Machine Translated by Google

Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832

Danh sách nội dung có sẵn tại ScienceDirect

Nghiên cứu carbohydrate

trang chủ tạp chí: www.elsevier.com/locate/carres

Đặc tính của polysaccharid vách tế bào từ đậu bắp

(Abelmoschus esculentus (L.) Moench)
b
, Henk A. Schols , Tanaboon Sajjaanantakul ,
một một

Nipaporn Sengkhamparn a, b, René Verhoef

một,*
Alphons GJ Voragen
một

Phòng thí nghiệm Hóa học Thực phẩm, Khoa Công nghệ Nông nghiệp và Khoa học Thực phẩm, Đại học Wageningen, PO Box 8129, 6700 EV Wageningen, Hà Lan b Khoa Khoa học và Công nghệ
Thực phẩm, Khoa Công nghiệp Nông nghiệp, Đại học Kasetsart, Ladyao, Jatujak, Bangkok 10900, Thái Lan

thông tin bài viết trừu tượng

Lịch sử bài viết: Vỏ đậu bắp được sử dụng phổ biến ở châu Á như một loại rau, nguyên liệu thực phẩm, cũng như một loại thuốc
Nhận ngày 25 tháng 6 năm 2008
truyền thống cho nhiều mục đích khác nhau; ví dụ, làm thuốc lợi tiểu, điều trị các bệnh răng miệng và giảm/
Nhận được ở dạng sửa đổi ngày 8 tháng 10 năm 2008
ngăn ngừa kích ứng dạ dày. Các đặc tính tốt cho sức khỏe được cho là bắt nguồn từ hàm lượng polysacarit cao
Chấp nhận ngày 9 tháng 10 năm 2008
của vỏ đậu bắp, dẫn đến dung dịch có độ nhớt cao với vẻ ngoài nhầy nhụa khi đậu bắp được chiết xuất bằng
Có sẵn trực tuyến ngày 21 tháng 10 năm 2008
nước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày một đặc điểm cấu trúc của tất cả các charide polysac chính
của thành tế bào có nguồn gốc từ vỏ đậu bắp. Quá trình chiết xuất tuần tự vật liệu thành tế bào đậu bắp thu
từ khóa:
được các phần chất rắn hòa tan có thể chiết xuất được bằng cách sử dụng dung dịch đệm nóng (HBSS), tác nhân
Đậu bắp

chelate (CHSS), kiềm loãng (DASS) và kiềm đậm đặc (CASS). Phần HBSS được chứng minh là giàu galactose,
polysacarit
Pectin rhamnose và axit uronic galact theo tỷ lệ 1,3:1:1,3. Mức độ acetyl hóa tương đối cao (DA = 58) trong khi mức
Xyloglucan độ metyl este hóa tương đối thấp (DM = 24). Phần CHSS chứa hàm lượng axit galacturonic metyl este hóa cao
xilan hơn nhiều (63% axit galacturonic; DM = 48) cùng với một lượng nhỏ rhamnose và galactose. Tỷ lệ galactose với
rhamnose với axit galacturonic lần lượt là 1,3:1,0:1,3 và 4,5:1,0:1,2 đối với HBSS và CHSS. Những kết quả
này chỉ ra rằng các phân số HBSS và CHSS chứa rhamnogalacturonan loại I bên cạnh homogalacturonan, trong khi
loại thứ hai chiếm ưu thế hơn trong CHSS. Ngoài ra, phần DASS được đặc trưng bởi một lượng lớn rhamnose,
galactose, axit galacturonic và một số arabinose, cho thấy rằng các nguyên tố rhamnogalacturonan I có chuỗi
bên giàu inose và galactose arab dài hơn là một phần của phần này. Quá trình tiêu hóa một phần HBSS và CHSS
bằng pec tin methyl esterase và polygalacturonase dẫn đến một phần có Mw thấp hơn và độ nhớt thấp hơn trong
dung dịch. Các mẫu này đã được phân tích NMR, điều này chỉ ra rằng, trái ngược với cấu trúc RG I đã biết,
các nhóm acetyl trong HBSS không nằm trên dư lượng axit galacturonic, trong khi đối với CHSS, chỉ một phần
của các nhóm acetyl nằm trên RG I galacturonic. dư lượng axit. Phần CASS bao gồm xyloglucan loại XXXG và 4-
metylglucuronoxylan như thể hiện qua thành phần (liên kết) đường và quá trình tiêu hóa bằng enzym của chúng.

2008 Elsevier Ltd. Bảo lưu mọi quyền.

1. Giới thiệu
Cây đậu bắp tên khoa học là Abelmoschus esculentus (L.) Moench, một
loại cây bản địa từ Châu Phi, hiện nay được trồng ở nhiều vùng khác
như Thái Lan, Trung Đông và các bang miền nam Hoa Kỳ. Vỏ đậu bắp thường
được dùng làm rau ăn. Chất chiết xuất từ nước của nó chứa polysaccharid
sli my đặc và được dùng để làm đặc súp và món hầm.1,2 Quả non cũng được
sử dụng trong y học dân gian như một chất lợi tiểu và điều trị bệnh
răng miệng.3 Polysaccharid của đậu bắp cũng được dùng thay thế lòng
trắng trứng ,4 chất béo thay thế trong thanh sô cô la cook ies5 và
trong món tráng miệng từ sữa đông lạnh bằng sô cô la.6
Polysacarit đậu bắp được tìm thấy đầu tiên dưới dạng charide
polysac có tính axit bao gồm galactose, rhamnose và axit galacturonic.7
Deters và cộng sự.8 đã xác nhận những phát hiện như Lengsfeld và cộng
sự.9 đã đề cập rằng polysacarit đậu bắp bao gồm các loại đường rhamnose,
axit galacturonic, galactose , glucose và axit glucuronic. Agarwal et
al.10 cho rằng axit galacturonic trong polysacarit đậu bắp có thể ở
cấu hình L. Các yếu tố cấu trúc chính của polysacarit đậu bắp đã được
mô tả bởi Tomada và cộng sự11 , người đã kết luận rằng nó chứa một đơn
vị lặp lại gồm các gốc rhamnosyl liên kết a-(1?2)- và axit galacturonic
liên kết a-(1?4) xen kẽ với một chuỗi bên disacarit của gốc galactosyl
được liên kết b-(1?4) gắn với O-4 của khoảng một nửa dư lượng L-
rhamnosyl. Hàm lượng acetyl của polysacarit đậu bắp được xác định là
5,5% w/w trong khi vị trí chính xác của các nhóm acetyl trong polysacarit

* Đồng tác giả. Điện thoại: +31 317 482888; fax: +31 317 484893.
không được đề cập. Lengsfeld et al.9 đề xuất
Địa chỉ email: fons.voragen@wur.nl (AGJ Voragen).

0008-6215/$ - xem vấn đề đầu tiên 2008 Elsevier Ltd. Bảo lưu mọi quyền. doi:10.1016/
j.carres.2008.10.012
Machine Translated by Google

N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832 1825

từ dữ liệu phân tích liên kết rằng các phân số phụ polysacarit đậu
bắp, được chiết xuất bằng nước và được phân đoạn bằng sắc ký thay đổi
anion-ex, chứa nhiều galacturan hơn rhamnogalacturonan là thành phần
cấu trúc chính.
Trái ngược với các đặc tính hóa học của pectin đậu bắp, thông tin
polysacarit, cụ thể là pectin, hemiaellulose và cellulose.12 Do đó,
đậu bắp AIS được chiết xuất tuần tự với các chất chiết nước khác nhau.
Bảng 2 cho thấy thành phần đường của các phân đoạn thu được từ quá
trình chiết xuất đậu bắp AIS tuần tự trong đó các phân đoạn HBSS và
DASS là các phân đoạn chính.

về các polysacarit khác như hemiaellulose vẫn còn thiếu. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi trình bày đặc tính của tất cả các polysacarit của
thành tế bào chính trong đậu bắp, được chiết xuất liên tục với các
chất chiết xuất dạng nước khác nhau có độ mạnh tăng dần, nhấn mạnh vào
cấu trúc chi tiết của các phần pectin khác nhau.
2. Kết quả và thảo luận
Phần HBSS bao gồm 35 mol % axit galacturonic, ngoài ra còn có một
lượng lớn rhamnose (26 mol %) và galactose (34 mol %). Galactose được
tìm thấy là đường trung tính chính trong phần HBSS và khoảng 30% tổng
số galactose có trong AIS đã được thu hồi trong phần này. Tỷ lệ của
các loại đường chính được đưa ra trong phân đoạn HBSS lần lượt là
1,3:1,0:1,3 đối với galactose:mũi rham:axit galacturonic, khá giống
với tỷ lệ được báo cáo bởi Tomada và cộng sự11 Lengsfeld và cộng sự9
đã báo cáo rằng điều này tỷ lệ là 0,9:1,0:0,6 đối với chiết xuất nước

