QUANG PHỔ UV – VIS

Ultravilolet – Visible Spectrocsopy

Biên soạn: TS.DS Nguyễn Hữu Lạc Thủy

Đại học Y Dược TpHCM
2.2020

1
Ts.NguyenHuu LacThuy 2
 UV Radiation

http://www.epa.gov/sunwise/kids/kids_uvindex.html UV Index
http://www.epa.gov/sunwise/uviscale.html

3
Hấp thụ năng lượng bức xạ của phân tử
Sự hấp thu năng lượng bức xạ của phân tử gây ra:
- Tịnh tiến  Et
- Quay  Er (0,03 – 0,3 Kcal/M)  phổ quay thuần túy
- Dao động nguyên tử/phân tử  Ev (0,3 – 12 Kcal/M)  phổ dao
động và phổ quay - IR.
- Chuyển động điện tử hóa trị quanh phân tử và điện tử quanh hạt
nhân  Ee (>10 – 100 Kcal/M)  Phổ điện từ - UV-Vis.

E = Ee + E v + Er + Et
Ee >> Ev (10 đến 100 lần)
Ev > Er (100 đến 1000 lần)
Et rất nhỏ
4
 MỤC TIÊU HỌC TẬP

1. Phạm vi phổ UV – Vis

2. Các yếu tố tham gia – Các yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng hấp thụ UV-Vis của vật chất

3. Các PP phân tích bằng UV–Vis

4. Cấu hình máy quang phổ UV–Vis

5. Ứng dụng phép đo UV–Vis trong ngành Dược

Ts.NguyenHuu LacThuy 5
 PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ
(UV – Vis; phổ điện tử)

- Vùng phổ UV – Vis: cận UV  cận IR

- Phổ UV – Vis

- Sự chuyển dịch điện tử của các hợp chất hữu cơ

- Nhóm chức mang màu – trợ màu

- Các yếu tố tham gia – ảnh hưởng đến quá trình hấp thụ UV – Vis

- Hệ thống quang phổ UV – Vis

- Ứng dụng phép đo UV – Vis trong ngành Dược (PT- KN)

Ts.NguyenHuu LacThuy 6
 PHỔ UV - VIS
- Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng UV – Vis  chuyển dịch
điện tử từ cơ bản lên kích thích.
- Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thụ theo bước
sóng: Phổ UV - Vis của vật chất trong các điều kiện xác định.

Ts.NguyenHuu LacThuy 7
 PHỔ UV-VIS CỦA DD VITAMIN B12

Ts.NguyenHuu LacThuy 8
Ts.NguyenHuu LacThuy 9
 PHẠM VI PHỔ UV - Vis

töû ngoïai töû ngoïai

tia X vuøng khaû kieán hoàng ngoïai
xa gaàn
0,1 50 200 400 800 nm

C
E = h = h
Ts.NguyenHuu LacThuy  10
 1. PHẠM VI PHỔ UV-Vis

- Vùng tử ngoại chân không (UV xa): 50 – 200 (nm):

- năng lượng lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết/phân tử

- bị hấp thụ mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy/không khí

- bị hấp thụ bởi thạch anh (dùng làm cốc đo)

- Vùng tử ngoại gần (UV gần) : 200 - 375 (nm)

- Vùng khả kiến (Vis): : 375 - 800 (nm)

UV-A (320-400 nm) UV-B (280-320 nm) UV-C (<280 nm)

Ts.NguyenHuu LacThuy 11
Regions of Electromagnetic Spectrum-the “colour” of light

12
 2. SỰ CHUYỂN NĂNG LƯỢNG ĐIỆN TỬ

Ts.NguyenHuu LacThuy 13
 Sự kích thích điện tử từ orbital liên kết  orbital phản liên kết

