30.06.2022 Bản thảo báo cáo NCKH của Nguyễn Văn A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN
KHOA KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ
BÁO CÁO KHOÁ LUẬN
TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT

GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA
TP. HỒ CHÍ MINH – 2022
Chương 1 – Tổng quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN
KHOA KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ
BÁO CÁO KHOÁ LUẬN
TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT

GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA
TP. HỒ CHÍ MINH – 2022

i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn hai Thầy và Cô đã hướng dẫn em là TS.
Nguyễn, thầy cô đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình học tập cũng như trong việc
hoàn thành thực tập tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô thuộc khoa Kỹ Thuật – Công Nghệ trường
Đại Học Văn Hiến đã tận tình giảng dạy cho em trong thời gian học tập.
Xin cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện giúp em hoàn thành học phần khoá luận tốt nghiệp thật tốt.
Tuy vậy, do thời gian có hạn, cũng như còn nhiều hạn chế về kiến thức và kinh
nghiệm nên sẽ không tránh khỏi những sai sót trong quá trình hoàn thành báo cáo. Vì
vậy, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của TS. Nguyễn để em khắc phục các
thiếu sót của mình và hoàn thiện báo cáo khoá luận này hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 4 năm 2022
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn A
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, do tôi tự thực hiện, không sao
chép, vay mượn từ các công trình nghiên cứu khoa học khác. Đảm bảo mọi tài liệu tham
khảo đều được trích dẫn, ghi chú đầy đủ.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2022
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn A
iii
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2022
Giảng viên hướng dẫn
TS. Nguyễn
iv
MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................1
2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu.............................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................2
5. Các kết quả đạt được của đề tài............................................................................2
6. Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp..........................................................................2
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN...........................................................................................4
1.1 Giới thiệu về kỹ thuật knockout gene................................................................4
1.2 Tổng quan về hệ thống CRISPER-Cas9...........................................................4
1.3. Định nghĩa về hệ thống keap1-nrf2....................................................................11
1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2...........................................................................11
1.3.2 Khám phá Nrf2: một phân tử chính trong phản ứng chống electrophile...12
1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: Bộ cảm biến nhận biết các chất elecreophile..13
1.3.4 Tổng quan về chức năng của hệ thống phân tử KEAP1-NRF2..................13
1.3.5 Cơ chế bảo tồn của hệ thống KEAP1-NRF2 giữa các loài động vật có
xương sống...............................................................................................................14
1.3.6 Cơ chế điều hoà hoạt động của hệ thống KEAP1-NRF2.............................15
1.3.7 Chức năng của hệ thống KEAP1-NRF2 cân bằng oxy hoá khử và bảo vệ tế
bào............................................................................................................................ 17
1.4 Ứng dụng trị liệu của hệ thống KEAP1-NRF2...............................................18
1.5 Hệ thống KEAP1-NRF2 ở cá ngựa vằn...........................................................19
1.6 Khả năng thành công........................................................................................20
1.7 Tính mới, tính thời sự.......................................................................................20
1.8 Ý nghĩa khoa học và sự cần thiết vấn đề cần nghiên cứu..............................20
1.9 Giới thiệu chung về cá ngựa vằn..........................................................................21
1.9.1 Giới thiệu chung.............................................................................................21
1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên...............................................................................21
1.9.3 Đặc tính sinh học cơ bản................................................................................22
1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn.........................................................................................23
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................25
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................25
v
2.2 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu...........................................................................25

2.3 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................27
2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde RNA
(sgRNA) và Cas9 mRNA.........................................................................................27
Vị trí sgRNA Nrf2.....................................................................................................27
2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas 9 và Phương pháp vi tiêm........................32
Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen......32
Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng
cách thêm 100 µL nuclease free duplex buffer (IDT) để có nồng độ cuối là 100 µM.
.................................................................................................................................. 32
Tiếp theo pha loãng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg (10 µg/µL) (10 µg/µL
Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 µL; Cas9 working protein buffer (20 mM
HEPES; 150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 µL, để đạt nồng độ cuối 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi
Cas9 Nuclease V3)....................................................................................................32
2.4 Xác định kiểu gen..................................................................................................33
2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA....................................................................................34
2.4.2. Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2...........................................................................36
2.5 GIẢI TRÌNH TỰ..................................................................................................41
2.5.1 Tinh sạch mẫu.................................................................................................41
CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................47
3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen.................................................................................47
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b.................................................................49
3.3 Kết luận..................................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................54
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, LƯU ĐỒ, HÌNH
Danh mục hình
Hình 1.1. Spacer, protospacer và PAM. Protospacer là DNA đích; PAM tiếp giáp với
DNA sợi đôi được nhắm mục tiêu. Phần đệm (Spacer) là một phần của RNA dẫn đường
gắn kết với protospacer................................................................................................15
Hình 1.2. Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9. Hình thành RNP (bước 1) có thể xảy ra bên
trong tế bào hoặc phòng thí nghiệm. Đầu tiên, CRISPR RNA (crRNA) và CRISPR RNA
chuyển hóa (tracrRNA) kết hợp với nhau, tạo thành RNA dẫn đường (gRNA) hoàn chỉnh.
Tiếp theo, gRNA liên kết với enzyme Cas, tạo thành ribonucleoprotein (RNP). Nếu quá
trình hình thành RNP được thực hiện trên phòng thí nghiệm, thì RNP sau đó phải được
chuyển đến các tế bào. Trong bước 2, gRNA hướng RNP đến mục tiêu bên trong tế bào.
Sau đó mục tiêu được phân tách (bước 3)....................................................................16
Hình 1.3. Các kết quả có thể xảy ra sau khi phân tách DNA bộ gen. Các con đường sửa chữa DNA của tế
bào chẳng hạn như nối kết cuối không tương đồng (NHEJ) có thể dẫn đến xóa (deletion), thay đổi trình
tự (changed sequences) và chèn nhỏ (small insertion).............................................................................17
Hình 1.4. Sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) có thể kết hợp các trình tự mới vào
DNA bộ gen. Các trình tự nhỏ có thể được thay đổi cho các mục đích chỉnh sửa hoặc sửa
đổi gen (trái), và các trình tự lớn như toàn bộ gen có thể được thêm vào một cách ngẫu
nhiên (phải)...................................................................................................................... 18
Hình 1.5. Các dạng gRNA khác nhau được sử dụng để loại bỏ gen. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi lựa chọn dạng sgRNA (bao gồm crRNA và tracrRNA). sgRNA có tính bền
và không cần ủ nhiệt trước khi chuyển vào phôi cá ngựa vằn..........................................20
Hình 1.6. Vị trí PAM và gRNA Cas9. Vị trí PAM nằm trên chuỗi DNA không nằm trong
mục tiêu trình tự loại bỏ gen. RNA dẫn đường liên kết với sợi mục tiêu. RNA dẫn đường
trong hình này là RNA dẫn đường hai phần, bao gồm crRNA và tracrRNA....................21
Hình 1.7. So sánh hai phần gRNA (A) và sgRNA (B). Cả hai loại gRNA đều có thể được
thêm vào Cas9 để tạo thành Ribonucleoprotein (RNP), sau đó có thể được phân phối đến
các tế bào......................................................................................................................... 22
Hình 1.8. Cơ chế phân tử của hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu NRF2
trong điều kiện căng thẳng...............................................................................................25
vii
Hình 1.9. Một bản tóm tắt về dư lượng cystein của Keap1. Việc bảo tồn từng cystein
được chỉ định như sau: O: được bảo tồn; ∆: Không được bảo tồn nhưng cysteine tồn tại
ba axit amin; X: không bảo tồn. Các cystein cảm biến được tô màu đỏ, xanh lá cây và
xanh dương. Mm: chuột; Hs: người; Ol: cá medaka; và Dr: cá ngựa vằn......................26
Hình 1.10. Mã Cysteine của phản ứng dựa trên KEAP1 đối với các rối loạn oxy hóa khử
khác nhau. Ba gốc cystein chính, Cys151, Cys273 và Cys288, của KEAP1 chịu trách
nhiệm chính cho các phản ứng đối với nhiều loại electrophile. OA-NO2, axit béo nitro;
4HNE, 4-hydroxynonel..................................................................................................27
Hình 1.11. Các điểm mạnh khi sử dụng mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu sinh học
phân tử........................................................................................................................... 31
Hình 1.12. Cá ngựa vằn đực và cái................................................................................34
Hình 1.13. Sự tương quan giữa bộ gen người, gà, chuột và cá ngựa vằn...........................
Hình 2.1. Hệ thống nuôi cá và bàn làm việc, thí nghiệm của phòng Công nghệ Sinh học
Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh.........................................36
Hình 2.2. Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn. Biểu
đồ được tạo bằng phần mềm Snapgen 2.3.2...................................................................39
Hình 2.3. Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí các chuỗi RNA
hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn. Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên
cứu này là gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio (danRer11/GEC11) ở
mục “In”. Tiếp theo chọn CRISPR/Cas9 ở mục “Using” và knockout ở mục “For”. Cuối
cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites”...................................................40
Hình 2.4. Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ
http://chopchop.cbu.uib.no/.
Rank: 1 với trình tự mục tiêu: TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn

(trình tự PAM được gạch chân)......................................................................................41
Hình 2.5. Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-
Cas9 ở cá ngựa vằn. Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no sau
khi thiết kế sgRNA keap1b.
viii
Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và

Nrf2.hma.r1: 5’- CAGTGTcttctcctgctcctg được lựa chọn..............................................41
Hình 2.6. sgRNA Nrf2 của cá ngựa vằn được tổng hợp từ công ty IDT........................42
Hình 2.7. Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dòng cá AB. A: Bể có thể tích 1.5 lít nước. Bể
đẻ được bố trí 3 cá cái và 2 cá đực. B: Trứng cá ngựa vằn dòng AB sau khi đẻ được thu
để trong đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm. Trứng màu trắng đục là trứng không thụ tinh.
Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt..................................................................43
Hình 2.8. Đĩa petri bên trái chứa 50 µL Ben zocaine (chất gây mê) với 50 mL nước. Đĩa
petri bên phải chứa nước sạch........................................................................................45
Hình 2.9. Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá........................................46
Hình 2.10. Thao tác bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.......................47
Hình 2.11. Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR............................................................49
Hình 2.12. Bơm mẫu vào các giếng trong gel................................................................51
Hình 2.13. Quá trình chạy điện di..................................................................................52
Hình 2.14. Kết quả sau khi chạy điện di........................................................................53
Hình 2.15. Cách pha Exo SAPit để tinh sạch sản phẩm PCR........................................53
Hình 2.16. Hoá chất EXP SAPit....................................................................................54
Hình 2.17 Spindown mẫu..............................................................................................55
Hình 2.18. Quá trình ly tâm mẫu...................................................................................56
Hình 2.19. Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô..........................................................57
Hình 2.20. Bỏ vào máy tác dụng nhiệt..........................................................................57
Hình 2.21. Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh................................................................58
Hình 3.1. Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn
giai đoạn F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).............................................................................59
ix
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1 (được
lai từ cá F0 và cá hoang dại). Kết quả có 03 dòng (Cá 2; 4 và cá 5) được knockout gen
Nrf2 thành công được tạo ra...........................................................................................60
Hình 3.3. Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ F1. Kết quả có
02 dòng được knockout gen keap1a thành công. Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2
(mẫu 7 15 bp deleted).....................................................................................................61
Hình 3.4. cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự. .62
Hình 3.5. Kết quả sau khi giải trình tự...........................................................................62
Hình 3.6. Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout gen Nrf2...63
Hình 3.7. Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ
Chí Minh........................................................................................................................ 64
Hình 3.8. Cá được chia ra đực, cái rõ rang....................................................................64
Danh mục bảng biểu
Bảng 2.1: Các hóa chất - nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu.........................37
Bảng 2.2: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu................................................38
Bảng 2.3: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.................................................38
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)........................................................44
Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA..................45
Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR........................................................................48
Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR......................................................................................49
Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel......................................................................50