2.1. Các bộ phận cụ thể của vỏ đậu bắp polysacarit đậu bắp.
So với kết quả này, phần HBSS của chúng tôi chứa nhiều galactose hơn

Để có ấn tượng về tỷ lệ các bộ phận riêng lẻ của quả đậu bắp tươi, một chút. Điều này cũng đúng khi so sánh với dữ liệu về polysacarit

toàn bộ quả đậu bắp được tách thành ba phần; đài hoa, cùi và hạt. đậu bắp chiết xuất trong nước như được mô tả bởi Deters và cộng sự.8

Lượng tương đối của các phần khác nhau của đậu bắp tươi được biểu thị Phần CHSS chứa hàm lượng axit galacturonic cao hơn (63 mol %) và

bằng trọng lượng tươi, trọng lượng khô và chất rắn không tan trong ít galactose hơn (17 mol %) và mũi rham ( 14 mol %) khi so sánh với

rượu (AIS) được thể hiện trong Bảng 1. Thịt quả là phần chính (khoảng phần HBSS. Phần CHSS cũng chứa 3 mol % arabinose trong khi loại đường

72 g/100 g) của đậu bắp tươi , trong khi đài hoa đại diện cho khoảng này không được tìm thấy trong phần HBSS. Không có xyloza nào được tìm

15 g/100 g đậu bắp tươi và hạt đại diện cho khoảng 15 g/100 g đậu bắp thấy trong HBSS, cả trong các phân đoạn CHSS đều không cung cấp bằng

tươi. 9 g/100 g đậu bắp tươi. Như có thể thấy từ các số liệu, khoảng chứng rằng không có xyloza nào chứa polyme pectic như xylogalacturonan

4% nguyên liệu không được phục hồi và điều này có thể là do một số có mặt trong cả hai phân đoạn. Ngoài ra, các phân đoạn HBSS và CHSS

phần hạt giống bị thất thoát. Do cùi đậu bắp hình thành nên phần chính chứa hàm lượng axit glucuronic thấp (tương ứng là 3 và 2 mol %) thấp

của vỏ đậu bắp nên phần này đã được nghiên cứu thêm. Bột đậu bắp mang hơn so với hàm lượng axit glucuronic được tìm thấy trong polysacarit

lại khoảng 5,8 g/100 g đậu bắp tươi của chất rắn không tan trong rượu đậu bắp chiết xuất bằng nước (8,8 mol %) như được mô tả bởi Lengsfeld

(AIS) đại diện cho vật liệu thành tế bào. et al.9 Phần HBSS có tỷ lệ rhamnose trên axit uronic galact (0,7) cao
hơn so với phần CHSS (0,2). Nói chung, rhamno galacturonan I (RG I)

bao gồm các gốc rhamnose và axit galacturonic xen kẽ như một xương

2.2. Thành phần đường và cấu hình tuyệt đối của chiết xuất đậu bắp sống.13 Tỷ lệ mũi rham:axit galacturonic trong một xương sống RG I là
AIS và đậu bắp AIS 1:1. Kết quả là, phần HBSS được tìm thấy chứa chủ yếu là các phân đoạn
RG I (85%) và ít hơn nhiều các phân đoạn homogalacturonan (HG).

Thành phần đường của AIS đậu bắp được thể hiện trong Bảng 2. AIS
đậu bắp bao gồm chủ yếu là glucose (44 mol %), galactose (17 mol %)
và axit galacturonic (16 mol %). Ngoài polysacarit, AIS còn chứa 15,8%
protein. Thành phần đường gợi ý rằng đậu bắp AIS bao gồm các loại CHSS chủ yếu chứa các phân đoạn HG (74%) và ít phân đoạn RG I hơn. Số

polysacarit khác nhau bao gồm pectin, hemiaellulose như xylan và lượng lớn các phân đoạn RG I trong phân đoạn HBSS hơi hiếm vì không
có chiết xuất nước từ các nguồn khác cho thấy số lượng phân đoạn RG I
xyloglucan, và cellulose. Việc trích xuất tuần tự vật liệu thành tế
bào (AIS) cung cấp thông tin về khả năng trích xuất của các loại khác cao như vậy. Ví dụ, polysacarit đậu tương hòa tan trong nước chứa 43%

nhau phân đoạn RG I trong polysacarit,14 chiết xuất nước từ bột củ cải
đường chứa 22% phân đoạn RG I trong polysacarit.15 Tỷ lệ đường trung
tính so với rhamnose gần như cho biết độ dài của các chuỗi bên. Tỷ lệ
Bảng 1
của (galactose và arabinose) so với rhamnose lần lượt là 1,3 và 1,4
Số lượng tương đối của các phần khác nhau của vỏ đậu bắp tươi
đối với các phân đoạn HBSS và CHSS. Điều này cho thấy rằng phần CHSS
Các bộ phận của vỏ đậu bắp trọng lượng tươi trọng lượng khô chứa chuỗi bên dài hơn một chút so với phần HBSS.
đài hoa 14.6 1.4

bột giấy 71,9 7.4

Hạt giống 9.1 1.3
Cấu hình tuyệt đối của các gốc đường trong phân đoạn HBSS và CHSS
được xác định bằng cách sử dụng GC-FID sau metan
một

Chất lượng gram trên 100 g vỏ đậu bắp tươi.

ban 2

Năng suất, thành phần và mức độ acetyl hóa (DA) và metyl este hóa (DM) của AIS đậu bắp và các chất chiết xuất và dư lượng polysacarit đậu bắp

Năng suất (g/100 g AIS) Rha Ara Phúc Xyl Đàn cô gái glc GalA GlcA DAa (%) DMa (%) Hàm lượng cacbohydratb hàm

ông (mol %) lượng proteinb

AIS 3(2)c 5(2) 0 26(2.5) 5(2) 3(2) 17(10) 44(25) 16(14) 7(1,7) 40 34(3,2) 1(0,1) 59 57,5 15,8
HBSS 11.2 0 0 14(0.5) 3(0.1) 0 0 0 35(4,0) 3(0,3) 58 17(0,6)
18 48(5.5)
1(0) 63(3,0)
2(0.2)2(0,1)
—d 24 90,0 3,5
CHSS 4.8 13(1.2) 13(1.0) 0 0 0 19(1.8) 4(0.4) 8(0.3) 52(2.0)
d 1(0.2)3(0.1)
—d 7(1.3)
1(0.1) — 48 86.2 10,5
DASS 13.2 CASS 0 0 —d 76,9 16,6
1(0.05) 3(0.1) 2(0.1) 78(15.3 ) 0
4.1 ĐỘC QUYỀN 27(0.8) 3(0,1) 3(0,5) 5(0,8) 0 5(0,9) tr(0) —d 86,8 13,2
26.5 —d 73,7 16,1

tr: Lượng vết.

một

Số mol acetyl hoặc metanol trên 100 mol axit galacturonic.

b
Chất lượng gram trên 100 g phân số.
c
Các giá trị trong ngoặc cho g/100 g AIS đối với từng loại đường.
đ
Không xác định.
Machine Translated by Google

1826 N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832

olysis và chuyển đổi thành butylglycoside tương ứng của chúng. Kết
quả cho thấy rằng tất cả các loại đường có trong các phân đoạn HBSS
và CHSS đều có cấu hình D ngoại trừ các chất phản ứng rhamnosyl có
trong cấu hình L. Những kết quả này trái ngược với những báo cáo của
Agarwal et al.10 , người đã tuyên bố rằng kẹo cao su đậu bắp có chứa
axit L-galacturonic. HBSS, đậu bắp rhamnogalac turonan I cũng khác
với rhamnogalacturonan I của chất nhầy hạt lanh có chứa L galactose
như một loại đường trung tính.16
Phần DASS chứa một lượng lớn galactose và axit galacturonic. Tỷ
lệ rhamnose so với axit galacturonic (0,3) cao hơn tỷ lệ tìm thấy
đối với phần CHSS (0,2). Có thể tính toán rằng phần DASS chứa 43%
phân đoạn RG I và 57% phân đoạn HG. Hơn nữa, phần DASS tương đối
giàu arabinose và galactose. Tỷ lệ arabinose so với rhamnose và tỷ
lệ (arabinose và galactose) so với rhamnose của phần DASS lần lượt
là 1,0 và 2,5, cao hơn so với tỷ lệ tìm thấy đối với phần CHSS (tương
ứng là 0,2 và 1,4).
một RG I tinh khiết với DA cao trong chiết xuất nước thường không được
báo cáo đối với các loại cây khác, mặc dù gần đây chất nhầy của hạt
arabidopsis đã được mô tả bởi Deng và cộng sự,21 cho thấy một
rhamnogalacturonan I tuyến tính có thể chiết xuất được trong nước.
2.4. Thành phần liên kết glycosid
Để có thêm thông tin về các poly sacarit khác nhau của thành tế
bào có trong các chất chiết xuất khác nhau, các mẫu được phân tích
liên kết bằng permethylation. Nhìn chung, dữ liệu thu được mang tính
chất định tính hơn là định lượng. Trước hết, các axit uronic không
bị khử hoàn toàn thành các chất tương tự đường trung tính và do đó
chúng không được đo. Thứ hai, có thể xảy ra việc đánh giá thấp gốc
pentose cuối cùng và gốc syl galactos liên kết 1,4 do sự bay hơi của
pentose cuối cùng và sự hình thành phức hợp của gốc galactosyl liên
kết 1,4 với tốc độ bo trong quá trình acetyl hóa,22 tương ứng.

