ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH

(Phòng thí nghiệm CNSH)

Giáo viên hướng dẫn: Ths. PHẠM THỊ KIM THẢO

Sinh viên thực hiện:
Lớp sinh hoạt:
Nhóm học phần:
Nhóm thí nghiệm:

LƯU HÀNH NỘI BỘ

Đà Nẵng, 2019-2020
NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài 1: Một số công thức pha môi trường, thuốc thử, chủng VSV

Bài 2: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng của chủng vi sinh vật
Bài 3: Hiện tượng lên men của vi sinh vật
Bài 4: Vi sinh vật phân giải tinh bột và cellulose
Bài 5: Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của bia
Bài 6: Bảo quản giống vi sinh vật

Kế hoạch thí nghiệm (5 buổi)

YÊU CẦU THÍ NGHIỆM
Sinh viên xem kỹ tất cả các bài thí nghiệm, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm,
ĐEM BÁO CÁO ĐÓNG TẬP SẴN TRONG MỖI BUỔI TN, MẪU CUỐI TÀI LIỆU 20 TRANG
VIẾT TAY 1 MĂT
KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM
Buổi 1(Bài 1)
Chuẩn bị môi trường và bao gói dụng cụ (Bài 1)
Buổi 2 (Bài 2)
Báo cáo kết quả tìm hiểu về chủng VSV được giao. Đánh giá sinh trưởng vi sinh vật (nấm men
bia)
Buổi 3: Bài 3
Báo cáo kết quả làm buổi 2, Vi sinh vật phân giả tinh bột, cellulose, protein
Buổi 4:
Lên men bia (chuẩn bị dịch lên men)
Buổi 5
Đánh giá một số chỉ tiêu của bia thành phẩm..
Thực hiên bài 5( bảo quản giống vi sinh vật )
Nộp báo cáo tại lớp
YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
1. Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm vi sinh vật
- Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm
- Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cụ thiết bị
dành riêng cho mình. Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn. Tuyệt đối không lấy của
người khác.
- Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc áo
Blue khi làm việc
- Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi
chưa được hướng dẫn.
- Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cụ thí nghiệm và sắp xếp gọn
gàng nơi làm việc
- Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn. Trường
hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn
2. Nguyên tắc làm việc với các giống vi sinh vật
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, các vi sinh vật được nuôi cấy trên các môi trường
dinh dưỡng đặc hoặc lỏng đựng trong các ống nghiệm, trong các bình thủy tinh hoặc
các đĩa Petri. Dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước
khi cấy, phải tiến hành theo những quy tắc nhất định để đảm bảo giữ cho các giống
nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn bởi vi sinh vật ở môi trường xung quanh.
Trước khi cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm (hoặc bình thủy tinh hoặc đĩa Petri):
- Tên môi trường
- Tên giống vi sinh vật
- Ngày cấy
Tất cả các thao tác được trực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn và tốt hơn hết là thực hiện
trong các phòng cấy vô trùng. Sau khi cấy, phải đặt ống nghiệm (hoặc các dụng cụ khác
có nuôi cấy vi sinh vật) vào các tủ ổn nhiệt (còn gọi là tủ ấm). Đối với các dụng cụ nuôi
cấy vi sinh vật đã dùng xong, cần phải khử trùng bằng nồi áp xuất, rồi mới đem đi rửa.
Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc đã dùng xong một lớp dung dịch khử trùng và giữ
yên một ngày sau đó mới đổ môi trường đi và cọ rửa sạch sẽ.
Tiến hành ghi chép thí nghiệm:
Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí
nghiệm. Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định.
Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc.
2/ Đối tượng nghiên cứu
3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm
4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng
5/Kết quả nhận được.
Các số liệu phải ghi thành từng bảng. Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình
vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ.
Bài 1:
MỘT SỐ CÔNG THỨC PHA MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ, CHỦNG VSV

1.1 Công thức môi trường

Bảng 1. Công thức pha môi trường thông dụng

Tên môi trường Công thức

Thạch thịt pepton Cao thịt: 5g

Pepton: 10g
(Vi khuẩn) NaCl : 5 g
Aga: 20g
Nước cất: 1000ml, pH = 7-7,2
Hansen Saccharose hoặc Maltose: 50g
- Pepton: 10g
(nấm men) - KH2PO4: 3g
- MgSO4: 3 – 5 g
- Agar: 20g, Nước cất: 1000ml
môi trường Czapek) - Saccharose: 30g
- NaNO3: 30g
(nấm mốc) - K2HPO4: 1g
- MgSO4: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
pH = 6, khử trùng 1atm/30 phút
Gauze 1 Tinh bột tan: 20g
- K2HPO4: 0,5g
(Xạ khuẩn) - MgSO4.7H2O: 0,5g
- KNO3: 1,0g
- NaCl: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
pH = 7,2 – 7,4 khử trùng 0,5 atm/30 phút