x
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Trang 1
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA
PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Stress oxy hóa gây ra thiệt hại cho nhiều thành phần tế bào, chẳng hạn như DNA,
protein và lipid, và có liên quan đến các tình trạng bệnh lý khác nhau của con người, bao
gồm ung thư, thoái hóa thần kinh và các bệnh viêm (Endo et al. 2020) Một số protein như
superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (Gpx), peroxiredoxin
(Prdx), và các phân tử thiol nhỏ glutathione (GSH) và thioredoxin (Txn), tham gia trực
tiếp vào việc loại bỏ stress oxy hóa.
Những khám phá gần đây về hệ thống chống oxy hóa tế bào đã làm nảy sinh khái
niệm mới về “chất chống oxy hóa gián tiếp”, hoạt động thông qua việc tăng cường khả
năng chống oxy hóa tế bào bằng cách tăng cường biểu hiện gen do yếu tố phiên mã Nrf2
(Takaya et al. 2012; Nguyen et al. 2020). Nrf2 là một yếu tố phiên mã dị loại hóa với các
protein Maf nhỏ và liên kết với yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) trong vùng điều
hòa của các gen mục tiêu của nó (Itoh et al. 1997). Một loạt các gen bảo vệ tế bào mã hóa
các enzym giải độc giai đoạn 2 và các protein chống oxy hóa, chẳng hạn như glutathione
S-transferase (GST), NAD(P)H: quinone oxidoreductase và glutamate-cysteine ligase,
được cảm ứng bởi Nrf2 (Okawa et al. 2006). Trong điều kiện cơ bản, Nrf2 liên tục bị
phân hủy thông qua con đường ubiquitin-proteasome theo cách phụ thuộc Keap1. Khi
tiếp xúc với electrophin hoặc căng thẳng oxy hóa, Nrf2 thoát khỏi sự phân hủy protein,
tích tụ trong nhân và kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu của nó.
Trước đây, phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen
tương đồng của cá ngựa vằn của Nrf2 và gen điều hòa Keap1 của nó (nrf2, keap1a và
keap1b) và chứng minh rằng sự cảm ứng của các gen bảo vệ tế bào bởi hệ thống Keap1-
Nrf2 được bảo tồn ở các động vật có xương sống (Tian et al. 2018). Bằng cách sử dụng
hệ thống cá ngựa vằn này, chúng tôi đã cung cấp những hiểu biết mới về các chức năng
của Nrf2 (Kobayashi et al. 2002, 2009; Nakajima et al. 2011), ví dụ sự phân lập của một
số dòng cá ngựa vằn đột biến biểu hiện phản ứng suy giảm với các hợp chất kích hoạt
Nrf2, và chứng minh sự biểu hiện cụ thể ở mô của Nrf2 và các gen mục tiêu của nó.
Tuy nhiên, vai trò sinh lý của Nrf2 ở cá ngựa vằn vẫn chưa rõ ràng và cần được làm
sáng tỏ để hiểu các chức năng của Nrf2 từ quan điểm tiến hóa. Trong nghiên cứu
“Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gene nrf2 phục vụ nghiên cứu oxy
hóa” này, tôi đã loại bỏ gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp
CRISPR-Cas9 (Ota et al. 2014). Kết quả của chúng tôi cho thấy cá ngựa vằn loại bỏ gen
Nrf2 có thể sống được và có khả năng sinh sản. Đây sẽ là mô hình lý tưởng để sử dụng
phân tích các đặc điểm oxy hóa trong tương lai
Trang 2
Mục đích nghiên cứu

- Mục tiêu của nghiên cứu này là làm rõ vai trò sinh lý của Nrf2 khi bị mất chức
năng. Nhiều nghiên cứu Nrf2 dựa trên các tế bào nuôi cấy liên quan đến cảm cảm biến
căng thẳng đã được báo cáo bao gồm chúng tôi. Đầu tiên, chúng tôi sẽ tạo ra các dòng cá
loại bỏ gen Nrf2, và kiểm tra đặc tính di truyền ở các thế hệ sau từ F0 đến F2. Thứ hai,
chúng tôi sẽ làm sáng tỏ chức năng sinh lý của cá ngựa vằn bị loại bỏ gen Nrf2.
Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài sinh viên, thời gian ngắn. Nên tôi xin thực hiện
mục đích nghiên cứu đầu tiên là tạo được dòng cá ngựa vằn loại bỏ gen Nrf2 đến thế hệ
F2.
2. Đối tượng nghiên cứu
- Cá ngựa vằn AB hoang dại từ trường Đại học Tsukuba, Nhật Bản.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Loại bỏ được gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp
CRISPR-Cas9.
4. Phương pháp nghiên cứu
- Loại bỏ gen Nrf2 ở cá ngựa vằn bằng phương pháp CRISPR-Cas9 và vi tiêm
CRISPR-Cas9 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn một tế bào.
5. Các kết quả đạt được của đề tài
- Loại bỏ được gen Nrf2 ở cá ngựa vằn mà cá thể vẫn có khả năng sống tiếp và sinh sản
6. Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp

Khoá luận tốt nghiệp này gồm 4 chương:
- Chương 1 - Tổng quan
- Chương 2 - Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
- Chương 3 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chương 4 – Kết quả và thảo luận

Trang 3
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật knockout gene
Knockout gene là một kỹ thuật di truyền trong đó một trong các gen của sinh vật
không hoạt động được. Knockout được thực hiện thông qua sự kết hợp của nhiều kỹ
thuật, bắt đầu trong ống nghiệm với plasmid, nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn hoặc
cấu trúc DNA khác, và tiến hành nuôi cấy tế bào. Các tế bào riêng lẻ được chuyển gen
với cấu trúc DNA. Thông thường, mục đích là tạo ra động vật chuyển gen có gen bị thay
đổi. Có thể thay thế 1 đoạn gen khác vào vị trí loại bỏ thay vì loại bỏ hoàn toàn đoạn gen
đó.
1.2 Tổng quan về hệ thống CRISPER-Cas9
Một số lượng chưa từng có của thông tin bộ gen bây giờ đã có sẵn của mô hình
sinh vật khác nhau bao gồm cả thực vật và động vật. Tuy nhiên, các chức năng sinh
học và phát triển liên quan đến các gen riêng lẻ nằm trong các bộ gen này không phải
lúc nào cũng được hiểu rõ. Sự phát triển của các nuclease ở các vị trí đặc trưng nhân
tạo như các zinc‐finger nucleases (ZFNs) và transcription activator‐like effector
nucleases (TALENs) đã cho phép điều tra các kiểu hình của các gen bị mất chức năng
liên quan. Cả ZFNs và TALENs đều bao gồm một tên miền DNA ‐ Binding (tên miền
zinc‐finger hoặc TALE) và tên miền xúc tác FOK I nuclease.
Các DNA sợi đơn bị phá vỡ (Double strand breaks (DSBs)) được gây ra bởi ZFNs
hoặc TALENs tại locus bộ gen được lựa chọn mục tiêu trước đó có thể được sửa chữa
bởi tái tổ hợp các gen tương đồng hoặc không tương đồng. Việc sữa chữa thường gây
ta quá trình chèn và/hoặc xóa (indel) các đột biến vào các vị trí của DSBs, dẫn đến đột
biến lệch khung đọc (frameshift mutation) mà dẫn đến sự phá vỡ chức năng gen. Nhìn
chung, cả hai phương pháp ZFNs và TALENs đều được chứng minh là công cụ mạnh
mẽ để chỉnh sửa bộ gen. Tuy nhiên, quy trình của các phương pháp này rất phức tạp
trong việc thiết kế và đưa vào sử dụng trong thực tế. Do đó tính ứng dụng của các
phương pháp này chưa cao, đặc biệt đối với các ứng dụng lâm sàng (Kotani et al.
2015).

Trang 4
Hình 1.1. Spacer, protospacer và PAM. Protospacer là DNA đích; PAM tiếp giáp
với DNA sợi đôi được nhắm mục tiêu. Phần đệm (Spacer) là một phần của RNA
dẫn đường gắn kết với protospacer. Nguồn: https://www.idtdna.com/
Gần đây, hệ thống CRISPR-Cas9 đã nổi lên như một mảng công nghệ chỉnh sửa
bộ gen mới (Jinek et al. 2012). CRISPR được viết tắt từ những chữ cái đầu của cụm từ
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Tên gọi này được sử dụng ở
thời điểm khi các nhà sinh học chưa biết rõ nguồn gốc và tại sao lại có mặt các đoạn trình
tự riêng rẽ xen giữa các đoạn trình tự giống hệt nhau. Ở thời điểm đó CRISPRs được
miêu tả như là đoạn DNA nhân sơ chứa các đoạn ngắn có trình tự base giống nhau được
lặp lại. Trong một đoạn trình tự xuôi ngược lặp đi lặp lại, khi đọc theo hướng xuôi hay
ngược thì đều có được trình tự nucleotide giống hệt nhau. Nằm cạnh mỗi trình tự xuôi
ngược là các đoạn DNA đệm có độ dài duy nhất mà sau này được phát hiện là có nguồn
gốc từ DNA ngoại lai (thể thực khuẩn hoặc plasmid). Ngoài các đoạn trình tự xuôi ngược
ngắn và vùng đệm DNA, còn có cụm nhỏ (cluster) các gen cas (hệ đi kèm với CRISPR)
nằm bên cạnh các trình tự CRISPR. Hệ thống CRISPR/Cas là một hệ thống miễn dịch
thích ứng được tìm thấy trong vi khuẩn và vi khuẩn cổ, và nó bảo vệ các bộ gen của các
sinh vật chống lại virus xâm lược và plasmid (Wiedenheft et al. 2012). Một số nhóm đã
chứng minh rằng loại II CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas9, đặc biệt hữu ích cho các thay đổi

Trang 5
bộ gen được nhắm mục tiêu trong các tế bào động vật có vú (Cong et al. 2013; Mali et al.
2013) và các sinh vật mô hình khác nhau bao gồm cá ngựa vằn (Hwang et al. 2013),
chuột (Li et al. 2013b), và chuột nhắt (Li et al. 2013a, b).
Hình 1.2. Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9. Hình thành RNP (bước 1) có thể xảy ra bên
trong tế bào hoặc phòng thí nghiệm. Đầu tiên, CRISPR RNA (crRNA) và CRISPR
RNA chuyển hóa (tracrRNA) kết hợp với nhau, tạo thành RNA dẫn đường (gRNA)
hoàn chỉnh. Tiếp theo, gRNA liên kết với enzyme Cas, tạo thành ribonucleoprotein
(RNP). Nếu quá trình hình thành RNP được thực hiện trên phòng thí nghiệm, thì
RNP sau đó phải được chuyển đến các tế bào. Trong bước 2, gRNA hướng RNP đến
mục tiêu bên trong tế bào. Sau đó mục tiêu được phân tách (bước 3). Nguồn:
https://www.idtdna.com/
Trong hệ thống này, các chuỗi gen được nhắm mục tiêu nằm liền kề với một
trình tự tiền vùng đệm (protospacer adjacent motif- PAM) mà được ghi nhận bởi RNA
hướng dẫn (gRNA)- chứa các trình tự bổ sung cho các vị trí đích và được phân cắt bởi

Trang 6
một phức hợp của gRNA và nuclease Cas9. Các đột biến indel tiếp theo gây ra bởi các
nuclease Cas9 góp phần vào sự gián đoạn gen. Trong thực tế, sự gián đoạn gen duy
nhất gây ra bởi CRISPR/Cas9 ở cá ngựa vằn đã được báo cáo bởi một số nhóm (Jao et
al. 2013; Hwang et al. 2013; Chang et al. 2013; Hruscha et al. 2013; Sung et al. 2014;
Bannikov và Lavrov 2017).
Hình 1.3. Các kết quả có thể xảy ra sau khi phân tách DNA bộ gen. Các con
đường sửa chữa DNA của tế bào chẳng hạn như nối kết cuối không tương đồng (NHEJ)
có thể dẫn đến xóa (deletion), thay đổi trình tự (changed sequences) và chèn nhỏ (small
insertion). Nguồn: https://www.idtdna.com/
Trình tự CRISPR lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1987 do các nghiên cứu của
Yoshizumi Ishino và cộng sự tại trường Đại học Osaka, Nhật Bản. Điều này thúc đẩy các
nhà khoa học tập trung nghiên cứu chức năng đặc biệt của chúng trong hệ miễn dịch của
vi khuẩn trong những năm gần đây. Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập của
Tiến sĩ Emmanuelle Charpentier tại trường đại học Umea và Tiến sĩ Jennifer Doudna tại
trường đại học California, Berkeley đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt động của enzyme
Cas và CRISPR.
Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm
2006 về công trình nghiên cứu RNAi (RNA interference), đã có những lời bình luận về

