička veličina svake
supstance, ali je istovremeno i najmanje osjetljiv detektor. Temperatura mora biti konstantna
unutar tolerancije od 0,001 oC, jer bilo koja promjena temperature, dovodi do promjene gustine
supstance, te će se i indeks refrakcije automatski mijenjati.

Rastvarači koji se koriste kao mobilna faza takoĎer imaju svoj indeks refrakcije, pa treba
odabrati takvu mobilnu fazu čiji će indeks refrakcije što više razlikovati od od indeksa refrakcije
supstance koja se odreĎuje. Zbog toga se ovi detektori ne mogu koristiti kod gradijentnog
eluiranja, jer svaka promjena u sastavu mobilne faze dovodi i do promjene indeksa refrakcije.

Kvalitativna analiza (identifikacija supstanci) u HPLC-u

Poredi se vrijeme zadržavanja ispitivane supstance iz uzorka sa vremenom zadržavanja

standardne supstance. Vrijeme zadržavanja je jedna od karakteristika supstance, ali nije i jedina
specifičnost za jednu supstancu.
Više supstanci može imati isto vrijeme zadržavanja, pa je za pouzdanu idenifikaciju potrebno
analizirati uzorak i standardnu supstancu na dvije različite stacionarne faze ili sa dvije različite
mobilne faze. Ukoliko se i pod promjenjenim uslovima hromatografiranja uzorak i standard
jednako ponašaju, onda je to potvrda da se radi o istoj supstanci.
Za identifikaciju se može koristiti i reducirano vrijeme zadržavanja. Najpouzdanija je
identifikacija preko relativnog vremena zadržavanja, koje predstavlja odnos reduciranog
vremena zadržavanja ispitivane supstance i reduciranog vremena zadržavanja nekog unutrašnjeg
standarda.

33
Kvantitativna analiza

Provodi se mjerenjem površine ispod pika ili mjerenjem visine pika. Ove veličine se mijenjaju
proporcionalno sa promjenom količine supstance. Mjerenje površine je tačnije, ali ima slučajeva
kada je druga metoda bolja (npr. u analizi tragova), jer na visinu pikova manje utiču
interferirajući pikovi. Mjerenje visine je direktno, a površina ispod pika se izračunava najčešće
metodom triangulacije (množi se visina pika sa širinom pika na polovini visine). Ova metoda se
koristi kad su pikovi dobro razdvojeni i ako su pikovi simetrični. Kvantitativna analiza se
provodi metodom unutrašnjeg (internog) ili spoljašnjeg (eksternog) standarda.

Metoda unutrašnjeg (internog ) standarda

Dva su načina kvantitativne analize metodom internog standarda.:

a) Konstruiše se kalibraciona kriva tako što se naprave različite koncentracije rastvora

standarda i u svaki dodaje tačnopoznata koncentracija unutrašnjeg (internog) standarda i
vrši hromatografiranje. Na ordinatu se nanosi odnos površina pikova standarda i internog
standarda a na apscisu koncentracija standarda. Koncentracije supstance u uzorku odredi se
tako što se kod pripreme u uzorak doda ista koncentracija internog standarda, uzorak
hromatografira, očita odnos površina, nanese na ordinatu i sa apscise očita koncentracija.

b) Hromatografira se standard supstance koja se odreĎuje u koncentraciji koja odgovara

očekivanoj koncentraciji u uzorku zajedno sa internim standardom, očitaju površine i
izračuna odnos površina standard/interni standard.. Nakon toga hromatografira se uzorak
kome je takoĎer dodat interni standard u istoj koncentraciji kao i kod hromatografiranja
standarda, očitaju površine i izračuna odnos površina uzorak/interni standard.

Koncentracija supstance u uzorku se izračuna na slijedeći način:

odnos površina uzorak/standard

Cx =  koncentracija standarda
odnos površina standard/interni standard

Metoda spoljašnjeg (eksternog) standarda

a) Konstruiše se kalibraciona kriva u opsegu koncentracija gdje je postoji linearna zavisnost

površine ispod pikova i odgovarajućih koncentracija spoljašnjeg (eksternog) standarda.
Nakon hromatografiranja uzorka, na osnovu površine pika uzorka očita se koncentracija
sa kalibracione krive.

b) Direktno se porede površine ili visine pikova, istih koncentracija i volumena uzorka i
standarda i koncentracija uzorka se izračuna na slijedeći način:

površina (visina) pika uzorka

Cx =  koncentracija standarda
površina (visina) pika standarda

34
 VJEŢBA BR. 6
ODREĐIVANJE SADRŢAJA DIAZEPAMA U AMPULAMA METODOM HPLC
(USP 40)

Uzorak: Diazepam injekcije 5 mg/ml

Prema USP diazepam injekcije predstavljaju sterilni rastvor diazepama u pogodnom rastvaraču.
Preparat ne smije sadržavati manje od 90% i ne više od 110% deklarisanog sadržaja diazepama.

Mobilna faza: Pripremiti filtriranu mješavinu metanola i vode (65:35). Ako je potrebno
napraviti korekcije.

Standardni rastvor: Rastvoriti odvaganu količinu USP Diazepam RS u metanolu, dopuniti

kvantitativno sa metanolom da se dobije rastvor poznate koncentracije od 1 mg/ml. Prenjeti 5 ml
ovog rastvora u odmjerni sud od 25 ml, dodati 5 ml rastvora internog standarda, dopuniti
metanolom do oznake tako da standardni rastvor ima koncentraciju od 0,2 mg USP Diazepama
Rs po ml.

Test otopina: Prenjeti onaj volumen ampule koji je ekvivalentan količini od 10 mg diazepama u
odmjerni sud od 50 ml. Pipetirati 10 ml rastvora internog standarda i dopuniti metanolom do
oznake.

Rastvor internog standarda: Svaki put pripremati ex tempore. Pripremiti rastvor p-

tolualaldehida u metanolu tako da sadrži 0,3 μl po ml.

Uslovi hromatografiranja:
Kolona: C18, 150mm x 4,6mm
UV detektor: 254 nm
Protok mobilne faze: 1 ml/min
Temperatura: 30oC
Volumen injiciranja: 20 μl

Sadržaj diazepama u ampulama se računa po obrascu

50  C
mg/ml diazepama 
R
V u
Rs
C- koncentracije u mg/ml USP Diazepama RS u standardnom rastvoru
V- volumen ampula korišten u analizi
Ru- odnos površina ispod signala diazepama i internog standarda u test otopini
Rs- odnos površina ispod signala diazepama i internog standarda u standardnom rastvor

35
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: OdreĎivanje sadržaja diazepama u ampulama metodom HPLC

Račun:

Zaključak:

36
 VJEŢBA BR. 7
KVALITATIVNA I KVANTITATIVNA ANALIZA METIL PARABENA U KREMAMA
ZA ZAŠTITU OD SUNCA
(HPLC-metoda eksternog standarda)

Zahtjev za metil paraben: max. 0,4% metil parabena u kremi

Uslovi hromatografiranja:
Kolona: Beckman C8 5µm 250 x 4.6
Mobilna faza: Metanol:voda-60:40
Temperatura: 420C
Protok: 1 ml/min
Talasna duţina: 254 nm

Priprema standarda metil parabena za kalibracionu krivu

Osnovna otopina metil parabena:

Na analitičkoj vagi se tačno odvaže 50 mg standardne supstance metil parabena u normalni sud
od 100 ml. U normalni sud se doda 40 ml smjese etanol-voda (90:10) i energično mućka 2
minute. Nakon toga rastvor se dopuni smjesom etanol-voda do oznake.