Chuyển mức năng lượng

Ts.NguyenHuu LacThuy 14
 - Điện tử :
+ liên kết đơn:  → *: E ( < 150 nm: Uv xa)
+ hidrocarbon no: n-hexan, nước
- Điện tử :
+ liên kết đôi, ba; nối đôi liên hợp; hệ thống thơm
+  → *: E < E (  Uv gần)
- Điện tử tự do n (không liên kết):
+ n có ở các dị tố O, S, N, X
+ n *: En < E < E
+ cấu trúc liên hợp:  và n
+ n*, *: En < E < E
Tổng quát: σ  σ * >   * > n  σ *> n  *

Ts.NguyenHuu LacThuy 15
 3. CÁC YẾU TỐ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THỤ, CÁC HIỆU ỨNG

3.1. MÀU SẮC

Màu của 1 chất liên quan với sự hấp thụ và phản xạ của chất đó.

Mắt người nhìn thấy màu bổ trợ cho màu hấp thụ

Màu hấp thụ và màu bổ trợ

Ts.NguyenHuu LacThuy 16
 Observed Color of Approximate
Color of Light Wavelength
Compound Absorbed of Light
Absorbed

Green Red 700 nm

Blue-green Orange-red 600 nm

Violet Yellow 550 nm

Red-violet Yellow-green 530 nm

lycopene, max = 474 nm

O
H
N
Red Green 500 nm
N
H
O
indigo
Orange Blue 450 nm

Ts.NguyenHuu LacThuy Yellow Violet 400 nm 17

 Màu sắc Bước sóng
dãi bức xạ Vis (nm) Ánh
sáng
Tím 380 - 435 trắng
Xanh lơ 435 - 500
Lục lam 500 - 520
Lục 520 - 565
Vàng 565 - 590
Cam 590 - 625
Đỏ 625 - 740
Ts.NguyenHuu LacThuy 18
 Sự hấp thụ ánh sáng, màu sắc dd và phổ hấp thụ Uv-Vis của:

a) Ion CrO42- (cam):

b) Bromophenol blue (xanh lơ):

c) Phenolphtalein (hồng):
Ts.NguyenHuu LacThuy 19
 UV Spectroscopy

lycopene, max = 474 nm

O
H
N

N
H
O
indigo

- λmax for lycopene is at 474 – in the near blue region of the spectrum
– this is absorbed, the compliment is now red.
- λmax for indigo is at 602 – in the orange region of the spectrum –
this is absorbed, the compliment is now indigo.

Ts.NguyenHuu LacThuy 20
 3. CÁC YẾU TỐ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THỤ, CÁC HIỆU ỨNG

3.2. NHÓM MANG MÀU (CHROMOPHORE):

Gây ra sự hấp thụ bức xạ trong vùng Uv – Vis ( > 200 nm)

- CHROMOPHORE chuyển dịch n  * thường có   300 nm

- CHROMOPHORE chuyển dịch   * thường có   190 nm

Ts.NguyenHuu LacThuy 21
Ts.NguyenHuu LacThuy 22
3. CÁC YẾU TỐ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THỤ, CÁC HIỆU ỨNG

3.3. NHÓM TRỢ MÀU (auxochrome)

là những nhóm thế gắn vào chromophore  thay đổi bước sóng lẫn
cường độ của dải hấp thụ cực đại.

Thường làm chuyển dịch max về phía dài hơn.

Ví dụ: -OH, -NH2, -CH3, -Cl, ... (tăng hấp thụ, giảm E cần hấp thụ)

Ts.NguyenHuu LacThuy 23
 3.4. CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

- Sự chuyển dịch sang đỏ (bathocromic)

- Sự chuyển dịch sang xanh (hypsocromic)

- Hiệu ứng tăng cường độ (hypercromic effect)

- Hiệu ứng giảm cường độ (hypocromic effect)

Ts.NguyenHuu LacThuy 24
 Chênh lệch năng lượng (hypsochromic)

Chênh lệch năng lượng (bathochromic)

Ts.NguyenHuu LacThuy 25
 Các hiệu ứng trong phổ UV-Vis

Ts.NguyenHuu LacThuy 26
Ts.NguyenHuu LacThuy 27
 ̣
4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ HẤP THU

4.1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ: (xem bài đại cương quang phổ)