Trang 7
tương lai hứa hẹn của phương pháp này như sau: “CRISPR/Cas có ý nghĩa vô cùng to
lớn, khả năng của nó vô cùng mạnh mẽ, bời vì chúng ta về cơ bản có thể thay đổi bộ gen
theo bất cứ điều gì chúng ta muốn”. Mello nhấn mạnh rằng phương pháp này có thể được
sử dụng rộng rãi từ các ứng dụng cho nông nghiệp đến các ứng dụng liệu pháp gen trong
điều trị các bệnh lý trên người. Phương pháp này thật sự là một thành công của nghiên
cứu khoa học cơ bản, đây cũng là một đột phá to lớn có tác động mạnh mẽ đối với di
truyền học phân tử.
Hình 1.4. Sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) có thể kết hợp các trình tự
mới vào DNA bộ gen. Các trình tự nhỏ có thể được thay đổi cho các mục đích
chỉnh sửa hoặc sửa đổi gen (trái), và các trình tự lớn như toàn bộ gen có thể được
thêm vào một cách ngẫu nhiên (phải). Nguồn: https://www.idtdna.com/
gRNA (RNA hướng dẫn) là một phân tử RNA tổng hợp ngắn được sử dụng trong
chỉnh sửa bộ gen dựa trên hệ thống CRISPR, một trong những loại công cụ chỉnh sửa
bộ gen đặc biệt cao. gRNA bao gồm chuỗi nucleotide dài ̴ 20 bp liên kết với trình tự
DNA mục tiêu của bộ gen. Trình tự này được gọi là trình tự miếng đệm. Phân tử gRNA

Trang 8
bao gồm một chuỗi giàn giao cho liên kết của Cas, endonuclease. Vì vậy, hai thành
phần của chỉnh sửa bộ gen dựa trên CRISPR là gRNA và CRISPR liên kết
endonuclease (Cas). Mặt khác, mục tiêu bộ gen của hệ thống CRISPR thay đổi theo
trình tự của gRNA.
sgRNA là RNA hướng dẫn duy nhất, một thuật ngữ được sử dụng để mô tả gRNA,
trong khi gRNA là RNA được hướng dẫn, một phân tử RNA được sử dụng để chỉ định
một mục tiêu cụ thể cho endonuclease trong chỉnh sửa bộ gen dựa trên hệ thống
CRISPR. Vì thế, cả sgRNA và gRNA là các thuật ngữ có thể hoan đồi cho nhau để mô
tả cùng một phân tử. Không có nhiều sự khác biệt giữa sgRNA và gRNA. Cả sgRNA và
gRNA đều là các phân tử tổng hợp và giống với crRNA trong hệ thống CRISPR theo
chức năng.
Có ba loại gRNA dựa trên phương pháp tổng hợp. Chúng là crRNA tổng hợp,
sgRNA lentivirus và sgRNA tổng hợp.
Hình 1.5. Các dạng gRNA khác nhau được sử dụng để loại bỏ gen. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi lựa chọn dạng sgRNA (bao gồm crRNA và tracrRNA).
sgRNA có tính bền và không cần ủ nhiệt trước khi chuyển vào phôi cá ngựa vằn.
Nguồn: https://www.idtdna.com/

Trang 9
Hình 1.6. Vị trí PAM và gRNA Cas9. Vị trí PAM nằm trên chuỗi DNA không
nằm trong mục tiêu trình tự loại bỏ gen. RNA dẫn đường liên kết với sợi mục
tiêu. RNA dẫn đường trong hình này là RNA dẫn đường hai phần, bao gồm
crRNA và tracrRNA. Nguồn: https://www.idtdna.com/

Trang 10
Hình 1.7. So sánh hai phần gRNA (A) và sgRNA (B). Cả hai loại gRNA đều có
thể được thêm vào Cas9 để tạo thành Ribonucleoprotein (RNP), sau đó có thể
được phân phối đến các tế bào. Nguồn: idtdna.com/
CRISPR/Cas đang ngày căng chứng tỏ tiềm năng ứng dụng mạnh mẽ của mình.
Các nhà khoa học đang tiến hành việc nghiên cứu để sử dụng hệ thống này để sửa chữa
các sai hỏng trong DNA bộ gen trong các bệnh lý di truyền ở con người. Một hướng
ứng dụng khác là trong các nghiên cứu tế bào gốc nhằm biệt hóa các tế bào gốc thành
nhiều loại tế bào khác nhau nhờ điều chỉnh di truyền trong DNA bộ gen. Ngoài ra,
CRISPR/Cas còn có thể được sử dụng trong việc tạo ra các loại động vật và thực vật
biến đổi gen với hiệu quả cao. Thậm chí gần đây, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Yoshio
Koyanagi còn sử dụng hệ thống CRISPR/Cas để phá hủy bộ gen của HIV nhằm dùng nó
như một liệu pháp tiềm năng đối với bệnh AIDS. Nhiều kết quả khả quan ban đầu của
việc sử dụng hệ thống này cũng đã được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới.
Mặc dù chỉ mới được phát triển gần đây, nhưng hệ thống CRISPR/Cas nhanh chóng
được sử dụng rộng rãi trong việc biến đổi DNA bộ gen.
Hiện nay ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về cơ chế phân tử liên quan đến hệ thống
Keap1/Nrf2 vẫn chưa được công bố. Tuy nhiên, các mô hình cá ngựa vằn và medaka đã
được các đơn vị như: trường Đại học Tự nhiên và Trung tâm Công nghệ Sinh học
Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và sử dụng.
1.3. Định nghĩa về hệ thống keap1-nrf2
1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2
Nhận thức về khái niệm môi trường có ảnh hưởng đến sức khỏe của chúng ta, đặc
biệt là trong những trường hợp gây ung thư, được Percival Pott mô tả lần đầu tiên vào
năm 1775 trong ấn phẩm Quan sát Chirurgical. Pott nhận thấy tỷ lệ mắc ung thư bìu
(dương vật) cao bất thường trong các cuộc quét ống khói ở London và cho rằng muội
than là một yếu tố môi trường gây ra ung thư. Năm 1915, mối liên hệ nhân quả giữa hóa
chất môi trường và ung thư đã được Yamagiwa và Ichikawa chứng minh rõ ràng. Họ cho
thấy rằng ung thư mãn tính trên tai thỏ do việc tiếp xúc với than đá. Ngày nay, người ta
đánh giá cao rằng việc tránh và loại bỏ tiếp xúc với các yếu tố bất lợi của môi trường là
rất quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư hóa học ở người.
Trong những năm 1960 và 1970, người ta đã chứng minh rằng các chất gây ung thư
từ than đá và từ các môi trường làm việc khác, thường yêu cầu phải trải qua chuyển hóa
sinh học thành các chất chuyển hóa có tính ái lực điện tử (electrophilic) để tạo thành các
chất cộng hóa trị với protein, RNA và DNA (Debaun et al. 1970). Sự kích hoạt trao đổi
chất này thường được xúc tác bởi hệ thống sắc tố tế bào (cytochrom P-450) của

Trang 11
microsome và các oxyase khác, còn được gọi là enzyme pha I (Miller 1978). Trong khi
sự chú ý ngày càng tăng đối với hóa chất là nguyên nhân gây ung thư ở người, các nghiên
cứu khác đã tìm kiếm các thuốc để trị bệnh ung thư gây ra từ hóa chất, mà có khả năng
ức chế các bước kích hoạt trao đổi chất và/hoặc tăng cường giải độc của các chất trực tiếp
hay trải qua phản ứng trung gian gây ung thư của chúng. Mối quan tâm ban đầu đối với
các chất ức chế ung thư đã tập trung vào các chất chống oxy hóa từ thực phẩm và các sản
phẩm tự nhiên như: flavonoid và isothiocyanate, được cho là an toàn đối với con người.
Tiền xử lý động vật gặm nhấm bằng chất chống oxy hóa từ thực phẩm (2 (3)-tert-butyl-4-
hydroxyanisole (BHA)) có khả năng ức chế hiệu quả quá trình gây ung thư (Yamamoto
et al. 2018).
Benson và các đồng nghiệp (Benson et al. 1980) đã báo cáo rằng BHA làm tăng các
hoạt động enzyme của glutathione S-transferase, epoxide hydratase, NAD(P)H: quinone
oxyoreductase và các enzyme giải độc khác trong nhiều mô của chuột. Nhiều loại hợp
chất chống oxy hóa khác như phenolic, thuốc nhuộm azo, chất thơm đa vòng, flavonoid,
coumarin, cinnamate, indole, isothiocyanate, 1,2-dithiole-3-thiones và thiocarbamate đã
được xác định là các chất có khả năng gây kích hoạt sự hoạt động của những enzyme giải
độc này. Một vài trong số các chất kích hoạt này có chứa một tính năng hóa học đặc biệt
là các chất nhận phản ứng Michael, được đặc trưng bởi các liên kết olefinic để tạo ra ái
lực điện tử (tích điện dương) bằng cách kết hợp với các chất hút electron. Hiệu lực của
các chất gây kích hoạt này chia sẻ tính chất chung của việc sửa đổi các nhóm sulfhydryl
bằng cách oxy hóa, khử hoặc kiềm hóa (Talalay et al. 1988). Sự phơi nhiễm của các tế
bào với liều thấp với các phản ứng electrophile sulfhydryl làm gia tăng hoạt động các
enzyme này (gọi là enzyme pha II), do đó bảo vệ các tế bào chống lại độc tính của
electrophile. Sự thích ứng này của tế bào được gọi là phản ứng chống electrophile
(Prestera et al. 1993). Xuất phát từ những quan sát này, giả thuyết đã đưa ra rằng các tế
bào có khả năng cảm biến (sensor) với các phân tử nhờ vào chức năng sulfhydryl độc đáo
để nhận ra và phản ứng với các chất gây kích hoạt enzyme bảo vệ.
1.3.2 Khám phá Nrf2: một phân tử chính trong phản ứng chống electrophile
Hoạt động enzyme giải độc bởi các chất electrophile hiện nay chủ yếu là do tăng
khả năng phiên mã của các gen tương ứng của chúng. Các yếu tố điều hòa quan trọng
cho sự biểu hiện cảm ứng của gen mã hóa enzyme pha II đã được xác định là yếu tố
đáp ứng chống oxy hóa (ARE) hoặc yếu tố đáp ứng electrophile (EpRE). Tuy nhiên,
các yếu tố điều hòa mã hóa của các yếu tố phiên mã cho ARE/EpRE vẫn chưa được
biết cho đến khi Itoh et al. tạo được mô hình chuột loại bỏ hoàn toàn gen NRF2 và
phân tích biểu hiện của enzyme pha II (Itoh et al. 1997). NRF2 ban đầu được phân lập

Trang 12
như là một yếu tố phiên mã tạo máu tương đồng NF-E2 p45, nhưng chức năng của nó
chưa được biết (Itoh et al. 1995). Họ phát hiện ra rằng kích hoạt các enzyme pha II của
BHA đã bị bãi bỏ hoàn toàn ở chuột bị loại bỏ gen NRF2. Việc xác định NRF2 như
một phân tử điều hóa chính của phản ứng chống electrophile đã mở ra một cánh cửa
mới trong nghiên cứu độc học, nơi các cơ chế giải độc được giải mã và hiểu ở cấp độ
phân tử.
1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: Bộ cảm biến nhận biết các chất elecreophile
Thật may mắn, cảm biến của các chất hóa học từ môi trường và điều hòa hoạt
động của NRF2 đã sớm được phát hiện. Năm 1999, Itoh et al. phân lập (bằng cách
sàng lọc hai loại nấm men) một loại protein mới giàu group thiol (R-SH) và là phân tử
ức chế của NRF2, được đặt tên là KEAP1 (Itoh et al. 1999). KEAP1 thúc đẩy sự suy
giảm NRF2 trong điều kiện không bị căng thẳng. Ngược lại trong điều kiện có các chất
kích thích oxy hóa khử, chúng có khả năng trực tiếp làm thay đổi các nhóm thiol của
KEAP1 và dẫn đến bất hoạt chức năng của KEAP1, kết quả NRF2 không bị ức chế bởi
KEAP1, ổn định hoạt động và di chuyển vào nhân tế bào nơi mà NRF2 có khả năng
phiên mã tạo ra các gen bảo vệ tế bào chất. Do đó KEAP1 được coi là bộ cảm biến
sinh học (biological sensor) cho các chất electrophile và ROS.
1.3.4 Tổng quan về chức năng của hệ thống phân tử KEAP1-NRF2

Hệ thống KEAP1-NRF2 đã được công nhận là cơ chế phòng thủ thống trị của cơ thể
để chống lại các tác động có hại của môi trường. Hệ thống KEAP1-NRF2 là một hệ
thống bao gồm hai thành phần điển hình: KEAP1 như một bộ cảm biến để nhận biết các
chất ái lực điện tử, NRF2 như một tác nhân kích hoạt sự phối hợp của các gen bảo vệ tế
bào. Trong tế bào chất, KEAP1 tạo thành phức hợp ligase ubiquitin E3 với CULLIN3
(CUL3) và NRF2, đánh dấu NRF2 cho sự thoái hóa nhanh chóng qua hệ thống
proteasome.
Do đó, trong điều kiện không bị căng thẳng, NRF2 được tổng hợp, nhưng liên tục bị
suy giảm. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với các chất ái lực điện tử hoặc các gốc tự do, dư lượng
cysteine phản ứng của KEAP1 được sửa đổi trực tiếp, làm giảm hoạt động ligase
ubiquitin E3 của phức hợp KEAP1-CUL3 và dẫn đến ổn định NRF2. NRF2 mới được tạo
ra sau đó có thể chuyển trực tiếp vào nhân, dị hóa với một trong các protein sợi cơ nhỏ
(sMAF), liên kết với yếu tố ARE/EpRE và kích hoạt mạnh mẽ năng lượng của các
enzyme pha II, do đó hoạt động như một yếu tố phiên mã chính.

