TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

KHOA NÔNG NGHIỆP – THỦY SẢN

ISO 9001 : 2015

TIỂU LUẬN
QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN GIỐNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ
THẢO (Cordyceps militaris)

Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Ngọc Trai

Sinh viên thực hiện: Bùi Đăng Khoa
Mã số sinh viên: 117719002
Lớp: DA19CNSH

Trà Vinh, tháng 07 năm 2022

1
 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH
KHOA NÔNG NGHIỆP – THỦY SẢN

ISO 9001 : 2015

TIỂU LUẬN
QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN GIỐNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ
THẢO (Cordyceps militaris)

Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Ngọc Trai

Sinh viên thực hiện: Bùi Đăng Khoa
Mã số sinh viên: 117719002
Lớp: DA19CNSH

Trà Vinh, tháng 07 năm 2022

2
 MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................ 3

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... 8
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................... 9
I. Tổng quan về nấm đông trùng hạ thảo ............................................................... 9
1.1 Tên gọi .......................................................................................................... 9
1.2 Nguồn gốc hình thành: ................................................................................. 9
1.3 Đặc điểm và phân loại .................................................................................. 9
1.4 Thành phần ................................................................................................. 10
1.5 Tác dụng dược lý của đông trùng hạ thảo theo y học hiện đại: ................. 12
1.5.1 Chống oxy hóa: ....................................................................................... 12
1.5.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư:............................................................. 12
1.5.3 Tác dụng chống mệt mỏi và stress: ......................................................... 12
1.5.4 Tác dụng trên hệ hô hấp: ........................................................................ 12
1.5.6 Tác dụng chống sợi hoá phổi: ................................................................. 12
1.6 Ứng dụng đông trùng hạ thảo trong lâm sàng:........................................... 13
II. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước:........................................... 13
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước: ............................................................. 13
2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước: ............................................................ 14
2.2.1 Cordyceps sinensis: ................................................................................. 14
2.2.2 Cordyceps militaris ................................................................................. 16
2.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Cordyceps militaris ............................... 16
a. Phân loại và mô tả nấm Cordyceps militaris ............................................... 16
b. Chu trı̀nh sống của nấm Cordyceps militaris .............................................. 19
c. Ký chủ ........................................................................................................... 19
2.2.2.2 Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris ........................................... 21
b. Các thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris:.............................. 22
2.3 Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps militaris: ..................................... 24
2.3.1 Nguồn dinh dưỡng ................................................................................... 24
2.3.2 Thời gian hình thành quả thể và năng suất Quả thể ............................... 24

3
 2.3.3 Yêu tố môi trường tác động đến việc nuôi cấy: ...................................... 25
a. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình nuôi trồng nấm: ........ 25
b. Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi nấm:............................ 26
c. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy: ........................................... 26
2.3. Các nghiên cứu Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam: ..................................... 28
CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS
MILITARIS) Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM................................... 29
I. Mục đích ........................................................................................................... 29
II. Xây dựng quy trình nuôi cấy:.......................................................................... 30
2.1 Thời gian bắt đầu hình thành quả thể: ........................................................ 30
2.2 Đặc điểm hình thành quả thể của C. militaris ............................................ 30
2.3 Năng suất quả thể nuôi cấy: ....................................................................... 32
III. Đánh giá chất lượng Đông trùng hạ thảo....................................................... 33
3.1 Hàm lượng các nucleoside chỉ thị trong quả thể và sợi nấm phát triển trên
giá thể: .............................................................................................................. 33
3.1.1 Hàm lượng adenosine trong sản phẩm: .................................................. 33
3.1.3 Hàm lượng Guanosine trong mẫu sản phẩm: ......................................... 35
3.2 Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số và tro tổng số: ............................... 36
3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa: ........................................................................... 36
PHẦN 2: QUY TRÌNH THỰC HÀNH NUÔI CẤY NẤM CORDYCEPS
MILITARIS ............................................................................................................ 38
CHƯƠNG 1: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHÂN LẬP NẤM CORDYCEPS
MILITARIS ............................................................................................................ 38
I. Dụng cụ, thiết bị: .............................................................................................. 38
1. Dụng cụ: ....................................................................................................... 38
2. Thiết bị: ........................................................................................................ 38
II. Nguyên vật liệu và hóa chất: ........................................................................... 39
1. Nguyên vật liệu: ........................................................................................... 39
2. Hóa chất:....................................................................................................... 39
III. Cách tiến hành ............................................................................................... 39
1. Chuẩn bị môi trường phân lập:..................................................................... 39
2. Sơ đồ quy trình kỹ thuật: .............................................................................. 40
3. Pha môi trường phân lập: ............................................................................ 40
4. Phân lập Nấm Đông trùng hạ thảo: .............................................................. 41
4
 a. Sơ đồ quy trình kỹ thuật: .............................................................................. 41
b. Các bước thực hiện ...................................................................................... 41
CHƯƠNG 2: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY LỎNG (LẮC) NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS
MILITARIS) ........................................................................................................... 42
I. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất: ........................................................................... 42
1. Dụng cụ: ....................................................................................................... 42
2. Thiết bị: ........................................................................................................ 42
II. Nguyên vật liệu và hóa chất ............................................................................ 42
1. Nguyên vật liệu: ........................................................................................... 42
2. Hóa chất:....................................................................................................... 43
III. Cách tiến hành: .............................................................................................. 43
1. Chuẩn bị môi trường giống lắc: ................................................................... 43
2. Tiến hành pha môi trường ............................................................................ 43
3. Tiến hành pha 2 lít môi trường ..................................................................... 44
4. Cách tiến hành tạo môi trường giống lắc: .................................................... 44
a. Sơ đồ mô tả:.................................................................................................. 44
b. Các bước thực hiện: ..................................................................................... 44
CHƯƠNG 3: QUI TRÌNH NUÔI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
(CORDYCEPS MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ GẠO LỨC............................... 46
I. Dụng cụ, thiết bị: .............................................................................................. 46
1. Dụng cụ: ....................................................................................................... 46
2. Thiết bị.......................................................................................................... 46
II. Nguyên vật liệu và hóa chất ............................................................................ 46
1. Nguyên vật liệu ............................................................................................ 46
2. Hóa chất ........................................................................................................ 46
III. Cách tiến hành: .............................................................................................. 46
1. Chuẩn bị môi trường dịch thể: ..................................................................... 46
2. Tiến hành pha môi trường cho 10 lít nước. .................................................. 47
a. Pha môi trường: ........................................................................................... 47
b. Tiến hành chủng giống:................................................................................ 48
PHẦN 3: KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO.................................................................................. 49
I. KẾT QUẢ NUÔI CẤY GIỐNG GỐC:............................................................ 49
5
 II. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH TẠO GIỐNG LẮC....................................... 49
III. KẾT QUẢ NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TRÊN MÔI TRƯỜNG
GẠO LỨC ............................................................................................................ 50
PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 52

6
 PHỤ LỤC BẢNG

Bảng 1: Các hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ Cordyceps sp ........................ 11
Bảng 2: Một số ký chủ thuộc các phân lớp khác của nấm Cordyceps militaris ................ 20
Bảng 3: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris ..................................................... 23
Bảng 4: Đặc điểm hình thái của quả thể nấm C. militaris trên các cơ chất ở điều kiện không
chiếu sáng .......................................................................................................................... 31
Bảng 5: Đặc điểm hình thái của quả thể nấm C. militaris trên các cơ chất ở điều kiện có
chiếu sáng .......................................................................................................................... 32
Bảng 6: Hàm lượng adenosine có trong quả thể và hệ sợi nấm ........................................ 34
Bảng 7: Hàm lượng cordycepin trong quả thể và hệ sợi nấm ........................................... 34
Bảng 8: Hàm lượng guanosine có trong quả thể và hệ sợi nấm ........................................ 35
Bảng 9: Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số và tro tổng số của nấm C. militaris ........ 36
Bảng 10: Khảo sát Trọng lượng, chiều dài sợ nấm và số lượng sợi nấm.......................... 50

7
 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Hình thái nấm Cordyceps sinensis ......................................................................... 9

Hình 2: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (shashidhar và ctv, 2013) .............................. 14
Hình 3: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (Holliday và Cleaver, 2004) ......................... 14
Hình 4: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại
Tibet ................................................................................................................................... 15
Hình 5: Các đoạn kẽm hây dây điện được chêm vào giữa thân nấm Cordyceps để tăng trọng
lượng .................................................................................................................................. 16
Hình 6: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử ....................... 17
Hình 7: Cordyceps militaris (www.jscr.jp) ....................................................................... 18
Hình 8: Các loài đông trùng hạ thảo .................................................................................. 18
Hình 9: Sự đa dạng về hình thái C. militaris ..................................................................... 18
Hình10: Các dạng bào tử của nấm Cordyceps militaris .................................................... 20
Hình 11: Cordyceps militaris nuôi trồng trên các điều kiện khác nhau ............................ 25
Hình 12: Thời gian bắt đầu hình thành quả thể của nấm C. militaris ............................... 30
Hình 13: Hình thái quả thể nấm C. militaris ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau ......... 31
Hình 14: Năng suất quả thể nấm C. militaris trên các loại cơ chất khác nhau .................. 32
Hình 15: Khả năng kháng oxi hóa của các mẫu dịch chiết ............................................... 37
Hình 16: Các thiết dụng cụ sử dụng trong phân lập .......................................................... 38
Hình 17: Các thiết bị được sử dụng phân lập .................................................................... 39
Hình 18: Các hóa chất được sử dụng cho phân lập ........................................................... 39
Hình 19: Các thao tác thực hiện pha môi trường phân lập ................................................ 40
Hình 20: Các bước tiến hành phân lập .............................................................................. 41
Hình 21: Các thiết bị sử dụng pha chế môi trường lỏng ................................................... 42
Hình 22: Các hóa chất sử dụng pha chế môi trường lỏng ................................................. 43
Hình 23: Các bước thực hiện pha chế môi trường lỏng .................................................... 43
Hình 24: Các bước thực hiện tạo giống lắc ....................................................................... 44
Hình 25: Các bước pha môi trường dịch thể ..................................................................... 47
Hình 26: Các bước tạo môi trường gạo lức ....................................................................... 48
Hình 27: Các bước tiến hành chủng giống ........................................................................ 48
Hình 28: Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 3 ngày phân lập .................... 49
Hình 29: Giống lắc sau 7 ngày được lắc trên máy ............................................................ 49
Hình 30: Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 60 ngày được nuôi cấy trên môi
trường gạo lức .................................................................................................................... 50

8
 PHẦN 1: MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
I. Tổng quan về nấm đông trùng hạ thảo
1.1 Tên gọi
Đông trùng hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), còn gọi là trùng thảo, hạ thảo
đông trùng hay đông trùng thảo, là một loại đông dược quý có bản chất là dạng ký
sinh của loài nấm Cordyceps sinensic (thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thể sâu
Hepialus fabricius. Phần dược tính của đông trủng hạ thảo đã được chứng minh là
do các chất chiết xuất từ nấm Cordyceps sinensic. Tên gọi "đông trùng hạ thảo" là
xuất phát từ quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Cordyceps sinensic mọc chồi
từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. (Nguyễn Thị Liên Thương và ctv 2014).
1.2 Nguồn gốc hình thành:
Vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn trùng), còn đến mùa
hè thì chúng trông giống một loài thực vật (thảo mộc) hơn. Riêng tên “Đông trùng
hạ thảo” được ghi chép là vị thuốc xuất hiện lần đầu tiên trong cuốn “Bản thảo cương
mục” vào đời nhà Minh của danh y Lý thời Trân (năm 1575), Đông Trùng Hạ Thảo
được xếp ngang với nhân sâm về công năng chữa bệnh – thuộc vào loại toàn diện
nhất. (Nguyễn Thị Liên Thương và ctv 2014).
Chu trình sống của Cordyceps:
 Cordyceps thuộc họ nấm, nó ký sinh trên thân của côn trùng. Mùa Đông, nấm ký
sinh vào côn trùng, phát triển thành hệ sợi nấm (đây là giai đoạn vô tính), sử dụng
nguồn dinh dưỡng từ cơ thể côn trùng và giết chết côn trùng.
 Mùa hạ, sợi nấm vô tính chuyển sang giai đoạn hữu tính, hình thành cây nấm là
cơ quan chứa bào tử vô tính và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào
thân sâu.

Hình 1: Hình thái nấm Cordyceps sinensis

1.3 Đặc điểm và phân loại
Chi nấm Cordyceps có tới hơn 600 loài khác nhau. Tuy nhiên cho đến nay
người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài Cordyceps sinensis (Berk.)
9
Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link. Từ năm 1964, chỉ có loại Cordyceps
sinensis được coi là dược liệu có trong dược điển C. sinensis. Đông trùng hạ thảo
khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc
lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng
giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà
thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 -
0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn
khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có
tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc
ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong
căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có
màu trắng ngà.
1.4 Thành phần
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của đông trùng hạ
thảo có 17 đến 19 loại acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên
tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nhất là phospho).
Quan trọng hơn là trong sinh khối đông trùng hạ thảo có nhiều chất -6- hoạt động
sinh học mà các nhà khoa học đang khám phá dần, nhờ tiến bộ của ngành hoá học
các hợp chất tự nhiên.
Nhiều hoạt chất trong đông trùng hạ thảo có giá trị dược liệu thần kỳ. Trong
đó phải kể đến là cordiceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl- adenosine.
Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl - Adenosine-
Analogs).
Đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều loại vitamin (trong 100g đông trùng hạ
thảo có 0,12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn
có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K...), ngoài ra còn có khoảng 25 - 30
% protein, 8% chất béo và đường mannitol.
Theo Holiday và Cleaver (2004), đông trùng hạ thảo đã được sử dụng như
một loại “thần dược” từ những năm 620 sau CN, vào thời nhà Đường ở Trung Quốc
(618-907).
Năm 1994, Trung Quốc đã chính thức xếp loại đông trùng hạ thảo như một
dược phẩm. Sau đó, đông trùng hạ thảo được sử dụng rất nhiều khi dịch SARS xuất
hiện ở Trung Quốc vào năm 2003. Gần đây, đông trùng hạ thảo được chứng minh
có tác dụng trong điều trị các bệnh về tim mạch, hô hấp, gan, thận, ức chế sự hình
thành khối u, …(Chen et al., 2006; Kuo, Sua, Yang, Huang, & Chen, 2006; Wang
& Shiao, 2000).