Serija razblaženja za kalibracionu krivu:

Od osnovnih otopina metil parabena parabena, koja su prethodno pripremljena, pripremi se serija
razblaženja metil parabena tako što se odpipetira 20 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml i 1 ml i preneseno u
normalne sudove od 50 ml. Svaki normalni sud dopuni se smjesom etanol/voda do oznake. Ove
otopine moraju biti svježe pripremljene.

Priprema uzoraka za analizu tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom

Uzorci se pripreme vaganjem 1 g svakog uzorka direktno u normalne sudove od 50 ml. U svaki
normalni sud se doda po 1 ml 2 M sulfatne kiseline i dopuni smjesom etanol/voda do oznake.
Svaki rastvor se mućka 1 minutu. Nakon toga, rastvori su prenesenu u vodeno kupatilo i drže 5
minuta na temperaturi 600C, da bi se olakšala ekstrakcija konzervanasa u etanolnu fazu. Rastvori
se naglo ohlade pod mlazom hladne vode i drže u frižideru 1 sat. Prije injiciranja svaki rastvor se
prethodno profiltrira kroz nepolarni filter veličine pora 0,45μm, nakon čega se injiciraa po 10 µl
svakog.

37
ZADATAK

1. Sa snimljenih hromatograma standarda očitati vrijeme zadržavanja metil parabena u

minutama. (Kvalitativna analiza) i površine za svaku koncentraciju (Kvantitativna analiza).

2. Iz jednačine pravca koja se dobije nakon konstruisanja kalibracione krive, izračunati

koncentracije metil parabena u uzorcima od 1-4. (Kvantitativna analiza)

3. Statistički obraditi rezultate analize računanjem aritmetičke sredine, standardne devijacije i

koeficijenta varijacije.

38
 OBRADA REZULTATA

Hromatogrami serije standarda metil parabena:

Hromatogram 1. Standard metil parabena koncentracije 10 µg/ml

Hromatogram 2. Standard metil parabena koncentracije 20 µg/ml

39
Hromatogram 3. Standard metil parabena koncentracije 50 µg/ml

Hromatogram 4. Standard metil parabena koncentracije 100 µg/ml

40
 Hromatogram 5. Standard metil parabena koncentracije 200 µg/ml

Koncentracija srednja KV
RT P1 P2 P3 SD
μg/ml vrijednost %

10μg/ml

20μg/ml

50 μg/ml

100 μg/ml

200 μg/ml

41
Račun:

42
Kalibraciona kriva:

baždarna kriva za metil paraben

14000000
y = 59823x + 145221
12000000
R2 = 0,9996
10000000
površina 8000000 Series1
6000000 Linear (Series1)
4000000
2000000
0
0 50 100 150 200 250
mg/ml

Hromatogrami uzoraka krema za zaštitu od sunca:

Hromatogram 6. Uzorak 1

Hromatogram 7. Uzorak 2

43
 Hromatogram 8. Uzorak 3

Hromatogram 9. Uzorak 4

Količina
Srednja KV
Uzorak P1 P2 P3 SD prisutna u
vrijednost %
uzorku u %

1.

2.

3.

4..

44
Račun:

Zaključak:

45
 VOLUMETRIJSKE (TITRIMETRIJSKE) METODE

Volumetrijske metode imaju široku primjenu u analitici lijekova jer su vrlo jednostavne, ne
zahtjevaju specifičnu, skupu opremu, tako da se mogu izvesti skoro u svakoj apoteci i
laboratoriji. OdreĎivanjem volumetrijskim metodama zasniva se na reakcijama izmeĎu dva
rastvora kod kojih jedan ima tačno poznatu koncentraciju i naziva se titrant. Iz utrošene
zapremine titranta odreĎuje se količina supstance (analita) u ispitivanom rastvoru.

ACIDIMETRIJA I ALKALIMETRIJA

Kiselo-baznim titracijama (acidimetrija i alkalimetrija) odreĎuju se kiseline, baze, soli jakih

kiselina i slabih baza i soli jakih baza i slabih kiselina Acidi-alkalimetrijske titracije primjenjuje
se za odreĎivanje sadržaja procesom neutralizacije uz stvaranje slabo disociranog produkta vode.
Ove vrste titracije se dijele na acidimetrijske i alkalimetrijske.

Alkalimetrijske titracije

Ovom vrstom tiracija se mogu odreĎivati jake kiseline kao hloridna, nitratna, sulfatna, zatim
slabe kiseline, kao boratna, fosfatna, sirćetna kao i soli nastale iz slabih baza i jakih kiselina.
Titracija se može provoditi direktno ili indirektno.
Kada se vrši titracija farmaceutskih oblika sa neorganskim ili organskim supstancama, često je
potrebno modificirati postupak u odnosu na direktnu klasičnu titraciju.

Acidimetrijske titracije

Ovom metodom može se provesti direktna titracija jakih baza kao što su KOH, Ca(OH)2 i
titracija slabih baza kao što su amonijum-hidroksid, magnezijum-oksid i organske baze, zatim
indirektna titracija soli i oksida kao što su HgNH2Cl, HgO i titracija soli nastalih iz jakih baza i
slabih kiselina kao što su Na2CO3, K2CO3, KHCO3, Na2B4O7, kalcijum-laktat, natrijum citrat i
druge, sa standardnim rastvorima baza.

Indikatori u alkaliacidimetrijskim analizama

Indikatori u alkali-acidimetrijskim titracijama su slabe organske kiseline ili baze koje mogu dati
ili primiti protone, mijenjajući pri tome svoju boju. Interval pH u kojem se može uočiti promjena
boje kiselo-baznog indikatora naziva se intervalom promjene boje i u prosjeku iznosi oko 2 pH
jedinice. Završna tačka u alkali-acidimetrijskoj analizi najčešće se provodi upotrebom indikatora,
ali se danas sve češće provodi elektrohemijskim metodama, potenciometrijski i
konduktometrijski. Indikatori se prema hemijskoj strukturi dijele na: azo, ftaleinske i
sulfoftaleinske indikatore.