Trang 13
Hình 1.8. Cơ chế phân tử của hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu NRF2
trong điều kiện căng thẳng. Nguồn: https://www.idtdna.com/
Các nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới về hệ thống KEAP1-NRF2 đã dẫn đến sự
tích lũy đáng kể những bằng chứng chứng minh tầm quan trọng của hoạt động NRF2 và
các cơ chế điều chỉnh của nó đối với việc duy trì sức khỏe của chúng ta. Điều quan trọng
sự điều hòa của hệ thống KEAP1-NRF2 làm cơ sở cho sinh bệnh khác nhau ở người.
Hiện tại, người ta nhận ra rằng hệ thống KEAP1-NRF2 cung cấp một mục tiêu hấp dẫn
để phát triển thuốc cho các tinh trạng bệnh lý khác nhau của con người, như bệnh tiểu
đường, viêm và ung thư.
1.3.5 Cơ chế bảo tồn của hệ thống KEAP1-NRF2 giữa các loài động vật có xương
sống
Hệ thống KEAP1-NRF2 được bảo tồn rất cao giữa các loài động vật có xương sống,
từ cá đến động vật có vú. Zebrafish KEAP1 điều chỉnh hoạt động NRF2 của cá ngựa
vằn theo cách tương tự như ở động vật có vú. Hệ thống này cũng được bảo tồn ở động
vật không xương sống (Hình 3). Ví dụ, ortholog NRF2 của ruồi giấm (Drosophila) được
gọi là nắp cổ áo (cap’n’ collar - CNC). Gen cnc ở Drosophila tạo ra nhiều biến thể mối
nối thay thế, với các sản phẩm CncA, CncB và CncC là các đồng dạng chính. CncC là
isoform dài nhất và giống nhất với NRF2 của động vật có vú. Tương tự như động vật có
xương sống NRF2, CncC của Drosophila yêu cầu sMAF để thực hiện các chức năng

Trang 14
giống như NRF2 của nó. Một ortholog KEAP1 ở Drosophila tương tác với CncC và
hoạt động như một bộ điều hòa ức chế, giống như KEAP1 điều chỉnh NRF2 ở động vật
có vú (Pitoniak and Bohmann 2015).
Hình 1.9. Một bản tóm tắt về dư lượng cystein của Keap1. Việc bảo tồn từng cystein
được chỉ định như sau: O: được bảo tồn; ∆: Không được bảo tồn nhưng cysteine tồn tại
ba axit amin; X: không bảo tồn. Các cystein cảm biến được tô màu đỏ, xanh lá cây và
xanh dương. Mm: chuột; Hs: người; Ol: cá medaka; và Dr: cá ngựa vằn.
Ngược lại, ở loài giun (C. Elegans) sở hữu một ortholog NRF2 được gọi là SKN-1
và hoạt động thông qua một hệ thống phòng thủ khác chống lại căng thẳng oxy hóa
(Blackwell et al. 2015). Cần lưu ý rằng, do tuổi thọ ngắn, Drosophila và C. Elegans
thường được sử dụng cho các nghiên cứu lão hóa. Kích hoạt CncC bằng đột biến KEAP1
giúp kéo dài tuổi thọ của Drosophila Sự gián đoạn SKN-1 ở C. Elegans làm giảm khả
năng chống lại căng thẳng và rút ngắn tuổi thọ (Tullet et al. 2017). Sự đóng góp của
SKN-1 vào kéo dài tuổi thọ cho thấy rằng việc củng cố phản ứng căng thẳng oxy hóa là
một cơ chế chống lão hóa hiệu quả. Một nghiên cứu gần đây sử dụng chuột chũi trần, loài
gặm nhấm có tuổi thọ tự nhiên dài, tiết lộ rằng hoạt động NRF2 cao hơn có liên quan chặt
chẽ với tuổi thọ của chúng (Yamamoto et al. 2018). Các báo cáo này ủng hộ mạnh mẽ
quan niệm rằng hoạt động NRF2 cao hơn có lợi cho tuổi thọ.
1.3.6 Cơ chế điều hoà hoạt động của hệ thống KEAP1-NRF2

KEAP1 là một protein giàu thiol chứa nhiều gốc cysteine, một số nằm liền kề với các
axit amin cơ bản ở các dạng anion phản ứng của nhóm sulfhydryl. Liên kết cộng hóa trị
với các chất gây cảm ứng electrophile với các gốc cystein đã được quan sát bằng phép đo
phổ khối. Sự đóng góp đáng kể của gốc cystein vào chức năng của KEAP1 như một cảm
biến nhận biết các chất đã được chứng minh trong các tế bào nuôi cấy (McMahon et al.
2010; Fourquet et al. 2010), cá ngựa vằn (Kobayashi et al. 2009) và chuột (Yamamoto et
al. 2008; Suzuki et al. 2011; Saito et al. 2015). Các nghiên cứu này cho thấy ba gốc
cysteine chính của KEAP1 rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động ligase ubiquitin E3 của

Trang 15
phức hợp KEAP1 - CUL3. Các gốc cystein quan trọng này là Cys151 ở domain BTB và
Cys273 và Cys288 ở domain IVR.
Hình 1.10. Mã Cysteine của phản ứng dựa trên KEAP1 đối với các rối loạn oxy hóa khử khác
nhau. Ba gốc cystein chính, Cys151, Cys273 và Cys288, của KEAP1 chịu trách nhiệm chính
cho các phản ứng đối với nhiều loại electrophile. OA-NO2, axit béo nitro; 4HNE, 4-
hydroxynonel (Yamamoto et al. 2018).
Việc thay thế Cys151 bằng serine không ảnh hưởng đến hoạt động liên hợp
ubiquitin của phức hợp KEAP1 - CUL3. Tuy nhiên, đột biến KEAP1 C151S đã không
phản ứng với một nhóm lớn các chất có ái lực điện tử electrophile, bao gồm
diethylmaleate, tert-butylhydroquinone, dimethylfumarate, sulforaphane và nitric oxide,
dẫn đến hiện tượng ubiquit hóa liên tục. Khi Cys151 được thay thế bằng tryptophane, đột
biến KEAP1 C151W không liên kết được với phức hợp CUL3 và không hỗ trợ hoạt động
ligase ubiquitin E3 của phức hợp KEAP1-CUL3, dẫn đến sự tích tụ NRF2 (Eggler et al.
2009).
Các dẫn xuất của hợp chất triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic-

acid (CDDO) là tác nhân cực kỳ mạnh mẽ của phản ứng chống electrophile. Các dẫn xuất
này liên kết với Cys151 và phá vỡ sự tương tác giữa KEAP1 và CUL3 (Cleasby et al.
2014; Lee et al. 2017). Các phân tử nhỏ sở hữu cấu trúc tương tự như CDDO (ví dụ,
CDDO-Im) đã được phát triển dưới dạng thuốc thử gắn kết với KEAP1 Cys151 (Huerta

Trang 16
et al. 2016). Mặc dù KEAP1 C151W đã được chứng minh là mất liên kết với CUL3
(Eggler et al. 2009), hầu hết các hóa chất electrophile gây kích hoạt NRF2 không phá vỡ
trực tiếp tương tác KEAP1-CUL3, với ngoại lệ duy nhất CDDO-Im (Takaya et al. 2012).
1.3.7 Chức năng của hệ thống KEAP1-NRF2 cân bằng oxy hoá khử và bảo vệ tế bào
Sự đóng góp của hệ thống KEAP1-NRF2 vào cân bằng nội môi sinh vật đã được
chứng minh trong nhiều nghiên cứu sử dụng chuột bị loại bỏ gen Nrf2 và Keap1. Báo
cáo đầu tiên về chuột bị loại bỏ gen Nrf2 vào năm 1996 đã mô tả không có bất thường
rõ ràng nào về sức sống, tăng trưởng hoặc khả năng sinh sản của nó (Chan et al. 1996).
Năm 1997, một nghiên cứu sử dụng dòng chuột loại bỏ gen Nrf2 được tạo ra độc lập đã
thực hiện khám phá tinh dịch rằng NRF2 đóng vai trò là chất điều hòa chính trong sự
biểu hiện cảm ứng của gen trong in vivo (Itoh et al. 1997). Sau đó, những con chuột này
đã được phân phối cho các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới để nghiên cứu thêm.
Phát hiện tiên phong năm 1997 đã đóng vai trò là nền tảng để tiết lộ vai trò quan trọng
của NRF2 trong các cơ chế phòng vệ căng thẳng và vẫn là bài báo được trích dẫn nhiều
nhất trong lĩnh vực này. Các nghiên cứu ban đầu cũng thúc đẩy sự tiến bộ trong lý
thuyết rằng một loạt các bệnh ở người có thể do rối loạn điều hòa hoặc suy giảm chức
năng NRF2 trong thời gian bị căng thẳng oxy hóa. Mô hình đã được tinh chỉnh khi tạo
ra chuột bị loại bỏ gen Nrf2 có điều kiện (conditional knockout). Tính năng này cho
phép kiểm tra các hiệu ứng mất chức năng của NRF2 theo cách đặc hiệu của dòng tế
bào (Reddy et al. 2011; Zhang et al. 2016).
Sau đó, chuột bị loại bỏ gen Keap1 được tạo ra và báo cáo vào năm 2003
(Wakabayashi et al. 2003). Trái với dự đoán ban đầu rằng sự gián đoạn Keap1 sẽ khiến
những con chuột này cực kỳ mạnh mẽ do sự ổn định cấu thành của NRF2, chuột bị loại
bỏ gen Keap1 đã chết trước khi cai sữa do suy dinh dưỡng. Các lớp biểu mô của thực
quản và dạ dày của chuột con bị loại bỏ gen Keap1 đã dày lên đáng kể, dẫn đến hẹp các
mô này. Điều quan trọng là sự dày lên bất thường của các lớp biểu mô và gây chết ở
giai đoạn cai sữa đã được bãi bỏ hoàn toàn bằng cách xóa đồng thời gen Nrf2. Điều này
chỉ ra rằng sự ổn định cấu thành của NRF2 chịu trách nhiệm cho các kiểu hình của
chuột bị loại bỏ gen Keap1.
Những con chuột bị loại Keap1 có điều kiện (conditional Keap1 knockout mice)
với sự gián đoạn Keap1 đặc hiệu tế bào gan đã được tạo ra vào năm 2006 và chứng minh
rằng sự gia tăng tín hiệu NRF2 dẫn đến khả năng kháng độc của gan với acetaminophen
(Okawa et al. 2006). Một dòng chuột loại bỏ Keap1 có điều kiện khác được thành lập vào
năm 2010 (Blake et al. 2010) với một alen nổi có tên là Keap1FB không biểu hiện kiểu
hình loại bỏ gen trực tiếp (Uruno et al. 2016). Alen Keap1FB rất hữu ích để phân tích các

Trang 17
đóng góp đặc trưng của dòng tế bào của gen Keap1, trong khi Keap1FA rất hữu ích để
nghiên cứu mức thay đổi của Keap1 trong toàn bộ cơ thể. Về vấn đề này, chuột loại bỏ
Keap1FA đóng vai trò là một công cụ hữu ích để mô hình hóa các hành động dược lý của
các chất gây cảm ứng trong in vivo.
1.4 Ứng dụng trị liệu của hệ thống KEAP1-NRF2