Ts.NguyenHuu LacThuy 28
 4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ HẤP THỤ

4.1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ

4.2. MÔI TRƯỜNG

Một số yếu tố như: Dung môi, Nồng độ pH, Nhiệt độ của mẫu đo,
Tương tác lưỡng cực, Liên kết hydro

4.3 THIẾT BỊ

Định luật Lambert – Beer: tia đơn sắc, các hiện tượng quang học
khác, điều kiện đo UV – Vis

Ts.NguyenHuu LacThuy 29
 4.2. MÔI TRƯỜNG

Một số yếu tố như:

- Dung môi,

- pH,

- Nhiệt độ của mẫu đo,

- Tương tác lưỡng cực

- Liên kết hydro

 ảnh hưởng: vị trí và cường độ dải hấp thụ phân tử

Ts.NguyenHuu LacThuy 30
4.2.1. DUNG MÔI

- Dm có thể hấp thụ bức xạ UV-Vis  Khi khảo sát phải chú thích dm
được dùng để hòa tan mẫu.

- Độ phân cực của dm có thể làm biến đổi môi trường điện tử của
nhóm hấp thụ mang màu.

Ví dụ: độ hấp thụ của aceton thay đổi: 259 – 279 nm

- Để phân tích so sánh, nên sử dụng một dung môi duy nhất cho tất
cả các lần đo.

Ts.NguyenHuu LacThuy 31
 Chênh lệch năng lượng (hypsochromic)

Chênh lệch năng lượng (bathochromic)

Ts.NguyenHuu LacThuy 32
Ts.NguyenHuu LacThuy 33
 Phổ của Phenol/Iso-octane và/Ethanol
Ts.NguyenHuu LacThuy 34
 KHOAÛNG BÖÔÙC SOÙNG HAÁP THUÏÏ CUÛA MOÄT SOÁ DUNG MOÂI

Độ dài sóng Các dung môi hấp thụ

180-195nm Acid sulphuric (96%), nước acetonitril, cyclohexan, isooctan

200-210nm cyclopentan, n-hexan, glycerol, methanol, ethanol

210-220nm n-butyl alcohol, isopropyl alcohol, cyclohexan, ethyl ether,

1,4-dioxan

245-260nm chloroform, ethyl acetat, methyl format

265-275nm carbon tetrachlorid, dimethyl sulphoxid/formamid, acetic acid

280-290nm benzen, toluen, m-xylen

300-400nm pyridine, aceton, carbon disulfit

Ts.NguyenHuu LacThuy 35
 4.2.2. NỒNG ĐỘ
Nồng độ ảnh hưởng đến cường độ của dải hấp thụ
Nồng độ cao: tương tác phân tử (dimer hoá)
 thay đổi về dạng và vị trí của dải hấp thụ.
Nồng độ thấp: khoảng tuyến tính, LOD LOQ

Ts.NguyenHuu LacThuy 36
 4.2.2. NỒNG ĐỘ

Phổ UV – Vis của Benzaldehyd thay đổi theo dung môi và nồng độ

Ts.NguyenHuu LacThuy 37
4.2.3. pH

Các giá trị pH khác nhau thì cấu trúc của vật chất có thể thay đổi
theo pH  cực đại hấp thụ thay đổi theo pH.

Nếu mẫu thử bị ảnh hưởng bởi pH  dùng hệ đệm.

Chú ý: hầu hết các hệ đệm hấp thụ có ý nghĩa và có thể ảnh
hưởng đến độ dài sóng cực đại đối với các phép đo.

 Thực hiện song song mẫu trắng.

Ts.NguyenHuu LacThuy 38
39
 4.2.4. NHIỆT ĐỘ

- sự trương nở đơn giản của dm có thể làm thay đổi độ hấp

thụ biểu kiến và do đó ảnh hưởng đến độ đúng.

- sự cân bằng vật lý hay hoá học: khi nhiệt độ tăng sẽ phá hủy
cấu trúc của acid nucleic.