10
Bảng 1: Các hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ Cordyceps sp

S.no Bioactive compounds References

1. Cordycepin Cunningham et al. (1950)

2. Cordycepic acid Chatterjee et al. (1957)

3. Chatterjee et al. (1957) Chatterjee et al. (1957)

4. Chatterjee et al. (1957) Chatterjee et al. (1957)

5. Ergosterol and ergosteryl esters Yuan et al. (2007)

6. Yuan et al. (2007) Isaka et al. (2001)

7. Hypoxanthine Hypoxanthine

8. Acid deoxyribonuclease Ye et al. (2004)

9. Polysaccharide and Yu et al. (2007, 2009), Xiao et

exopolysaccharide al. (2010), Yan et al. (2010)

10. Chitinase Chitinase

11. Macrolides (C10H14O4) Rukachaisirikul et al. (2004)

12. Rukachaisirikul et al. (2004) Krasnoff et al. (2005)

13. Superoxide dismutase Wanga et al. (2005)

14. Protease Protease

15. Naphthaquinone Unagul et al. (2005)

16. Cordyheptapeptide Rukachaisirikul et al. (2006)

17. Rukachaisirikul et al. (2006) Rukachaisirikul et al. (2006)

18. Fibrynolytical enzyme Kim et al. (2006)

19. Lectin Jung et al. (2007)

20. Cordymin Cordymin

11
1.5 Tác dụng dược lý của đông trùng hạ thảo theo y học hiện đại:
1.5.1 Chống oxy hóa:
Trên thực nghiệm: dịch chiết bằng nước và rượu, cả cordyceps tự nhiên và nuôi cấy
cho thấy tác dụng chống oxy hoá:
 Ức chế khả năng oxy hoá acid linoleic.
 Khử hoạt tính của chất 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DDPH), hydrogen
peroxide, gốc tự do hydroxyl, anion superoxide, hoạt tính bắt giữ kim loại.
 Poly phenolic và flavonoid có trong Cordyceps là chất anti oxidants.
1.5.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư:
Nghiên cứu trên các loại tế bào ung thư khác nhau như: hạch, gan, đại tràng,
tuyến tiền liệt, và vú, cho thấy dịch chiết rượu từ cordyceps có tác dụng chống tăng
sinh của các loại tế bào ung thư này. Một nghiên cứu khác cho thấy cordyceps ức
chế tăng sinh tế bào ung thư đại tràng qua con đường ức chế sự thoái giáng của chất
I-kappa B-alpha trong tế bào và ức chế hoạt tính của NF-Kappa B.
1.5.3 Tác dụng chống mệt mỏi và stress:
Dịch chiết bằng nước nóng của Cordyceps sinensis có tác dụng chống mệt
mỏi và stress trên chuột ICR và chuột Sprague-Dawly.
1.5.4 Tác dụng trên hệ hô hấp:
Dịch chiết bằng cồn cho kết quả:
 Ức chế sự tăng sinh những tế bào BALF (Bronchoalveolar lavage fluids) được
hoạt hóa bởi lipopolysaccharide (LPS),
 Ức chế sự sản xuất IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10 và INF – alpha trên BALF.
1.5.5 Tác dụng chống sợi hoá gan:
Trên mô hình chuột Sprague –Dawly, gây sợi hóa gan bằng Dimethyl nitrosamine,
cho uống Cordyceps sinensis, kết quả cho thấy giảm đáng kể sợi hóa ở gan, bởi nó
thúc đẩy sự thoái giáng chất collagen như Hydroxyproline, ức chế metalloproteinase
– 2 ở mô, collagen loại IV và loại I.
1.5.6 Tác dụng chống sợi hoá phổi:
Nghiên cứu được thực hiện trên người bệnh SARS đã phục hồi, chia 2 nhóm:
- Nhóm thử: 16 người (4 nam và 12 nữ); tuổi trung bình 34,3 tuổi; cho uống 3 gr
Cordyceps mỗi ngày.
- Nhóm chứng: 15 người, được chăm sóc bằng y học hiện đại.
- Kết quả đánh giá bằng chụp CT scanner phổi, xét nghiệm Serum soluble Interleukin
– 2 Receptor (SIL – 2R): nhóm thử thuốc cải thiện tốt trên CTscanner và giảm nồng
độ SIL – 2R, trong khi nhóm chứng không có được kết quả này.
1.5.7 Tác dụng kích thích hệ miễn dịch:

12
Tính chất điều hòa hệ miễn dịch của polysaccharides từ cordyceps sinensis đã được
khảo qua xét nghiệm máu ngoại vi. Kết quả: dịch chiết có khả năng gây sản xuất yếu
tố hoại tử bướu alpha (TNF-alpha), Interleukin (IL) -6, và IL-10.
1.6 Ứng dụng đông trùng hạ thảo trong lâm sàng:
Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị ho, viêm phế quản mạn tính, bệnh
ở thận, tiểu đêm, suy nhược sinh dục nam, thiếu máu, tăng cholesterol, rối loạn chức
năng gan, mệt mỏi, ù tai, sụt cân…
Tăng chức năng hệ miễn dịch, tăng lực cho vận động viên, chống lão hoá sớm,
cải thiện chức năng gan với người viêm gan siêu vi B.

Một số người dùng đông trùng hạ thảo như một “adaptogen” để tăng thể lực
và chống mệt mỏi. Trên hệ tim mạch: đông trùng hạ thảo tốt cho hoạt động của tim
và mạch máu, điều hoà nhịp tim, hạ cholesterol máu, ức chế kết tụ tiểu cầu, có tác
dụng chống viêm, cải thiện tuần hoàn bàng hệ.
Myriocin và thermozymocidin (1 acid amin không điển hình) ức chế hữu hiệu
serine palmitoyltransferase, chất hình thành trong giai đoạn đầu của sự sinh tổng hợp
sphingosin (Zhao. et al., 2013)
Myriocin có tác dụng ức chế miễn dịch (immunosuppressant) gấp 10-100 lần
cyclosporine.
II. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước:
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước:
Các báo cáo khoa học về Cordyceps tại Việt Nam còn rất ít và còn khá sơ khai
so với khối lượng nghiên cứu đồ sộ trên thế giới.
Nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm C. militaris trong các
môi trường nuôi cấy cơ bản được thực hiện bởi Phạm Quang Thu và ctv. (2012).
Nhóm tác giả Trương Bình Nguyên, Đinh Minh Hiệp, Lê Huyền Ái Thúy và
ctv, (2010) tập trung vào các nghiên cứu phát hiện các chủng nấm Cordyceps bản
địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và khảo sát một số hoạt tính sinh học
của các loài nấm này.
Năm 2012-2014, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học – môi trường, trường
ĐH Nông Lâm thực hiện đề tài NCKH cấp Bộ về xây dựng quy trình nuôi cấy đông
trùng hạ thảo qui mô phòng thí nghiệm.
Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học và môi
trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM (Lê Thị Diệu Trang, Lê Phước Thọ,
Trần Công Sơn và Nguyễn Thị Ngọc Anh) báo cáo công trình nghiên cứu “Sản xuất
đông trùng hạ thảo Cordyceps sp. quy mô phòng thí nghiệm” trong cuộc thi Eureka
2013 của Thành Đoàn TP.HCM. Nhóm tác giả Lê Thị Diệu Trang, Trần Công Sơn,
Lê Phước Thọ, Nguyễn Thị Ngọc Anh (2013) đã công bố các kết quả xây dựng quy

13
trình nuôi cấy C. sinensis, đánh giá tính kháng oxy hóa và hàm lượng adenosin trên
tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp của Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM.
Gần đây, trong Hội nghị nấm học tổ chức tại Trung tâm Công nghệ sinh học
TP.HCM (11/2014), một số công trình của các nhóm tác giả Vũ Xuân Tạo và ctv,
Phạm Nguyễn Duy Bình và Phan Kim Ngọc đã công bố kết quả nghiên cứu về các
yếu tố môi trường tác động đến sự sinh trưởng của C. militaris; Võ Thị Xuyến và
ctv nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy C. pseudomilitaris.
2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
Hiện nay, có khoảng 680 loài nấm thuộc chi Cordyceps (Holliday, Cleaver, &
Wasser, 2005). Hai loài nấm đông trùng hạ thảo được sử dụng lâu đời trong y học
cổ truyền Trung Quốc là Cordyceps sinensis (tên khác: Ophiocordyceps sinensis) và
Cordyceps militaris.
Hàng ngàn công trình nghiên cứu từ các trường đại học và các viện nghiên
cứu đã được thực hiện từ rất lâu và chủ yếu tập trung vào hai loài đông trùng hạ thảo
có giá trị cao nói trên.
2.2.1 Cordyceps sinensis:
Cordyceps sinensis ( tên khác: Ophiocordyceps sinensis) là loài ký sinh trên
ấu trùng côn trùng và phân bố chủ yếu ở Tibet, các vùng đồng cỏ ở Nepal, Bhutan
và Bắc Ấn độ nơi có độ cao 3500-5000m so với mực nước biển..

Hình 2: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (shashidhar và ctv, 2013)

Hình 3: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (Holliday và Cleaver, 2004)

14
 Cordyceps sinensis đã được thị trường hóa dưới dạng chất bổ sung dinh dưỡng
dưới sự kiểm soát của FDA, do vậy nhu cầu thị trường của Đông trùng hạ thảo ngày
càng cao ở nhiều quốc gia (Dong & Yao, 2007).
Tuy nhiên sự gia tăng của nhu cầu đã diễn đến tình trạng khai thác quá mức
đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên, làm cạn kiệt ngoài tự nhiên của loài dược liệu quí
này (Holliday, Cleaver, Megan, & Patel, 2004; Hsu, Shiao, Hsiea, & Chang, 2002).
Trước tình trạng trên, cơ quan quản lý CITES (Conventinon on international
Trade in Endangered Species) của Trung Quốc đã chính thức xếp loại nấm này danh
mục các loài có nguy cơ tuyệt chủng (CITES Management Authority of China,
2012).
Nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, các nhà nghiên cứu đã tìm cách nuôi
cấy loại nấm này trong điều kiện nhân tạo và đến giữa thập kỷ 1990. Cordyceps
sinensis nuôi cấy nhân tạo đã được thi trường hóa rộng rãi trên thế giới (Holiday et
al., 2004).
Đặc điểm phân loại Cordyceps sinensis:
 Kingdom - Fungi
 Phylum - Ascomycota
 Class - Ascomycetes
 Order - Hypocreales
 Family - Clavicipataceae
 Genus - Cordyceps
 Species - Cordyceps sinensis
Đặc điểm hình thái của Cordyceps sinensis:
 Quả thể C. sinensis có màu nâu đậm đến đen, thường mọc ra từ phần đầu của
ấu trùng loài sâu Hepialis armoricanus.
 Phần thân ấu trùng có vàng hay vàng nâu.
 Khi quả thể phát triển thành thục sẽ hình thành bào tử, các bào tử này dễ dàng
rời khỏi túi bào tử và phát tán theo gió hoặc rơi xuống đất.

Hình 4: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước
biển tại Tibet (Daniel Winkler, 2010)

15
Vì mục đích lợi nhuận, rất nhiều sản phẩm giả hoặc kém chất lượng xuất hiện trên
thị trường.

Hình 5: Các đoạn kẽm hây dây điện được chêm vào giữa thân nấm Cordyceps để
tăng trọng lượng (Holiday và Cleaver, 2005)
Nhiều công nghệ tiên tiến trong việc nuôi cấy nhân tạo loài nấm này được
nghiên cứu và phát triển đồng thời giúp kiểm soát chất lượng các sản phẩm trên thị
trường.
Tuy nhiên, cho đến nay, việc nuôi cấy và sản xuất Cordyceps sinensis chỉ
dừng lại ở mức độ sản xuất hệ sợi nấm.
Các nhà nghiên cứu trên thế giới chưa thành công trong việc tạo ra quả thể
của Cordyceps sinensis trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo.
2.2.2 Cordyceps militaris
2.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Cordyceps militaris
a. Phân loại và mô tả nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là loài nấm thuôc họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps.
Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris
(Bảng 1) (Kobayasi, 1982). Cordyceps Fr. là chi đa dạng nhất trong họ
Clavicipitaceae về số lượng loài và phổ ký chủ. Ước tính có hơn 400 loài trong giống
này (Mains, 1958; Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al., 2005).
Nấm Cordyceps militaris thuộc giới Nấm, chi Ascomycota, lớp
Sordariomycetes, bô ̣ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps và loài
C.Militaris. Tên khoa học Cordyceps militaris (L.) Fr. (1818) (Kobayasi et al, 1982).
Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm và sâu
bướm, có màu cam, chiều dài 8-10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng.
Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt,
rỗng ở giữa (Hıǹ h 1). Các nang bào tử dài từ 300-510 micro mét, bề rông 4 micro
mét . Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoan, kích ̣ thước 3,5-6 × 1- 1,5
micro mét.