Dựa trên những đóng góp sâu sắc của NRF2 trong việc ngăn ngừa và giảm bớt
nhiều tình trạng bệnh lý trong mô hình chuột, các nỗ lực trên toàn thế giới đã được thực
hiện để phân lập từ các nguồn tự nhiên hoặc phát triển các hóa chất kích hoạt NRF2
mạnh và đặc hiệu. Trong số đó, dimethyl fumarate (Tecfidera) đã được Cơ quan Quản lý
Thực phẩm và Dược phẩm và Thiết bị Y tế, Mỹ phê duyệt và được kê toa lâm sàng cho
bệnh nhân mắc bệnh đa xơ cứng. CDDO-Me, một thành viên của nhóm thuốc gây cảm
ứng oleanane triterpenoid NRF2 cực kỳ mạnh, đang trải qua các thử nghiệm lâm sàng tại
Nhật Bản để điều trị bệnh thận đái tháo đường, mặc dù sự phát triển của nó bị dừng lại ở
Hoa Kỳ do sự xuất hiện của biến chứng tim ở bệnh nhân ở giai đoạn cuối bệnh thận
(Pergola et al. 2011; de Zeeuw et al. 2013). Các chất cảm ứng có hiệu lực và độ đặc hiệu
ít hơn cũng đang được phát triển lâm sàng, đặc biệt là các axit béo nitro (Delmastro-
Greenwood et al. 2014) và isothiocyanate sulforaphane có nguồn gốc từ bông cải xanh
(Dinkova-Kostova et al. 2017). Có thể việc sửa đổi dư lượng cystein bổ sung ngoài
KEAP1 có thể kích hoạt tín hiệu bổ sung giúp tăng cường hiệu quả bảo vệ. Một số thử
nghiệm nhỏ ở bệnh tự kỷ (Singh et al. 2014) và ô nhiễm không khí (Egner et al. 2014) sử
dụng sulforaphane dưới dạng chiết xuất bông cải xanh đã cho thấy những tác động đầy
hứa hẹn, ít nhất là một phần. Mặc dù dư lượng cystein của KEAP1 có tính phản ứng cao
và được sửa đổi hiệu quả bởi các chất electrophile này, các chiến lược không đòi hỏi tính
đặc hiệu của electrophile vẫn cần được xem xét. Do đó, các chất gây cảm ứng NRF2 có
độ đặc hiệu cao hơn có thể được tìm thấy ở dạng hóa chất không phải electrophile mà phá
vỡ sự tương tác giữa KEAP1 và NRF2.
Lưu ý rằng KEAP1 chứa một số cảm biến cysteine riêng biệt và hoạt động tự động
(C151, C226, C273, C288 và C613), bằng chứng hiện tại cho thấy NRF2 và KEAP1 tích
hợp tín hiệu oxit nitric, Zn2+ và alkenal với tín hiệu oxi hóa khử với nhau. Các tác động
trực tiếp và gián tiếp khác nhau của các chất kích hoạt NRF2 đôi khi được hiểu là tác
dụng không đặc hiệu. Tuy nhiên, sự phát triển của một số công tắc oxi hóa khử dựa trên
thiol (R-SH) riêng biệt trong KEAP1 cho phép các loài động vật có vú thích nghi với phổ
rộng của hóa chất thực vật. Đặc biệt, các lợi ích đa mục tiêu của kích hoạt NRF2 bao gồm
duy trì tín hiệu oxy hóa khử, tăng cường sinh học xenobiotic, kiểm soát và giải quyết tình
trạng viêm, ức chế gluconeogenesis và lipogenesis gan, hỗ trợ quá trình tạo protein và ức

Trang 18
chế xơ hóa. Trong bối cảnh này, đáng chú ý là hầu hết các bệnh mãn tính, đặc biệt là
những bệnh nhân bị giới hạn trong dân số già, không có căn nguyên độc nhất, cũng
không biểu hiện một bệnh lý đơn lẻ, và như vậy chúng có thể được điều trị hiệu quả nhất
bằng thuốc kích hoạt NRF2. Thật vậy, việc kích thích các cơ chế bảo vệ tế bào rộng khi
kích hoạt NRF2 ít có khả năng bị áp đảo hoặc phá vỡ một cách hiệu quả bởi các quá trình
gây bệnh hơn là các biện pháp can thiệp điều trị được nhắm mục tiêu cụ thể hơn.
1.5 Hệ thống KEAP1-NRF2 ở cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn (Danio rerio) đã trở thành một mô hình hữu ích cho các ứng dụng y
tế và sinh học. Cá ngựa vằn ở giai đoạn phôi thai và ấu trùng cá ngựa vằn có màu trong
suốt. Do đó có thể dễ dàng theo dõi sự biểu hiện của gen. So với các mẫu chuột, việc bảo
trì và chăm sóc dễ quản lý hơn và không đắt bằng. Cá ngựa vằn cũng có thể cung cấp một
số lượng đáng kể phôi để phân tích thống kê. Rất khó để tạo ra cá ngựa vằn loại trực tiếp
gen, nhưng gần đây, các cụm thường xuyên lặp lại palindromic ngắn xen kẽ nhau
(CRISPR) -CRISPR liên kết protein 9 phương pháp (Cas9) đã được giới thiệu trong lĩnh
vực cá ngựa vằn và bộ gen cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng (Ota et al., 2014). Do đó,
việc phân tích loại gen và biểu hiện gen ở cá ngựa vằn đã trở nên dễ dàng.
Hình 1.11. Các điểm mạnh khi sử dụng mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu sinh học
phân tử.

Trang 19
Ngoài ra, cá ngựa vằn đã được sử dụng làm mô hình ứng dụng dịch bệnh và sàng
lọc thuốc với thành công lớn (Lam & Gong, 2006; Mukaigasa và cộng sự, 2018; Park và
cộng sự, 2008; Smith và cộng sự, 2010; Tobia và cộng sự., 2013; Weigt và cộng sự,
2011; White, 2015; Yen và cộng sự, 2014). Hơn nữa, so với các loài động vật có vú, hệ
thống Keap1-Nrf2 ở cá ngựa vằn được bảo tồn (Fuse & Kobayashi, 2017), và Nrf2 và
Keap1 của cá ngựa vằn đã được Kobayashi và cộng sự, (2002) phân lập. Đầu tiên, thể đột
biến Nrf2, nrf2afh318 đã được phân lập và thể hiện độ nhạy cao với stress oxy hóa
(Mukaigasa et al., 2012). Sau đó, người ta phát hiện ra rằng Keap1 thoát ra ở cá ngựa vằn
trong hai đồng trực hệ, keap1a và keap1b, mà Li và cộng sự, (2008) đã xác định được
keap1a. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cả keap1a và keap1b đều có các hoạt
động đàn áp tương tự trong Nrf2, nhưng khác biệt về các hoạt động cảm nhận căng thẳng
(Kobayashi và cộng sự, 2009). Do đó, cá ngựa vằn có thể là một mô hình tuyệt vời để
nghiên cứu không chỉ Nrf2 mà còn cả hàm Keap1.
1.6 Khả năng thành công

Trước đây rất khó để tạo ra đột biến gen ở cá, nhưng gần đây, phương pháp
CRISPR-Cas9 đã được ứng dụng thành công ở cá ngựa vằn (Ota et al. 2014), và do đó bộ
gen của cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng. Bằng cách tận dụng công nghệ này, chúng
tôi quyết định tạo ra các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Keap1a và Keap1b để tìm
hiểu các chức năng sinh lý của chúng.
1.7 Tính mới, tính thời sự

Đây sẽ là đề tài mô tả knockout gen Nrf2 bằng CRIPR-Cas9 được thực hiện trên
đối tượng cá ngựa vằn đầu tiên trên thế giới. Đây cũng là dự án đầu tiên sử dụng phương
pháp CRISPR-Cas9 thực hiện loại bỏ gen trên đối tượng cá ngựa vằn tại Việt Nam. Do
vậy dự án nghiên cứu này thành công sẽ thúc đẩy các nhà khoa học có cái nhìn mới hơn
về phương pháp loại bỏ gen bằng hệ thống CRISPR-Cas9 cho các nhà khoa học tại Việt
Nam trong tương lai.
Điểm tập trung của nghiên cứu này là sử dụng cá ngựa vằn làm mô hình động vật
để nghiên cứu vai trò sinh lý của Nrf2. Từ các nghiên cứu Nrf2 trước đây của chúng tôi,
chúng tôi nhận thấy rằng các loài cá nhỏ như cá ngựa vằn là một mô hình tuyệt vời để
phân tích chức năng in vivo của các phân tử liên quan đến căng thẳng. Điểm độc đáo của
nghiên cứu này là dựa trên nghiên cứu in vitro trước đây của Mukagasa et al. 2012 cho
thấy hai Nrf2 của cá ngựa vằn có khả năng cảm biến với các chất oxy hóa khác nhau.
1.8 Ý nghĩa khoa học và sự cần thiết vấn đề cần nghiên cứu
Xác định vai trò sinh lý của "cảm biến căng thẳng" sẽ khá hữu ích cho không chỉ
khoa học cơ bản mà còn ứng dụng, chẳng hạn như sự phát triển của thuốc kích hoạt Nrf2.

Trang 20
Hơn nữa, việc xác định vai trò sinh lý của Keap1 là "thuốc ức chế ung thư" sẽ rất quan
trọng để xem xét sự cân bằng giữa chống lão hóa và chống ung thư.
1.9 Giới thiệu chung về cá ngựa vằn

1.9.1 Giới thiệu chung
Cá ngựa vằn được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:
Ngành có dây sống: Chordata
Lớp cá xương: Actinopterygii
Bộ cá vược: Cypriniformes
Họ cá rô phi: Cyprinidae
Giống Pterophyllum
Loài: Danio rerio sp.
Tên tiếng việt: Cá ngựa vằn; Cá sọc ngựa.
Cá ngựa vằn có tên khoa học là Danio rerio, là một giống cá nước ngọt vùng nhiệt đới
từ lâu đã là một loại cá yêu thích cho những người chơi cá cảnh cũng như đối với các nhà khoa
học vì các đặc tính như dễ nuôi, sinh sản nhanh, và các đặc bộ gen học thú vị. Cá ngựa vằn đã
được dùng làm động vật mô hình thí nghiệm từ giữa những năm 1900s. Vào những năm 1980s,
tiến sĩ George Streisinger và cộng sự ở đại học Oregon đã thực hiện một cuộc cách mạng về
mô hình nghiên cứu di truyền mà trước đây chỉ thực hiện ở động vật không có xương sống.
Tiếp đó, các nhóm nghiên cứu khác ở Boston và Đức đã thực hiện hai cuộc sàng lọc di
truyền lớn tạo ra hàng ngàn các chủng đột biến, là công cụ vô giá để hiểu rõ về sự phát triển ở
mức độ phân tử. Những nghiên cứu mang tính bước ngoặc này lần đầu tiên được xuất bản vào
đầu những năm 1990s, đã đưa cá ngựa vằn trở thành một mô hình động vật nghiên cứu về sự
phát triển. Qua thời gian, cá ngựa vằn đã được mở rộng làm các mô hình nghiên cứu về sức
khoẻ và bệnh lý ở con người, mô hình thử độc tính, mô hình cách thức hành động và tiến hoá
(Harper and Lawrence 2011).
1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên

Cá ngựa vằn, có nguồn gốc từ Nam Á, phân bố chủ yếu khắp hạ lưu của nhiều sông lớn
của Ấn Độ, Bangladesh và Nepal. Địa lý này khu vực được đặc trưng bởi khí hậu gió mùa của nó,
với mùa mưa và mùa khô. Cá ngựa vằn chủ yếu là một loài sống ở vùng ngập lũ, và thường là gặp ở
các vùng nước nông, đứng hoặc chuyển động chậm với thảm thực vật thủy sinh ngập nước và lớp
nền phủ phù sa. Chất lượng nước trong những môi trường sống này có thể thay đổi rộng rãi. Ví dụ,
phạm vi pH và nhiệt độ được ghi lại tại một số địa điểm thu thập cá ngựa vằn trong tự nhiên lần lượt

Trang 21
là 5,9 – 8,5 và 16 – 38°C. Trong tự nhiên, cá ngựa vằn chủ yếu ăn nhiều loại động vật phù du và côn
trùng (cả dưới nước và trên cạn), tảo, mảnh vụn, và nhiều vật liệu hữu cơ khác (Harper and
Lawrence 2011).
1.9.3 Đặc tính sinh học cơ bản