- nhiệt độ thay đổi: chỉ số khúc xạ của dm thay đổi có ý nghĩa.

Như vậy:
Khi đo phổ, nhiệt độ có ảnh hưởng đến mẫu thì phải sử dụng
cốc đo ổn nhiệt để không làm thay đổi độ hấp thụ biểu kiến.

Ts.NguyenHuu LacThuy 40
 4.2.5 CÁC HIỆN TƯỢNG QUANG HỌC KHÁC:

- tán xạ

- khuếch tán

 dung dịch đo phải trong suốt

Ts.NguyenHuu LacThuy 41
 4.2.6 LIÊN KẾT HYDRO

Dung môi có liên kết hydro tác động lên các điện tử n và
ngược lại dung môi có điện tử n cũng tác động lên phân tử
có liên kết hydro

 n – pi*: mở rộng khoảng cách  hypsochromic

Ts.NguyenHuu LacThuy 42
 4.2.7 TƯƠNG TÁC LƯỠNG CỰC

Dung môi phân cực + phân tử phân cực  tương tác dipole
– dipole:

Khoảng cách pi – pi* ngắn lại  bathochromic

Khoảng cách n – pi* dài ra  hypsochromic

 dung dịch đo phải trong suốt

Ts.NguyenHuu LacThuy 43
 4.3 THIẾT BỊ

- Định luật Lambert – Beer: tia sáng đơn sắc

- Detector: giảm tín hiệu theo thời gian (tế bào quang điện,
ống nhân quang hết tuổi thọ, bộ khuếch đại yếu).

 Mở rộng khe để tăng cường độ chùm tia tới  giảm độ

đơn sắc của bức xạ.

Ts.NguyenHuu LacThuy 44
ĐIỀU KIỆN ĐO UV – VIS:

Thiết bị: tia đơn sắc

Mẫu: bền Uv – Vis

Nồng độ đo: tuyến tính

Dung dịch: trong suốt

Ts.NguyenHuu LacThuy 45
 5. MÁY QUANG PHỔ TỬ NGOẠI – KHẢ KIẾN

1: đèn nguồn 2: cách tử hay lăng kính

3: cốc chứa dung dịch đo 4: Bộ phận phát hiện;
5+ 6: bộ phận khuếch đại va máy ghi tín hiệu
Ts.NguyenHuu LacThuy 46
5.1.1 ĐÈN NGUỒN

- Deuterium: UV
- Half – life: 1.000 giờ

- Tungsten: Vis
- Half – life: 10.000 giờ

Ts.NguyenHuu LacThuy 47
5.1.2. LĂNG KÍNH, CÁCH TỬ

Ts.NguyenHuu LacThuy 48
http://physics.unl.edu/history/histinstr/spectra.html
5.1.3. CỐC ĐO
Cốc đo có thể làm bằng thạch anh, plastic hay thủy tinh
Thạch anh: 200 - 700 nm
Thủy tinh và plastic: 400 – 800 nm

Ts.NguyenHuu LacThuy 49
5.1.4. DETECTOR

Detector ống nhân quang - Photomultiplier Tube (PMT)

http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/uvvisab3.htm

Ts.NguyenHuu LacThuy 50
 Detector dải diode quang
Photodiode Array Detectors (PDA)

http://www.ant7.com/forum/forum_
Ts.NguyenHuu LacThuy 51
posts.asp?TID=8066&PN=1 http://news.thomasnet.com/images/large/542/542148.jpg
 QUANG PHỔ KẾ UV -VIS

Ts.NguyenHuu LacThuy 52
Sơ đồ khối của máy đo quang phổ
Spectrometer

Light Source Monochromator

(filter,
wavelength selector)
Detector
Sample

Data Processing
Ts.NguyenHuu LacThuy 53
Ts.NguyenHuu LacThuy 54
 ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ UV -VIS
Phổ Uv – vis có vai trò quan trọng trong công tác KN.
Phép đo phổ Uv – vis phổ biến ở các phòng thí nghiệm.
- Chất rắn: ít được đo.
- Chất lỏng: cốc đo bằng silica, thủy tinh hay plastic
- Chất khí: cốc đo tương tự như cốc đo chứa chất lỏng nhưng
được dán lại hay nút kín lại, không để thoát khí ra ngoài.