Phần CASS chứa glucose (52 mol %) và xyloza (27 mol %) là đường bàn số 3

trung tính chính và chỉ có một lượng nhỏ axit glucuronic khá giống Thành phần liên kết đường của các phân đoạn polysacarit đậu bắp

với các phân đoạn khác. Sự có mặt của gốc glucose xyloza và axit HBSS DASS CASS
dư lượng glycosyl CHSS (mol %)
glucuronic có thể chỉ ra rằng bên cạnh xyloglucan, xylan có tính axit
t-araf 0,5 4.2 7,5 0,3
cũng là một phần của phần này. 0,3 0,2 0,6
1,2-araf

1,5-araf 0,8 29,4 22,4

Trong cặn chiết xuất, đường chính là glucose (78 mol %) chiếm 1,3-araf 0,6 0,2 0,6

1,3,5-araf 6,8 4,5 0,2

khoảng 50% tổng lượng glucose có trong AIS. Glucose này bắt nguồn từ
1,2,5-araf 1 1,7 0,2
cellulose và hemicellulose. Sự hiện diện của dư lượng xyloza (5 mol
1,2,3,5-araf 0,4 0,2
%) và galactose (7 mol %) cho thấy rằng một phần xyloglucan vẫn còn
tổng ara 2.3 41,9 36,9 1,5
lại trong dư lượng. Xyloglucan này hoặc được gắn chặt vào cấu trúc
t-xylp 0,1 0,3 0,1 0,8
của các sợi xenlulo hoặc liên kết hydro rộng rãi với các sợi xenlulo
1,4-xylp 0,9 2.6 11
đến mức nó chống lại quá trình chiết xuất bằng NaOH 6M. 1,7
1,2-xylp

1,3-xylp 0,5 1,3

Phần cặn cho thấy dung môi dùng để chiết 1,3,4-xylp 0,4 0,2 0,4

1,7 1,8 0,7

đậu bắp AIS có thể hòa tan vật liệu pectic. Tuy nhiên, chỉ một phần 1,2,4-xylp

1,2,3,4-xylp 0,4
ba polysacarit trong AIS có thể được chiết xuất trong khi 26% được
1.9 2.6 4,9 15,5
thu hồi trong phần cặn. Điều này dẫn đến sự phục hồi 60%. Ngoài ra, Tổng số xyl

tương ứng, 26%, 32% và 15% của tất cả dư lượng glucose, gal actose t-rạp 0,3

3,3 1,4 2.7

và xyloza trong AIS không được đưa vào phân tích của tất cả các phân 1,2-rạp

1,3-rạp 0,1 0,3

số. Chúng rất có thể thuộc về vật liệu hemixenluloza và bị mất đi
1,4-rạp 0,5 1,1 0,2
trong bước chiết xuất bằng kiềm đậm đặc. 34 5,5 5 0,1
1,2,4-rạp

Tổng rha 38.1 8.3 7,9 0,1

t-fucp 0,03 1.2

2.3. Mức độ metyl este hóa và acetyl hóa
Tổng cộng 0,03 1.2

Mức độ methyl ester hóa (DM) của các pectin HBSS (24%) thấp một t-glcp 1 1.8 2,2 2,7

25,4 52,1
cách đáng ngạc nhiên và thấp hơn nhiều so với DM của CHSS. Phần DASS 1,4-glcp

1,2,4-glcp 0,1
không được đưa vào phân tích do loại bỏ metyl este và nhóm acetyl
1,4,6-glcp 0,6 0,3 0,3 16,5
trong quá trình chiết kiềm loãng. Theo thành phần đường (Bảng 2), 0,7 0,1 0,3
1,3,4-glcp
75% của tất cả axit galacturonic có trong các pectin HBSS có nguồn 1,2,3,4,6-glcp 0,8 0,3

gốc từ RG I mà không có bằng chứng nào cho thấy axit galacturonic 3.1 2,5 28.2 71,4
Tổng glc
còn lại trong các phân đoạn RG I là metyl este hóa.17 Giả sử rằng
1,4 người 0,7 2,1 0,4 2,2
metyl este chỉ hiện diện trong các phân đoạn HG của HBSS pectin, DM 1,2,3,4,6 người 0,8 0,6 0,2 0,01

của HG này có thể cao tới 96%. DM của hộp thiếc CHSS pec (48%) là
tổng đàn ông 1,5 2.7 0,6 2.2
khá thấp do các tác nhân chelate được cho là sẽ chiết xuất các pectin
t-galp 34,5 9,4 6,1 5,3
nhạy cảm với canxi với DM18 thấp hiện diện ở dạng gel pectate canxi.12
1,6-galp 1,9 3,5 2,3 0,1

1,4-galp 12,2 12,5 4,8 0,6

1,2,6-galp 0,6 0,2

Mức độ acetyl hóa (DA) cao hơn nhiều ở phần HBSS (58%) so với 1,2,4-galp 0,4 0,5 0,3 0,8

1,4,6-galp 1,5 3,7 2,2 0,7

phần CHSS (18%). Cho đến nay chỉ có bằng chứng về sự hiện diện của
1,3,4-galp 0,2 0,7 0,2
các nhóm O-acetyl trên O-2 và/hoặc O-3 của gốc axit galacturonic 1,6 9 4,6 0,2
1,3,6-galp
trong phân đoạn HG và phân đoạn RG I.17,19 Nói chung, DA cao trong 1, 3,4,6 nhịp 0,6

phân đoạn RG Tôi phân đoạn (các vùng có lông) của pectin như được 1,2,3,4,6 nhịp 0,8 1,4 1 0,2

minh họa bởi DA là 60% được tìm thấy cho các vùng có lông biến tính Tổng số dạ tiệc 53 42 21,5 8.1

từ táo.20 Do đó, phần HBSS đại diện gửi các pectin có cấu trúc độc 0,8 0,4 0,7 0,4
Tỷ lệ t/b
đáo khác với các loại pectin khác, chẳng hạn như táo, củ cải đường
một

Axit uronic không bị giảm trước khi methyl hóa.