Cá ngựa vằn là loài cá nhỏ, năng động, với 5 đến 7 sọc ở hai bên cơ thể của chúng.
Chúng có 3 vây chưa ghép đôi và 2 vây có cặp. Cá ngựa vằn cũng có 2 cặp vạch ở mặt bên bụng của
khoang miệng. Cá ngựa vằn một tuổi có thể dài từ 25 mm đến 35 mm. Tốc độ tăng trưởng của cá
ngựa vằn là nhanh nhất trong thời gian 3 tháng đầu đời và về 0 trong giai đoạn từ khoảng 18 tháng
tuổi. Tốc độ phát triển của cá ngựa vằn được nuôi trong phòng thí nghiệm lớn hơn tốc độ tăng
trưởng của cá ngựa vằn hoang dã. Cá cái lớn hơn cá ngựa vằn đực bất kể chúng có nguồn gốc từ tự
nhiên hay phòng thí nghiệm, con đực mảnh mai hơn con cái, có màu vàng nhạt trên bụng của chúng,
và có xu hướng có vây hậu môn lớn hơn so với cá cái (Harper and Lawrence 2011).
Hình 1.12. Cá ngựa vằn đực và cái.
Cá ngựa vằn có thời gian sinh sản ngắn, từ 2 đến 4 tháng, và thụ tinh là bên ngoài. Trong tự
nhiên, cá ngựa vằn được cho là đẻ trứng trước và trong mùa mưa. Trong điều kiện phòng thí

Trang 22
nghiệm, cá ngựa vằn có thể đẻ trứng hàng ngày, đẻ vài trăm trứng hoặc nhiều hơn. Khi thụ tinh,
trứng có đường kính khoảng 0,7 mm. Các phôi trong suốt về mặt quang học trong vài ngày đầu tiên
sau khi thụ tinh (dpf), và tất cả các cơ quan chính hình thành trong vòng 36 giờ sau khi thụ tinh. Ấu
trùng cá ngựa vằn bắt đầu tìm kiếm thức ăn ở ngày thứ 5. Tuổi thọ của cá ngựa vằn trong môi
trường phòng thí nghiệm khoảng 42 tháng, có khi lên đến 66 tháng (3.5 – 5.5 năm). Các chủng đột
biến có thể có tuổi thọ ngắn hơn, tùy thuộc vào các khiếm khuyết di truyền (Harper and Lawrence
2011).
1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn có bộ gen lưỡng bội, gồm 25 cặp nhiễm sắc thể. Bộ gen được giải trình tự bởi
viện Welcome Trust Sanger khởi xướng vào năm 2001, dài khoảng 1.4x 109 bp, bằng khoảng gần
một nửa kích thước của bộ gen người, dự đoán chứa hơn 26,000 gen mã hoá cho protein với số
lượng cao hơn so với bất kỳ động vật nào đã được giải trình tự trước đó bao gồm người, chuột, gà,
với các trình tự lặp lại cao ước tính chiếm khoảng 40%, đây là đặc tính giống với bộ gen người. Thật
vậy, mức độ tương đồng của bộ gen cá ngựa vằn và người tương đối cao chiếm khoảng 70% (Howe
et al. 2013).
Hình 1.13. Sự tương quan giữa bộ gen người, gà, chuột và cá ngựa vằn (Howe et
al. 2013)
Một so sánh trực tiếp giữa gen mã hoá cho protein ở người và cá ngựa vằn cho thấy các đặc
tính thú vị sau. Đầu tiên, 71.4% số gen người có ít nhất một đồng phân với cá ngựa vằn được xác

Trang 23
định bởi Ensembl. Ngược lại, 69% số gen cá ngựa vằn có ít nhất 1 đồng phân ở người. Trong số các
gen đồng phân, 47% gen người có mối quan hệ 1-1 với đồng phân ở cá ngựa vằn (Howe et al. 2013).
Một trong những số đồng phân này thể hiện qua con đường chống oxy hoá bảo vệ tế bào
bằng hoạt hoá Keap1-Nrf2 đã được nghiên cứu có sự bảo tồn từ cá ngựa vằn cho đến
người. Tuy nhiên, ở người chỉ có 1 gen keap1 trong khi ở cá ngựa vằn có 2 dạng đồng
phân là keap1a và keap1b (Nguyen et al. 2020)

Trang 24
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• Thời gian thực hiện: từ 11/2021 đến 04/2022
• Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ
Sinh học TP.HCM.
\
Hình 2.1. Hệ thống nuôi cá và bàn làm việc, thí nghiệm của phòng Công nghệ
Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh
2.2 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu
Các loại hóa chất, dụng cụ, thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê theo các
bảng bên dưới:
Chương 2 – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trang 25
Bảng 2.1: Các hóa chất - nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất – nguyên liệu
1 Ethanol 70
2 Dược liệu khô mỗi loại 200g
3 HCL
4 EDTA
5 NaCl
6 SDS 10%
7 Taq buffer
8 dNTP
9 Các mồi primers
10 Tap
11 Polyacrylamide gel
12 TBE
13 TEMDED
14 APS 10%
15 Hydrogen peroxide
16 Methylene blue
17 Tricaine

Trang 26
Bảng 2.2: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
ST
Dụng cụ
T
1 Pippete và đầu típ các loại
2 Ống Falcon
3 Đĩa petri
4 Đĩa 6 giếng
5 Chai thủy tinh 2 lít
6 Ống bóp 5 mL
Bảng 2.3: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
ST
Thiết bị
T
1 Máy cô quay Buchi R300
2 Máy chạy PCR
3 Máy xay dược liệu khô
4 Hệ thống máy chạy Realtime PCR
5 Bể ủ nhiệt
6 Cân phân tích
7 Tủ lạnh
8 Bộ chạy điện di đứng
2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde RNA
(sgRNA) và Cas9 mRNA
Các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Nrf2 sẽ được tạo ra bởi phương pháp
CRISPR-Cas9. Cụ thể
Vị trí sgRNA Nrf2

Trang 27
Hình 2.2. Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn.
Biểu đồ được tạo bằng phần mềm Snapgen 2.3.2.
Để thiết kế các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) cụ thể, chúng tôi tìm các mục
tiêu của vị trí RNA hướng dẫn (gRNA) bộ gen bằng cách làm theo hướng dẫn của trang
web: http://chopchop.cbu.uib.no . Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen
nfe2l2a (Nrf2) vào mục “Target”, bấm chọn “Danio rerio (danRer11/GEC11)” ở mục
“In”. Tiếp theo chọn “CRISPR/Cas9” ở mục “Using” và “knockout” ở mục “For”. Cuối
cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites” (Hình 1).
Các vị trí gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn lần lượt là 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' (Trình tự PAM được gạch chân) (Hình 2; 5).
Tiếp theo để xác định được hiệu quả knockout gen Nrf2 sau khi vi tiêm để tạo cá
thế hệ F0 và F1. Các cặp mồi Nrf2.hma.f1; Nrf2.hma.r1 (Hình 14; bảng 1) được thiết kế
theo đề xuất của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no (Hình 3; 5). Các cặp mồi được đề
xuất sau khi lựa chọn các vị trí RNA dẫn đường được thực hiện.

Trang 28
Hình 2.3. Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí các chuỗi RNA
hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn. Cụ thể, nhập tên gen (trong
nghiên cứu này là gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio
(danRer11/GEC11) ở mục “In”. Tiếp theo chọn CRISPR/Cas9 ở mục “Using” và
knockout ở mục “For”. Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites”.
Hình 2.4. Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ
http://chopchop.cbu.uib.no/. Rank: 1 với trình tự mục tiêu:
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn (trình tự PAM được gạch chân).

Trang 29
Hình 2.5. Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen Nrf2 bằng
CRISPR-Cas9 ở cá ngựa vằn. Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web
http://chopchop.cbu.uib.no sau khi thiết kế sgRNA keap1b.
Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và
Nrf2.hma.r1: 5’- CAGTGTcttctcctgctcctg được lựa chọn.
Các trình tự gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' sau đó được gởi đến công ty “Integrated DNA
Technologies, Inc” để tổng hợp RNA dẫn đường đơn (sgRNA) keap1a và keap1b. Alt-R S.p
HiFi Cas9 Nuclease V3 được mua từ công ty “Integrated DNA Technologies, Inc”
Hình 2.6. sgRNA Nrf2 của cá ngựa vằn được tổng hợp từ công ty IDT.

Trang 30

Trang 31
2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas 9 và Phương pháp vi tiêm
Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen
Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng cách
thêm 100 µL nuclease free duplex buffer (IDT) để có nồng độ cuối là 100 µM.
Tiếp theo pha loãng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg (10 µg/µL) (10 µg/µL
Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 µL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES;
150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 µL, để đạt nồng độ cuối 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9
Nuclease V3).
Để pha dung dịch thực hiện vi tiêm tạo sản phẩm RNP, kết hợp 3 µL sgRNA Nrf2
với 3 µL của 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3. Ủ ở nhiệt độ 37 oC cho 10
phút, sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phòng.
Cho đẻ cá ngựa vằn dòng AB:
Để tiến hành knockout gen Nrf2, dòng cá ngựa vằn AB (được thu thập từ trường
Đại học Tsukuba, Nhật Bản) được sử dụng để cho sinh sản tạo phôi trứng, sẵn sàng để
thực hiện knockout gen keap1a và keap1b.
Cá ngựa vằn nuôi đạt kích thước khoảng 3 tháng tuổi. Sau đó cá cá đực và cái được
tách ra nuôi từng bể riêng.
Trước ngày cho đẻ 1 ngày, tiến hành ghép cá đực và cái theo tỉ lệ 3 cái: 2 đực trong
bể cho đẻ được tiết kế có lớp lưới inox ngăn bên dưới để trứng rơi xuống, mà tránh cá bố
mẹ ăn trứng (Hình 9)
Hình 2.7. Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dòng cá AB. A: Bể có thể tích 1.5 lít nước. Bể
đẻ được bố trí 3 cá cái và 2 cá đực. B: Trứng cá ngựa vằn dòng AB sau khi đẻ được thu

Trang 32
để trong đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm. Trứng màu trắng đục là trứng không thụ tinh.
Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt.
Thu trứng cá ngựa vằn dòng AB ở giai đoạn 1 tế bào và thực hiện vi tiêm 3 nL sản
phẩm kết hợp RNP. Vi tiêm ít nhất 20 trứng cho mỗi lần tiêm. Sau khi vi tiêm kiểm tra tỉ
lệ sống của phôi tại thời điểm 8 hrs; 24 hrs; 48 hrs; và 96 hrs).
Sau 96 hrs, tiến hành thu 15 ấu trùng cá riêng biệt để chạy PCR với cặp mồi
Nrf2.hma.f1/r1 và Nrf2.hma.f1/r1 để kiểm tra hiệu quả knockout gen ở thế hệ F0. Phân
tích sản phẩm PCR trên 9% acrylamide gel và đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Sau khi đánh giá hiệu quả sau vi tiêm, cá F0 sẽ được nuôi đến giai đoạn thành thục
(~3 tháng), sau đó cho lai với cá hoang dại tạo ra đàn cá F1, ấu trùng cá F1 hoặc F2 ở giai
đoạn sau 96 hrs sau khi thụ tinh sẽ được đánh giá hiệu quả knockout gen bằng cặp mồi
Nrf2.hma.f1 và Nfr2.hma. r1. Nếu xuất hiện band heteroduplex, các mẫu này sẽ được
thực hiện giải trình tự với mồi ở bảng 1 để đánh giá liệu gen đó được loại bỏ (deletion)
hay thêm vào (insertion) các nucleotide.
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)
Genes Mục đích Trình tự mồi
Sequencing 5’- TATAGTCTTCGCTGTATTGGAAGCTGC
5’- TGCTTTGTTTGTGTGTGTTCCTGTAT
Nrf2
Heteroduplex 5’- CTAGTGTGTGATGCCTGACCTC
mobility assay
5’- CAGTGTCTTCTCCTGCTCCTG
2.4 Xác định kiểu gen

Đối với kiểu gen, DNA tổng số được chiết xuất từ cắt vây đuôi cá trưởng
thành bằng cách sử dụng môi trường tách chiết: 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM
EDTA (pH 8.0), NaCl 200 mM, 0.1 % sodium đoecyl sulfate và 400 g/mL proteinase
K (Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật Bản), bằng cách ủ ở 55°C trong 4 h. DNA tổng số
thu được sẽ được khuếch đại bằng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi 5′-
TGTGATGCCTGACCTCTGATGT và mồi 5′- GTCGAACACCTCACGGCCC cho
gen Nrf2 (Bảng 2). Kiểu gen được đánh giá sau khi chạy điện di trên 9% gel
polyacrylamide.