Ts.NguyenHuu LacThuy 55
 PHỔ UV-VIS
- Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng
tử ngoại gần (200 – 400 nm) và khả kiến (400 – 800 nm)
của các chất gây ra sự chuyển dịch của các điện tử từ trạng
thái cơ bản sang trạng thái kích thích.
- Biểu đồ biển diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thu
theo bước sóng của một chất được gọi là phổ Uv – Vis của
chất khảo sát trong điều kiện xác định.

Ts.NguyenHuu LacThuy 56
6.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
Thí dụ: benzen/ethanol hoặc cyclohexan,
sulfur carbon trong carbon tetraclorid
ethynodiol diacetate/17 ethinylestra -3,5,diene

Ts.NguyenHuu LacThuy 57
6.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BẰNG PHỔ UV - VIS

- Qui luật Woodward có thể dẫn đến nhiều chỉ dẫn hữu ích
trong việc xác định cấu trúc. Cho kết quả tốt nếu hợp chất
khảo sát cho dải phổ hẹp hay khi sử dụng bộ phận phát hiện
đa kênh.

- Thường kém chính xác và ít được sử dụng.

Ts.NguyenHuu LacThuy 58
6.3. ĐỊNH TÍNH
Phổ hấp thụ của một chất là đường biểu diễn độ hấp thụ của
chất đó theo bước sóng của ánh sáng chiếu tới.
A = f ()

CỰC ĐẠI HẤP THỤ: bước sóng cho

độ hấp thụ lớn nhất λmax.
- Phổ UV -Vis cung cấp thông tin ít
hơn phổ IR.
- Sự hấp thụ của các chất hữu cơ là
do sự có mặt của các nối .

Ts.NguyenHuu LacThuy 59
6.3.1. Định tính trong trường hợp có chất chuẩn

So sánh phổ của mẫu khảo sát với phổ của mẫu chuẩn:

- Cùng nồng độ hai phổ phải cho  max và  max phù hợp nhau

Ts.NguyenHuu LacThuy 60
6.3.2. Định tính trong trường hợp không có chất chuẩn

- So sánh max,  max của phổ điện tử của chất khảo sát với
phổ điện tử có trong tài liệu về phổ.

Phổ UV của B12

Thí dụ:
Vitamin B12 có 3 cực đại ở 278  1; 361  1 và 548  2 nm.
Vitamin B12 có A 11 = 207 ở 361 nm
 max và  là 2 hằng số phổ Uv - Vis đặc trưng riêng.
Phải thực hiện đúng theo các điều kiện đã ghi/tài liệu về
dung môi, nồng độ, loại máy.
Ts.NguyenHuu LacThuy 61
6.4. Định lượng
6.4.1 Định lượng trực tiếp
6.4.1.1.Định lượng chất khảo sát có một thành phần
a. Phương pháp đo tuyệt đối
(không sử dụng trực tiếp chất chuẩn - máy phải được chuẩn hóa)

A(hoaëcD)
Cx% =
E11%cm

Holmium Oxide Colored Glass Transmittance Standards

Filters Filter Sets — Mid-Infrared
Ts.NguyenHuu LacThuy http://www.aviantechnologies.com/products/standards/transmit.php
62
- Định lượng dung dịch B12
Cân chính xác 0,002g chế phẩm, cho vào một bình định mức
50ml, thêm nước tới vạch, lắc đều cho tan (40 µg/ml).
Độ hấp thu A = 0,787 λmax 361nm cốc đo l = 1 cm.
Hãy xác định nồng độ của dd B12.
Biết E1cm
%
= 207 tại 361 nm.