46
1. Azo- metiloranž, metilcrveno, dimetilžuto
2. Ftaleinske- fenolftalein, timolftalein
3. Sulfoftaleinske boje- bromfenolplavo, bromtimolplavo, fenolcrveno

U volumetriji se najčešće koriste slijedeći indikatori: metil oranž, fenolftalein i metilcrveno.

47
 VJEŢBA BR. 8
ODREĐIVANJE SADRŢAJA ACETILSALICILNE KISELINE U TABLETAMA

1 tableta sadrţi 500 mg acetilsalicilne kiseline

(Tablete moraju sadrţavati 90-110% acetilsalicilne kiseline)

Postupak:
Odvagati količinu tabletne mase koja sadrži 150 mg acetilasalicilne kiseline, dodati 10 ml
hloroforma, miješati na ultrasoničnom kupatilu 5 minuta i profiltrirati. U filtrat dodati 5 ml vode
i 5 kapi fenolftaleina i titrirati sa 0,1 mol/l NaOH do pojave postojane ružičaste boje.
Utrošena količina rastvora 0,1 mol/l NaOH odgovara sadržaju acetilsalicilne kiseline.

1 ml 0,1 mol/l NaOH odgovara 0,0265 g acetilsalicilne kiseline.

48
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: OdreĎivanje sadržaja acetilsalicilne kiseline u tabletama

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

49
 KOMPLEKSOMETRIJSKE TITRACIJE

Kompleksometrijske titracije su volumetrijske metode kvantitativne hemijske analize kod kojih

kompleksirajući agens stvara kompleks sa metalnim jonom. U analitici lijekova upotrebljavaju se
za odreĎivanje jona Al3+, Bi3+, Ca2+, Cu2+, Hg2+, Mg2+, Zn2+ i drugih metala u gotovim
preparatima, galenskim pripravcima i raznim rastvorima.
Reakcije kompleksiranja odvijaju se izmeĎu jona metala sa molekulama ili jonima koji na nekom
od svojih atoma sadrže slobodan elektronski par tzv. kompleksirajućim agensima.
Kompleksirajući agensi mogu da formiraju jednu ili više kovalentnih veza sa metalnim jonom.
Metalni jon u kompleksu naziva se centralni jon, a molekuli ili joni koji se vežu u kompleks sa
metalnim jonom nazivaju se ligandi. Veza izmeĎu metalnog jona (M) i liganda (L) je polarna
kovalentna veza u kojoj oba elektrona daje ligand (Lewisova baza), a metalni jon je akceptor
elektronskog para (Lewisova kiselina). Ova vrsta veze naziva se koordinaciono-kovalentna veza.
Maksimalan broj liganada koje metalni jon može da veže naziva se koordinacioni broj metalnog
jona. Koordinacioni broj zavisi od osobina metalnog jona i liganda i najčešće iznosi 6 ili 4, rjeĎe
2 ili 8, a vrlo rijetko 3, 5 ili 7.
Ako ligandi vezivanjem sa metalom stvaraju prstenaste komplekse, nastali kompleksi nazivaju se
helatnim kompleksima ili helatima.

U kompleksometrijskoj titraciji se upotrebljavaju se dvije vrste helacionih agenasa, jedna vrsta

stvara rastvorljive komplekse u vodi, a druga rastvorljive komplekse u organskim rastvaračima.

Helacioni agensi koji stvaraju rastvorljive komplekse u vodi su:

 1,2-diamino-etan,
 etilendiaminotetrasirćetna kiselina (komplekson II, titripleks II, chelapleksa II, idranal II),
 etilendiaminotetrasirćetna kiselina odnosno njena dinatrijumova so (EDTA, komplekson
III, titripleks III, chelapleks III), cikloheksan diamin-1,2-tetrasirćetna kiselina (komplekson
IV).

Helacioni agensi agensi koji stvaraju nerastvorne komplekse u vodi, a rastvorljive u organskim
rastvaračima su:
 dimetilglioksim,
 salicilaldoksim,
 8-hidroksihinolin i dr.

Najčešće se kao titrant u kompleksometriji koristi otopina etilendiamin-tetrasirćetna kiseline

(EDTA). Budući je EDTA slabo rastvorljiva u vodi, kao reagens u kopleksometriji koristi se
njena dinatrijeva so. EDTA je polidentantni ligand koji posjeduje 6 koordinacijskih mjesta, dva
preko atoma nitrogena i četiri preko kisikovih atoma iz acetatnih grupa. U reakciji s centralnim
metalnim ionom može stvarati stabilne kelatne komplekse s 4, 5 ili 6 koordinacijskih mjesta.
Reakcija izmeĎu metalnog iona i EDTA odvija se u tačno odreĎenom i konstantnom pH
području.
EDTA-kompleksi s dvovalentnim metalnim ionima stabilni samo u baznoj sredini, a s
trovalentnim i četverovalentnim metalnim ionima stabilni su i u kiselim rastvorima. Reakcija
50
iona metala sa EDTA, bez obzira na njihov oksidacijski broj je u stehiometrijskom odnosu 1:1.
Hemijska struktura kompleksa je ciklična, tako da dvovalentni kationi grade tri ciklusa,
trovalentni kationi četiri, a četverovalentni kationi pet ciklusa

Završna tačka titracije u kompleksometrijskoj analizi može se pratiti primjenom indikatora,

elektrohemijskim ili spekroskopskim metodama.
U kompleksometriji, za odreĎivanje završne tačke titracije, koriste se indikatori koji sa metalnim
jonom stvaraju obojene komplekse koji se razlikuju od boje čistog indikatora ili fluoresciraju.
Takve indikatori nazivaju se metalo indikatori. Metal i indikator treba da pri odreĎenom pH
grade obojeni kompleks koji mora biti manje stabilan od kompleksa metal-helacioni agens, ali
ipak mora biti dovoljno stabilan da daje odgovarajuću promjenu boje pri završnoj tački. Boja
slobodnog indikatora mora se dovoljno razlikovati od boje kompleksa metal-indikator, tako da se
vizuelno lako može uočiti prelaz boje, odnosno završna tačka titracije. Bojena reakcija treba da
bude selektivna za metal koji se odreĎuje i da na nju ne utiče prisustvo drugih supstanci u
rastvoru. Boja metalnog kompleksa se mijenja sa promjenom pH vrijednosti, zato je neophodno
obezbijediti u toku kompleksometrijske titracije stalnu pH vrijednost upotrebom pufera.
Dodatkom EDTA kompleks metal-indikator se raspada i izdvaja se čist indikator, pri čemu u
toku titracije dolazi do promjene boje.