16
 Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi
tạo các bào tử thứ cấp. Nấm nà y có phân bố rộng, ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á
(Paul et al, 2008).

Hình 6: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử (Christian
et al., 1837)
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra các đặc điểm về di truyền
học, nhu cầu về dinh dưỡng và môi trường phát triển, các đặc tính dược liệu và sinh
hóa của Cordyceps militaris.
Gần đây bộ gen C. militaris đã được giải trình tự (Zheng và ctv, 2011). Bộ
gen C. militaris có kích thước 32,2 Mb với 9684 gen mã hóa prôtêin được dự đoán,
trong đó có 13,7% là gen đặc hiệu loài.
Cordyceps militaris có hình thái đa dạng và có khả năng thích nghi với nhiều
loại ký chủ côn trùng. Các ký chủ thường gặp là ấu trùng và nhộng của các loài côn
trùng thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera.
Ngoài ra, có thể tìm thấy C. militaris ký sinh trên các loại côn trùng khác
thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, bộ hai cánh Diptera…
Kích thước quả thể C. militaris trong tự nhiên thường nhỏ, không đủ để thỏa
mãn nhu cầu thị trường.
Đã có những nghiên cứu về việc nuôi cấy loài nấm này ở qui mô lớn ở cả dạng
sợi nấm lẫn quả thể (Dai và ctv., 2007; Gu and ctv., 2007).
 (de Bary 1867, 1887; Shanor 1936; Müller-Kögler 1965; Leatherdale 1970)
 Nghiên cứu sản xuất quả thể C. militaris trên các cơ chất hữu cơ (Pettit 1895;
Sopp 1911; Kobayasi 1941; Basith và Madelin 1968; Yue và ctv, 1982)
Đặc điểm phân loại C. militaris:
 Kingdom: Fungi
 Phylum: Ascomycota
 Sub-phylum: Ascomycotina
 Class:Ascomycetes/Pyrenomycetes
17
  Order: Hypocreales
 Family: Clavicipataceae
 Genus: Cordyceps
 Species: Cordyceps militaris

Hình 7: Cordyceps militaris (www.jscr.jp)

Hình 8: Các loài đông trùng hạ thảo (A) C. Sinensis, (B) C. gunnii; (C) C. barnesii;
(D) C. gracilis (E) C. liangshanensis; (F) C. militaris

Hình 9: Sự đa dạng về hình thái C. militaris

Mật độ sợ nấm thay đổi trên các môi trường khác nhau. Mật độ tơ Cordyceps
militaris rất thấp trên môi trường WA, nghèo ở môi trường MA và CMA, trong khi
18
rất nhiều tròng các môi trường SDAY và SMAY (Shretha el al., 2006). Màu sắc
khuẩn lạc dao động từ trắng, vàng, cam nhạt đến cam tùy theo thành phần dinh
dưỡng. Các quan sát cho thấy môi trường có bổ sung pepton và cao nấm men cho
khuẩn lạc có màu sắc đậm hơn (Shretha el al., 2006)
b. Chu trı̀nh sống của nấm Cordyceps militaris
Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C. militaris là một loài nấm ký
sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng. Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai
đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa
đông. Bào tử nấm theo gió dın ́ h vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hıǹ h thành
các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzyme như lipase,
chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể.
Sau đó hê ̣ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và
gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoăc thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào
không khí (Kobayasi et al, 1982; Kamble et al, 2012). Các quả thể nấm C. militaris
thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al., 2011). Nấm Cordyceps
militaris có các dang bào tử khác nhau trong chu trıǹ h sống của nấm (Hı̀nh 10). Ở
các điều kiên môi trường khác nhau, sư hình thành các dạng bào tử cũng cho thấy
sự khác biệt, ̣ như viêc tạo bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các
chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng.
c. Ký chủ
Nấm Cordyceps militarisis là loài được nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các
loài của giống Cordyceps (Kobayasi et al, 1941). Sự đa dạng về hình thái và khả
năng thích nghi của loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên do khiến
chúng có mặt ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất (Kobayasi et al, 1941;
Mains, 1958; Sung và Spatafora, 2004). Ký chủ phổ biến của loài C.militaris trong
tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm. Ngoài ra, còn có các ký chủ
khác như các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng
(Hymenoptera), và bộ hai cánh (Diptera). Ví dụ nhu Ips sexdentatus, Lachnosterna
quercina, Tenebrio molitor (thuộc bộ cánh cứng), Cimbex similis (thuộc bộ cánh
màng), và Tipula palulosa (thuộc bộ hai cánh) (Bảng 2).
Trong tự nhiên có nhiều loài Cordyceps có hình thái tương tự hoặc gần giống
loài C.militaris, bao gồm C. cardinalis G.H. Sung & Spatafora, C. Kyusyuensis A.
Kawam., C.pseudomilitaris Hywel Jones & Sivichai, C. rosea Kobayasi & Shimizu,
C. roseostromata Kobayasi & Shimizu, C.washingtonensis Mains, và một số loài
khác (Sung và Spatafora, 2004; Sung et al., 2007; Wang et al., 2008)

19
 Hình10: Các dạng bào tử của nấm Cordyceps militaris (Zheng et al., 2011).
Conidia: bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn. Blastospores: chồi bào tử
tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng. Fruiting-body: quả thể. Perithecia: thể quả
hình chai. Asci: nang. Fragmented ascospores: các mảnh nang bào tử. Microcycle
conidiation: vi chu kỳ tạo bào tử.
Bảng 2: Một số ký chủ thuộc các phân lớp khác của nấm Cordyceps militaris

Bộ Họ Loài Tác giả

Coleoptera Scarabaeidae Scarabaeidae Farlow và ctv. (1888)

Diptera Tipulidae Tipula paludosa Müller-Kögler (1965)

Hymenoptera Cimbicidae Cimbex similis Kobayasi (1941)

Lepidoptera Bombycidae Andraca bipunctata Panigrahi (1995)

d. Tế bào học và di truyền học của Cordyceps militaris

Cho đến nay chỉ có một số ít nghiên cứu về tế bào học và di truyền của loài
C. militaris. Tác giả Moore (1964) cho thấy rằng nhân tế bào soma phân chia tương
tự như các tế bào sinh dưỡng khác. Phân tích điện di karyotype cho thấy loài này có
7 nhiễm sắc thể, kích thước nhiễm sắc thể dao động trong khoảng 2,0 và 5,7 Mb
(Wang et al, 2010). Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy toàn bộ gen gần đây
của C. militaris có chiều dài khoảng 32,2 Mb (Zheng et al., 2011).
Các kết quả phân tích gen cho thấy có sự khác biệt di truyền đáng kể giữa các
chủng hoang dại và chủng thoái hóa (Li et al., 2003,2007). Tuy nhiên, không giống
như sự đa dạng đáng kể trong di truyền của loài O. sinensis (Zhang et al., 2009), các
khoảng cách di truyền của các loài C. militaris phân lập từ các khu vực khác nhau là

20
cực kỳ thấp khi phân tích dựa trên trình tự nrDNA ITS (khoảng cách K2P <0.01)
(Wang et al., 2008).
Các điều kiện ảnh hưởng đến sự hình thành và tái sinh của bào tử trần của loài
C. militaris đã được nghiên cứu rộng rãi (Ma et al., 2008; Liu et al., 2009; Zhou và
Luo, 2009;. Li et al., 2011). Một số các nghiên cứu cho thấy khi gây đột biến bằng
bức xạ trên C. militaris có thể tạo ra các loài đột biến có đặc điểm vượt trội hơn so
với đối chứng, như tạo ra hàm lượng cao hơn các chất cordycepin, polysaccharide,
hoặc cho năng suất quả thể cao hơn (Che et al., 2904; Zhou và Bian, 2007; Zhou và
Luo, 2009; Li et al, 2011).
Dựa trên trình tự biểu hiện Tag (EST) cho thấy các mô hình phiên mã gen
khác nhau ở loài C. militaris khi nuôi hệ sợi nấm trong môi trường lỏng, môi trường
rắn chứa gạo và khi tạo quả thể trên môi trường gạo hoặc nhộng tằm (Xiong et al,
2010). Các phân tích cho thấy gen tham gia vào quá trình chuyển hóa tế bào, chuyển
hóa năng lượng, và đáp ứng stress. Các gen cũng quy định cấu trúc vách tế bào trong
quá trình hình thành bào tử hữu tính (Xiong et al, 2010). Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh có sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến việc hình thành quả thể và tạo các
hợp chất chuyển hóa (ví dụ, cordycepin, polysaccharide), tuy nhiên các cơ sở di
truyền giải thích cho các quá trình này vẫn chưa rỏ ràng (Cui và Zhang 2011; He et
al., 2011).
2.2.2.2 Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris
Cordyceps militaris dễ dàng hình thành quả thể trong môi trường nuôi cấy
nhân tạo.
Giá trị dược liệu cao, hoạt chất Cordycepin trong Cordyceps militaris cao hơn
so với Cordyceps sinensis. Cordycepin được chứng minh là có khả năng kháng ung
thư, kháng oxy hóa, kháng viêm, tăng cường hoạt động hệ miễn dịch, gan, thận…
(Tuli và ctv. 2014).
a. Các hợp chất dược liệu:
Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều
trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao.
Nấm Cordyceps militaris rất khan hiểm trong tự nhiên. Vì vậy, việc sản xuất ở quy
mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps
militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết.
- Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ
nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa
miễn dịch (Shonkor et al, 2010).
- Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2
chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo
phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011).
- Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm
từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và
hình dạng bình thường tăng. Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng
21
sử dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế
phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở
lợn (Lin et al., 2007).
- Hạn chế virus cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm
Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều
trị cúm A. Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào
(Yuko et al., 2007)
- Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư C. militaris: protein (CMP) tách
chiết từ nấm có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7-9.
Protein này ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng
quan (Byung-Tae et al., 2009). Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng
vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong
việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joon et al., 2000).
Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu
đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF- ̣ kB, do đó
đươc hy vọng sẻ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều
trị các bệnh về miễn dịch (Seulmee ̣ et al., 2009).
- Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris
có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả
năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh
khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất
ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá
thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae-Sung et al.,
2006).
- Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ
quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát
1 popolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thíc 1 việc sản xuất nitric oxide),
việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u a (TNF-a) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào
RAW 264,7. Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm
giảm đáng kể LPS, TNF-a và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết.
Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất
các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol et al., 2010).
- Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm - Cordyceps militaris: Mặc dù nấm
Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các
ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ nấm
Cordyceps militaris có thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng
phối, họ có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010)
b. Các thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris:
Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris
cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại vitar
in: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 m/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam),
vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se
22
(0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất
quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%)
(Shih et al., 2007).
Acid amin
Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps
militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g
trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng acid amin mỗi loại
trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15–15,06 mg/g
và 0,36–2,99 mg/g. Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine
(15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g),
arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) in the fruiting body. Số liệu phân tích
của Cháng và ctv. (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic
(2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001)
Acid béo
Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70%
tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và
21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5%
trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 3) (Hur, 2008).
Bảng 3: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris

Phần trăm acid béo

Acid béo tổng (%)

Quả thể Sinh khối

Palmitic acid (C16:0) 24.5 21,5

Palmitoeic acid (C16:1) 2.3 2,1

Stearic acid (C18:0) 5.8 5,0

Oleic acid (C18:1) 6.0 17,7

Linoleic acid (C18:2) 61.3 33,0

Linolenic acid (C18:3) - 20,6

Adenosine và cordycepin
Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps
militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối
với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối
(0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008).

23
 Polisaccharide
Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường
monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại
polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng
này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có
thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm.
2.3 Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps militaris:
2.3.1 Nguồn dinh dưỡng
Nguồn dinh dưỡng cần thiết để nuôi cấy Cordyceps militaris là các loại côn
trùng như:
 Ấu trùng và nhộng Bombyx mori
 Nhộng tầm sồi Antherea pernyi
 Sâu hại bắp cải Mamestra brassicae
 Sâu gạo Tenebrio molitor
 Sâu đục thân bắp Ostrinia nubilalis
 Các loài sâu khác như Heliothis virescens, H. Zea và Spodoptera
Ngũ cốc có thể là nguyên liệu thay thế cho côn trùng. Koyayashi (1941) đã
sản xuất quả thể Cordyceps militaris trên nền cơ chất gạo. Tiếp đó hàng loạt các
nghiên cứu khác cũng sử dụng gạo như thành phần chính trong nuôi cấy tạo quả
thể nấm này.
Khi sử dụng để nuôi cấy Cordyceps militaris thì tỷ lệ gạo: nước 1:1-1:1,35
được cho là thích hợp để quả thể phát triển nhưng tỷ lệ này phụ thuộc vào độ dẽo
của gạo được sử dụng (Sung et al., 1999, 2002; Lin et al., 2006b; Zheng et al.,
2008c; yue, 2010).
Các cơ chất hữu cơ khác có thể được sử dụng để nuôi cấy Cordyceps militaris:
bột đậu, cám bắp, hạt kê, cao lương, hạt hướng dương và lúa mì (Chen và Wu
1990; Zhang và Liu 1997; Li 2002; Li và ctv. 2004a; Zhao và ctv. 2006a; Gao và
Wang 2008; Wei và Huang 2009).
Sử dụng hỗn hợp gạo và côn trùng cũng cho kết quả tốt (Ren 1998; Chen và
ctv. 2002; Shrestha và ctv. 2004, 2005; Sung và ctv. 2002, 2006; Zhao và ctv.
2006; Jin và ctv. 2009).
Ở một số nghiên cứu cho thấy:
 Cordyceps militaris cho năng suất không cao trên môi trường là côn trùng nhưng
lại tốt hơn trên môi trường ngũ cốc.
 Tuy nhiên, chất lượng nấm Cordyceps militaris nuôi cấy trên côn trùng cho hàm
lượng các hoạt chất sinh học quý hiếm như adenosine, cordycepin...cao hơn
nhiều so với nuôi cấy trên ngũ cốc
2.3.2 Thời gian hình thành quả thể và năng suất Quả thể
Quả thể thường được tạo ra trong khoảng 35-70 ngày nuôi cấy (Zhang và Liu
1997; Sung và ctv. 1999; Yue 2010; Du và ctv. 2010) tùy theo các cơ chất khác nhau.

