XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLOROPHYLL BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC)

1. Giới thiệu.
Rau cải bó xôi (Spinacia oleracea L.) còn có tên là rau bina, rau chân vịt, là loại rau được
trồng phổ biến ở nước ta. Đây là loại rau thường được sử dụng trong chế biến món ăn
hoặc ép nước để uống và có giá trị dinh dưỡng cao. Rau bina được xem như là một "siêu
thực phẩm" nhờ có nguồn vitamin và khoáng chất tuyệt vời đối với sức khỏe. cải bó xôi
là loại rau có giá trị dinh dưỡng cao, nhiều vitamin thiết yếu như: A, K, D, E, khoáng chất
Fe, P, Ca và có rất nhiều Chlorophyll và các dẫn xuất của nó.
Chlorophyll (chất diệp lục) là sắc tố màu xanh lá cây được tìm thấy trong cây xanh, tảo,
cây dương xỉ, rêu và một số loại vi khuẩn. Chlorophyll có nhiều trong các loại rau lá
xanh như mầm lúa mì, rau ngò tây, cải bó xôi, rau xà lách rocket và các loại đậu...
Chlorophyll chịu trách nhiệm thu nhận năng lượng từ ánh sáng mặt trời cho quá trình
quang hợp, tạo ra tinh bột và oxy từ cacbon dioxit và nước, và chuyển hóa quang năng
thành hóa năng [1] Chlorophyll và các dẫn xuất của nó như chlorophyllin được biết đến
là các chất có hoạt động chống oxy hóa. Chlorophyll có thể giúp trì hoãn hoặc ngăn ngừa
một số bệnh như ung thư, là biểu hiện lão hóa gây ra bởi các gốc tự do.
Trong công nghiệp thực phẩm, chlorophyll cũng là một chất màu thực phẩm (E140),
được sử dụng để bổ sung trong một số sản phẩm bánh kẹo, súp, sốt, các sản phẩm trái
cây, nước chấm, mứt, nước giải khát hoặc dầu thực vật để tăng giá trị cảm quan.
Trong y học, chlorophyll được sử dụng với mục đích chữa bệnh như: ngăn ngừa và điều
trị ung thư, giải độc gan, kích thích hệ thống miễn dịch, kháng viêm và da phát ban, thanh
lọc máu và độc tố trong cơ thể, làm sạch ruột, chữa lành vết thương…[2]
Chlorophyll có thể ức chế sự tích lũy canxi oxalat dihydrate (còn gọi là sỏi thận).
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó thường được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm
dược phẩm, chúng làm tăng nhanh khả năng chữa lành vết thương đến hơn 25% [3]
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu
Rau cải bó xôi được mua tại chợ hay các cửa hàng thực phẩm tại Gò Vấp, Tp. Hồ Chí
Minh. Sau khi mua về sẽ chọn những lá tươi, không bị hư hỏng, dập, úa, không bị sâu
bệnh, … xử lý sơ bộ nhằm loại bỏ các tạp chất cơ học chứa lẫn như cành vụn, đất cát....
Sau đó, mẫu được để cho ráo nước, tránh ánh nắng trực tiếp tránh ảnh hưởng đến kết quả
nghiên cứu.
2.1.1 Dụng cụ
Phiễu tách 500ml 1 Bảng mỏng (20cm x 20 cm) (DC-
Alufolien, Kieselgel 60 / Kieselgur F254,
1 Becker 100ml
Art.5567 Merck)
1 Becker 250ml
1 Hủ thủy tinh có nắp ( bình khai triển)
1 erlen 250 ml
1 Kéo
1 Pipet 10ml
1 Máy sấy
1 pipet 5ml
1 Thiết bị UVIS
1 pipet 2ml
1 Nhíp gắp bản mỏng
1 Cối chày
Lọ bi
2 Mao mạch
2.1.2 Hóa chất
Acetone 80%???
Cồn etylic 900
Toluen
ete dầu hoả
CaCo3
2.2 Phương pháp
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó
đã đặt các chất cần tách Giọt dung dịch mẫu được nhỏ trên đường xuất, còn rìa bản được
nhúng vào dung môi thích hợp. Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển
động dọc theo lớp hấp phụ và chuyển vận các cấu tử chứa hỗn hợp với các vận tốc khác
nhau đưa đến việc tách các cấu tử Sự khếch tán các cấu tử trong lớp hấp phụ vừa theo
chiều dọc vừa theo chiều ngang vì vậy có thể xem quá trình sắc ký thực hiện theo 2
chiều .
Ưu điểm: Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích; Có thể phân tích đồng thời mẫu và
chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân
tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
Chiết xuất sắc tố lá
Lấy 10 gam cải bó xôi còn tươi cắt nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá), trộn thêm 2 gam bột
CaCO3 để trung hoà dịch axit của tế bào. Nghiền các mẩu lá đến khi thành một thể đồng
nhất, cho 15 - 20 ml axeton 80% hoặc cồn etylic 900 vào cối sứ khuấy đều và để 5 phút
rồi lọc bằng bông trên phễu thuỷ tinh, cô quay thu được mẫu đã chiết. Do tính chất của
chlorophyll không bền khi có acid và ánh sáng nên dụng cụ thử nghiệm phải được trung
hòa, đảm bảo không có acid, lượng vết acid sẽ làm chlorophyll chuyển thành pheophytin.
Khi có ánh sáng chlorophyll sẽ bị phân hủy rất nhanh nên cần tiến hành thí nghiệm ở nơi
có ánh sáng dịu và dụng cụ chứa cản sáng.