Metal + Indikator (A obojenje) = Metal-indikator (B obojenje)

Metal-indikator (B obojenje) + EDTA Metal-EDTA + Indikator (A obojenje)

U kompleksometrijskoj titraciji kao indikatori se najčešće upotrebljavaju eriohromcrno T,

mureksid, difenil karbazon, metil crveno, metiltimolplavo, kateholviolet i drugi. Boja
metaloindikatora je ovisna o pH-vrijednosti rastvora jer većina metalohromnih indikatora, osim
metalnih jona, može da veže i protone i da se istovremeno ponašaju kao kiselinsko-bazni
indikatori. Eriohomcrno T indikator ima u baznoj sredini oko pH 10 plavu boju, a u većini
kompleksa je crvene boje.
Uz ovaj indikator mogu se direktno titrirati Mg2+, Ca2+, Hg2+, Pb2+, Zn2+, Mn2+, Cd2+. Za
odreĎivanje Ba2+ doda se EDTAu višku, pa se izvrši retitracija sa poznatim rastvorom
magnezijum (II) hlorida. Metalni joni Al3+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Ag+, Pb2+ sa eriohromcrno T grade
stabilnije komplekse nego sa EDTA, pa se ne mogu titrirati uz ovaj indikator.
Vizuelno praćenje završne tačke može se postići primjenom alkaloacidimetrijskih indikatora.
Kada se dvovalentni metalni jon doda u rastvor EDTA dolazi do oslobaĎanja hidrogen jona, koji
se mogu titrirati sa bazom. Ovaj način praćenja završne tačke se rijetko upotrebljava, jer nije
dovoljno precizan.
Od instrumentalnih tehnika za odreĎivanje završne tačke koriste se spektroskopija u vidljivom
području, potenciometrijska, konduktometrijska, kulometrijska titracija i jon selektivne
elektrode.
Standardizacija rastvora EDTA obično se izvodi sa kalcijum-karbonatom, a može se izvoditi i sa
metalnim jonom koji se odreĎuje pod istim uslovima pod kojim će se izvoditi i analiza.

51
Vrste kompleksometrijskih titracija

S obzirom na redoslijed dodavanja kompleksirajućeg agensa, metalnog jona i načina izvoĎenja

razlikuju se. direktna titracija, indirektna titracija, titracija zamjene i retitracija.

Direktna titracija

Direktna titracija je najjednostavniji, najbrži i najtačniji način titracije. Moguća je kada postoji
pouzdan indikator za odreĎivanje završne tačke titracije. U rastvor koji sadrži metalni jon doda
se rastvor pufera, zatim doda indikator i vrši titracija sa standardnim rastvorom EDTA dok ne
doĎe do promjene boje, ili se završna tačka odredi nekom drugom metodom. Prethodno se izvrši
titracija slijepe probe i tako provjeri prisustvo nečistoće. Kod odreĎivanja dvovalentnih metalnih
jona pH-vrijednost se najčešće podešava dodatkom pufera amonium hidroksid / amonijum
hlorid, koji za vrijeme titracije održava pH na vrijednosti 10. Ako su u rastvoru, uz odreĎivani
metalni jon, prisutni i drugi metalni joni, potrebno je prije podešavanja pH-vrijednosti (kako ne
bi došlo do njihovog taloženja u obliku hidroksida ili teško rastvorlivih baznih soli) te metalne
jone maskirati, tj. vezati u stabilne komplekse.
Direktna titracija se koristi za odreĎivanje velikog broja dvovalentnih jona metala kao što su:
kalcijum, magnezijum, cink, željezo, bakar, kadmijum mangan, nikl, stroncijum, cink i drugih.
Soli dvovalentnog željeza prvo oksidiraju u trovalentno željezo i odreĎuju se direktnom
titracijom sa EDTA pri pH od 2 do 3, uz sulfosalicilnu ili salicilnu kiselinu kao indikator.

Retitracija

Kod ovog načina titracije dodaje se helacioni agens u višku i taj višak retitrira sa standardnim
rastvorom soli metala. Ovaj postupak se primjenjuje kod odreĎivanja onih jona metala koji se
nalaze u obliku hidroksida na pH vrijednosti potrebnoj za titraciju, za supstance koje sporo
reaguju sa EDTA ili kada metalni jon gradi stabilni kompleks sa EDTA, ali nema pogodnog
indikatora za odreĎivanje završne tačke titracije. Stvaranje kompleksa može se ubrzati
zagrijavanjem, a poslije hlaĎenja retitracija se obično provodi sa magnezijumovim ili cinkovim
solima. Postupkom titracije odreĎuju se soli bizmuta (Bi-nitrat, Bi-karbonat). Soli žive (živin
amino hlorid, živin oksid, sublimat), odreĎuje se sa Mg ili Zn-sulfatom u amonijačnom puferu na
pH vrijednosti oko10, uz eriohromcrno T. Kod odreĎivanja fenobarbitona, fenobarbiton se taloži
sa Denigesovim reagensom u filtrat koji sadrži živa (II) jone, doda se komplekson III,
eriohromcrno T i amonijačni pufer i provede retitracija sa cink sulfatom.
Ova metoda titracije se primjenjuje i kada se u rastvoru nalaze anjoni koji sa odreĎivanim
metalnim jonom daju teško rastvorne taloge kao što su npr. PbS0 MgNH P0 , CaC 0 , koji se,
4l 4 4 2 4
meĎutim, dodatkom EDTA rastvaraju gradeći stabilne metalne komplekse.
Titracija zamjene

Titracijom zamjene metal se može odrediti kada direktna titracija ili retitracija ne daju oštru
završnu tačku. Na metal-EDTA kompleks dodaje se rastvor soli metala koja sadrži metal jačeg
afiniteta, koji se veže na kompleksirajući agens i dolazi do istiskivanja vezanog metala iz
kompleksa. OsloboĎeni jon metala se direktno se titrira sa standardnim EDTA rastvorom.
Mangan (II) jon može odrediti titracijom zamjene tako da se u rastvor koji sadrži mangan (II) jon

52
doda kompleks magnezijum-EDTA, pri čemu se magnezijum kvantitativno zamijeni sa mangan
(II) jonom.

Mn2+ + Mg-EDTA2- = Mg2+ + Mn-EDTA2- (zamjena)

Mg2+ + EDTA2- = Mg-EDTA2+ + 2H+

Indirektna titracija

Indirektna titracija koristi se za odreĎivanje aniona koji ne reaguju sa helacionim agensima.

Barbiturati se mogu kvantitativno istaložiti u baznoj sredini sa živa (II) jonom, stvarajući
kompleks sastava 1:1. Nastali talog se odvoji i rastvori u višku EDTA pri čemu se nagradi
kompleks sa živa (II) jonom. Višak dodane EDTA se odredi retitracijom sa rastvorom soli cinka.
Količina barbiturata se na taj način odredi indirektno, jer je ekvivalentna količini žive.
Anioni se mogu odrediti dodatkom metala u višku i titracijom viška metala sa standardnim
rastvorom EDTA. Tako se mogu odreĎivati sulfati dodatkom barijum jona i retitracijom viška
barijum jona.