và đậu nành Pectin. Hơn thế nữa,
Machine Translated by Google
N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832
Đối với phần HBSS, kết quả thành phần liên kết đường (Bảng 3) cho thấy
sự hiện diện của các cấu trúc RG I phân nhánh cao, vì phần lớn (89%) tất
cả các gốc rhamnosyl được liên kết 1,2 đều được thay thế bằng O-4. Các gốc
rhamnosyl này được thay thế bằng chuỗi bên galactan ngắn chứa 1 hoặc 2 gốc
galactosyl vì 65% tổng số galactose có mặt ở dạng gốc cuối cùng và 23% ở
dạng đơn vị liên kết 1,4.
Phần CHSS được tìm thấy đại diện cho cấu trúc RG I ít phân nhánh hơn
một chút như được thể hiện bằng mức thấp hơn của dư lượng rhamnosyl được
thay thế O-4 (66% của tất cả rhamnose). Chỉ 22% trong số tất cả các gốc
galactosyl có mặt được liên kết đầu cuối cho thấy thực tế là các chuỗi bên
galactan dài hơn một chút có mặt trong CHSS so với HBSS. Tóm lại, có thể
nói rằng phần HBSS chứa xương sống RG I với chuỗi bên galactan monome hoặc
di meric, trong khi phần CHSS chứa RG I với chuỗi bên galactan dài hơn một
chút. Quan sát này cũng được báo cáo bởi Tomada et al.11 đối với các chuyến
cưỡi polysaccha đậu bắp chiết xuất trong nước. Ngoài gốc galactosyl được
liên kết 1,4 được tìm thấy với số lượng khá cao, một số gốc galactosyl được
liên kết 1,6 và 1,3,6 được tìm thấy có mặt cho thấy sự hiện diện của
arabinogalac tan loại II ở dạng chuỗi bên. Lượng arabinose ước tính trong
quy trình phân tích liên kết cho phần CHSS cao hơn so với lượng được tìm
thấy trong phân tích thành phần đường như được báo cáo trong Bảng 1.
Khoảng 42% của tất cả arabinose hiện diện dưới dạng liên kết 1,5, điều này
cho thấy sự hiện diện của chuỗi bên arabinan tuyến tính.
So với HBSS và CHSS, phần DASS chứa RG I ít phân nhánh hơn như thể hiện
qua mức độ thấp của các gốc rhamnosyl được liên kết 1,4 và 1,2,4. Phần lớn
tất cả arabinose có trong CHSS và DASS đều có mặt ở dạng 1,5-; Các gốc
arabi nosyl được liên kết 1,3,5- và 1,2,5 ở dạng furanose, cho thấy sự có
mặt của các a-(1,5)-arabinan phân nhánh 1,2 và 1,3. Phần DASS tương đối
giàu arabinan phân nhánh, trong đó số lượng gốc arabinosyl liên kết cuối
cùng khá phù hợp với số lượng điểm phân nhánh. Bên cạnh các chuỗi bên
arabinan, phần DASS chứa hỗn hợp các cấu trúc AG I và AG II như thể hiện
qua sự có mặt của cả gốc galacto syl được liên kết 1,4 và 1,3,6 được liên
kết.
Phần CASS rõ ràng là giàu hemiaellulose như xy lan, mannan và glucan
hiện diện dưới dạng các chuỗi liên kết 1,4 tuyến tính dài.
Ngoài ra, xyloza, galactose và fucose cũng có mặt ở dạng gốc cuối cùng và
kết hợp với sự có mặt của gốc glu cosyl được liên kết 1,4,6, điều này cho
thấy sự có mặt của xyloglucan.23
2.5. phân bố trọng lượng phân tử
Sự phân bố Mw của các polysacarit trong các phần khác nhau thu được từ
đậu bắp AIS được thể hiện trong Hình 1. Sự phân bố Mw
100
phản
hồi
RI
16 18 20
Hình 1. Sự phân bố trọng lượng phân tử của các phân số polysacarit đậu bắp (chỉ số trọng lượng phân tử dựa trên tiêu chuẩn pectin).
1827
mẫu kết hợp của HBSS chỉ cho thấy một quần thể có Mw khá cao, trong khi
CHSS cho thấy sự phân bố Mw rộng hơn nhiều đại diện cho các quần thể có
trọng lượng phân tử cao hơn và thấp hơn HBSS. Ngoài ra, mẫu phân phối Mw
của DASS tương tự như mẫu phân phối Mw của CHSS. Phân đoạn CASS đại diện
chủ yếu chứa hemicel lulosic polysacarit cho thấy một phân bố Mw rộng đại
diện cho các quần thể gửi có giá trị Mw thấp hơn so với các phân số khác.
Những xu hướng này cũng được báo cáo đối với ô liu,24 quả mọng xanh và dòng
đen.25 Cần đề cập rằng bước siêu lọc của dịch chiết được thực hiện bằng
cách sử dụng màng 30 kDa đã loại bỏ vật liệu Mw thấp có thể có.
2.6. Phân đoạn giàu Pectin
Thành phần đường (liên kết) của phân đoạn HBSS chỉ ra rằng HBSS chủ yếu
chứa các phân đoạn RG I bên cạnh một số HG có mức acetyl cao thể hiện cấu
trúc không phổ biến đối với các polysacarit được chiết xuất bằng nước. Do
đó, sắc ký trao đổi anion đã được thực hiện để thu thập thông tin về tính
đồng nhất của HBSS. Các đặc điểm cấu trúc của các tiểu phần được xác định
và so sánh với các cấu trúc pectin có trong phần CHSS.
2.6.1. sắc ký trao đổi anion
Tính đồng nhất về điện tích của các phân đoạn HBSS và CHSS được xác
định bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion.
Dung dịch mẫu được áp dụng cho cột Dòng chảy nhanh Sepharose của DEAE và
vật liệu liên kết với nhựa được rửa giải bằng gradient tuyến tính của dung
dịch đệm NaOAc có độ pH 5. Hình 2 cho thấy DEAE là một mẫu sắc ký trao đổi
ion của HBSS và mẫu CHSS. Hầu như tất cả vật liệu được rửa giải trong một
pic chính ở khoảng 0,8 và 0,6 M dung dịch đệm NaOAc cho HBSS và CHSS, tương
ứng. Thành phần đường của pic chính này được xác định sau khi gộp phân đoạn
và được phát hiện là tương đương với nguyên liệu ban đầu.
Sự đồng rửa giải của tất cả các loại đường trong một đỉnh duy nhất có cùng
thành phần đường như nguyên liệu ban đầu cho thấy rằng chỉ có 1 quần thể
pectin có mặt trong cả hai phân đoạn HBSS và CHSS.
2.6.2. Cộng hưởng từ hạt nhân Các phân
đoạn pectin được tìm thấy chủ yếu bao gồm hai nguyên tố cấu trúc, HG
và RG I. Thành phần đường và mức độ phân tích acetyl hóa cho thấy rằng phân
đoạn HBSS chứa chủ yếu là RG I và có sự thay thế cao với các nhóm acetyl
trong khi phân đoạn CHSS chứa chủ yếu là HG và ít nhóm acetyl. Để giảm độ
nhớt của pectin nhằm cải thiện chất lượng của phổ NMR, HBSS đã được phân
hủy bằng polygalacturonase và pec
51,4 34,6 10
kDa
CASS
DASS
CHSS
HBSS
22 24 26 28 30 32
Thời gian lưu (phút)
Machine Translated by Google

1828 N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832

100
Một
2 100
b 2

90 90

80 80
1,5 1,5
70 70

60 60

50 1 50 1
NaOAc
pH5
đệm NaOAc
dịch
Dung
pH5
đệm

đường
(ug/
Nồng
ml)
độ

40 đường
(ug/
Nồng
ml)
độ

40

30 30
0,5 0,5
20 20

10 10

0 0 0 0
0 1000 2000 0 1000 2000
Thể tích rửa giải (ml) E Thể tích rửa giải (ml)

Hình 2. Các mẫu sắc ký trao đổi anion DEAE của HBSS (A) và CHSS (B). Vạch đậm: axit uronic, vạch mảnh: đường trung tính, vạch chấm: gradient NaOAc.

tin methyl esterase và CHSS chỉ được tiêu hóa bằng polygalacturonase.
Các chất phân hủy sau đó được thẩm tách, đông khô, hòa tan trong D2O
và sau đó phổ proton NMR được ghi lại.
Quang phổ được thể hiện trong Hình 3. Từ dữ liệu thu được cho HBSS
PG/PME, rõ ràng là mẫu chứa cả rhamnose không phân nhánh liên kết
a-1,2 (1,25 ppm) và phân nhánh 1,2,4 liên kết rhamnose (1,33 phần
triệu); sự dịch chuyển hóa học thường thấy đối với H-6 của các gốc
rhamnosyl này và 1 hoặc 2 tín hiệu dị thường giữa 5,22 và 5,25 ppm
được gán cho các chất phản ứng rhamnosyl. Các tín hiệu dị thường ở
5,01 và 4,96 ppm kết hợp với tín hiệu ở 4,42 ppm được gán cho H-1 và
H-4 của axit uronic galact.26–30
Tương tự như mẫu HBSS, các đơn vị rhamnosyl được liên kết với CHSS
1,2, 1,2,4 được liên kết với PG cũng được tìm thấy. Ngoài ra, một số
tín hiệu (tín hiệu trong hộp 1, 2 và 3 trong Hình 3) thuộc về axit
galacturonic đã được tìm thấy rằng chúng có nguồn gốc từ HG và RG I,
và cho thấy sự hiện diện của sự thay thế nhóm acetyl trên cả hai thực
thể cấu trúc. .28–34
Hơn nữa, sự hiện diện của một số tín hiệu dị thường trong vùng
giữa 4,45 và 4,65 ppm của cả hai mẫu cho thấy sự hiện diện của
galactose đầu cuối và galactose liên kết 1,4 trong các mẫu. Điều này
chỉ ra rằng cả hai mẫu đều chứa chuỗi bên galactan ngắn và phù hợp
với phân tích thành phần đường và liên kết. Cả hai mẫu cũng cho thấy
tín hiệu nằm trong khoảng từ 2,10 đến 2,20 ppm thường đối với nhóm
thế O-axetyl. Lerouge và cộng sự30 nhận thấy rằng khi một nhóm O-
acetyl được gắn vào axit uronic galact ở vị trí O-2 hoặc O-3, hai tín
hiệu phụ xuất hiện trong vùng dị thường ở mức 5,1 và 5,4 ppm. Các tín
hiệu này không có trong phổ HBSS. Phổ CHSS NMR cho thấy các gốc axit
galacturonic khác nhau kết hợp với hai tín hiệu chính cho O-axetyl ở
mức 2,10 và 2,07 ppm. Điều này chỉ ra rằng các nhóm acet yl được liên
kết với các vị trí khác nhau của axit galacturonic có trong HG và RG
I. Hợp lý nhất đối với HBSS là acetyl nên được liên kết với khối xây
dựng rhamnose hoặc galactose. Tuy nhiên, không thể loại trừ rằng
trong CHSS các loại đường khác cũng bị acetyl hóa.