A  (ñoä pha loaõng) A  50


E11cm
%
 (löôïng ñöôïc caân) 207  a

0,787  50
C%   1%  95%
207  0,002

Ts.NguyenHuu LacThuy 63
b. Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ mol 
- Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc rồi đo độ hấp
thụ Ac trên máy tại bước sóng của đỉnh có độ hấp thụ cao nhất
trong các đỉnh cực đại với cốc đo dày 1 cm.
Từ định luật Lambert - Beer, tính   Ct (mol/lit).

Ac Ac (l = 1 cm).
Ac= .Cc. l   = 
Cc  l Cc

At At
Ct = 
ε l ε
Ts.NguyenHuu LacThuy 64
c. Phương pháp so sánh độ hấp thụ (có chất chuẩn)
- Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc.
- Pha dung dịch mẫu thử có nồng độ Ct, trong cùng dung môi.

At Ct At
  Ct  Cc
Ac Cc Ac

Chú ý: Trong thực nghiệm, Ct và Cc càng gần nhau kết quả càng chính xác.

Ts.NguyenHuu LacThuy 65
Ts.NguyenHuu LacThuy 66
d. Phương pháp sử dụng đường tuyến tính
(xây dựng đường cong chuẩn độ)
- Pha các dd mẫu chuẩn C1, C2, C3,C4,… Cn
- Lần lượt xác định A1, A2, A3, A4... An ở λmax
- Xác định y = ax + b với R2 = 0,995
- Đo Ax của dd cần khảo sát rồi căn cứ vào đồ thị tìm Cx
(Cx phải nằm trong khoảng C1 – Cn khảo sát)

Ts.NguyenHuu LacThuy 67
Ts.NguyenHuu LacThuy 68
Ts.NguyenHuu LacThuy 69
6.4.1.2. Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần

a: Sự chồng phổ: ở một bước sóng xác định, độ hấp thụ của
nhiều hợp chất có mặt trong một hỗn hợp bằng tổng độ hấp
thụ của mỗi thành phần.

Ts.NguyenHuu LacThuy 70
b. Phương pháp sử dụng luật cộng tính mật độ quang
Điều kiện: max cách nhau  10 nm.

Pp này chỉ áp dụng được cho các hỗn hợp 2 - 3 thành phần
Ts.NguyenHuu LacThuy 71
Ts.NguyenHuu LacThuy 72
6.4.1.2. Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần
Tiến hành:
- Quét phổ UV-Vis riêng rẽ của 2 chất chuẩn X và Y.
- Chọn 2 cực đại max1 và max2 của 2 chất chuẩn X và Y.
- Đo riêng A từng chất
- Đo A của dd hỗn hợp ở các  max1 và  max2 của các thành
phần với cốc đo dày 1cm
ε 1x ,ε 1y ε 2x ,ε 2y

1 1
A1 = ε x  X  l  ε y  Y  l
2 2
A2 = ε x  X  l  ε y  Y  l

ε 1x ,ε 1y :hệ số tắt mol của X và Y ở 1,

ε 2x ,ε 2y : hệ số tắt mol của X và Y ở 2 (các hệ số này được xác định trước khi đo riêng biệt dung
dịch của các thành phần nguyên chất).
X và LacThuy
Ts.NguyenHuu Y là 2 ẩn số. Giải 2 phương trình 2 ẩn số. 73
6.4.2. Chiết đo quang = Tạo dẫn chất hấp thụ

Thêm một thuốc thử hữu cơ vào chất khảo sát không có tính
hấp thụ (hoặc hấp thụ yếu) để tạo thành phức chất có tính hấp
thụ mạnh hơn chất ban đầu rồi sau đó chiết sang môi trường
khác và đo trực tiếp.

Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và tăng tính chọn lọc một cách
có ý nghĩa.

Thí dụ 1:
Sử dụng Dimethylglyoxime tạo
dẫn chất với Ni3+ có màu hấp
thụ mạnh tách ra khỏi hỗn hợp

Ts.NguyenHuu LacThuy 74
6.5. CÁC ỨNG DỤNG KHÁC

6.5.1. Nghiên cứu động học phản ứng

Cơ sở lý thuyết: Xét một phản ứng hoá học:
A + B  C + D
Tốc độ của phản ứng này có thể đo được bằng 2 cách:
- đo sự giảm độ hấp thụ tại 1 do các chất phản ứng A hay B
- đo sự gia tăng độ hấp thụ tại 2 do các sản phẩm C hay D
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để định lượng enzym
đã xúc tác.