53
 VJEŢBA BR. 9
STANDARDIZACIJA 0.01M EDTA SA STANDARDNIM RASTVOROM CaCO3

Reakcija se odvija prema sljedečoj jednadžbi:

Ca2+ + EDTA4- --------CaEDTA2-

Titracija se odvija pri pH 13, što se postiže rastvorom 1M NaOH. Pri ovoj pH vrijednosti je
moguće titrirati Ca u prisustvu Mg jona, koji precipitiraju kao Mg(OH)2.
Procedura se odvija u sljedečim koracima:
 odvagati tačno 1g suhog kalcijevog karbonata
 odvaganu količinu prenijeti u odmjerni sud od 1l,
 rastvoriti u 25ml 1M HCl i dopuniti odmjernu tikvicu vodom do oznake
 prenijeti 25ml rastvora kalcijum karbonata u Erlenmajer tikvicu
 dodati 75ml destilovane vode
 dodati 10ml 1M rastvora NaOH
 dodati na vrhu špatule murexid indikator sa NaCl-om (100mg indikatora pomiješati sa 20g
analitički čistog NaCl)
 rastvor titrirati sa rastvorom EDTA do promjene boje u ružičasto.

Na osnovu utrošenog volumena EDTA izračunati koncentraciju EDTA i odrediti faktor korekcije
na osnovu relacije:
C1  V1  f1  C2  V2  f 2
C1= koncentracija CaCO3 u rastvoru
V1= titrirani volumen CaCO3
f1= faktor korekcije i za CaCO3 iznosi 1, jer je standarna supstanca
C2= stvarna koncentracija EDTA
V2= utrošeni volumen EDTA pri titraciji
f2= odrediti faktor korekcije, u slučaju da ne iznosi 1 (ako nije EDTA standardni rastvor, faktor
korekcije će biti različit od 1)

54
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Standardizacija 0.01M EDTA sa standardnim rastvorom CaCO3

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

55
 VJEŢBA BR. 10
KOMPLEKSOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KALCIJUMA U TABLETAMA

1 tableta sadrţi 300 mg kalcijum karbonata

(mora sadrţavati 90-110% deklarisanog sadrţaja)

Odvagati količinu tabletne mase koja sadrži oko 60 mg kalcijum karbonata, rastvoriti u 2 ml
mol/l HCl i dodati 5 ml redestilovane vode. Nakon toga dodati još 15 ml redestilovane vode, 30
ml 6 mol/l rastvora amonijum hidroksida, indikator metil-timol plavo i titrirati sa 0,1 mol/l
rastvorom EDTA.

1 ml 0,1 mol/l EDTA odgovara 0,01008 g kalcijum karbonata

56
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Kompleksometrijsko odreĎivanje kalcijuma u tabletama

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

57
 VJEŢBA BR. 11
KOMPLEKSOMETRIJSKO ODREĐIVANJE MAGNEZIJUM SULFATA

Postupak:
Uzorak otopiti u 100 ml vode, dodati 5 ml amonijakalnog pufera (r.o.), indikator eriohrom crno
T (i) i titrirati sa 0,05 mol/l EDTA do pojave plave boje.

1 ml 0,05 mol/l EDTA odgovara 12,32 mg MgSO4 x 7 H2O (6,018 mg MgSO4).

58
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Kompleksometrijsko odreĎivanje magnezijum sulfata

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

59
 TITRACIJE U NEVODENOJ SREDINI

Titracije u nevodenoj sredini su vrsta volumetrijskih titracija pomoću kojih se odreĎuju slabe
baze i slabe kiseline, koje pri titracijama u vodenoj sredini ne daju oštar prikaz boje indikatora.
TakoĎer, ova vsta titracija se koristi za odreĎivanja supstanci koje su nerastvorljive u vodi.
Titracije u nevodenoj sredini se koriste u kontroli farmaceutskoh oblika koji u svom sastavu
sadrže supstance koje su slabo kiselog ili slabo baznog karaktera. U tu grupu spadaju: antibiotici,
antihistaminici, piperazinski preparati, fenotiazini, barbiturati, p-aminosalicilna kiselina i drugi.
Princip ovih titracija je slijedeći: disocijacija slabih kiselina povećava se rastvaranjem u
rastvaraču koji je bazičniji od vode, odnosno efikasnije privlači protone. S druge strane,
disocijacija slabih baza povećava se rastvaranjem u rastvaračima koji su kiselog karaktera. Ovaj
efekat rastvarača na stepen disocijacije naziva se nivelirajući efekat.
Rastvarači koji su kiseliji od vode imaju nivelirajući efekat za slabe baze, a rastvarači koji su
bazniji od vode imaju nivelirajući efekat na slabe kiseline. Nivelirajući efekat rastvarača zavisi
od jonizacione sposobnosti rastvarača i stabilnosti nastalog jona. Jonizaciona sposobnost je
odreĎena dielektričnom konstantom i efektom solvacije rastvarača. Prema Brönsted-Lowryevoj
teoriji kiseline su proton donori, a baze proton akceptori. Pri titraciji kiselina daje proton i prelazi
u konjugiranu bazu. Nastala konjugirana baza kombinacijom sa protonom daje kiselinu koja se
sada označava kao konjugirana kiselina. Tako, na primjer, acetatna kiselina daje proton i acetatni
jon.
CO3COOH  H   CH 3COO

Acetatni jon je konjugirana baza acetatne kiseline, a acetatna kiselina je konjugirana kiselina
acetatnog jona.

Rastvarači koji se koriste kod titracije u nevodenoj sredini dijele se na: protofilne, protogene,
aprotonske i amfiprotonske.

U grupu protofilnih rastvarača spadaju rastvarači koji posjeduju osobine da akceptiraju protone,
pri čemu dolazi do stvaranja konjugovane baze odgovarajuće kiseline.U grupu protofilnih
rastvarača spadaju supstance baznog karaktera: piridin, aceton, eter, dioksan, amini, amonijak i
dr.

Protogeni rastvarači su sposobni da otpuštaju protone, pri čemu dolazi do stvaranja konjugovanih
kiselina. Protogeni rastvarači pokazuju nivelirajući efekat na slabe baze.Ovu grupu rastvarača
sačinjavaju rastvarači kiselog karaktera i to acetona, formijatna, sulfatna, hloridna i fluoridna
kiselina.

Aprotonski rastvarači ne posjeduju osobinu da privlače niti otpuštaju protone. Po svom karakteru
to su neutralna i nereaktivna jedinjenja. Odsusutvo jonizacije u takvim rastvaračima može se
prikazati na rastvoru pikrinske kiseline u benzenu. Rastvaranjem pikrinske kiseline u benzenu
dobije se bezbojan rastvor. Dodatkom baze u ovaj rastvor javlja se žuta boja, koja potiče od
nagraĎenog pikratnog jona. U ovu grupu spadaju neutralna i hemijski indiferentna jedinjenja kao
kloroform, benzen, zasićeni i aromatski ugljovodonici.