2.7. Phân số giàu hemicellulose

Thành phần liên kết đường đã chứng minh rằng phần CASS rõ ràng bao

H-4 gồm hemiaellulose. Nói chung, hemi cellulose trong thành tế bào thực
HBSS vật là xyloglucans, xylans, mannans và/hoặc arabinogalactans.17 Do
1,2- -rha α
đó, để có thêm thông tin về cấu trúc của hemicellulose, phần CASS đậu
bắp được ủ với enzyme cụ thể và sau đó phân tích quá trình phân hủy
để xác định oligomer được giải phóng.
H-1 rha
CH3

O-axetylt
2.7.1. Phân hủy endo-glucanase (XEG) đặc hiệu Xyloglucan của phần CASS
H-6
CHSS đậu bắp
- α-rha
1,2,4-
,
Xyloglucans đại diện cho một polysacarit hemixenluloza chính trong
thành tế bào sơ cấp của nhiều loại thực vật. Nói chung, xyloglucan có
H-6
thể được phân thành ba loại, loại XXXG, loại XXGG và loại XXXX, có
1,2-- -rha α thể được phân biệt bằng sự thay đổi trong thay thế xương sống với dư
1 2 3 lượng xyloza.35,36 Lượng glucose và xyloza cao được tìm thấy trong
CASS đậu bắp cho thấy sự hiện diện của xyloglucan.
Để có thêm thông tin về xyloglucan này, phần này được ủ với glucanase
5.0 4,5 4.0 3,5 2.01.5 1.0 đặc hiệu của xyloglucan, và các mảnh giải phóng được phân tích.
f1 (ppm) Xyloglucanase38 cụ thể này tách xylo glucans giữa gốc glucose được

1 thay thế xyloza và gốc glucose không được thay thế giải phóng các
Hình 3. Phổ H NMR của ChSS PG và HBSS PG/PME; 1: axit galacturonic có nguồn gốc
từ axit galacturonic HG hoặc O-axetyl hóa; 2: axit galacturonic có nguồn gốc từ RG I khối xây dựng oligosacarit từ xyloglucan.35 Các khối xây dựng
và không thay thế; 3: axit galacturonic H-4. oligomeric được
Machine Translated by Google

N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832 1829

Phúc |

cô gái XLFG
XXXG

| |

Xyl | Xyl Xyl | |

XXFG

Glc – Glc – Glc – Glc

XLFG Xyloglucan oligomer

Phản
PAD
hồi

xxlg

XLLG
XLXG

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Thời gian lưu (phút)

Hình 4. Mẫu HPAEC của phần CASS đậu bắp sau khi ủ với endo-glucanase đặc hiệu xyloglucan.

được xác định bằng cách sử dụng các chất tiêu hóa xyloglucanase
từ hạt khoai tây và hạt me,37 và được xác nhận bằng phép đo khối
phổ MALDI-TOF (kết quả không được hiển thị). Mẫu HPAEC (Hình 4)
của chất tiêu hóa cho thấy sự giải phóng của ba chất chính (XXXG,
XXFG và XLFG) và ba oligome xyloglucan nhỏ (XLXG, XXLG và XLLG).
Các mẫu này khá giống với các oligome xyloglucan thu được từ nhiều
vách tế bào thực vật,39 và gần đây cũng được tìm thấy đối với các
dòng màu đen.40 Những kết quả này chỉ ra rằng phần CASS của đậu
bắp chứa xyloglucan loại poly XXXG mang cả hai thay thế galactose
và fucose mà nói chung là được tìm thấy ở cây hai lá mầm.40
2.7.2. phân hủy endo-Xylanase của phần CASS đậu bắp
Bên cạnh xyloglucan, xylose có thể được trình bày dưới dạng
thành phần của một polysacarit hemixenluloza khác tồn tại trong
thành tế bào, ví dụ, xylan. Xylan có trong thực vật một lá mầm
thường thuộc loại arabinoxylan, trong khi ở thực vật hai lá mầm
thường là xylan có tính axit hầu như không có bất kỳ chất thay
thế arabinose nào được tìm thấy.41,42 Phần CASS đậu bắp được ủ
với endo-Xylanase từ Aspergillus awamori CMI 142717 (Xyl III thuộc
họ GH 11)36 để có thêm thông tin về cấu trúc xylan có mặt.