24
 Năng suất: Wu và ctv. (1996) thu được 25g quả thể tươi từ 50g môi trường
gạo, trong khi đó Zhang và Liu (1997) thu được lượng quả thể có thể đến 61% trên
môi trường gạo, 58-59% trên môi trường có chứa hạt kê, Lin và ctv. (2006) lại có
thể thu được đến 18g quả thể tươi từ 20g môi trường...
2.3.3 Yêu tố môi trường tác động đến việc nuôi cấy:
a. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình nuôi trồng nấm:
Cordyceps militaris được trồng trong môi trường lỏng để thu hoạch sợi nấm
đồng thời trên môi trường rắn để thu quả thể. Các tác giả Kim và Liu đã tối ưu hóa
điều kiện nuôi cấy chìm nấm C. militaris (Kim et al., 2003; Liu et al., 2008). Để sản
xuất quy mô lớn về số lượng quả thể nấm C. militaris hiện nay người ta chỉ sử dụng
môi trường rắn chứa các cơ chất nhân tạo hoặc ngôi trường rắn chứa côn trùng (ví
dụ, ấu trùng tằm L mori). Tuy nhiên, việc nuôi nấm lấy quả thể trên côn trùng rất
tốn kém, do đó hiện nay nấm chủ yếu được nuôi trên môi trường có thành phần chính
la gạo. Các môi trường dùng cho nuôi cấy bao gồm môi trường nhân giống, môi
trường tiền nuôi cấy hệ sợi và môi trường sản xuất. Thành phần các môi trường này
khác nhau phù hợp với sự phát triển của nấm ở các giai đoạn. Có 4 giai đoạn chính
trong sự phát triển của nấm, bao gồm: giai đoạn tạo hệ sợi, giai đoạn tạo sắc tố, giai
đoạn nảy chồi, và giai đoạn tạo quả thể (Lu et al., 2005). Các quá trình này đòi hỏi
việc kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng (Ren et al., 2009).

Hình 11: Cordyceps militaris nuôi trồng trên các điều kiện khác nhau (Dữ liệu
nghiên cứu của phòng thí nghiệm Nấm dược liệu, Đại học Thủ dầu một; (a) Nấm
Cordyceps militaris nuôi trồng trên môi trường rắn có bổ sung gạo và bột nhuộng
(1-9 tuần); (b) Nấm Cordyceps militaris nuôi trên môi trường lõng SDAY; (c)
Nấm Cordyceps militaris mọc trên môi trường thạch agar bổ sung đạm hữu cơ.

25
 Việc nuôi cấy các loại nấm trên môi trường rắn đã được nghiên cứu trong
nhiều năm qua. So sánh với các loại môi trường khác, môi trường rắn hiệu quả hơn
về các mặt như diện tích nuôi trồng nhỏ, giảm lượng nước tiêu thụ so với nuôi cấy
lỏng, đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải và tiêu thụ năng lượng trong quy trình
nuôi nấm. Trong tự nhiên nấm C. militaris sinh trưởng rất hạn chế ký sinh trên côn
trùng. Khi nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo nấm có thể phát triển trong điều kiện
tối ưu như độ thoáng khí giúp cho việc phát triển tơ nấm và quả thể, nhất là chủ yếu
quả thể chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hơn (Sung et al., 2006; Zhang et
al., 2008). Quả thể đã dược trồng thành công trên môi trường gạo lứt (Choi et al.,
1999; Sung et al., 2002) hoặc ấu trùng côn trùng (Harada et al., 1995; Sato và
Shimazu, 2002). Các nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng hạt kê có thể tạo
ra nấm có hàm lượng adenosine cao. Các nghiên cứu cũng cho thấy khi hạt đậu nành
được dùng làm môi trường rắn hàm lượng cordycepin tăng so với giá thể gạo (Lim
et al., 2012).
b. Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi nấm:
 Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng:
Môi trường nuôi cấy nấm có thể dùng cá c loại nhộng và sâu khác nhau, nhưng
hầu hết sử dung ̣ nhộng tằm Bombyx mori (Hong et al., 2010). Các nghiên cứu cũng
cho thấy có khả năng sử dụng các loại côn trùng khác để nuôi nấm như ấu trùng
bướm đêm Antherea pernyi (Wang et al., 2002), Mamestra brassicae (Harada et al.,
1995)...
 Nguồn dinh dưỡng từ các hợp chất hữu cơ tự nhiên
Việc sử dụng côn trùng trong nuôi cấy nấm ở quy mô lớn cho thấy nhiều hạn chế
về mặt nguyên liệu sẵn có, sư tạp nhiễm trong quá trình nuôi cao hơn, do đó các hợp
chất hữu cơ đã được sử dụng để thay thế côn trùng. Xie và ctv cho thấy việc bổ sung
gao lứt, lúa mạch và đậu nành vào môi trường nuôi cấy thı́ ch hơp để thay thế côn
trùng (Xie et al., 2009b). Tuy nhiên, Yahagi cũng chỉ ra rằng môi trườ ng dinh dưỡng
trên thạch không phù hơp cho việc sản xuất nấm (Yahagi et al., 2004).
Các hormone thực vật như 2,4-D, citric acid triamine, colchi-cines cũng cho thấy
có ảnh hưởng đến năng suất quả thể (Wang et al., 2010). Nghiên cứu của Li năm
2004 và Dong năm 2012 cho thấy việc bổ sung các muối khoáng như K+, Mg2+, Ca2+
ở nồng độ khoảng 0.1 g/L cũng có thể tăng năng suất quả thể và hàm lượng các hoạt
chất sinh học trong nấm (Li et al., 2004; Dong et al., 2012). Thời gian tạo quả thể
nấm dao đông theo loại môi trường sản xuất quả thể, thường trong khoảng 35-70
ngày (Du et al., 2010). Zhang và Liu (1997) kết luận trên môi trường gạo cần 35-45
ngày cho thời gian thu hoạch quả thể, tuy nhiên khi sử dụng các môi trường khác thı̀
thời gian tạo quả thể sẻ dài hơn như khi dùng hạt kê, ngô làm môi trường trồng ̣ nấm.
c. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy:
 Nhiệt độ:

26
 Nhiệt độ thích hợp để hệ sợi nấm phát triển mạnh là 25°C, nhưng nhiệt độ để
hình thành quả thể 18-22°C (Sung và ctv. 1999, 2002; Gao và ctv. 2000a; Zhao và
ctv. 2006; Du và ctv. 2010; Sato và Shimazu 2002).
Trong khi đó, một nghiên cứu khác (Li và ctv. 2004a; Yue 2010) lại cho rằng
25°C là nhiệt độ tối ưu cho cả hệ sợi lẫn quả thể.
 Ánh sáng:
Sato và Shimazu (2002) cho rằng quả thể C. militaris không thể hình thành trong
bóng tối. Cường độ ánh sáng giới hạn sự phát triển quả thể ở 1400lux. Trong khi đó,
Gao và ctv. thu được quả thể ở 4500lux.
Các báo cáo gần đây cho thấy cường độ ánh sáng phù hợp cho quả thể phát triển
nằm trong khoảng 500-1000 lux tùy thuộc vào thời gian chiếu sáng dài hay ngắn
(Sung và ctv. 1999, 2002; Gao và ctv. 2000; Sato và Shimazu (2002); Li và ctv
(2004); Zhao et al., (2006); Du et al., (2010)).
 Độ thoáng khí và độ ẩm:
Độ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm.
Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng màng bao HFM (hydrophobic fluoropore
Membrane) cho kết quả tốt nhất về hiệu suất quả thể nấm C. militaris (Zhang et al.,
2010). Khoảng ẩm độ thích hợp cho nấm dao động từ 70– 90 %, tương đương với
đô ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thể. Khi độ ẩm thấp sẽ
làm môi trường khô nhanh han chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể. Do
đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn.
Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy C. militaris cần được chú ý duy trı̀
pH trong khoảng 6.0–6.5, nhiêt độ ̣ 20–25°C và bổ sung các nguồn dinh dưỡng như
carbohydrate, nitrogen và muối khoáng (Sung et al., 2006).
 Vấn đề thoái hóa giống trong nuôi trồng C. militaris:
Thoái hóa giống là vấn đề quan trọng trong việc nuôi trồng nấm C. militaris trong
điều kiện nhân tạo. Sự thoái hóa giống thể hiên ở việc giảm tốc độ sinh trưởng, giảm
mật độ tơ nấm, màu sắc tơ và năng suất quả thể, cũng như các thay đổi về hình dạng
và kı́ch thước quả thể. Ngoài ra, sự thoái hóa giống còn thể hiện ở việc giảm hàm
lượng các hợp chất có lợi tạo ra trong môi trường nuôi cấy và trong quả thể nấm.
Thoái hóa trong tạo quả thể thường có liên quan đến vật liệu dùng phân lập. Nếu
giống đươc phân lập từ đa bào tử hoặc mô, viêc thoái hóa giống sẽ xảy ra ở lần nuôi
cấy thứ hai hoăc ba (Shrestha ̣ et al., 2004). Tuy nhiên, giống nấm C. militaris ı́t
thoái hóa hơn khi được phân lập từ các đơn bào tử (Shrestha et al., 2004; Sung et al.,
2006). Việc giảm sắc tố cũng được ghi nhận khi nuôi trồng nấm sau vài lần nhân
giống (Sung et al., 2006). Hoạt tính của enzyme dehydrogenase và sắc tố giảm (Lin
et al., 2010).
Một số nghiên cứu cho thấy việc trữ giống ở 4 - 100C có thể duy trı̀ khả năng tạo
quả thể đến 6 tháng (Sung et al., 2006; Geng et al., 2009). Các nghiên cứu trên gen
cũng chỉ ra rằng có sự liên hệ ̣ giữa các biến đổi ở mức độ gen và sư thoái hóa giống

27
của nấm C. militaris (Li et al., 2003), tuy nhiên các gen chính xác liên quan đến quá
trình này vẫn chưa được xác định.
Khi phát triển quy trình nuôi cấy hiệu quả nấm C. militaris các nhà sản xuất cần
đáp ứng các yêu cầu về giống nấm, duy trì năng suất quả thể và hàm lượng
cordycepin trong quả thể cao. Du và ctv. (2010) phát triển phương pháp nuôi cấy đạt
hàm lượng cordycepin cao (24.98 mg/g quả thể) trong khi Che và ctv. (2004) tạo ra
chủng nấm có năng suất cao và ổn đinh hơn nhờ đột biến bằng tia UV (Che et al.,
2004; Du et al., 2010). Nấm thường được nuôi trong các chai nhỏ 0.5- 1 lı́t do nấm
đòi hỏi độ ẩm cao. Sử dung các chai nhựa trong hoặc chai thủy tinh thích hợp cho
việc phát triển tơ và quả thể nấm, đồng thời có thể tái sử dụng làm giảm chi phı́ trong
sản xuất.
2.3. Các nghiên cứu Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam:
Các báo cáo khoa học về Cordyceps tại Việt Nam còn rất ít và còn khá sơ khai
so với khối lượng nghiên cứu đồ sộ trên thế giới.
Nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm C. militaris trong các
môi trường nuôi cấy cơ bản được thực hiện bởi Phạm Quang Thu và ctv. (2012).
Nhóm tác giả Trương Bình Nguyên, Đinh Minh Hiệp, Lê Huyền Ái Thúy và
ctv, (2010) tập trung vào các nghiên cứu phát hiện các chủng nấm Cordyceps bản
địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và khảo sát một số hoạt tính sinh học
của các loài nấm này.
Năm 2012-2014, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học – môi trường, trường
ĐH Nông Lâm thực hiện đề tài NCKH cấp Bộ về xây dựng quy trình nuôi cấy đông
trùng hạ thảo qui mô phòng thí nghiệm.
Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học và môi
trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM (Lê Thị Diệu Trang, Lê Phước Thọ,
Trần Công Sơn và Nguyễn Thị Ngọc Anh) báo cáo công trình nghiên cứu “Sản xuất
đông trùng hạ thảo Cordyceps sp. quy mô phòng thí nghiệm” trong cuộc thi Eureka
2013 của Thành Đoàn TP.HCM.
Nhóm tác giả Lê Thị Diệu Trang, Trần Công Sơn, Lê Phước Thọ, Nguyễn Thị
Ngọc Anh (2013) đã công bố các kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy C. sinensis,
đánh giá tính kháng oxy hóa và hàm lượng adenosin trên tạp chí khoa học kỹ thuật
Nông Lâm nghiệp của Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM.
Gần đây, trong Hội nghị nấm học tổ chức tại Trung tâm Công nghệ sinh học
TP.HCM (11/2014), một số công trình của các nhóm tác giả Vũ Xuân Tạo và ctv,
Phạm Nguyễn Duy Bình và Phan Kim Ngọc đã công bố kết quả nghiên cứu về các
yếu tố môi trường tác động đến sự sinh trưởng của C. militaris; Võ Thị Xuyến và
ctv nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy C. pseudomilitaris.