60
Amfiprotonski rastvarači pokazuju osobine protofilnih i protogenih rastvarača. U grupu
amfiprotniskih rastavarača spadaju: glacijalna acetatna kiselina, alkohol, voda. Protogeno
djelovanje acetatne kiseline dolazi do izražaja ako se koristi za rastvaranje slabe baze.

CO3COOH  B  CH 3COO  BH 

Prilikom titracija u nevodenoj sredini vrlo je važno voditi računa o temperaturi na kojoj se
titracija izvodi,. Naime, prilikom izvoĎenja ovih titracija koeficijent temperaturnog širenja
organskog rastavarača je daleko veći nego kod vode. Kao posljedica toga može doći do greške
prilikom mjerenja ako se razlikuju temperature na kojoj je rastvor standardiziran od temperature
na kojoj se vrši titracija. Radi toga treba kontrolisati temperaturu ratvora koji se titrira i nakon
završene titracije, dobivenu zapreminu utrošenog rastvora za titriranje korigovati sa odreĎenim
faktorima navedenim u farmakopeji.

Indikatori koji se koriste za praćenje završne tačke titracije u titracijama u nevodenoj sredini su:
timoplavog, kristal ljubičastog, naftol-benzena i malahitzelenog. Kod jedinjenja kiselog
karaktera upotrebljava se timoplavo, a kod jedinjenja baznog karaktera kristalviolet. Pored
upotrebe indikatora, završna tačka titracije u nevodnoj sredini može se pratiti potenciometrijski.
Kod potenciometrijskog odreĎivanja koristi se kalomel i staklena elektroda. Najtačnije
odreĎivanje završne tačke je paralelno praćenje promjene boje indikatora i potenciometrijsko
mjerenje.

61
 VJEŢBA BR. 12
ODREĐIVANJE SADRŢAJA KOFEINA U TABLETAMA TITRACIJOM U
NEVODENOJ SREDINI

1 tableta sadrţi 65 mg kofeina

(mora sadrţavati 90% - 110% od deklarisanog sadrţaja)

Postupak:
Odvaganu količinu tabletne mase otopiti zagrijavanjem u 10 ml anhidrida acetatne kiseline. Kada
se ohladi, dodati 20 ml benzena i profiltrirati. U filtrat dodati 5 kapi kristal violeta (i) i titrirati sa
0,1 mol/l HCLO4 do pojave žute boje.

1 ml 0,1 mol/l HCLO4 odgovara 4,212 mg kofeina.

Izračunati sadržaj kofeina u tableti i odrediti procenat odstupanja od deklarisanog sadržaja

62
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: OdreĎivanje sadržaja kofeina u tabletama titracijom u nevodenoj sredini

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

63
 VJEŢBA BR. 13
POTENCIOMETRIJA – PRIREĐIVANJE PUFERA I ODREĐIVANJE pH
VRIJEDNOSTI

Rastvor fostatnog pufera pH 6,5

Rastvoriti 2,75g natrijum dihidrogen fosfata R i 4,5g natrijum hlorida R u 500ml vode R.
Podesiti pH sa rastvorom fosfatnog pufera pH 8,5

Rastvor fosfatnog pufera pH 8,5

Rastvoriti 3,5g dikalijum hidrogen fosfata i 4,5g natrijum hlorida R u 500ml vode R. Podesiti pH
sa mješavinom jednskih volumena diluirane fosfatne kiseline i vode R.

Fosfatna kiselina, koncentrovana R- sadrži najmanje 84% H3PO4 (M= 98, 00)

Fosfatna kiselina (r.o.)- 100g koncentrovane fosfatne kiseline R pomiješa se sa oko 240g vode.
Sadržava 24,5-25,5% H3PO4.

Fosfatna kiselina, diluirana (r.o.)- 10ml fosfatne kiseline (r.o. dopuni se vodom do 100 ml.
Sadržava 2,5% H3PO4.

64
 OBRADA REZULTATA

Naziv vjeţbe: Potenciometrija – prireĎivanje pufera i odreĎivanje ph vrijednosti

Farmaceutski preparat:

Račun:

Zaključak:

65
 VALIDACIJA ANALITIČKE METODE

Validacija metode predstavlja postupak utvrĎivanja karakterističnih analitičkih parametara koji

su dobiveni na osnovu laboratorijskih ispitivanja. Ovaj postupak izvodi se u cilju potvrĎivanja
opravdanosti primjene date metode.
Validiraju se sljedeći analitički parametri: specifičnost/selektivnost, linearnost, tačnost,
preciznost, limit detekcije, limit kvantifikacije i opseg određivanja.

Specifičnost/selektivnost — Specificity/Selectivity
Specifičnost/selektivnost analitičke metode je mogućnost tačnog odreĎivanja analizirane
komponente, analita (analitička vrsta koja se ispituje, to jest aktivna supstancija, konzervansi,
degradacioni proizvodi, nečistoće, boje, aditivi itd.) pored komponenti koje mogu biti prisutne u
uzorku (produkti degradacije, ekscipijent, jedinjenja koja mogu nastati reakcijom aktivne
supstancije i ekscipijenta, nečistoće nastale u procesu proizvodnje, ostaci rastvarača, sredstvo za
ekstrakciju itd.). PotvrĎuje se uporeĎivanjem rezultata dobivenih za analit, u prisustvu oče-
kivanih komponenti, sa rezultatima dobivenim za uzorak koji sadrži samo analit.

Linearnost – Linearity
Linearnost analitičke metode je mogućnost da se u datoj oblasti koncentracija dobiju rezultati
(kod HPLC metode npr. površina pika) proporcionalni koncentraciji analita.
Linearnost se statistički utvrĎuje za najmanje pet rastvora standarda čija se koncentracija nalazi u
opsegu od 80% do 120% i izračunavanjem jednačine prave y = ax + b metodom najmanjih
kvadrata (gde je y površina pika za datu koncentraciju x, a - nagib prave i b - odsječak na
ordinati) kao i korelacionog koeficijenta r koji predstavlja stepen rasipanja tačaka oko idealne
prave. Prema preporukama Agencije za hranu i lijekove (Food and Drug Administration, FDA)
vrijednost korelacionog koeficijenta treba da bude r≥0,999.
Nagib prave a definiše osjetljivost metode. Odsječak na ordinati b treba što manje da odstupa od
nule (prihvatljivo je ± 2%), a svako veće odstupanje ukazuje na postojanje nekih interakcija.

Tačnost – Accuracy
Tačnost metode je mjera usaglašenosti eksperimentalno dobivenih vrijednosti predloženom
metodom sa pravim (stvarnim) vrijednostima, odnosno ukazuje na ispravnost mjerenja. Najčešće
se izražava kao procenat prinosa (recovery) odreĎivanja za poznatu, dodatu količinu uzorka
placebo smjesi (placebo smjesa predstavlja tabletu koja sadrži samo ekscipijens, bez aktivne
supstancije).