600

500

(GlcAme)
759
X4

(GlcAme)
891
X5

400

cường
[au]
cao.
độ
300

(GlcAme)
1023
X6

200

(GlcAme)
627
X3

100

0
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
m/z

Hình 5. Phổ khối MALDI-TOF của phân đoạn CASS đậu bắp phân hủy bằng Xyl III.
Machine Translated by Google
1830 N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832
Sau 24 giờ ủ phần CASS đậu bắp với Xyl III, các sản phẩm thoát ra được
HPAEC phân tích (dữ liệu không được hiển thị) và được so sánh với dữ liệu
được tìm thấy trước đó, chẳng hạn như xylan ô liu.36 Từ mẫu HPAEC, chủ yếu là
xyloza, xylobiose và xylotriose được phát hiện là có mặt, trong khi các hợp
chất xylan oligo được thay thế bằng arabinose chỉ được tìm thấy dưới dạng sản
phẩm phụ bên cạnh một số hợp chất được giữ lại lâu hơn nhờ quá trình trao đổi
anion. Để biết thêm thông tin, các bản tóm tắt cũng được phân tích với MAL DI-
TOF MS. Quang phổ (Hình 5) cho thấy sự có mặt của hàng loạt xylo-oligome được
thế bằng một axit 4-O-metylglucuronic [X3-7(GlcAme)]. Các tín hiệu MS chính là
m/z lần lượt là 759 và 891 tương ứng với X4(GlcAme) và X5(GlcAme) . Sự hình
thành của các oligome này có thể được giải thích bằng tính đặc hiệu cơ chất
của enzyme được sử dụng vì Xyl III bị cản trở bởi sự thay thế của trục xylan
và chỉ có thể tách các liên kết glycosid giữa hai gốc xylose không được thay
thế mà không liền kề với các chất thay thế đơn lẻ hoặc kép. dư lượng
xylose.24,43 Do đó, xylan có trong phần CASS của đậu bắp là một 4-O-
methylgluconoxylan thường được tìm thấy trong thực vật hai lá mầm như ol ive24
và cả trong gỗ cứng như gỗ bạch đàn.44 Hơn nữa, 4 Các nhóm axit -O-metyl
glucuronic dường như được phân phối khá ngẫu nhiên trên xương sống xylan.
Tóm lại, quá trình chiết xuất đậu bắp AIS tuần tự mang lại các quần thể
polysacarit khác nhau. Thành phần đường (liên kết) cho thấy các phân tử pectic
giàu galactose được tìm thấy trong ba chiết xuất khác nhau (HBSS, CHSS và
DASS) có cấu trúc hóa học khác nhau. Phần HBSS là một polyme tích điện đồng
nhất và có cấu trúc đều đặn bao gồm chủ yếu là RG I phân nhánh cao với chuỗi
bên galactan rất ngắn (trung bình 1-2 gal actose). HBSS còn chứa hàm lượng
cao các nhóm acetyl, điều bất ngờ là khi phân tích NMR cho thấy các nhóm
acetyl không được gắn vào các đơn vị axit galacturonic.
Phần CHSS cũng là một polyme tích điện đồng nhất và chứa chủ yếu là HG và
một số RG I với chuỗi bên galactan bao gồm trung bình từ 2 đến 3 gốc galactose.
Ngoài ra còn có nhiều chuỗi bên không đồng nhất của arabinan và AG II. Cả HBSS
và CHSS đều cho thấy một quần thể trên biểu đồ sắc ký trao đổi anion cho thấy
các tỷ lệ khác nhau của homogalacturonan và rhamnogalacturonan trong HBSS và
CHSS. Các nghiên cứu NMR về HBSS và CHSS được xử lý bằng PG cho thấy sự hiện
diện của các nhóm acetyl được liên kết với các gốc đường khác có mặt như
rhamnose và/hoặc galactose hơn là axit galacturonic. Hơn nữa, phần DASS chứa
các pectin thậm chí còn phức tạp hơn với arabinan, AG I và AG II, ở dạng chuỗi
bên trung tính.
Bên cạnh nguyên liệu pectic, đậu bắp AIS còn chứa các polysacarit
hemicellulose chủ yếu có trong phần CASS. Vật liệu hemixenluloza trong phần
này được phát hiện bao gồm chủ yếu là xyloglucan loại XXXG và 4-
metylglucuronoxylan.
Để có thêm thông tin về vị trí của các nhóm acetyl và độ dài của chuỗi bên
galactan, nhiều nghiên cứu về sự phân hủy enzyme của polyme và các đặc tính
NMR và MS của oligome sẽ được thực hiện.
3. Vật liệu và phương pháp
3.1. Vật chất
Quả đậu bắp mềm và chín, A. esculentus (L.) Moench (dài 5–10 cm), được
trồng và thu hái tại chợ địa phương vào tháng 6 năm 2005, Thái Lan.
3.2. Cô lập chất rắn không tan trong rượu
Sau khi loại bỏ hạt, vỏ đậu bắp được cắt lát và đồng nhất hai lần với dung
dịch nước etanol 70% (v/v) ở nhiệt độ phòng. Sau khi lọc, phần cặn không tan
được gộp lại
và rửa bằng hai thể tích cloroform/metanol (1/1, v/v) đồng thời khuấy nhẹ
trong 30 phút để loại bỏ các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (có màu).45
Sau khi lọc, dịch lọc được rửa bằng axeton và làm khô trong không khí (cồn-
chất rắn không hòa tan, AIS).
3.3. Khai thác tuần tự đậu bắp AIS
Okra AIS (20 g) được chiết xuất tuần tự theo Vierhuis et al.24 với 600 mL
chất chiết xuất sau đây; Dung dịch đệm natri axetat 0,05 M ở pH 5,2 và 70 C
(chất rắn hòa tan trong dung dịch đệm nóng, HBSS), EDTA 0,05 M và natri axetat
0,05 M trong natri oxalat 0,05 M ở pH 5,2 và 70 C (chất rắn hòa tan chất
chelat, CHSS), 0,05 Natri hydroxit M ở 0 C và 20 mM NaBH4 (id chất rắn hòa
tan trong kiềm loãng, DASS) và natri hydroxit 6 M ở 0 C và 20 mM NaBH4 (chất
rắn hòa tan trong kiềm đậm đặc, CASS). Việc chiết xuất được thực hiện liên
tục cho đến khi tổng hàm lượng đường của chất nổi phía trên cuối cùng thấp
hơn 40 lg/mL, được xác định bằng xét nghiệm phenol– axit sunfuric.46 Sau mỗi
lần chiết xuất, polyme hòa tan được tách ra khỏi phần cặn không hòa tan bằng
cách ly tâm ( 19.000 g trong 25 phút). Dịch nổi được siêu lọc qua màng 30 kDa
(A/G Technology Corporation) và làm đông khô.
Dư lượng cuối cùng đã được thẩm tách và đông khô.
3.4. Phương pháp phân tích
3.4.1. Tổng hàm lượng đường trung tính và axit uronic
Tổng hàm lượng đường trung tính và hàm lượng axit uronic được xác định
bằng phương pháp so màu bằng orcinol/axit sulfuric tự động như xét nghiệm
say47 và m-hydroxydiphenyl,48–50 tương ứng, sử dụng máy phân tích tự động
(Skalar Analytical BV, Breda, Hà Lan). Gal actose và axit galacturonic được
sử dụng làm chất chuẩn. Các hiệu chỉnh đã được thực hiện đối với sự can thiệp
của axit uronic trong các mẫu. Sự khác biệt giữa axit galacturonic và axit
glucuronic được thực hiện bằng sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao (HPAEC,
Dionex, USA) sau quá trình metanol hóa theo De Ruiter et al.51
3.4.2. Thành phần đường Thành
phần đường trung tính của đậu bắp AIS được xác định bằng sắc ký khí52 sử
dụng inositol làm chất nội chuẩn. Các mẫu được xử lý trước khi thủy phân bằng
axit sunfuric 72% khối lượng/trọng lượng ở 30 C trong 1 giờ, sau đó là bước
thủy phân sử dụng axit sunfuric 1 M ở 100 C trong 3 giờ. Đường được chuyển
thành alditol axetat của chúng và được phân tích bằng GC theo Hilz và cộng
sự.25 Đối với các phần thu được, sau khi sấy khô ở 40 C trong điều kiện chân
không trên P2O5, các mẫu được thủy phân bằng HCl 2 M trong meth anol khô
ở 80 C cho 16 giờ và tiếp theo là 2 M TFA ở 121 C trong 1 giờ. Các monome được
phân tích bằng cách sử dụng sắc ký thay đổi anion-ex hiệu suất cao (HPAEC,
Dionex, Hoa Kỳ) được trang bị cột (2 250 mm) CarboPac PA 1 (Dionex, Hoa Kỳ)
và bổ sung cột sau cột (Dionex, Hoa Kỳ). Nước millipore, NaOH 0,1 M và NaOAc
1 M trong NaOH 0,1 M với lưu lượng 0,3 mL/phút ở 20 C được sử dụng làm chất
rửa giải và NaOH 0,5 M với lưu lượng 0,1 mL/phút ở 20 C được thêm vào cột sau
cho phép phát hiện PAD.
Độ dốc sau đây được áp dụng bằng cách sử dụng dòng 0,3 mL/phút ở 20 C của
NaOH: 0–30,0 phút, 0 mM; 30,0–30,1 phút, 0–100 mM; 30,1–50,0 phút, 100 mM. Độ
dốc đồng thời của NaOAc là 0,0–30,1 phút, 0 mM; 30,1–45,0 phút tối thiểu, 0–