28
 CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS
MILITARIS) Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
I. Mục đích
Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống con người ngày
càng được nâng cao nên nhu cầu về sức khỏe là vấn đề rất được quan tâm. “Sống
khỏe, không bệnh tật” đó là niềm ao ước của con người ở bất cứ thời đại nào. Tuy
nhiên, sức khỏe của con người lại tùy thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, môi
trường sống, dinh dưỡng và phòng trị bệnh; trong đó dinh dưỡng để phòng ngừa các
bệnh tật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe. Việc sử dụng các dược
liệu quý có nguồn gốc tự nhiên trong chế độ dinh dưỡng đã có những tác động rất
hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị và phòng chống một số bệnh. Đông trùng hạ thảo
là một trong số các dược liệu quý đó, đã được sử dụng lâu đời trong lịch sử Đông y.
Đông trùng hạ thảo là một dạng kí sinh giữa loài nấm túi Cordyceps với ấu
trùng của một số loài côn trùng. Trong tự nhiên, đông trùng hạ thảo chỉ sinh sống và
phát triển ở những vùng núi cao từ 3500 – 5000 m so với mực nước biển và khí hậu
lạnh (Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, 2009; Nguyễn Lân Dũng, 2010). Do vậy,
sản phẩm tự nhiên thường rất khan hiếm và năng suất ngày càng giảm do khai thác
quá mức, nhu cầu tiêu dùng lại ngày càng tăng dẫn đến giá thành rất đắt đỏ. Vì vậy,
việc thay thế các sản phẩm Cordyceps tự nhiên bằng các sản phẩm Cordyceps nuôi
cấy là hướng đi mới và mang tính đột phá.
Trong các loài Cordyceps thì C. militaris là một trong các dược liệu quý và
có giá trị cao. Trên thế giới, việc sản xuất Cordyceps chủ yếu tập trung vào hệ sợi
nấm bằng kỹ thuật lên men chìm. Tuy nhiên, trong thực tế, người tiêu dùng vẫn có
xu hướng ưa chuộng các sản phẩm nguyên thủy (có mang quả thể). Hiện nay, có
nhiều sản phẩm đông trùng hạ thảo trên thị trường với chất lượng và giá cả khác
nhau hầu như không kiểm soát được. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất C. militaris
có mang quả thể trong điều kiện nhân tạo là phù hợp với nhu cầu thực tế tại Việt
Nam.. Trong khi đó, ở Việt Nam chưa có nhiều công bố khoa học về việc nuôi cấy
sản xuất C. militaris. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác đã chứng minh, các hoạt
chất quý trong sợi nấm và quả thể Cordyceps nuôi cấy có hàm lượng cao và hiệu
quả dược lý không thua kém so với các sản phẩm Cordyceps tự nhiên (Fan và ctv,
2007). Có thể thấy rằng, sản xuất thành công C. militaris trong điều kiện nhân tạo là
một cơ hội mang ý nghĩa quan trọng và có giá trị thương mại hóa cao. Chính vì vậy,
việc nghiên cứu sản xuất đông trùng Hạ thảo (Cordyceps militaris) trong điều kiện
nhân tạo ở quy mô phòng thí nghiệm đã được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
Xây dựng quy trình nuôi cấy sản xuất quả thể C. militaris ở qui mô phòng thí
nghiệm, nhằm mục đích:
 Năng suất và chất lượng tốt, ổn định
 Chủ động thời gian sản xuất
 Đảm bảo nguồn dược liệu tốt, an toàn
 Giá thành phù hợp

29
 Nội dung thực hiện nghiên cứu:
 Xây dựng quy trình nuôi cấy quả thể nấm
 Tối ưu hoá quy trình ly trích adenosine, cordycepin và guanosine
 Đánh giá chất lượng sản phẩm sau nuôi cấy
II. Xây dựng quy trình nuôi cấy:
2.1 Thời gian bắt đầu hình thành quả thể:
Thời gian nấm C. militaris bắt đầu mọc quả thể dao động từ 20 – 23 ngày. Kết
quả phân tích thống kê cho thấy, không có sự khác biệt ý nghĩa về thời gian bắt đầu
hình thành quả thể giữa các nghiệm thức. Nhìn chung, các nghiệm thức sử dụng cơ
chất có nguồn gốc thực vật (bắp, kê, cơm) có số ngày bắt đầu hình thành quả thể
nhanh hơn các nghiệm thức sử dụng cơ chất có nguồn gốc động vật (nhộng) từ 1 –
2 ngày.

Hình 12: Thời gian bắt đầu hình thành quả thể của nấm C. militaris
2.2 Đặc điểm hình thành quả thể của C. militaris
Quả thể trong điều kiện không chiếu sáng và chiếu sáng có sự khác nhau rõ
rệt về đặc điểm hình thái:
Quả thể trong điều kiện không chiếu sáng: có màu trắng ngà, đường kính trung
bình từ 0,2 – 0,4 cm.
Quả thể trong điều kiện chiếu sáng (> 12h chiếu sáng): có màu vàng cam,
đường kính trung bình từ 0,2 – 0,3 cm.
Quả thể mọc trên cơ chất A1 (bắp – kê) và A2 (bắp) khá giống nhau: dài,
tương đối thẳng và ít phân nhánh.
Quả thể trên cơ chất cơm: thân ốm (đường kính chủ yếu khoảng 0,15 cm),
xoăn.
Quả thể trên cơ chất nhộng: thân to mập (đường kính chủ yếu khoảng 3 – 4
cm), phân nhánh.

30
Hình 13: Hình thái quả thể nấm C. militaris ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau

Bảng 4: Đặc điểm hình thái của quả thể nấm C. militaris trên các cơ chất ở
điều kiện không chiếu sáng

Giá thể Đặc điểm hình thái quả thể nấm C. militaris

A1 Màu trắng ngà, thân hình trụ dẹt, đường kính 0,2 – 0,5 cm, hơi
(bắp – kê) xoăn, phân nhánh ít, đỉnh nấm nhọn.

A2 (bắp) Màu trắng cam, thân hình trụ, khá thẳng, đường kính 0,2 – 0,4 cm,
phân nhánh từ giữa thân hoặc ngọn, đỉnh nấm nhọn.

A3 (cơm) Màu trắng ngà, thân hình trụ, đường kính 0,1 – 0,3 cm, hơi xoăn, ít
phân nhánh, phân nhánh trên ngọn, đỉnh nấm nhọn.

A4 (nhộng) Màu trắng cam, thân hình trụ dẹt, đường kính 0,2 – 0,5 cm, khá
thẳng, phân nhánh ở giữa thân hoặc ngọn, đỉnh nấm nhọn hoặc tròn
phình to.

A5 Màu trắng ngà, thân hình trụ, đường kính 0,2 – 0,4 cm, thẳng, phân
(nhộng – cám) nhánh từ gốc hoặc giữa thân.

31
Bảng 5: Đặc điểm hình thái của quả thể nấm C. militaris trên các cơ chất ở
điều kiện có chiếu sáng

Giá thể Đặc điểm hình thái quả thể nấm C. militaris

A1 Màu vàng cam, thân hình trụ, đường kính 0,2 – 0,3 cm hơi xoăn, ít
(bắp – kê) phân nhánh, nhánh mọc từ giữa thân, đỉnh nấm nhọn.

A2 (bắp) Màu vàng cam, thân hình trụ, đường kính 0,2 – 0,3 cm hơi xoăn, ít
phân nhánh, nhánh mọc từ giữa thân, đỉnh nấm nhọn.

A3 (cơm) Màu vàng cam, thân hình trụ dẹt, đường kính 0,1 – 0,3 cm, xoăn,
phân nhiều nhánh ở phần ngọn, đỉnh nấm nhọn.

A4 (nhộng) Màu vàng cam, thân hình trụ dẹt, đường kính 0,1 – 0,3 cm, xoăn,
phân nhiều nhánh ở phần ngọn, đỉnh nấm nhọn.

A5 Màu vàng cam, thân hình trụ, đường kính 0,2 – 0,4 cm, thẳng, phân
(nhộng – cám) nhiều nhánh, nhánh mọc từ giữa thân, đỉnh nấm nhọn hoặc trụ dẹt.

2.3 Năng suất quả thể nuôi cấy:

Sinh khối quả thể nấm C. militaris khác biệt trên các cơ chất và điều kiện
chiếu sáng khác nhau.

Hình 14: Năng suất quả thể nấm C. militaris trên các loại cơ chất khác nhau
P<0,05 A1: Bắp kê, A2: Bắp; A3: Cơm; A4: Nhộng; A5: Nhộng cám
B1: Chiếu sáng 12 giờ B2: Chiếu sáng > 12 giờ
Có thể thấy rằng cơ chất nhuộng luôn cho tỷ lệ sinh khối quả thể cao nhất là
rất phù hợp với thực tế bởi ngoài tự nhiên, nấm C. militaris kí sinh trên một số loài
32
côn trùng bộ cánh vảy (Nguyễn Lân Dũng, 2010). Vì nhộng tằm cũng thuộc bộ côn
trùng cánh vảy và được xem là giá thể thay thế gần nhất so với kí chủ mà nấm kí
sinh. Bên cạnh đó, giá trị dinh dưỡng của nhộng rất cao (trong 100 g nhộng có 79,7
g nước; 13 g protid; 6,5 g lipid; nhiều vitamine và chất khoáng) không thua kém các
loại thịt, cá thông thường (Hoàng Liên, 2009) nên nấm C. militaris sinh trưởng và
phát triển rất tốt trên giá thể nhộng.
Qua đó, nhận thấy xét về mặt năng suất nấm C. militaris cho khả năng hình
thành quả thể cao nhất trên giá thể nhộng và nhộng – cám ở điều kiện chiếu sáng
trên 12 giờ.
III. Đánh giá chất lượng Đông trùng hạ thảo
3.1 Hàm lượng các nucleoside chỉ thị trong quả thể và sợi nấm phát triển trên
giá thể:
Adenosine, cordycepin và guanosine là những nucleoside được coi là các
thành phần chính trong C. militaris và được sử dụng làm chỉ thị để đánh giá chất
lượng Đông trùng hạ thảo, manitol… (Guo và ctv, 1998; Hsu và ctv, 2002). Quy
trình phân tích adenosine, cordycepin và guanosine bằng kỹ thuật HPLC được tối
ưu hóa tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học
Nông Lâm TP.HCM.
3.1.1 Hàm lượng adenosine trong sản phẩm:
Trên mẫu quả thể hàm lượng adenosine đều cao hơn rất nhiều so với hệ sợi
hệ nấm phát triển trên giá thể tương ứng.
Kết quả hàm lượng adenosine có trong quả thể nấm C. militaris dao động
trong khoảng 1,13 – 1,91 mg/g là tương đương với chất lượng nấm C. militaris của
các nước Mỹ, Nhật Bản sản xuất và hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Huang
và ctv (2009) (hàm lượng adenosine của C. sinensis tự nhiên là 1,63 mg/g).
Ở giá thể A3 cả quả thể và sợi nấm đều có hàm lượng adenosine thấp nhất là
điều tất yếu bởi đây là giá thể nghèo chất dinh dưỡng và độ ẩm khá thấp, tuy nấm C.
militaris nuôi trên giá thể A3 vẫn có thể hình thành quả thể song chất lượng quả thể
sẽ không cao mặc dù nguyên liệu rẻ tiền và luôn luôn có sẳn …
Cả quả thể và hệ sợi nấm trên giá thể nhộng cho hàm lượng adenosine cao
nhất và khác biệt khá lớn so với quả thể và hệ sợi nấm trên các giá thể khác (trừ quả
thể trên giá thể A5 (nhộng – cám)).