Tačnost je mjera egzaktnosti analitičke metode. OdreĎuje se primjenom te metode na uzorak,

kao i na smesu ekscipijenta i dodate količine uzorka a koja je ili viša ili niža od očekivane u
uzorku. Za ljekovite supstancije i farmaceutske preparate preporučuju se koncentracije 80, 100 i
120% od propisane (deklarisane). Potrebno je uraditi najmanje po tri odreĎivanja od svake
koncentracije i izračunati relativnu standardnu devijaciju (RS), koja će odrediti tačnost metode ili
njena odstupanja. Kod formulacija kao što su tablete, supozitorije ili transdermalni flasteri
odstupanje bi moglo ukazati na interakciju aktivne supstancije sa ekscipijentom.

66
Preciznost — Precision
Preciznost je mjera usaglašenosti rezultata dobivenih iz više paralelnih odreĎivanja iz istog
uzorka pod istim uslovima. Statistički se procjenjuje standardnom devijacijom (S) ili relativnom
standardnom devijacijom, odnosno koeficijentom varijacije (K). Internacionalna konferencija o
harmonizaciji (International Conference of Harmonization, ICH) definiše preciznost u tri nivoa:
ponovljivost, srednja preciznost i reproduktivnost.
a) Ponovljivost (repeatability) je preciznost procijenjena od strane jednog istog analitičara, na
istim uzorcima, istoj aparaturi i u kratkom vremenskom intervalu. Procjena ponovljivosti
sprovodi se sa najmanje deset injektiranja. Metoda je precizna ako je RS≤1%.
b) Srednja preciznost (intermediate precision) je preciznost procijenjena unutar iste
laboratorije, na istoj aparaturi, od strane više analitičara u toku više dana.
c) Reproduktivnost (reproducibility) je preciznost procijenjena od strane više analitičara, u
različitim laboratorijama, na različitim aparaturama. Prema USP 23 mjera reproduktivnosti
definiše se i kao rigidnost (ruggedness), odnosno reproduktivnost rezultata dobijenih za isti
uzorak pod različitim uslovima kao što su različite laboratorije, različiti analitičari, različiti
instrumenti, različite serije reagenasa i različito vrijeme.

Limit detekcije - Limit of Detection (LOD)

Limit detekcije je najmanja koncentracija ispitivane supstancije u uzorku koja može biti
registrovana (detektovana) ali nije neophodno da bude i tačno odreĎena pod datim
eksperimentalnim uslovima.

Kod instrumentalnih postupaka za odreĎivanje limita detekcije mogu se koristiti različiti

postupci:
 vizuelni,
 izračunavanje odnosa signal/šum (opšteprihvaćen odnos je 3:1 ili 2:1),
 izračunavanje standardne devijacije odgovora detektora (Sa) i nagiba kalibracione krive
(a) iz sljedećeg izraza:

3  Sa
LD 
a

Limit kvantifikacije - Limit of Quantitation (LOQ)

Limit kvantifikacije je najmanja koncentracija ispitivane supstancie u uzorku koja može biti
odreĎena sa prihvatjivom preciznošću i tačnošću, pod datim eksperimentalnim uslovima.
OdreĎivanje limita kvantifikacije izvodi se na sljedeći način:
 vizuelnim putem,
 izračunavanjem odnosa signal/šum (opšteprihvaćen odnos je 10:1),
 izračunavanjem standardne devijacije odgovora detektora (Sa) i nagiba kalibracione krive
(a) iz sljedećeg izraza:
10  S a
LQ 
a

67
Opseg – Range
Opseg analitičke metode predstavlja interval izmeĎu gornje i donje koncentracije ispitivane
supstance (uključujući i te vrijednosti) unutar koga se odreĎivanje može vršiti sa prihvatljivom
tačnošču, preciznošću i linearnošću.
Prema preporukama FDA i ICH za validaciju metode potrebno je odrediti i recovery vrijednost i
robustnost

Recovery
Recovery vrijednost predstavlja količinu analita u ispitivanom uzorku u odnosu na teorijsku,
odnosno deklarisanu količinu, izraženu u procentima.

Robustnost – Robustness
Robustnost analitičke metode je sposobnost metode da „sačuva“ tačne rezultate pri malim i
namjernim promjenama eksperimentalnih uslova. Pod ovim se podrazumjavaju npr. sljedeće
promjene: pH vrijednost mobilne faze, sastav mobilne faze, promjena kolone, temperature, kao i
brzine protoka mobilne faze.

68
 VJEŢBA BR. 14
VALIDACIJA ANALITIČKE METODE - KVALITATIVNA I KVANTITATIVNA
ANALIZA CIJANOKOBALAMINA (VITAMIN B12)

Eksperimentalni dio
OdreĎivanje cijanokobalamina provodi se metodom UV spektrofotometrije. Sadržaj
cijanokobalamina se dobiva računskim putem iz odnosa dobivenih apsorbanci uzorka i standarda
na 361 nm ± 2 nm. Ova metoda je oficinalna prema Ph.Eur. (monografija 0547;
Cyanokobalamin)

Materijal:
1. Ph.Eur.CRS standard cyanocobalamin
2. Uzorak: Vitamin B12 500 μg/ml, injekciona otopina
3. Otapalo za pripremu standarda prečišćena voda
4. Otapalo za pripremu radnih koncentracija standarda (S3, S2, S1) i uzorka (T3, T2, T1) je
prečišćena voda.

Oprema:
1. Spektrofotometar UV/VIS (Perkin Elmer, SAD)
2. Vaga sa preciznošću 0,01 mg (Kern 770, Njemačka)
3. Vortex (Thermolyne, SAD)
4. Propipete, odmjerne tikvice, menzure i drugo laboratorijsko posuĎe.

Radna procedura:

Priprema otopine standarda:

U testu se radilo sa CRS standardom cyanocobalamina (CRS Batch/lot no 4), Ph.Eur. Sadržaj
vlage u standardu je 9,34%.

Odvagati 0,01104 g standarda, što odgovara 10 mg cijanokobalamina, i kvantitativno prenese u

odmjernu tikvicu od 10 ml, otopi dodatkom prečišćene vode i dopuni do crte istim otapalom. Na
ovaj način dobije se osnovna otopina standarda (OOS) koncentracije 1mg/ml.

0,5 ml OOS (500 μg) prenese se u odmjernu sud od 20 ml i dopuni prečišćenom vodom do
oznake. Dobije se radna otopina standarda (ROS) koja sadrži 25 μg cijanokobalamina po ml.

Dalja razreĎenja za standardnu krivu praviti od ROS sa sterilnom prečišćenom vodom:

S5 = 50 μg/ml; S4 = 40 μg/ml; S3 = 30 μg/ml; S2 = 20 μg/ml; S1 = 10 μg/ml.

69
Priprema otopine uzorka:

1 ml otopine injekcija (500 μg cijanokobalamina) prenjeti u odmjerni sud od 20 ml, razrijediti i

dopuniti sa prečišćenom vodom do oznake. Dobivena radna otopina uzorka (ROT) je
koncentracije 25 μg/ml cijanokobalamina.