400 mM; 45,1–50,0, 1000 mM. Nước Millipore được sử dụng từ 0,0 đến 30,0 phút.
Đối với cột sau, NaOH 0,5 M với lưu lượng 0,1 mL/phút được sử dụng trong 0,0–
30,1 phút. Sau mỗi lần chạy, cột được rửa trong 5 phút với NaOAc 1 M trong
NaOH 0,1 M, trong 8 phút với NaOH 0,1 M và sau đó được cân bằng nước trong 15
phút.53
3.4.3. cấu hình tuyệt đối
Cấu hình của tất cả các loại đường có mặt được phân tích bằng sắc ký khí
và methyl-aD-galactopyranoside được sử dụng làm
Machine Translated by Google
N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832
tiêu chuẩn nội bộ. Mẫu được metanol hóa bằng HCl 1 M trong metanol
khô. Sau khi chuyển đổi thành ()-2-butyl glycoside tương ứng của
chúng và trimethylsilation, trimethylsilated ()-2-butyl glycoside
được phân tích bằng GC-FID.54
3.4.4. Mức độ acetyl hóa và metyl este hóa
Mức độ acetyl hóa và metyl este hóa của các mẫu được xác định sau
khi xà phòng hóa bằng natri hydroxit 0,4 M trong isopropanol/nước
(50/50 v/v) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Thermo
Finnigan (Mỹ) được trang bị cột Aminex HPX 87H (Bio -Rad, USA).55
Quá trình rửa giải diễn ra ở 40 C với H2SO4 0,01 N với tốc độ dòng
0,6 mL/phút. Mức độ acetyl hóa và metyl este hóa được tính lần lượt
là số mol axit axetic và metanol trên 100 mol axit galacturonic.
3.4.5. Hàm lượng đạm
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp đốt56 với Máy
phân tích đạm và đạm Thermo Quest NA 2100 (Interscience, Hà Lan). D-
Methionine được sử dụng làm chất chuẩn bên ngoài. Hàm lượng protein
được tính bằng cách sử dụng 6,25 dưới dạng hệ số chuyển đổi nitro
thành protein.
3.4.6. Sắc ký loại trừ kích thước hiệu năng cao (HPSEC)
Sắc ký loại trừ kích thước hiệu suất cao (HPSEC) đã được thực
hiện trên HPLC của Sản phẩm tách nhiệt (Mỹ), được trang bị ba cột
TosoH Biosep-TSK-Gel G (nhựa Methyacrylate) nối tiếp (7,8 mm 30 cm,
4000PWXL–3000PWXL–2500PWXL) trong kết hợp với cột bảo vệ PWXL (TosoH,
Nhật Bản). Các mẫu (5 mg/mL; ngoại trừ HBSS: 1 mg/mL) được rửa giải
ở 30 C bằng natri nitrat 0,2 M với tốc độ dòng 0,8 mL/phút.57 Dịch
ra của cột được theo dõi bằng máy dò chỉ số phản xạ (Shodex SE -61,
Showa Denko KK, Nhật Bản). Việc hiệu chuẩn được thực hiện bằng cách
sử dụng hộp thiếc pec có trọng lượng phân tử đã biết.20
3.4.7. Phân tích liên kết glycosid
Thành phần liên kết glycosid của mỗi mẫu được phân giải an toàn
như được mô tả bởi Hakomori58 và được sửa đổi bởi Verhoef và cộng
sự.59 Các alditol axetat được methyl hóa một phần được phân tích bằng
GC-FID và GC–MS theo Verhoef và cộng sự.59
3.4.8. Sự phân hủy bằng enzym
3.4.8.1. phân giải pectin. được Phần HBSS là dis
phân giải (3 mg/ml) trong dung dịch đệm NaOAc 50 mM, ở độ pH 5 và
được ủ với 0,016 đơn vị polygalacturonase từ A. aculeatus và 1,08
đơn vị pectin methyl esterase từ A. niger.20 Phần CHSS (4 mg/mL)
được ủ với 0,024 đơn vị polygalac turonase. Quá trình ủ được thực
hiện ở 40 C trong 24 giờ và các dịch phân hủy sau đó được gia nhiệt
trong 5 phút ở 100 C để vô hiệu hóa enzyme. Dịch phân hủy được thẩm
tách bằng máy lọc ly tâm Centricon với 3 kDa bị cắt ở 1500g trong 30
phút và sau đó, đông khô.
3.4.8.2. Sự phân hủy endo-glucanase (XEG) đặc hiệu Xyloglucan.
Phần CASS được hòa tan (5 mg/mL) trong dung dịch đệm NaOAc
50 mM, ở độ pH 5 và được ủ với 2,3 đơn vị endo-glucanase đặc hiệu
cho can xyloglu từ A. aculeatus38 ở 40 C trong 16 giờ. Dịch phân hủy
được gia nhiệt ở 100 C trong 5 phút để vô hoạt enzyme.
3.4.8.3. phân hủy endo-Xylanase III. Phần CASS được hòa
tan (10 mg/mL) trong dung dịch đệm NaOAc 150 mM, ở pH 5 và được ủ ở
40 C trong 24 giờ với 0,09 đơn vị endo-xylanase III từ A. awamori.36
Enzym này bị bất hoạt bằng cách đun nóng digest trong 5 phút ở 100 C.
1831
3.4.9. HPAEC của oligosacarit Để
xác định oligome xyloglucan, các chất phân hủy enzyme được phân
tích bằng cách sử dụng cột 4 250mm CarboPac PA 100 (Dionex, Hoa Kỳ)
với phát hiện ampe kế dạng xung. Các dải màu của NaOH và NaOAc với
lưu lượng 1 mL/phút đã được sử dụng để rửa giải oligome theo Vincken
và cộng sự.37 Để xác định quá trình phân hủy từ endo-xylanase III,
cột (2 250 mm) CarboPac PA 1 (Dionex, USA) với phát hiện ampe kế
xung được cân bằng với 100 mM NaOH.
Các lớp NaOH và NaOAc được sử dụng đồng thời để rửa giải các oligome
theo Vierhuis et al.36
3.4.10. Phân tích thời gian ion hóa giải hấp thụ laser được hỗ trợ
bởi ma trận của phép đo khối phổ chuyến bay (MALDI-TOF MS)
Phân tích MALDI-TOF MS được thực hiện trên thiết bị Ultra flex
(Bruker Daltonics, Đức) với chùm tia laser Nitrogen 337 nm. Dữ liệu
được thu thập từ trung bình 200 lần chụp với năng lượng laser thấp
nhất (35%). Mẫu phân hủy được khử muối bằng nhựa (Nhựa AG 50W-X8,
dạng H+ ; Bio-Rad, USA). Một thìa nhỏ nhựa Dowex được thêm vào 10 lít
dung dịch mẫu, trộn và ly tâm trong 5 phút ở 13.000 g. Một microlit
dung dịch nền, 10 mg/mL axit 2,5-dihydroxybenzoic trong nước millipore
(Milli-Q Gradient A-10, USA) được đặt trên đĩa MALDI-TOF cùng với 1
lít dung dịch mẫu và làm khô trong điều kiện không khí ấm áp liên tục.
3.4.11. sắc ký trao đổi anion
Sắc ký trao đổi anion được thực hiện trên cột Dòng chảy nhanh
DEAE Se pharose (50 2,6 cm, Amersham Bioscience, Thụy Điển) bằng hệ
thống thám hiểm akta (Amersham Bioscatics, Thụy Điển). Mẫu (280 ml;
0,5 mg/mL) được nạp vào cột (10 mL/phút). Sau khi nạp mẫu, cột được
rửa bằng nước trong 1 thể tích cột (250 mL, 50 mL/phút) và rửa giải
liên tục bằng gradien tuyến tính 0–2 M của dung dịch đệm NaOAc, pH
5, trong 10 thể tích cột. Cuối cùng cột được rửa bằng 2 thể tích cột
NaOH 1M. Trong quá trình rửa giải bằng dung dịch đệm NaOAc, các phần
của 50 mL được thu thập cũng như cột được rửa sạch và phân tích hàm
lượng đường trung tính và axit uronic như đã mô tả. Các phần kiềm
được trung hòa trực tiếp bằng cách thêm axit axetic. Sau khi gộp các
phân số thích hợp, các bể được thẩm tách và đông khô.
1
3.4.12. 13C và Cộng hưởng từ hạt nhân H (NMR)
Trước khi phân tích NMR, mẫu được hòa tan trong 5 mM NaOAc, pH 5,
để đặt pD = pH và đông khô. Sau đó, mẫu được hòa tan trong 99,96%
D2O (Phòng thí nghiệm đồng vị Cambridge, Hoa Kỳ) và sau khi đông
khô, hòa tan lại trong 99,996% D2O (Phòng thí nghiệm đồng vị
Cambridge, Hoa Kỳ). Phổ NMR được ghi lại ở nhiệt độ đầu dò 25 C trên
máy quang phổ Bruker AV-600 được trang bị tủ lạnh đặt tại Biqualys,
Wageningen. Độ dịch chuyển hóa học được biểu thị bằng ppm so với
axeton bên trong: d = 2,225 ppm đối với phổ proton H được ghi lại ở
1 1
600,13 MHz bằng cách sử dụng 64 lần quétH. 8192
Cái 1D
điểm dữ
rộng
liệu
quét
và là
độ 3000
Hz.
Sự nhìn nhận
Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ tài chính từ Ủy ban
Giáo dục Đại học, Bộ Giáo dục Thái Lan, thuộc dự án Phát triển Nhân
viên cho Chương trình Tiến sĩ Chung. Chương trình Khoa học Thực phẩm
tại Đại học Kasetsart, Thái Lan. Hỗ trợ một phần cũng đến từ Trường
Cao học của Đại học Kasetsart, Thái Lan. Hơn nữa, chúng tôi xin cảm
ơn Tiến sĩ Pieter de Waard từ trung tâm NMR Wagen ingen đã giúp đỡ
các thí nghiệm NMR.
Ngoài ra, chúng tôi xin cảm ơn Biqualys, Wageningen, đã cung cấp
thời gian đo trên máy quang phổ NMR tủ lạnh 600 MHz của họ.
Machine Translated by Google