33
Bảng 6: Hàm lượng adenosine có trong quả thể và hệ sợi nấm

Hàm lượng adenosine (x ± SD) (mg/g)

Môi trường Quả thể Hệ sợi nấm phát triển
trên môi tường

Bắp – kê 0,17 ± 0,03 0,17 ± 0,03

Bắp 1,21 ± 0,02 1,21 ± 0,02

Cơm 1,13 ± 0,02 0,11 ± 0,04

Nhộng 1,91 ± 0,15 1,02 ± 0,07

Nhộng – cám 1,76 ± 0,09 0,51 ± 0,01

Cordyceps tự nhiên 1,63 mg/g (Huang và ctv, 2009)

3.1.2 Hàm lượng cordycepin trong sản phẩm

Quả thể và hệ sợi nấm phát triển trên cơ chất nhộng cho hàm lượng cordycepin
cao nhất với 2,102mg/g và 3,419mg/g tương ứng, khác biệt rất có ý nghĩa với các
nghiệm thức khác về mặt thống kê ở mức P = 0,01.
Như vậy, có thể thấy môi trường bán rắn thích hợp để nuôi cấy đông trùng hạ
thảo là cơ chất nhộng, hàm lượng cordycepin thu được sẽ rất cao, sản phẩm nuôi cấy
sẽ có giá trị dược liệu hơn so với các môi trường nuôi cấy khác.
Trong khi đó, nghiên cứu của Kumar (2013) trên C. militaris tự nhiên cho
hàm lượng cordycepin là 0,288 mg/g, còn Huang (2009) cũng nuôi cấy trên giá thể
nhộng tằm cho hàm lượng cordycepin trung bình là 1,848 mg/g.
Bảng 7: Hàm lượng cordycepin trong quả thể và hệ sợi nấm

Nghiệm thức Hàm lượng cordycepin

trung bình mg/g

Môi trường - bắp kê 1,712bcd

Quả thể - bắp kê 1,655bcd

Môi trường - bắp 2,147bc

Quả thể - bắp 1,422cd

Môi trường – cơm 0,959d

Quả thể - cơm 2,489b

34
 Môi trường - nhộng cám 2,079bc

Quả thể - nhộng cám 0,935d

Môi trường - nhộng 3,419a

Quả thể - nhộng 2,103bc

3.1.3 Hàm lượng Guanosine trong mẫu sản phẩm:

Từ kết quả nghiên cứu, nhận thấy:
- Hàm lượng guanosine trong các sản phẩm sử dụng cơ chất nhộng (quả thể)
và nhộng cám (quả thể) cao:
+ Trên cơ chất nhộng (quả thể): hàm lượng guanosine là 1,483 mg/g
+ Trên cơ chất nhộng cám (quả thể): hàm lượng guanosine là 1,042 mg/g
- Hàm lượng guanosine thấp hơn trong các sản phẩm sử dụng cơ chất thực
vật, thấp nhất là cơ chất cơm (0,709 mg/g) và bắp (0,800 mg/g).
Theo Fan (2006), sản phẩm C. militaris nuôi cấy trong một số nghiên cứu có
hàm lượng guanosine trong khoảng (0,128 – 0,663 mg/g). Có thể thấy rằng hàm
lượng guanosine trong các sản phẩm của Viện CNSH-MT cao hơn hẳn so với số liệu
tham khảo trên.
Bảng 8: Hàm lượng guanosine có trong quả thể và hệ sợi nấm

Nghiệm thức Hàm lượng cordycepin

trung bình mg/g

Môi trường - bắp kê 0,967ab

Quả thể - bắp kê 0,334cd

Môi trường - bắp 0,801bc

Quả thể - bắp 0,342cd

Môi trường – cơm 0,709bcd

Quả thể - cơm 0,192d

Môi trường - nhộng cám 1,042ab

Quả thể - nhộng cám 0,841bc

Môi trường - nhộng 1,483a

Quả thể - nhộng 0,760bc

35
3.2 Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số và tro tổng số:
Kết quả phân tích các chỉ tiêu của nấm C. militaris (quả thể và sợi nấm phát
triển trên giá thể): tro tổng số, đạm tổng số, lipid tổng số của Viện Công nghệ Sinh
học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh như sau:
- Đạm tổng số: quả thể và hệ sợi nấm trên giá thể nhộng có hàm lượng cao
nhất lần lượt là 7,62 và 5,14 %,. Các loại giá thể cơm, bắp, kê có hàm lượng đạm
trong sợi nấm và quả thể khá thấp lần lượt là 2,16; 2,61 và 1,72%. So sánh với kết
quả nghiên cứu về đông trùng hạ thảo trên tằm dâu của Nguyễn Mậu Tuấn (2010)
trích dẫn bởi Bình Nguyên (2012), với 7,75% đạm tính trên khối lượng khô thì hàm
lượng đạm của nấm C. sinenes trên giá thể nhộng là tương đương.
- Lipid tổng số: hàm lượng lipid của quả thể và sợi nấm trên các giá thể nằm
trong khoảng từ 6,59 – 8,18%. Kết quả phân tích này cũng phù hợp với nghiên cứu
của Nguyễn Mậu Tuấn (2010) với 7,77% lipid tính trên khối lượng khô của đông
trùng hạ thảo tằm dâu.
- Tro tổng số: giá thể nhộng có hàm lượng tro cao nhất (5,50 - 7,30 %) gấp 2
– 3 lần so với giá thể thực vật. Giá thể cơm cho lượng tro tổng số thấp nhất với
2,02%.
Bảng 9: Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số và tro tổng số của nấm C.
militaris

Các chỉ tiêu

Môi trường
Đạm tổng số (%) Lipid tổng số (%) Tro tổng số (%)

Bắp – kê 2,16 6,85 3,87

Bắp 2,61 7,04 3,81

Cơm 1,72 8,19 2,02

Nhuộng 7,62 7,87 5,50

Nhuộng - cám 5,14 6,59 7,30

Phương pháp thử TCVN 8314:2009 TCVN 8314:2009 TCVN 8314:2009

nghiệm

Kết quả tính trên khối lượng mẫu sấy khô

Kết quả phân tích của Viện CNSH – MT
3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa:
Để đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các mẫu dịch chiết, thử nghiệm đông
trùng hạ thảo được sử dụng để đánh giá khả năng bắt gốc tự do của các hợp chất có

36
trong các mẫu dịch chiết, qua đó cũng đánh giá được khả năng kháng oxi hóa của
các hợp chất sinh học hiện diện trong Cordyceps.
Để so sánh một cách đầy đủ hoạt tính chống oxy hóa giữa các mẫu với nhau
cần căn cứ vào giá trị IC50 (nồng độ mẫu thử có khả năng làm giảm 50% gốc tự do
DPPH). Mẫu nào có giá trị IC50 thấp hơn, tức nồng độ mẫu thử có khả năng bắt
50% gốc DPPH thấp.

Hình 15: Khả năng kháng oxi hóa của các mẫu dịch chiết
Qua các giá trị IC50 cho thấy tất cả các thành phần sản phẩm nấm C. militaris
đều cho khả năng kháng oxi hóa.

37
 PHẦN 2: QUY TRÌNH THỰC HÀNH NUÔI CẤY NẤM CORDYCEPS
MILITARIS
CHƯƠNG 1: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHÂN LẬP NẤM CORDYCEPS
MILITARIS

I. Dụng cụ, thiết bị:

1. Dụng cụ:
- Ống đong.
- Đĩa petri.
- Cốc 1000ml
- Chay thủy tinh 500ml.
- Bình thủy tinh 500ml
- Dao
- Xô nhựa.
- Ống hút Pipet

Hình 16: Các thiết dụng cụ sử dụng trong phân lập

2. Thiết bị:
- Nồi điện.
- Máy khuấy từ.
- Máy đo pH.
- Cân 6 số lẽ.
- Nồi hấp tuyệt trùng autoclave.
38
 Hình 17: Các thiết bị được sử dụng phân lập
II. Nguyên vật liệu và hóa chất:

1. Nguyên vật liệu:

Giống đông trùng hạ thảo cordyceps militaris được nuôi trồng tại trường Đại
học Trà Vinh.
2. Hóa chất:

Hình 18: Các hóa chất được sử dụng cho phân lập
III. Cách tiến hành
1. Chuẩn bị môi trường phân lập:
- PGA (Khoai tây): 200g/l

39
- Dextrose: 20g/l
- Agar: 7g/l
- pH: 6,5
Tiến hành pha trong 500ml nước dùng cho khoảng 30 đĩa petri
2. Sơ đồ quy trình kỹ thuật:

Hình 19: Các thao tác thực hiện pha môi trường phân lập
3. Pha môi trường phân lập:
- PGA (Khoai tây) sau khi loại bỏ phần vỏ sẻ được rữa sạch, sau đó tiến hành cân
trọng lượng 100g sau đó cắt nhỏ cho vào nồi đun sau đó cho khoảng 300ml nước cất
vào nồi đun đến khi thấy ra hết dịch là được. Dùng vải mỏng lọc hết phần dịch trong
nồi.
- Dùng cốc thủy tinh có dung tích 500 ml cho cho 10g Dextrose, tiếp đến cho phần
dịch PGA vừa lọc được dùng máy khuấy từ khuấy đều hổn hợp trên, cho thêm nước
cất vào để đạt dung tích 500 ml vào cốc tiến hành đo pH và điều chỉnh đến khi pH=
6,5 tiến hành dừng lại.
- Dùng chay thủy tinh 500ml cho vào 3,5g Agar, tiếp đến cho hỗn hợp trong cốc vừa
điều chỉnh pH vào tiến hành hấp khử trùng môi trường trong 30 phút ở nhiệt độ
1210C.
- Chuẩn bị tủ cấy đổ môi trường: Môi trường sau khi được hấp khử trùng sẻ tiến
hành đổ vào đĩa petri dùng để phân lập nấm đông trùng hạ thảo. Trước khi đổ môi
trường tiến hành lao tủ cấy bằng cồn, bật đèn UV trong 15 phút sau để diệt vi sinh
vật bề mặt sau đó tiến hành đổ môi trường. Môi trường được cô đặc trong đĩa petri
được sử dụng sau 1 ngày để tiến hành dùng để phân lập nấm.

40
4. Phân lập Nấm Đông trùng hạ thảo:
a. Sơ đồ quy trình kỹ thuật:

Hình 20: Các bước tiến hành phân lập

b. Các bước thực hiện
- Chọn giống tiến hành phân lập: Nấm đông trùng hà thảo là một giống có giá trị
kinh tế cao và chứa các dược chất có lợi cho sức khỏe con người vì vậy để phân lập
nấm đông trùng hạ thảo chúng ta cần chọn mua giống ở cơ sở bán Giống đông trùng
hạ thảo chất lượng, có uy tín để mua về chúng ta nên chọn những bịt nấm không bị
nhiễm nấm mốc xanh, mốc đen. Nên xem kỹ ở phần đáy bịt để chọn được những bịt
nấm tươi chất lượng để tiến hành phân lập. Tuy nhiên nếu chúng ta mua giống đã
được phân lập sẳn thì sẻ đỡ phải tốn công chuẩn bị môi trường phân lập và khổi phải
tốn công tiến hành phân lập nấm nhưng giá thành tương đối cao hơn việc mua nấm
tươi về để tiến hành phân lập.
- Tiến hành phân lập giống: Trước khi tiến hành phân lập nấm ta vệ sinh tủ cấy, bật
đèn UV để diệt vi sinh vật. Trước khi cấy mẫu chuẩn bị đĩa petri, dao cấy, kẹp (Đã
được hấp khử khuẩn), đèn cồn, bình chứa cồn 960C để tiến hành khử khuẩn dụng cụ,
Bịt giống đông trùng hà thảo được tiến hành khử trùng bề mặt. Trước khi cấy tiến
hành khử khuẩn tay bằng cồn 700C. Khử trùng dụng cụ cấy bằng cồn sau đó mở bịt
giống nấm tưới dùng dao cấy kết hợp với kẹp cặt 1 sợi nấm đông trùng hạ thảo chọn
sợi còn tươi để vào đĩa petri sau đó ta tiến hành dùng dao cắt bỏ phần đầu và phần
gốc cắt 1 đoạn nhỏ có kích thước khoảng 1/10 mm để chuẩn bị cấy vào môi trường
trên đĩa Pêtri. Hơ đĩa petri đã chuẩn bị sẳn tiến hành hơ trên ngọn lữa đèn cồn sau
đó dùng kẹp gắp 1 phần sợ nấm đã được cắt nhỏ cấy lên môi trường thạch sau đó
dùng bao bịt thực phẩm tiến hành bao lại phần tiếp giáp giữa 2 miệng đĩa petri để
không cho không khí và vi sinh vật xâm nhập vào bên trong để vào trong tối để tiến
hành nuôi tơ nấm. Nấm đông trùng hạ thảo được phân lập sau thời gian nuôi cấy từ
7-10 ngày ta có thể sử dụng để tạo giống lắc.

41
 CHƯƠNG 2: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY LỎNG (LẮC) NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS
MILITARIS)

I. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:

1. Dụng cụ:
- Ống đong.
- Cốc 1000ml
- Tam giác 500ml
- Phích
- Ống hút Pipet
2. Thiết bị:
- Máy khuấy từ.
- Máy đo pH.
- Cân 6 số lẽ.
- Nồi hấp tuyệt trùng autoclave.
- Máy lắc môi trường lỏng

Hình 21: Các thiết bị sử dụng pha chế môi trường lỏng
II. Nguyên vật liệu và hóa chất
1. Nguyên vật liệu:
Giống đông trùng hạ thảo cordyceps militaris được phân lập trên đĩa pêtri.

42
2. Hóa chất:

Hình 22: Các hóa chất sử dụng pha chế môi trường lỏng
III. Cách tiến hành:
1. Chuẩn bị môi trường giống lắc:
- Yeast extreet 25g/l
- MgSO4 0,50g/l
- K2HPO4 1,0g/l
- Đường cát 20g/l
- pH 6,2
2. Tiến hành pha môi trường

Hình 23: Các bước thực hiện pha chế môi trường lỏng

43
3. Tiến hành pha 2 lít môi trường
Cho 50g Yeast extreet, MgSO4 100g, K2HPO4 2,0g, Đường cát 40g đong đủ
vào 2 lít nước vào phích, sau đó tiến hành chuẩn pH về 6,2 đem rót vào bình thủy
tinh 500ml khoảng 300ml môi trường trên sau đó dùng bông không thấm làm nút
kín miệng bình đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 30 phút.
4. Cách tiến hành tạo môi trường giống lắc:
a. Sơ đồ mô tả:

Hình 24: Các bước thực hiện tạo giống lắc

b. Các bước thực hiện:
- Dung dịch lắc sau khi tiến hành pha sẳn và hấp tuyệt trùng. Sau 1 ngày có thể tiến
hành tạo môi trường lắc cho giống Đông trùng hạ thảo.
- Vệ sinh tủ cấy cho dung dịch lắc vào tủ bật UV trong 20 phút để khử khuẩn bề mặt
tạo môi trường vô trùng trong tủ cấy. Dùng nấm Đông trùng hạ thảo đã được phân
lập trước đó 7-10 ngày, lúc này tơ nấm đã phát triển đều trên môi trường phân lập,
chọn những đĩa tơ đã phát triển kín đĩa petri tạo thành vòng tròn đồng tâm và có màu
đỏ nhạt trên đĩa petri không chọn những đĩa petri bị nhiễm mốc có màu khác lạ sẻ
làm ảnh hưởng đến chất lượng giống lắc.
- Các tiến hành: dùng cồn 700C khử khuẩn tay trước khi cấy, sau đó dùng dao cấy
khử khuẩn trên ngọn lữa đèn cồn, sau đó dùng dao cắt xung quanh đĩa petri khu vực
có màu đỏ nhạt, chia vòng tròn trên thành 4 phần bằng nhau. Tiếp đến cho khoảng
2 phần vòng tròn đã cắt ở trên vào môi trường lắc đã được chuẩn bị trước được chứa
44
trong bình thủy tinh, sau đó hơ khử khuẩn miệng bình trên ngọn lữa đèn cồn đậy
bình và đóng nấp lại. Ta cứ thực hiện các thao tác trên đến khi hết môi trường lắc.
Sau khi cho giống nấm đã phân lập vào môi trường ta tiến hành đưa lên máy lắc với
tốc độ 180 vòng/phút trong vòng 4-5 ngày là có thể sử dụng để nuôi cấy đông trùng
hạ thảo.