Trang 33
2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA

Số con cá được cắt đuôi để tiến hành chạy PCR là 32 con. Để thực hiện cần chuẩn bị
cá F1 Nrf2 knockout gen; Chất gây mê (Ben zocaine); 32 ly đựng nước có đánh số từ 1
đến 32; 32 ống eppendorf có đánh số từ 1 đến 32 có chứa 50µL TNEST để giúp phân hủy
đuôi cá sau khi cắt nhằm thu được DNA của cá; nước sạch; 2 đĩa petri; Muỗng; Nhíp cắt
đuôi cá.
Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA
Cách pha TNEST 1X
1M-HCl (pH8.2) 0.5µL
0.5 EDTA 1 µL
5M NaCl 2 µL
10% SDS 0.5 µL
H2 O 46 µL
Tổng cộng 50 µL
Hình 2.8. Đĩa petri bên trái chứa 50 µL Ben zocaine (chất gây mê) với 50 mL
nước. Đĩa petri bên phải chứa nước sạch.

Trang 34
Hình 2.9. Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá.
Các bước tiến hành cắt đuôi cá: Đầu tiên bắt cá F1 Nrf2 knockout gene cho vào
đĩa petri có pha chất gây mê để cá nằm yên (khoảng 1 phút). Sau đó, vớt cá qua đĩa petri
chứa nước sạch, lấy nhíp cắt 1 phần đuôi cá (cắt 1 phần đuôi cá để cá có thể phục hồi
đuôi). Sau đó bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf đã chuẩn bị có chứa TNEST và đậy
nắp lại. Cuối cùng thả cá sau khi tiến hành cắt đuôi xong vào ly chứa nước sạch đã chuẩn
bị.

Trang 35
Hình 2.10. Thao tác bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.
Thêm 0.5 µL enzyme proK (50 mg/mL) for 50 uL môi trường TNEST buffer. Sau
đó, ủ mẫu ở 55oC ít nhất 4 hrs. Sau khi mẫu ủ, tiến hành pha loãng mẫu DNA 1/10 để
chạy PCR.
2.4.2. Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2

Sau khi để mẫu đuôi cá qua đêm thì sẽ chạy PCR. Đầu tiền là pha loãng mẫu DNA
của cá ngựa vằn. Hút 2µL mẫu đuôi cá pha với 38µL H2O. Sau đó, chuẩn bị các thiết bị
và hoá chất bao gồm: H2O, 10uM-Nrf2.seq.f5, 10uM-Nrf2.seq.r5, DreamTag Green PCR
master mix.
Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR
Chuẩn bị pha premix để chạy PCR X1 Mẫu X1 X23
Water, nuclease-free 5.5 µL 3.5 µL 81.3 µL
10uM-Nrf2.seq.f5 0.5 µL 0.3 µL 7.4 µL
10uM-Nrf2.seq.r5 0.5 µL 0.3 µL 7.4 µL
DreamTag Green PCR master mix 7.5 µL 4.8 µL 110.9 µL
Trộn bằng pipet
Sum 14.0 µL 9.0 µL 207.0 µL
Sau đó, chia đều 9 µL premix vào PCR tube.
Cho thêm 1 µL DNA đã pha loãng vào mỗi PCR tube. Rồi tiến hành đưa các PCR tube
vào máy PCR để chạy theo chu trình.

Trang 36
Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR
95oC 2 phút
95 oC 10 giây
35 vòng
60 oC 30 giây
72 oC 30 giây
72 oC 5 phút
4 oC ∞
Hình 2.11. Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR
Sau khi chạy PCR xong thì sẽ tiến hành đổ gel. Các dụng cụ, thiết bị và hoá chất cần
chuẩn bị bao gồm: khuôn đổ gel, lược tạo giếng cho gel, H 2O, 30% Acrylamide, 10X
TBE, TEMDED, 10% APS.
Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel
Đổ gel Acrylamide 9% 1 Gel 2 Gel
H2O 4.75 mL 9.5 mL
30% Acrylamide 2.25 mL 4.5 mL
10X TBE 0.4 mL 0.8 mL
TEMDED 5 µL 10 µL
10% APS 65 µL 130 µL

Trang 37
Sau đó, trộn đều hỗn hợp rồi đổ vào khuôn, gắn lược. Đợi khoảng 30 phút sau gel sẽ
đông lại.
Sau khi gel đông và mẫu trong máy PCR chạy xong thì sẽ tiến hành hút 9 µL từ PCR
tube để bơm vào các giếng trong miếng gel. Giếng đầu tiên sẽ cho 7 µL thang vào.
Hình 2.12 Bơm mẫu vào các giếng trong gel

Trang 38
Sau khi xong sẽ cho gel vào máy chạy điện di để chạy điện di mẫu. Chu trình chạy
điện di mẫu: 200V, 60mA, 50 phút.
Hình 2.13. Quá trình chạy điện di
Sau khi chạy điện di 50 phút thì sẽ lấy gel ra và cho vào trong dung dịch ethidium
bromide khoảng 30 phút rồi cho vào máy để đọc gel.

Trang 39
Hình 2.14. Kết quả sau khi chạy điện di
2.5 GIẢI TRÌNH TỰ

2.5.1 Tinh sạch mẫu
Bước 1: Cho vào tuýp 5µL mẫu PCR, 2µL EXP SAPit
Bước 2: Chạy mẫu ở điều kiện 37oC trong vòng 15 phút và 80oC trong vòng 15
phút
PCR for sequencing Nrf2 KO
Exo SAPit mixture

PCR product 5uL Incubate 37oC 15min
Exp SAPit 2uL 80oC 15 min
4oC oo for sequencing or store at -20oC
Premix 2 Nrf2.seq.f1 x1 x6 PCR condition

96oC 3 min
Big dye terminator 0.5 uL 3 uL 96oC 10 sec
Buffer bigdye 1.5 9 50oC 5 sec 25
10uM Nrf2.seq.f1 0.15 uL 0.9 uL 60oC 4 min cycles
H2O 4.85 uL 29 uL 60oC 7 min
Total 7 uL 42 uL 4oC oo
Add Exo SAPit mixture 3 uL
Hình 2.15. Cách pha Exo SAPit để tinh sạch sản phẩm PCR.

Trang 40
Hình 2.16. Hoá chất EXP SAPit
2.5.2 Giải trình tự
Sau đây là các bước pha mẫu để giả trình tự:
Bước Ethanol/EDTA precipitation
1. Ly tâm mẫu chạy 5-10 giây
2. Thêm 2.5 uL của 125 mM EDTA
QUAN TRỌNG! Cho trực tiếp EDTA xuống dưới các mẫu GTT.
3. Thêm 30uL của 100% Ethanol. Tổng mẫu 42.5 uL/giếng
4. Chuyển 42.5 uL mỗi mẫu từ tube PCR sang eppendoft 1.5 mL
5. Votex eppendoft 2-3 seconds. Sau đó ly tâm nhanh 5-10 seconds at 1.000 g
6. Để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút tạo kết tủa
QUAN TRỌNG! Thời gian tạo kết tủa là quan trọng
7. Li tâm 2.000 g, 45 min, 4oC
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo

Trang 41
8. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
9. Thêm 30 uL, 75% Ethanol
10. Vortex nhanh 5-10 giây
11. Li tâm 2000 g, 15 min, 4oC
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
12. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
13. Li tâm 1000 g trong 1 phút
14. Để khô trong không khí, miệng úp xuống, tránh sáng ở nhiệt độ phòng 5-10 phút.
15. Cho 15 uL HIDI-Formamide để hoàn tan cục kết tủa
16. Nung nóng mẫu 96oC trong 2 phút, bỏ trong đá 4oC ngay lập tức.
17. Chuyển mẫu vào đĩa giải trình tự. Đậy nắp
18. Thực hiện giải trình tự
Hình 2.17 Spindown mẫu

Trang 42
Hình 2.18. Quá trình ly tâm mẫu

Trang 43
Hình 2.19. Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô

Trang 44
Hình 2.20. Bỏ vào máy tác dụng nhiệt
Hình 2.21. Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 45
CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen

sgRNA Nrf2 cùng với Cas9 protein được vi tiêm vào giai đoạn phôi 1 tế bào cá
ngựa vằn. Hiệu quả vi tiêm sẽ được kiểm tra sau những ngày này.
Hình 3.1. Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn
giai đoạn F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Chương 3 – Kết quả và thảo luận

Trang 46
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1 (được
lai từ cá F0 và cá hoang dại). Kết quả có 03 dòng (Cá 2; 4 và cá 5) được knockout gen
Nrf2 thành công được tạo ra.
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 ở giai
đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp
mồi keap1a-hma-f1 (5’-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) và keap1a-hma-r1 (5’-
GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT), cho kết quả thành công tạo band hetetoduplex
(hình 1) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dòng cá F0 này được nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ
được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành
chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) và
Keap1a-seq-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) và kiểm tra các dòng cá
được knockout gen keap1a hay không. Kết quả hình 2 cho thấy, có 3 dòng kiểm
tra knocout gen thành công. Dòng 1 (mẫu 2.6 có 9 bp deleted); dòng 2 (mẫu 2.10 9
bp deleted); và dòng 3 (mẫu 2.11 24 bp deleted + 21 bp insert = 3 bp deleted).

Trang 47
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3. Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1. Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công. Dòng 1 (mẫu 3 có
4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.4. cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự

Trang 48
Hình 3.5. Kết quả sau khi giải trình tự

Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở
giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp
PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’- GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và
keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết quả thành công
tạo band hetetoduplex (hình 3) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dòng cá F0 này được nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành
thục sẽ được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng
tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1 (5’-
CCCCCTCAGGATTCGCGT) và Keap1b-seq-r1 (5’-
CGACGTGTGTGTCGAGCG) và kiểm tra các dòng cá được knockout gen
keap1a hay không. Kết quả hình 4 cho thấy, có 2 dòng kiểm tra knocout gen thành
công. Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Các dòng cá F1 này được nuôi lớn và cho sinh sản tạo ra cá F2. Các
dòng cá F2 này đang được nuôi sàn lọc tạo các dòng ổn định phục vụ cho thí
nghiệm

Trang 49
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen
keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6. Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout
gen Nrf2.

Trang 50
Hình 3.7. Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học
Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.8. Cá được chia ra đực, cái rõ ràng

Trang 51
Hình 3.9. Mô tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2
bằng phương pháp CRISPR-Cas9
3.3 Kết luận

Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9
5. Kết luận và kiến nghị

Trang 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bannikov A V., Lavrov A V. (2017) CRISPR/CAS9, the king of genome editing tools.
Mol. Biol. 51:514–525
Benson AM, Hunkeler MJ, Talalay P (1980) Increase of NAD(P)H: quinone reductase by
dietary antioxidants: Possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc
Natl Acad Sci U S A 77:5216–5220. https://doi.org/10.1073/pnas.77.9.5216
Blackwell TK, Steinbaugh MJ, Hourihan JM, et al (2015) SKN-1/Nrf, stress responses,
and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med 88.
https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2015.06.008
Blake DJ, Singh A, Kombairaju P, et al (2010) Deletion of Keap1 in the lung attenuates
acute cigarette smoke-induced oxidative stress and inflammation. Am J Respir Cell Mol
Biol 42:524–536. https://doi.org/10.1165/rcmb.2009-0054OC
Chan K, Lu R, Chang JC, Kan YW (1996) NRF2, a member of the NFE2 family of
transcription factors, is not essential for murine erythropoiesis, growth, and development.
Proc Natl Acad Sci U S A 93:13943–13948. https://doi.org/10.1073/pnas.93.24.13943
Chang N, Sun C, Gao L, et al (2013) Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in
Zebrafish embryos. Cell Res 23:465–472. https://doi.org/10.1038/cr.2013.45
Cleasby A, Yon J, Day PJ, et al (2014) Structure of the BTB domain of Keap1 and its
interaction with the triterpenoid antagonist CDDO. PLoS One 9.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0098896
Cong L, Ran FA, Cox D, et al (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas
systems. Science (80- ) 339:819–823. https://doi.org/10.1126/science.1231143
de Zeeuw D, Akizawa T, Audhya P, et al (2013) Bardoxolone Methyl in Type 2 Diabetes

and Stage 4 Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 369:2492–2503.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa1306033
Debaun JR, Smith JYR, Miller EC, Miller JA (1970) Reactivity in vivo of the carcinogen
N-hydroxy-2-acetylaminofluorene: Increase by sulfate ion. Science (80- ) 167:184–186.
https://doi.org/10.1126/science.167.3915.184
Delmastro-Greenwood M, Freeman BA, Wendell SG (2014) Redox-Dependent Anti-