1832 N. Sengkhamparn et al. / Nghiên cứu Carbohydrate 344 (2009) 1824–1832

Người giới thiệu 28. Renard, C.; Crepeau, MJ; Thibault, JF Eur. J. Hóa sinh. 1999, 266, 566–574.
29. Renard, C.; Lahaye, M.; Lẩm bẩm, M.; Voragen, FGJ; Thibault, JF Carbohydr.
độ phân giải 1997, 305, 271–280.
1. BeMiller, JN; Người huýt sáo, RL; Barbalowm, DG trong Polysacarit nướu công nghiệp và
30. Lerouge, P.; Oneill, MA; Darvill, AG; Albersheim, P. Carbohydr. độ phân giải 1993, 243,
các dẫn xuất của chúng; Roy, LW, BeMiller, JN, Eds.; Nhà xuất bản Học thuật: San Diago,
359–371.
1993. Trang 235–255.
31. Colquhoun, IJ; Deruiter, GA; Học giả, HA; Voragen, AGJ Carbohydr. độ phân giải 1990,
2. Woolfe, Mỹ; Chaplin, MF; Otchere, GJ Sci. Thực phẩm nông nghiệp. 1977, 28, 519–529.
206, 131–144.
3. Ndjouenkeu, R.; Goycoolea, FM; Morris, Phòng cấp cứu; Akingbala, JO Carbohydr.
32. Renard, CMGC; Jarvis, MC Carbohydr. polyme. 1999, 39, 201–207.
polyme. 1996, 29, 263–269.
33. Nhu cầu, PW; Rigby, NM; Colquhoun, IJ; Ring, SG Phytochemy 1998, 48,
4. Costantino, AJ; Romanchick-Cerpoviez, JEJ Am. Chế độ ăn. PGS. 2004, 104, 44.
71–77.
5. Romanchik-Cerpovicz, JE; Tilmon, RW; Baldree, KAJ Am. Chế độ ăn. PGS. 2002, 102, 1301–
34. Perrone, P.; Hewage, CM; Thomson, AR; Bailey, K.; Sadler, IH; chiên, SC
1303.
Hóa thực vật 2002, 60, 67–77.
6. Romanchik-Cerpovicz, JE; Costantino, AC; Laura, HGJ Am. Chế độ ăn. PGS.
35. Chiên, SC; York, WS; Albersheim, P.; Darvill, A.; Hayashi, T.; Joseleau, JP; Katô, Y.;
2006, 106, 594–597.
Lorences, EP; Maclachlan, GA; McNeil, M.; Tử thần, AJ; Reid, JSG; Seitz, HU; Selvendran,
7. Người huýt sáo, RL; Conrad, HEJ Am. hóa học. Sóc. 1954, 76, 1673–1974.
RR; Voragen, AGJ; Trắng, AR Vật lý. Plantarum 1993, 89, 1–3.
8. Ngăn chặn, AM; Lengsfeld, C.; Hensel, AJ Ethnopham. 2005, 102, 391–399.
9. Lengsfeld, C.; Titgemeyer, F.; Faller, G.; Hensel, AJ Agric. Hóa chất thực phẩm 2004, 52,
36. Vierhuis, E.; Học giả, HA; Beldman, G.; Voragen, AGJ Carbohydr. polyme. 2001,
1495–1503.
44, 51–62.
10. Agarwal, Monika; Rajani, S.; Mishra, A. Macromol. mẹ. Tiếng Anh 2001, 256, 560–
37. Vinken, JP; Beldman, G.; Niessen, WMA; Voragen, AGJ Carbohydr.
563.
polyme. 1996, 29, 75–85.
11. Tomada, M.; Shimada, K.; Saito, Y.; Sugi, M. Chem. dược phẩm. Bò đực. 1980, 28, 2933–
38. Pauly, M.; Andersen, LN; Kauppinen, S.; Kofod, LV; York, WS; Albersheim,
2940.
P.; Darvill, A. Glycobiology 1999, 9, 93–100.
12. Voragen, AGJ; Pilnik, W.; Thibault, J.; Axelos, MAV; Catherine, MGC trong Polysacarit
39. Hoffman, M.; Giả, Z.; Peña, MJ; Tiền mặt, M.; Harper, A.; Blackburn, AR, II; Darvill,
thực phẩm và ứng dụng của chúng; Stephen, AM, Ed.; Marcel Dekker: New York, 1995; trang
A.; York, WS Carbohydr. độ phân giải 2005, 1826–1840.
287–339.
40. Hilz, H.; de Jong, LÊ; Kabel, MA; Học giả, HA; Voragen, AGJJ Chromatogr.,
13. Học giả, HA; Voragen, AGJ Trong Pectin và thao tác của họ Khoa học sinh học Sheffield;
A. 2006, 1113, 207–286.
Seymour, GB, Knox, JP, Eds.; Nhà xuất bản Blackwell: Oxford, 2002; trang 1–29.
41. McNeil, M.; Darvill, AG; Chiên, SC; Albersheim, P. Annu. Linh mục Biochem. 1984, 53,
625–663.
14. Vương, Tề; Hiểu Khánh, H.; Akihiro, N.; Walther, B.; Hallett, FR Carbohydr. độ phân giải
42. Brett, C.; Waldom, K. Sinh lý học và Hóa sinh của Thành tế bào Thực vật; Hyman: Boston,
2005, 340, 2637–2644.
1990. trang 1–45.
15. Osterveld, A.; Beldman, G.; Học giả, HA; Voragen, AGJ Carbohydr. độ phân giải 1996,
43. Kormelink, FJM; Gruppen, H.; Vietor, RJ; Voragen, AGJ Carbohydr. độ phân giải 1993, 249,
288, 143–153.
355–367.
16. Naran, R.; Quý Bình, C.; Carpita, NC Bản tóm tắt của các bài báo, Họp tường tế bào lần
44. Kabel, MA; Học giả, HA; Voragen, AGJ Carbohydr. polyme. 2002, 50, 191–
thứ XI, Copenhagen, Đan Mạch, 12–17 tháng 8 năm 2007; vật lý. thực vật. 130.
200.
17. O'Neill, MA; York, WS Trong Thành tế bào Thực vật; Hoa hồng, JKC, Ed.; Nhà xuất bản CRC:
45. Monpien, W. Luận văn thạc sĩ, Khoa Khoa học và Công nghệ Thực phẩm,
Mỹ, 2003; trang 1–54.
Đại học Kasetsart, Thái Lan. 2005, 142 tr.
18. Ralet, MC; Crepeau, MJ; Hội trưởng, HC; Thibault, JF Biochem. Tiếng Anh J. 2003,
46. Dubois, M.; Gilles, KA; Hamilton, JK; Rebers, DA; Smith, F. Hậu môn. hóa học.
16, 191–201.
1956, 28, 350–356.
19. Rombouts, FM; Thaibault, JF Trong Hóa học và Chức năng của Pectin; Người cá, ML, Jen,
47. Tollier, MT; Robin, JP Ann. công nghệ. nông nghiệp. 1979, 28, 1–15.
JJ, Eds.; Chuỗi hội nghị chuyên đề ACS 310; Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ: Washington DC,
48. Thibault, J.-F. Lebensm. Wiss. công nghệ. 1979, 21, 247–251.
1986; tr 49.
49. Ahmed, AER; Labavitch, Hóa sinh thực phẩm JMJ. 1977, 1, 361–365.
20. Học giả, HA; Sau khi chết, MA; Voragen, AGJ Carbohydr. độ phân giải 1990, 206, 117–
50. Kintner, PK; van Buren, Khoa học thực phẩm JPJ. 1982, 47, 756–765.
129.
51. De Ruiter, GA; Học giả, HA; Voragen, AGJ; Rombouts, FM hậu môn. hóa sinh. 1992, 207, 176–
21. Đặng, C.; O'Neill, MA; York, WS Carbohydr. độ phân giải 2006, 341, 474–484.
185.
22. Harris, PJ; Henry, RJ; Blakeney, AB; Đá, BA Carbohydr. độ phân giải 1984, 127,
52. Tiếng Anh, HN; Cummngm, Nhà phân tích JH 1984, 109, 937–942.
59–73.
53. Westphal, Y. Dữ liệu chưa công bố
23. Vinken, Nhật Bản; Beldman, G.; Voragen, AGJ Vật lý thực vật. 1994, 104, 99–107.
54. Gerwig, GJ; Kamerling, JP; Vliegenthart, JFG Carbohydr. độ phân giải 1978, 62,
24. Vierhuis, E.; Học giả, HA; Beldman, G.; Voragen, AGJ Carbohydr. polyme. 2000,
349–357.
43, 11–21.
55. Voragen, AGJ; Học giả, HA; Pilnik, W. Hydrocolloid thực phẩm 1986, 1, 65–70.
25. Hilz, H.; Bakx, EJ; Học giả, HA; Voragen, AGJ Carbohydr. polyme. 2005, 59,
56. Dumas, Biên niên sử JBA. Chim. vật lý. 1831, 47, 198–205.
477–488.
57. Trần, Z.; Học giả, HA; Voragen, AJG Carbohydr. polyme. 2004, 52, 219–226.
26. Habibi, Y.; Heyraud, A.; Mahrouz, M.; Vignon, MR Carbohydr. độ phân giải 2004, 339,
58. Hakomori, SJ Biochem. 1964, 55, 205–208.
1119–1127.
59. Verhoef, R.; de Waard, P.; Học giả, HA; Rättö, M.; Siika-aho, M.; Voragen, AGJ
27. Huisman, MMH; Pháp, CTM; Kamerling, JP; Vliegenthart, JFG; Học giả, HA; Voragen, AGJ
Cacbohydrat độ phân giải 2002, 337, 1821–1831.
Biopolyme 2001, 58, 279–294.