45
 CHƯƠNG 3: QUI TRÌNH NUÔI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
(CORDYCEPS MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ GẠO LỨC

I. Dụng cụ, thiết bị:

1. Dụng cụ:
- Ống đong.
- Cốc 500ml
- Bình thủy tinh 500ml
- Hộp nhựa
- Dao
- Xô
2. Thiết bị
- Nồi điện.
- Máy khuấy từ.
- Máy đo pH.
- Cân 6 số lẽ.
- Nồi hấp tuyệt trùng autoclave.
II. Nguyên vật liệu và hóa chất
1. Nguyên vật liệu
Giống lắc đã được lắc trên máy từ 5-7 ngày.
2. Hóa chất
- PGA (Khoai tây)
- Dextrose.
- Yeast extreet
- MgSO4
- K2HPO4
- Đường cát.
III. Cách tiến hành:
1. Chuẩn bị môi trường dịch thể:
- PGA (Khoai tây) 1 kg
- Dextrose 100g
- Yeast extreet 100g
- MgSO4 10g
46
- K2HPO4 15g
- Đường cát 300g
- Trứng gà 20 quả
- pH 6,2
2. Tiến hành pha môi trường cho 10 lít nước.
a. Pha môi trường:

Hình 25: Các bước pha môi trường dịch thể

- PGA (Khoai tây) sau khi loại bỏ phần vỏ sẻ được rữa sạch, sau đó tiến hành cân
trọng lượng 1 kg sau đó cắt nhỏ cho vào nồi đun sau đó cho khoảng 300 - 500ml
nước cất vào nồi đun đến khi thấy ra hết dịch là được. Sau đó dùng vải mỏng lọc hết
phần dịch.
- Cân trọng lượng chính xác các thành phần trên gồm: Dextrose, Yeast extreet,
MgSO4, K2HPO4, Đường cát và dịch PGA (Khoai tây) đã được lọc sẳn cho vào xô
lớn. Đong nước cất cho thêm vào để đạt 10 lít nước sau đó tiến hành điều chỉnh pH
về 6,2.

47
 Hình 26: Các bước tạo môi trường gạo lức
- Cho 60g gạo lức vào hộp nhựa, sau đó cho 100ml môi trường chuẩn bị sẳn vào
phần hộp gạo lức, đậy nập lại (hở 1 cạnh) tiến hành hấp khử trùng trong 30 phút ở
nhiệt độ 1210C sau đó để nguội chuẩn bị chủng giống.
b. Tiến hành chủng giống:
* Sơ đồ mô tả:

Hình 27: Các bước tiến hành chủng giống

- Giống lắc sau 4-5 ngày dùng máy lắc có chứa giống nấm đông trùng hạ thảo đã
được cô đặc có thể sử dụng để chủng giống đông trùng hạ thảo trên môi trường gạo
lức. Khi chọn giống lắc để sử dụng nên chọn những bình giống có độ đặc vừa phải
không nên chọn những bình giống quá đặc hoặc còn quá lõng. Không chọn những
bình giống mà màu sắc giống nấm bám trên phần thành bình có màu sắc khác lạ so
với các bình còn lại. Dùng giống lắc đã chuẩn bị sẳn cho vào tủ cấy để tiến hành
chủng giống.
- Trước khi tiến hành cấy giống chúng ta tiến hành vệ sinh tủ cấy, bật đèn UV để vệ
sinh bề mặt sau đó mới tiến hành chủng giống. Chúng ta Cho khoảng 10-15 ml dịch
lắc vào hộp chứa gạo lức đã được hấp khử trùng và để nguội sau đó đóng nấp hộp
kín. Tiến hành chủng giống cho đến khi hết môi trường gạo lức. Đem hộp nấm đã
được chủng vào khu vực lạnh duy trì nhiệt độ khoảng 25-260C, tiến hành chăm sóc
và đón nấm.

48
 PHẦN 3: KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

I. KẾT QUẢ NUÔI CẤY GIỐNG GỐC:

Hình 28: Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 3 ngày phân lập
Nấm đông trùng hạ thảo được phân lập từ hệ sợi trên nền tảng nguồn nấm tươi
chất lượng cao với các thao tác của quy trình phân lập được tiến hành cụ thể và tỉ
mỹ từ bước pha môi trường nuôi cấy đến bước phân lập trong tủ cấy vô trùng nên
hệ tơ sau khi đưa vào bóng tối để nuôi sợi ở nhiệt độ khoảng 25-260C thì sau 3 ngày
ta quan sát được hệ sợ đang phát triển rất tốt nấm lan rộng phát triển trên bề mặt môi
trường thạch trên đĩa pêtri, đồng thời không có dấu hiệu bị nhiễm các loại nấm khác.
II. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH TẠO GIỐNG LẮC

Hình 29: Giống lắc sau 7 ngày được lắc trên máy

49
 Giống lắc sau 7-10 ngày được lắc trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ta
thấy được giống có màu vàng nhạt đặc trưng của giống nấm đông trùng hạ thảo, dịch
lắc hơi xệt lại, ở điểm tiếp giáp giữa dịch giống lắc và phần bình thủy tinh có bám
một vòng nấm màu vàng. Quan sát bằng cảm quan ta nhận thấy giống lắc phát triển
tốt có thể sự dụng để nuôi cấy Đông trùng hạ thảo.
III. KẾT QUẢ NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TRÊN MÔI TRƯỜNG
GẠO LỨC

Hình 30: Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 60 ngày được nuôi cấy
trên môi trường gạo lức
Nấm Đông trùng hạ thảo sau 60 ngày tiến hành nuôi trong điều kiện phòng
lạnh, nấm phát triển tốt không có hộp nấm bị nhiễm các loại nấm mốc. Nấm phát
triển đều có màu Đỏ nhạt đặc trưng của giống nấm Đông trung hạ thảo.
Bảng 10: Khảo sát Trọng lượng, chiều dài sợ nấm và số lượng sợi nấm

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

Trọng lượng (g) 150 150 149 170 169 162 172

Số sợi nấm (sợi) 153 141 177 214 225 194 174

Tb chiều dài
54,52 60,64 63,75 55,03 58,31 64,20 60,97
nấm (mm)

* Ghi chú: H1: Hộp số 1; H2: Hột số 2; H3: Hộp số 3; H4: Hộp số 4; H5:
Hộp số 5; H6: Hộp số 6; H7: Hộp số 7.
Kết quả cho thấy hộp có khối lượng nặng nhất là 172g (H7) và nhẹ nhất là
150g (H1 và H2), Trọng lượng trung bình mỗi hợp là 160,29 g; Hộp có số lượng sợi
nấm nhiều nhất là 225 sợi (H5) và số lượng sợi nấm ít nhất là 141 (H2), Trung bình
số sợi nấm là 182,57; Sợi nấm có chiều dài nhất là 63,75 mm (H3), có chiều dài ngắn
nhất là 54,52 mm (H1), chiều dài trung bình sợi nấm là 59,63 mm.
Kết quả trên cho thấy rằng trọng lượng hộp nấm có ảnh hưởng đến số lượng
sợi nấm trên mỗi hộp những không có ảnh hưởng đến chiều dài trung bình mỗi sợi
50
nấm trên mỗi hộp, mà chiều dài trung bình của mỗi hộp nấm chiệu ảnh hưởng bởi
hàm lượng dinh dưỡng trong cơ chất nuôi trồng và điều kiện nuôi trồng như: ánh
sáng, nhiệt độ…trong nhà trồng có tác động trực tiếp đến các giai đoạn sinh trưởng
của nấm đông trùng hạ thảo.
Tuy nhiên cũng có thể thấy rằng không phải có trọng lượng lớn thì số lượng
sợi nấm sẻ nhiều bởi vì trong một hộp nấm có diện tích nhất định khi nấm phát triển
đến ngững thì không thể phát triển số lượng sợi nấm thêm được nữa, mặc khác khi
hộp nấm có nhiều sợi nấm to thì số lượng sợi nấm sẻ giảm lại (bảng 10).

51
 PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu trong nước:
BS. Trần Văn Năm, Đông trùng hạ thảo trong y học, 2014
Nguyễn Thị Liên Thương và ctv (2016). Nấm đông trùng hạ thảo cordyceps
militaris: đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
nuôi trồng nấm. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. 44 (2016): 9-22.
Trần Văn Năm và ctv (2014). Chuyên đề: Đông trùng hạ thảo – công dụng,
xu hướng sản xuất và thương mại. Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ TP.
HCM.
2. Tài liệu ngoài nước:
Basith M., Madelin M.F., 1968. Studies on the production of perithecial
stromata by Cordyceps militaris in artificial culture. Canadian Journal Botany
46:473–480.
Bushan Shrestha, Weimin Zhang, Yongjie Zhang, Xingzhong Liu. 2012. The
medicinal fungus Cordyceps militaris: research and development. German
mycology society and Springer. Myco. Progress.
Byung-Tae P., Kwang-Heum N., Eui-Cha J., Jae Wan P., Ha-Hyung K.,
2009. Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom
Cordyceps militaris. Korean Journal of Physiol Pharmacology 13: 49 - 54.
Chang, H. L., Chao, G. R., Chen, C. C., Mau, J. L., 2001. Non-volatile taste
components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps
militarismtcelia. Food Chemistry. 74:203-207.
Che Z.M., Wang Y., Zhou L.L., 2004. Study on the breeding of a new variety
of Cordyceps militaris by mutated with ultraviolet radiation. Food Ferment Industry.
30(8):35–38.
Choi Y.S., Lee H.K., Kim S.H., 1999. Production of fruiting body using
cultures of entomopathogenic fungal species. Korean Journal of Mycology. 27: 15–
19
Christian G.D.N. E. and Henry A. C. F., 1837. Das System der Pilze: part one.
Das S.K., Masuda M., Mikio S., 2010. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps
militaris: current state and prospects. Fitoterapia. 81:961–968.
Comparative study on cultivated Cordyceps militaris and wild Cordyceps
sinensis. Journal of Chengdu University. 33(3):82–84.
De Bary A., 1887. Comparative morphology and biology of the fungi,
mycetozoa and bacteria. Clarendon, Oxford.
Dong, C.H., Yao, Y.J. (2005) Nutritional requirements of mycelia growth of
Cordyceps sinensis in submerged culture. J. Applied Microbiology, 99: 483-492.