Ts.NguyenHuu LacThuy 75
 6.5. CÁC ỨNG DỤNG KHÁC

6.5.1. Nghiên cứu động học phản ứng

Tdụ: định lượng -chymotrypsin (cơ chất) bằng cách cho n-

acetyl tyrosin ethyl ester (enzym) vào ddịch -chymotrypsin, đo
độ giảm hấp thụ của ddịch trên ở 237 nm theo thời gian.

Ts.NguyenHuu LacThuy 76
6.5.2. Xác định hằng số pKa
Phổ UV-Vis của các chất hữu cơ chứa các nhóm chức có tính acid
hay base thường thay đổi theo pH của môi trường.
Dạng và cường độ của đường cong hấp thụ thay đổi theo [H+]
Thí du: HA: acid/nước bị phân ly HA + H2O  H3O+ + A-
A-: base liên hợp. Với dd acid loãng HA, ta có:

[ H  ][ A  ] pKa = pH + [base]
Ka  lg Henderson - Hasselbalch
[HA ] [acid]
- Giá trị pH đo bằng máy đo pH.
- Giá trị của tỷ số đo được bằng máy đo quang phổ. Từ đó tính được pKa
Giải thích: +/mt acid sẽ đo được giá trị hấp thụ̣ cực đại của dạng HA
+/mt kiềm sẽ đo được giá trị hấp thụ̣ cực đại của dạng A-
+/mt trung gian đo được giá trị hấp thụ̣ cực đại của cả HA và A-
Độ hấp thụ đo được sẽ là sự tổ hợp tuyến tính của 2 dạng đó.

Ts.NguyenHuu LacThuy 77
Thí dụ:
Xác định pKa của đỏ methyl bằng cách khảo sát đường cong hấp thụ của đỏ
methyl) ở các môi trường: HCl 0,1N, NaOH 0,1N, đệm acetic, acetat
[HA ]
(CH3COONa 0,1M, CH3COOH 0,35M) [A  ]
pKa của đỏ methyl: pKa = pH đệm + lg
N NH N NH N NH
- -
COOH COO COO

pK1 # 2.5 pK2 # 5.1

NMe 2 NMe2 NMe2

H2In+ HIn (ñoû) In- (vaøng)

Ts.NguyenHuu LacThuy 78
6.5.3. Xác định khối lượng phân tử
Nguyên tử lượng của các hợp chất có thể đo bằng quang phổ.
Chuẩn bị các dẫn chất thích hợp của các hợp chất này
Ex: nếu muốn xác định MW của một amin thì chuyển thành
dạng muối amine picrate
Kế đó, cân một lượng amin picrate hòa vào 1 lít dung dịch và
đo độ hấp thu tại λmax 380 nm. Sau đó, tính nồng độ của dung
dịch bằng mg/ lít theo công thức

“C” được tính theo phương trình trên, khối lượng “W” của
amine picrate đã biết. Từ “c” và “w”, tính MW của amine
picrate. MW của muối picrate được tính bằng cách dùng MW
của amine picrate.

Ts.NguyenHuu LacThuy 79
6.5.4. Bộ phận phát hiện của hệ thống HPLC

Máy UV-Vis được sử dụng như đầu dò cho HPLC.

Purification and characterization of rat testicular glutathione S-

transferases: role in the synthesis of eicosanoids

Ts.NguyenHuu LacThuy 80
7. Kết luận
- Chính xác
- Nhạy
- Đúng
 - HPT – KN: Định tính (chồng phổ - max1)
Định lượng (Absortion – ĐL Lambert-Beer)
- Hóa sinh; Hóa dược; Hóa hợp chất tự nhiên …

Ts.NguyenHuu LacThuy 81