Mjerenje:

Mjerenje apsorbanci radnih otopina standarda i uzorka će se provesti na 361 nm uz prečišćenu

vodu kao slijepu probu (Ph.Eur.).

Preračunavanje:

Sadržaj cijanokobalamina u uzorku, izražen u μg/ml, izračunati prema slijedećoj formuli:

Ap  mS  Ps
mg / ml   0,5  1000
As  10

Ap i As – apsorbanca otopine uzorka i standarda

mS – odvaga standarda cijanokobalamina u mg (prema aktivnosti preračunatoj u odnosu na
sadržaj vlage
Ps – aktivnost standarda cijanokobalamina, u decimalnim jedinicama
1000 – koeficijent za konvekciju u mg/ μg

Rezultati validacije spektroskopske metode:

a) Selektivnost metode

Selektivnost metode je mjera sposobnosti da tačno i specifično odreĎuje analit u prisutnosti

komponenti prisutnih u matriksu.
Selektivnost metode je odreĎena pomoću placeba koji sadrži amonij sulfat i Na edetat u
omjerima koji su prisutni u uzorku, u prečišćenoj vodi.
Selektivnost metode je prikazana na spektrima (Slika 5, 6, 7)

70
 Slika 5. Prikaz UV spektra otopine cijanokobalamina

Slika 6. Prikaz UV spektra otopine placeba

Slika 7. Uporedni prikaz UV spektra otopine standarda, uzorka i placeba

71
b) Tačnost metode

Tačnost metode odreĎivanja sadržaja cijanokobalamina u metodi UV spektrofotometrije je

testirana u području od 80-120% deklarisanog sadržaja.

Otopine korištene u ispitivanju tačnosti metode su: osnovni rastvor (stok otopina) placeba-bez
cijanokobalamina i osnovni rastvor (stok otopina) cijanokobalamina.

Osnovni rastvor (stok otopina) placeba (10 x koncentracija)

Amonij sulfat 0,250
Na Edetat 0,100
Prečišćena voda do 100 ml

Osnovni rastvor (stok otopina) cijanokobalamina, aktivnosti 1000 μg/ml:

USP standard u količini koja odgovara 5000 μg cijanokobalamina, rastvoriti i razblažiti do 5 ml (
u odmjerni sud od tamnog stakla), 25% etanolom. (Etanolna otopina standarda je stabilna kroz
mjesec dana na +40C).

Prikaz izrade otopina u postupku ispitivanja tačnosti metode

STOCK otopina STOCK otopina Prečišćena voda
vitamina B12 placeba
80% otopina : 0,4 ml + 0,1 ml + 0,5 ml
100% otopina : 0,5 ml + 0,1 ml + 0,4 ml
120% otopina : 0,6 ml + 0,1 ml + 0,3 ml

Rezultati ispitivanja tačnosti metode prikazani su tabelarno

80% (412,9 μg/ml) 100% (516,2 μg/ml) 120% (619,4 μg/ml)
NaĎeno NaĎeno NaĎeno
(μg/ml) R (%) (μg/ml) R (%) (μg/ml) R (%)
1. 408,908 99,02 518,007 100,35 611,247 98,68
2. 406,686 98,48 527,887 101,68 616,239 99,49
3. 408,726 98,97 520,199 100,77 613,713 99,08
X 408,107 98,82 521,031 100,93 613,733 99,08
SD 1,2343 0,298 3,515 0,680 2,5 0,405
RSD 0,302 0,302 0,675 0,674 0,407 0,409

Srednja vrijednost za postotak iskorištenja (recovery: R %) 99,91

Ukupna SD: 4,49
Ukupna RSD (%): 0,49

72
c) Linearnost metode

Linearnost metode je provjerena kroz linearnost „odgovora“ standarda (standardne krive) i

linearnost metode u ispitivanom području.

Linearnost „odgovora standarda“:

Rezultati u testu ispitivanja linearnosti „odgovora“ standarda su dobiveni mjerenjem u triplikatu

pet koncentracija otopine standarda u koncentracijama od 20-50 μg/ml. Dobiveni rezultati su
prikazani tabelarno i grafički.

Koncentracija
1 2 3 X
standarda u μg/ml
50 1,097 1,097 1,097 1,097
40 0,869 0,869 0,869 0,869
30 0,649 0,649 0,650 0,649
25 0,548 0,548 0,548 0,548
20 0,431 0,4319 0,4319 0,432

Slika 8. Prikaz linearnosti standardne krive

Linearnost metode

Linearnost metode odreĎena je u području od 80-120% deklarisane količine cijanokobalamina,

prikazana je grafički:

73
 Slika 9. Prikaz linearnosti metode

Ponovljivost metode oko ciljane koncentracije

Za ovaj test su iskorišteni podaci dobiveni ispitivanjem tri nezavisna uzorka. Rezultati testa su
prikazani tabelarno.

Uzorak 1 2 3 X SD RSD (%)

μg vitamina B12 (cijanokobalamina)/ml

Rezultati
492,346 496,151 494,994 494,497 1,95 0,394

Ponovljivost mjerenja

U ovom testu je deset puta ponovljeno mjerenje apbsorpcije istog uzorka. Rezultati su izraženi
kao sadržaj cijanokobalamina u ml uzorka.

74
Prikaz dobivenih rezultata testa ponovljivosti mjerenja

Rezultat
Broj mjerenja
μg cijanokobalamina/ml %
1. 500,352 99,982
2. 500,352 99,982
3. 500,535 100,018
4. 500,443 100,000
5. 500,535 100,018
6. 500,352 99,982
7. 500,443 100,000
8. 500,535 100,018
9. 500,535 100,018
10. 500,352 99,982
X 500,453 100,000
SD 0,085 0,017
RSD (%) 0,017 0,017

Intermedijarna preciznost

U ovom testu je provedeno ispitivanje jedne serije uzorka uz sudjelovanje dva analitičara u
kratkom vremenskom periodu.

Dobiveni rezultati prikazani su u tabelarno i grafički.

Analitičar I
Srednja
Uzorak 1 2 3 SD RSD
vrijednost

Rezultat
μg cijanokobalamina/ml 492,346 496,151 494,994 494,497 1,951 0,394
% 98,382 99,142 98,911 98,812 0,390 0,394
Analitičar II
Uzorak 1 2 3

Rezultat
μg cijanokobalamina/ml 503,822 492,62 494,325 496,922 6,036 1,214
% 100,675 98,437 98,777 99,296 1,206 1,215

Prosječna vrijednost, n =10 (mg cijanokobalamina/ml)...............495,71

Ukupna standardna devijacija ..........................................................4,49
Ukupna RSD (%) .............................................................................0,90

75
Slika 10. Grafički prikaz dobivenih rezultata za preciznost Analitičara I

Slika 11. Grafički prikaz dobivenih rezultata za preciznost Analitičara II

76