52
 Dong, C.H., Yao, Y.J. (2007). In vitro evaluation of antioxidantactivities of
aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis. Food
Science and Technology. Vol. 41: 669-677
Farlow W.G., Seymour A.B., 1888. A provisional host-index of the fungi of
the United States: part 1. Polypetalae, Cambridge.
Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G. and
Zhongzheng G., 2011. Structural characterization and antioxidant activity of
purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris. African Journal of
Microbiology Research. 5(18): 2743-2751.
Gao S.Y., Wang F.Z., 2008. Research of commercialized cultivation
technology on Cordyceps militaris. North Hortic 9:212–215.
Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000. Study on influences of abiotic factors on
fruitbody differentiation of Cordyceps militaris. Acta Agriculture Shanghai. 16: 93–
98.
Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000. Study on influences of abiotic factors on
fruitbody differentiation of Cordyceps militaris. Acta Agriculture Shanghai. 16: 93–
98.
Gong C.L., Pan Z.H., Zheng X.J., 2006a. Anti oxidation of cultured
Cordyceps militaris growing on silkworm pupa. In: Proceedings of International
Workshop on Silk handcrafts cottage industries and silk enterprises development in
Africa, Europe, Central Asia and the Near East, & Second Executive Meeting of
Black, Cas-pian seas and Central Asia Silk Association (BACSA), Bursa, Turkey,
pp 615−620.
Gong C.L., Pan Z.H., Zheng X.J., 2006b. Immunoregulation function of
artificially Cordyceps militaris growing on pupae of silkworm Bombyx mori for
mice. In: Proceedings of International Workshop on Silk handcrafts cottage
industries and silk enterprises develop-ment in Africa, Europe, Central Asia and the
Near East, & Second Executive Meeting of Black, Caspian seas and Central Asia
Silk Association (BACSA), Bursa, Turkey, pp 633−638.
Gu Y.X., Wang Z.S., Li S.X., 2007. Effect of multiple factors on
accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris. Food Chemistry
102:1304–1309.
Halpern G.M., 1999. Cordyceps: China’s healing mushroom. Avery, New
York
Harada Y., Akiyama N., Yamamoto K., Shirota Y., 1995. Production of
Cordyceps militaris fruit body on artificially inoculated pupae of Mamestra
brassicae in the laboratory. Transactions of the Mycological Society of Japan. 36:
67–72.
Holliday JC, Cleaver P, Loomis-Powers M, and Patel D (2004). Analysis of
quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis
(Berk.) Sacc. (Ascomycetes). International journal of medicinal mushroom. Vol. 6:
53
151-164. 7. (2006). Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional
Chinese medicine. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Vol. 41: 1571-1584.
Hong I.P., Kang P.D., Kim K.Y., 2010. Fruit body formation on silkworm by
Cordyceps militaris. Mycobiology. 38:128–132.
Huang S.J., Tsai S.Y., Lee Y.L., 2006. Nonvolatile taste components of
fruiting bodies and mycelia of Cordyceps militaris. Food Science Technology
39:577–583.
Hur H., 2008. Chemical Ingredients of Cordyceps militaris. Mycobiology.
36(4):233-235.
Investigation on artificial fruiting of Cordyceps militaris. Korean Journal of
Mycology. 30: 6–10. Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006. Selection of superior
strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity.
Mycobiology. 34: 131–137.
Jae-Sung K., Kumar S., Se-Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T. H.,
Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., Hong Sung C., Yeal P., Sung-Jun
K., 2006. A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps
militaris. Journal of Microbiology 44(6):622-31.
Jones K., 1997. Cordyceps: tonic food of ancient China. Sylvan, Washington.
Kamble V.R. and Agre D.G., 2012. Reinvestigation of insect parasite fungus
Cordyceps militaris from Maharashtra. Bionano Frontier 5(2):224-225.
Khan M.A., Tania M., Zhang D.Z., 2010. Cordyceps mushroom: a potent
anticancer nutraceutical. Open Nutraceuticals Journal. 3:179–183
Kim S.W., Hwang H.J., Xu C.P., 2003. Optimization of submerged culture
process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by
Cordyceps militaris C738. Journal of Apply Microbiology. 94:120–126.
Kobayasi Y., 1941. The genus Cordyceps and its allies. Science Reports of
the Tokyo Bunrika Daigaku section B. 84(5):53–260.
Kobayasi Y., 1981. Revision of the genus Cordyceps and its allies 1. Bulletin
of the National Science Museum Tokyo. 7:1–13.
Kobayasi Y., 1982. Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella.
Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York.
Kwon J.S., Lee J.S., Shin W.C., 2009. Optimization of culture conditions and
medium components for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides
with Cordyceps militaris in liquid culture. Biotechnology and Bioprocess
Engineering. 14:756–762.
Leatherdale D., 1970. The arthropod hosts of entomogenous fungi in Britain.
Entomophaga. 15:419–435.
Li C.B., Tong X.D., Bai J., 2004. Artificial stromata production of Cordyceps
militaris. Journal of Dalian National University. 6(5):29–31.
54
 Li C.L., Liu X.L., Zheng X.Q., 2011. Mutagenesis of Cordyceps militaris
protoplast for high production of exopolysaccharide. Indian Microbiology.
41(2):51–56.
Li M.N., Wu X.J., Li C.Y., 2003. Molecular analysis of degeneration of
artificial planted Cordyceps militaris. Mycosystema 22:277– 282.
Li N., Song J.G., Liu J.Y., Zhang H., 1995. Compared chemical composition
between Cordyceps militaris and Cordycpes sinensis. Journal of Jilin Agriculture
University 17, 80–3. (in Chinese).
Lim L., Lee C., Chang E., 2012. Optimization of solid state culture conditions
for the production of adenosine, cordycepin, and D mannitol in fruiting bodies of
medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes).
International Journal of Medicinal Mushrooms. 14:181–188.
Lin Q.Q., Qiu X.H., Zheng Z.L., 2010. Characteristics of the degenerate
strains of Cordyceps militaris. Mycosystema 29:670– 677.
Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K.,
Lai M.N., Jeng K.C., 2007. Improvement in sperm production in subfertile boars by
Cordyceps militaris. The American Journal of Chinese Medicine.35(4):631-41.
Liu D., He L.L., Wang Z.Q., 2006. The influences of subculture of Cordyceps
militaris to colonial morphology and fruitbody yield. Journal of Shenyang
Agriculture University. 37:538–541.
Liu M.M., Ning S.Y., Cui X.Y., 2008. Optimization of submerged culture
condition for Cordyceps militaris using response surface methodology. China
Agricultural Science. 24(5):127–131.
Liu X.L., Zhou J.Z., Huang K.H., 2009. Study on preparation and regeneration
of protoplast of Cordyceps militaris. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiens.
21(9):119–120.
Liu Z.Y., Yao Y.J., Liang Z.Q., 2001. Molecular evidence for the
anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research.
105: 827–32.
Lu J.M., Zeng Z.J., He H.Q., 2005. Culture technique of Cordyceps militaris
on artificial media. Guangdong Agricultural Science. 2:88–89.
Ma L.P., Zhao J.F., Liu K.Y., 2008. Research on the isolation condition of
Cordyceps militaris protoplast. Journal of Anhui Agricultural Science 36:14612–
14613.
Ma T., Feng Y., Wu X.P., 2007. Primary investigation of a host insect of
Cordyceps militaris and analysis of its main ingredients. Forest Resources 20:63–
67.
Mains E.B., 1958. North American entomogenous species of Cordyceps.
Mycologia. 50:169–222. D.J., Jones K., Hughes K., 2002. Botanical medicines: the
desk reference for major herbal supplements, 2nd edn. Haworth.
55
 Mizuno T., 1999. Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link
(Ascomycetes) and Isaria Fr. (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi,
“Tochukaso” (Review). International Journal of Medicinal Mushrooms. 1:251-261.
Moore R.T., 1964. Fine structure of mycota: 12 Karyochorisis – somatic
nuclear division – in Cordyceps militaris. Z Zellforsch. 63:921–937.
Müller-Kögler E., 1965. Cordyceps militaris (Fr.) Link: Beobachtun-gen und
Versuche anlässlich eines Fundes aufTipula paludosa Meig. (Dipt., Tipul.). Z
Angew Entomol. 55:409–418.
Ni H., Li H.H., Huang W.F., 2007. Research and product develop-ment of
Cordyceps militaris and its bioactive substances. Review Science and Technology
25(15):75–79.
Panigrahi A., 1995. Fungus C. militaris infestation in the pupa of the tea pest
Andraca bipunctata Walker. Environmental Ecology. 13:942–946.
Paterson R.R.M., 2008. Cordyceps—a traditional Chinese medicine and
another fungal therapeutic biofactory? Phytochemistry. 69:1469–1495.
Paul M. K., Paul F. C., David W. M. and Stalpers J. A., 2008. Dictionary of
the Fungi; CABI.
Peng Zh.,Yongliang X., Guohua X., Chenghui X., Xiao H., Siwei Zh.,
Huajun Zh., Yin Huang, Yan Zh., Shengyue W., Guo-Ping Zh., Xingzhong L.,
Raymond J. St L. and Chengshu W., 2011. Genome sequence of the insect
pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine.
Genome Biology,12: 116.
Peng Zheng, Yongliang Xia, Guohua Xiao, Chenghui Xiong, Xiao Hu, Siwei
Zhang, Huajun Zheng,Yin Huang, Yan Zhou, Shengyue Wang, Guo-Ping Zhao,
Xingzhong Liu, Raymond J St Leger and Chengshu Wang. 2011. Genome sequence
of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a value traditional Chinese
medicine. BioMed Central, http://genomebiology.com/2011/12/11/R116. 21pp.
Ren W.Y., Zhao H., Wu Z.K., 2009. Techniques for fast and high yielding
cultivation of the valuable edible and medicinal mushroom, Cordyceps militaris.
China Agricultural Technology Extension. 25(5):28–29.
Russell R., Paterson M. 2008. Cordyceps – A traditional Chinese medicine
and anotherfungal therapeutic biofactory? Phytochemistry 69 (2008) 1469–1495.
Sato H. and Shimazu M., 2002. Stromata production for Cordyceps militaris
(Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host
insects. Applied Entomology and Zoology. 37:85–92.
Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-
Kil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K., 2009. Cordycepin Suppresses
Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharide-
induced Inflammation in Macrophages. Immune Network. 9(3):98-105.

56
 Shanor L., 1936. The production of mature perithecia of Cordyceps militaris
(Linn.) Link in laboratory culture. Journal of the Elisha Mitchell Scientific Society.
52:99–105.
Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007. Effects of culture conditions on the
mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of
Cordyceps militaris. Biochemical Engineering Journal. 33, 193–201.
Shonkor K. D., Shinya F., Mina M. and Akihiko S., 2010. Efficient Production
of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris
Mutant. Lecture Notes in Engineering and Computer Science. 20-22.
Shonkor Kumar Das, Mina Matsuda, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara.
2010. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and
prospects. Fitoterapia. 81: 961-968.
Shrestha B., Lee W.H., Han S.K., Sung J.M., 2006. Observations on Some of
the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of Cordyceps militaris
Isolates. Mycobiology. 34(2):83-91.
Shrestha B., Park Y.J., Han S.K., 2004. Instability in vitro fruiting of
Cordyceps militaris. Journal of Mushroom Science and Production. 2:140–144.
Shrestha B., Sung J.M., 2005. Notes on Cordyceps species collected from
central region of Nepal. Mycobiology 33:235–239. Shrestha B., Zhang W.M., Zhang
Y.J., 2010. What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis
(Ophiocordycipitaceae)?.Mycology. 1:228–236.
Stensrud Ø., Hywel-Jones N.L., Schumacher T., 2005. Towards a
phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm
divergent lineages and paraphyly. Mycological Research. 109: 41–56.
Sung G.H., Spatafora J.W., 2004. Cordyceps cardinali ssp. nov., a new species
of Cordyceps with an east Asian-eastern North American distribution. Mycologia
96:658–666.
Sung J.M., Park Y.J., Lee J.O., 2007. Effect of preservation periods and
subcultures on fruiting body formation of Cordyceps militaris in vitro. Mycobiology
34:196–199 Supplements. American Journal of Chinese Medicine. 35(4):631-41.
Wang L., Zhang W.M., Hu B., 2008. Genetic variation of Cordyceps militaris
and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data. Fungal
Divers 31:147–155.
Wang X.L., Yao Y.J., 2011. Host insect species of Ophiocordyceps sinensis:
a review. ZooKeys. 127:43–59.
Wang X.Q., Chen C.Q., Zhang R., 2002. Methodological studies on
cultivation of Cordyceps militaris on pupae of Antheraea pernyi. Journal of Anhui
Agricultural Science. 30:965-968.
Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-
Dong L., Sang Wha L., Su-Yeong S. and Min-Ho J., 2010 .The Anti-inflammatory
57
Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage.
Mycobiology. 38(1): 46-51.
Xie C.Y., Gu Z.X., Fan G.J., 2009a. Production of cordycepin and mycelia by
submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture. Applied
Biochemistry and Biotechnology. 158:483–492.
Xie C.Y., Liu G.X., Gu Z.X., 2009b. Effects of culture conditions on
mycelium biomass and intracellular cordycepin production of Cordyceps militaris
in natural medium. Annua Microbiology. 59:293–299.
Xiong C.H., Xia Y.L., Zheng P., 2010. Developmental stage-specific gene
expression profiling for a medicinal fungus Cordyceps militaris. Mycology 1:25–66.
Yahagi N., Yahagi R., Takano F., 2004. Growth of ascoscarps from cultured
Cordyceps militaris(L.:Fr.) Fr. and Cordyceps formicarum Kobayasi in an agar
medium. Nippon Kingakukai Kaiho. 45:15–19.
Yan H., Zhu D., Xu D., Wu J. and Bian X., 2008. A study on Cordyceps
militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis. African
Journal of Biotechnology. 7 (22): 4004-4009.
Young-Joon A., Suck-Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S. and Don-Ha C.,
2000. Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of
Cordyceps militaris against Clostridium spp. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 48: 2744−2748.
Yu H.M., Wang B.S., Huang S.C., 2006. Comparison of protective effects
between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against
oxidative damage. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 54:3132–3138.
Yue D.C., Yang Y.P., Wang S.F., 1982. Preliminary study on stroma
formation of Cordyceps militaris strain (Briefing). Journal of China Medicinal
Materrial. 05:7 Yue G.G.L., Lau C.B.S., Fung K.P., 2008. Effects of Cordyceps
sinensis, Cordyceps militaris and their isolated compounds on ion transport in Calu-
3 human airway epithelial cells. Journal of Ethno-pharmacology. 117:92–101.
Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., Dong Ki P. and Toshimitsu H.,
2007. In Vivo Anti influenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic
Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated Soybeans.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55: 10194–10199.
Zhang J.Y., Wu K.L., Duan J., 2010. Influence of air permeability on growth
of Cordyceps militaris. Guangdong Agricultural Science. 4:45–47. Zhang X.K. and
Liu W.X., 1997. Experimental studies on planting Cordyceps militaris (L. ex Fr.)
Link with different culture materials. Edible Fungi China. 16(2):21–22.
Zhang Y.J., Li E., Wang C.S., 2012. Ophiocordyceps sinensis, the flagship
fungus of China: terminology, life strategy and ecology. Mycology. 3:2–10. Zhang
Z., Lei Z., Lu Y., 2008. Chemical composition and bioactivity changes in stale rice
after fermentation with Cordyceps sinensis. Journal of Bioscience and
Bioengineering. 106: 188–93.
58
 Zhou H.Y., Bian Y.B., 2007. Identification and selection of high cordycepin-
yielding protoplast fusion products of Cordyceps militaris. Acta Edulis Fungi.
14(2):65–70.
Zhou L.H., Luo L.M., 2009. Preparation and regeneration of protoplasts from
Cordyceps militaris. Hubei Agricultual Science. 48:1621–1624.

59