Inflammatory Signaling Actions of Unsaturated Fatty Acids. Annu Rev Physiol 76:79–
105. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021113-170341
Trang 53
Dinkova-Kostova AT, Fahey JW, Kostov R V., Kensler TW (2017) KEAP1 and done?
Targeting the NRF2 pathway with sulforaphane. Trends Food Sci Technol.
https://doi.org/10.1016/j.tifs.2017.02.002
Eggler AL, Small E, Hannink M, Mesecar AD (2009) Cul3-mediated Nrf2 ubiquitination

and antioxidant response element (ARE) activation are dependent on the partial molar
volume at position 151 of Keap1. Biochem J 422:171–80.
https://doi.org/10.1042/BJ20090471
Egner PA, Chen JG, Zarth AT, et al (2014) Rapid and sustainable detoxication of
airborne pollutants by broccoli sprout beverage: Results of a randomized clinical trial in
China. Cancer Prev Res 7:813–823. https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-14-0103
Endo Y, Muraki K, Fuse Y, Kobayashi M (2020) Evaluation of antioxidant activity of

spice-derived phytochemicals using zebrafish. Int J Mol Sci 21.
https://doi.org/10.3390/ijms21031109
Fourquet S, Guerois R, Biard D, Toledano MB (2010) Activation of NRF2 by Nitrosative

Agents and H 2 O 2 Involves KEAP1 Disulfide Formation. J Biol Chem 285:8463–8471.
https://doi.org/10.1074/jbc.M109.051714
Harper C, Lawrence C (2011) The laboratory zebrafish
Howe K, Clark MD, Torroja CF, et al (2013) The zebrafish reference genome sequence
and its relationship to the human genome. Nature 496:.
https://doi.org/10.1038/nature12111
Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al (2013) Efficient CRISPR/Cas9 genome

editing with low off-target effects in zebrafish. Dev 140:4982–4987.
https://doi.org/10.1242/dev.099085
Huerta C, Jiang X, Trevino I, et al (2016) Characterization of novel small-molecule

NRF2 activators: Structural and biochemical validation of stereospecific KEAP1 binding.
Biochim Biophys Acta - Gen Subj 1860. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2016.07.026
Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a

CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 31:227–229. https://doi.org/10.1038/nbt.2501
Itoh K, Chiba T, Takahashi S, et al (1997) An Nrf2/Small Maf Heterodimer Mediates the

Induction of Phase II Detoxifying Enzyme Genes through Antioxidant Response
Trang 54
Elements. Biochem Biophys Res Commun 236:313–322.

https://doi.org/10.1006/bbrc.1997.6943
Itoh K, Igarashi K, Hayashi N, et al (1995) Cloning and Characterization of a Novel

Erythroid Cell-Derived CNC Family Transcription Factor Heterodimerizing with the
Small Maf Family Proteins
Itoh K, Ishii T, Wakabayashi N, Yamamoto M (1999) Regulatory mechanisms of cellular

response to oxidative stress. Free Radic Res 31:319–324.
https://doi.org/10.1080/10715769900300881
Jao LE, Wente SR, Chen W (2013) Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing
using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A 110:13904–13909.
https://doi.org/10.1073/pnas.1308335110
Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA

endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (80- ) 337:816–821.
https://doi.org/10.1126/science.1225829
Kobayashi M, Itoh K, Suzuki T, et al (2002) Identification of the interactive interface and

phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system. Genes Cells 7:807–20
Kobayashi M, Li L, Iwamoto N, et al (2009) The Antioxidant Defense System Keap1-

Nrf2 Comprises a Multiple Sensing Mechanism for Responding to a Wide Range of
Chemical Compounds. Mol Cell Biol 29:493–502. https://doi.org/10.1128/MCB.01080-
08
Kotani H, Taimatsu K, Ohga R, et al (2015) Efficient Multiple Genome Modifications

Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One
10:e0128319. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128319
Lee Y, Chou T-F, Pittman SK, et al (2017) Keap1/Cullin3 Modulates p62/SQSTM1

Activity via UBA Domain Ubiquitination. Cell Rep 19:188–202.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.03.030
Li D, Qiu Z, Shao Y, et al (2013a) Heritable gene targeting in the mouse and rat using a
CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31:681–683
Li L, Kobayashi M, Kaneko H, et al (2008) Molecular evolution of Keap1: Two Keap1

molecules with distinctive intervening region structures are conserved among fish. J Biol
Chem 283:3248–3255. https://doi.org/10.1074/jbc.M708702200
Trang 55
Li W, Teng F, Li T, Zhou Q (2013b) Simultaneous generation and germline transmission

of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31:684–
686
Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al (2013) RNA-guided human genome engineering via
Cas9. Science (80- ) 339:823–826. https://doi.org/10.1126/science.1232033
McMahon M, Lamont DJ, Beattie KA, Hayes JD (2010) Keap1 perceives stress via three
sensors for the endogenous signaling molecules nitric oxide, zinc, and alkenals. Proc Natl
Acad Sci U S A 107:18838–43. https://doi.org/10.1073/pnas.1007387107
Miller EC (1978) Some Current Perspectives on Chemical Carcinogenesis in Humans

and Experimental Animals: Presidential Address. Cancer Res 38:1479–1496
Nakajima H, Nakajima-Takagi Y, Tsujita T, et al (2011) Tissue-Restricted Expression of

Nrf2 and Its Target Genes in Zebrafish with Gene-Specific Variations in the Induction
Profiles. PLoS One 6:e26884. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026884
Nguyen VT, Bian L, Tamaoki J, et al (2020) Generation and characterization of keap1a-

and keap1b-knockout zebrafish. Redox Biol 36:101667.
https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101667
Okawa H, Motohashi H, Kobayashi A, et al (2006) Hepatocyte-specific deletion of the

keap1 gene activates Nrf2 and confers potent resistance against acute drug toxicity.
Biochem Biophys Res Commun 339:79–88. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.10.185
Ota S, Hisano Y, Ikawa Y, Kawahara A (2014) Multiple genome modifications by the

CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes to Cells 19:555–564.
https://doi.org/10.1111/gtc.12154
Pergola PE, Raskin P, Toto RD, et al (2011) Bardoxolone Methyl and Kidney Function in
CKD with Type 2 Diabetes. N Engl J Med 365:327–336.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa1105351
Pitoniak A, Bohmann D (2015) Mechanisms and functions of Nrf2 signaling in

Drosophila. Free Radic. Biol. Med. 88:302–313
Prestera T, Zhang Y, Spencer SR, et al (1993) The electrophile counterattack response:

Protection against neoplasia and toxicity. Adv Enzyme Regul 33:281–296.
https://doi.org/10.1016/0065-2571(93)90024-8
Trang 56
Reddy NM, Potteti HR, Mariani TJ, et al (2011) Conditional Deletion of Nrf2 in Airway
Epithelium Exacerbates Acute Lung Injury and Impairs the Resolution of Inflammation.
Am J Respir Cell Mol Biol 45:1161–1168. https://doi.org/10.1165/rcmb.2011-0144OC
Saito R, Suzuki T, Hiramoto K, et al (2015) Characterizations of Three Major Cysteine

Sensors of Keap1 in Stress Response. Mol Cell Biol 36:271–284.
https://doi.org/10.1128/MCB.00868-15
Singh K, Connors SL, Macklin EA, et al (2014) Sulforaphane treatment of autism

spectrum disorder (ASD). Proc Natl Acad Sci U S A 111:15550–15555.
https://doi.org/10.1073/pnas.1416940111
Sung YH, Kim JM, Kim HT, et al (2014) Highly efficient gene knockout in mice and
zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Res 24:125–131.
https://doi.org/10.1101/gr.163394.113
Suzuki T, Maher J, Yamamoto M (2011) Select heterozygous Keap1 mutations have a

dominant-negative effect on wild-type Keap1 in vivo. Cancer Res 71:1700–1709.
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-10-2939
Sykiotis GP, Bohmann D (2008) Keap1/Nrf2 Signaling Regulates Oxidative Stress

Tolerance and Lifespan in Drosophila. Dev Cell 14:76–85.
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2007.12.002
Takaya K, Suzuki T, Motohashi H, et al (2012) Validation of the multiple sensor

mechanism of the Keap1-Nrf2 system. Free Radic Biol Med 53:817–827.
https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2012.06.023
Talalay P, De Long MJ, Prochaska HJ (1988) Identification of a common chemical signal

regulating the induction of enzymes that protect against chemical carcinogenesis. Proc
Natl Acad Sci U S A 85:8261–8265. https://doi.org/10.1073/pnas.85.21.8261
Tian W, Rojo de la Vega M, Schmidlin CJ, et al (2018) Kelch-like ECH-associated

protein 1 (KEAP1) differentially regulates nuclear factor erythroid-2–related factors 1
and 2 (NRF1 and NRF2). J Biol Chem 293:2029–2040.
https://doi.org/10.1074/jbc.RA117.000428
Tullet JMA, Green JW, Au C, et al (2017) The SKN-1/Nrf2 transcription factor can
protect against oxidative stress and increase lifespan in C. elegans by distinct
mechanisms. Aging Cell 16:1191–1194. https://doi.org/10.1111/acel.12627
Trang 57
Uruno A, Yagishita Y, Katsuoka F, et al (2016) Nrf2-Mediated Regulation of Skeletal

Muscle Glycogen Metabolism. Mol Cell Biol 36:1655–1672.
https://doi.org/10.1128/MCB.01095-15
Wakabayashi N, Itoh K, Wakabayashi J, et al (2003) Keap1-null mutation leads to

postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation. Nat Genet 35:238–245.
https://doi.org/10.1038/ng1248
Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA (2012) RNA-guided genetic silencing systems

in bacteria and archaea. Nature 482:331–338
Yamamoto M, Kensler TW, Motohashi H (2018) The KEAP1-NRF2 system: A thiol-

based sensor-effector apparatus for maintaining redox homeostasis. Physiol Rev
98:1169–1203. https://doi.org/10.1152/physrev.00023.2017
Yamamoto T, Suzuki T, Kobayashi A, et al (2008) Physiological significance of reactive

cysteine residues of Keap1 in determining Nrf2 activity. Mol Cell Biol 28:2758–70.
https://doi.org/10.1128/MCB.01704-07
Zhang Y, Hou Y, Liu C, et al (2016) Identification of an adaptor protein that facilitates

Nrf2-Keap1 complex formation and modulates antioxidant response. Free Radic Biol
Med 97:. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.05.017.

30.06.2022 Bản thảo báo cáo NCKH của Nguyễn Văn A

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

30.06.2022 Bản thảo báo cáo NCKH của Nguyễn Văn A

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO KHOÁ LUẬN

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT

TP. HỒ CHÍ MINH – 2022

Chương 1 – Tổng quan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO KHOÁ LUẬN

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT

TP. HỒ CHÍ MINH – 2022

Chương 1 – Tổng quan

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 4 năm 2022

Sinh viên thực hiện

LỜI CAM ĐOAN

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn

2.2 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu...........................................................................25

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, LƯU ĐỒ, HÌNH

Danh mục hình

Hình 1.12. Cá ngựa vằn đực và cái................................................................................34

Rank: 1 với trình tự mục tiêu: TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn

Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và

Hình 2.11. Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR............................................................49

Hình 2.12. Bơm mẫu vào các giếng trong gel................................................................51

Hình 2.13. Quá trình chạy điện di..................................................................................52

Hình 2.14. Kết quả sau khi chạy điện di........................................................................53

Hình 2.16. Hoá chất EXP SAPit....................................................................................54

Hình 2.17 Spindown mẫu..............................................................................................55

Hình 2.18. Quá trình ly tâm mẫu...................................................................................56

Hình 2.19. Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô..........................................................57

Hình 2.20. Bỏ vào máy tác dụng nhiệt..........................................................................57

Hình 3.5. Kết quả sau khi giải trình tự...........................................................................62

Hình 3.8. Cá được chia ra đực, cái rõ rang....................................................................64

Danh mục bảng biểu

Bảng 2.2: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu................................................38

Bảng 2.3: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.................................................38

Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)........................................................44

Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR........................................................................48

Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR......................................................................................49

Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel......................................................................50

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Mục đích nghiên cứu

2. Đối tượng nghiên cứu

4. Phương pháp nghiên cứu

5. Các kết quả đạt được của đề tài

6. Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp

- Chương 1 - Tổng quan

- Chương 2 - Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

- Chương 3 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 4 – Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – Tổng quan