Tách chất bằng sắc kí bản mỏng (TLC)

Hệ dung môi: ethyl acetate- axeton (5:5).
Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) Bình khai triển là bình thủy tinh
hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín. Bão hòa hơi dung môi rồi
rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình.Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở nhiệt độ
phòng. Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng kéo
thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm. Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản
để đưa mẫu lên bản mỏng. Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 0,5cm -
1cm và cách bề mặt dung môi từ 0,2 – 0.3 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 -
6mm và cách nhau 15mm. [5] Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 0.5cm
để tránh hiệu ứng bờ. Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình khai triển, các vết
chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ
không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra
khỏi bình, sấy khô và đo bước sóng 645nm-663nm.
đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh,
đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách. Tính hệ số Rf.

Mẫu

Cắt nhỏ

CaCO3, Cho vào becker

5 phút
axeton 80%

Hợp chất màu Màu sắc Rf

Lọc chlorophyll a blue-green 0.46
chlorophyll b Green 0.42

Chiết lấy phần trên

(màu xanh)

Cô quay

Dịch chiết

Xác định chất bằng

TLC

Tính Rf
Xác định hàm lượng cholorophyll
Cân 0.1 g mẫu thêm 50 ml dung môi chiết để hòa tan hoàn tàn hỗn hợp Để dịch chiết lắng
10 min và sau đó gạn một lượng vừa đủ dịch chiết qua giấy lọc huyển dịch chiết đã lọc
vào cuvet và đo độ hấp thụ bằng máy đo phổ ở bước sóng 665 nm, 705 nm và 625 nm
Hàm lượng clorophyl tính bằng mg/kg theo công thức (TCVN10414:2014):
𝑘 × 𝐴𝑐𝑜𝑐𝑡 × 𝑉
𝑤=
𝑚×𝑙
Trong đó:
Acoct : độ ẩm thụ hiệu chính tính bằng A665-(A705+A625)/2
A665: độ hấp thụ ở bước sóng 665nm
A705: độ hấp thụ ở bước sóng 705nm
A625: độ hấp thụ ở bước sóng 625nm
k là hằng số bằng 13
l là chiều dài đường quang của cuvetquang học, tính bằng cm
m là khối lượng của phần mẩu thử(g)
Vlà thể tích của dung môi được thêm vào ống (ml)
3. Kết quả

Rf = a/B
Trong đó: Rf: hệ số di chuyển, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất
thử và khoảng dịch chuyển của dung môi

a (cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử.
b (cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi
của vết.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
 Hình: 1 phân tách các chất có trong cải bó xôi

Hình: 2 sắc kí bảng mỏng cholorophyll

a= 1,3 cm
b=2.1cm
 V ethyl acetate: V hexan Các vệt màu Rf
3,5:6,5 Xanh lá nhạt (a) Rf=a/B=1,3/4=0.325
Xanh lá đậm(b) Rf=b/B=1.8/4=0,45

Hàm lượng clorophyl tính bằng mg/kg theo công thức (TCVN10414:2014):
𝑘 × 𝐴𝑐𝑜𝑐𝑡 × 𝑉
𝑤=
𝑚×𝑙

Acoct= A665-(A705+A625)/2=0,204-(0,178+0,169)/2=0.0305
13×0.0305×50
W= =198,25 mg/kg
0.1×1

4. kết luận
Từ khối lượng ban đầu 500g cải bó xôi sau quá trình trích ly ta thu được …………g
chlorophyll.Từ màu sắc và khoảng giá trị Rf t có thể định danh chất màu có trong cải bó
xôi: a: màu xanh nhạt Rf=0.325 là cholorophyll b và b: màu xanh đậm Rf =0.45 là
cholorophyll a.
4. Tài liệu tham khảo
[1] Thuyết minh dự thảo tiêu chuẩn quốc gia Thực vật và thực phẩm nguồn gốc thực vật
[2]. M. G. Ferruzzi and J. Blakeslee, (2007), "Digestion, absorption, and cancer
preventative activity of dietary chlorophyll derivatives," Nutrition Research, vol. 27, pp.
1-12.
[3]. L. W. Smith and A. E. Livingston, (1945), "Wound healing: an experimental study of
water soluble chlorophyll derivatives in conjunction with various antibacterial agents,"
The American Journal of Surgery, vol. 67, pp. 30-39
[4] Áp dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ
thông
[5] https://duocdienvietnam.com/phuong-phap-sac-ky-lop-mong
[6] Gíao trình phân tích công cụ thực phẩm