- Môi trường PDA để nuôi cấy nấm men và nấm mốc

Bảng 1.2. Thành phần môi trường PDA
Thành phần Số lượng Đơn vị

Chất chiết khoai tây 200 Ml

Agar 20 G

Dextrose 20 G

Nước cất 1 Lít

 Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ trong
1 lít nước cất trong 30 phút. Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, đó là chất chiết khoai tây.
Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hoà tan. Hấp tiệt trùng trong 15 phút ở 1210C.
Cho từng thể tích 20 – 25ml vào các đĩa petri vô khuẩn 15x100mm. pH cuối là 5,6±0,2.
Không làm tan chảy môi trường nhiều hơn một lần.
- Môi trường hoạt hóa tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii
❖ Môi trường rắn:
- Glucose: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l
- Pepton: 3g/l - Ethanol: 30g/l
- Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l
- Axit axetic: 2m/l - Nước cất bổ sung: 1000ml.
Etanol 99.7% và axit axetic bổ sung vào môi trường sau khi đã tiệt trùng và làm
nguội.
- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh axit axetic của tế bào vi khuẩn
Gluconacetobacter hansenii
- Glucose: 10g/l - Cao nấm men: 2g/l
- Pepton: 2g/l - Ethanol: 20g/l
- Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l
- Thuốc thử brommocresol: 0.2g/l ( pha trong cồn 200C)
- Nước cất bổ sung: 1000ml.
Etanol 99.7% và thuốc thử cho vào môi trường sau khi đã tiệt trùng và
làm nguội 40-450C
- Môi trường thạch - thịt - pepton để phân lập và nuôi vi khuẩn
- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l
- NaCl : 5g/l - Agar : 20g/l
- Nước cất bổ sung : 1000ml
- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme amylaza (MT5)
- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l
- NaCl : 5g/l - Tinh bột tan : 5g/l
- Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml
- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme cellulaza (MT6)
- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l
- NaCl : 5g/l - CMC : 10g/l
 - Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml
- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme proteaza (MT7)
- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l
- NaCl : 5g/l - Gelatin : 10g/l
- Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml
1.2. Thuốc thử
+ Đối với amylase và cellulase: sử dụng lugol
Thành phần và cách pha dung dịch Lugol: Hòa tan 2g KI trong 5ml nước cất, thêm 1g I2
vào, sau đó bổ sung nước cất đến đủ 300ml và lắc đều cho tan thành dung dịch thuốc thử
Lugol đồng nhất.
+ Đối với Protease sử dụng: Amido – Black 1%, hoặc Tricloroacetic acid 10% (sẽ kết tủa
các protein chưa bị thủy phân)
Công thức pha thuốc nhuộm Amido – Black 1%: Hòa 1g Amido – Black trong 100ml dung
dịch CH3COOH 7%.
1.3. Chủng vi sinh vật
1.3.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
1.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger
1.3.3. Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium
1.3.4. Nấm men bia Saccharomyces carlsbergensis
1.3.5. Xạ khuẩn X5

Yêu cầu: Sinh viên tự tìm hiểu đặc điểm của các chủng vi sinh vật nêu
trên (đặc điểm sinh trưởng, có khả năng sinh enzym gì, ứng dụng)
BÀI 2
ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

Sự tăng trưởng của giống vi sinh vật được biễu diễn bằng sự gia tăng của mật độ tế bào
( số tế bào/ml môi trường, N/ml) hay sự gia tăng sinh khối giống theo thời gian nuôi cấy.
• Đánh giá sự sinh trưởng thông qua số tế bào
Đếm vsv trên buồng đếm chuyên dùng:
- Buồng đếm Thoma, Malassez
- Kỹ thuật Breed (đếm vi khuẩn): sử dụng 0.01mL mẫu cố định trên 1cm2 phiến
kính, nhuộm màu vsv rồi đếm
- Đếm khuẩn lạc trên hộp petri
• Đánh giá sự sinh trưởng thông qua lượng sinh khối
- Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi
- Xác định độ đục của canh trường
• Đánh giá sự sinh trưởng thông qua hàm lượng các chất nội bào
- Phương pháp định lượng ATP
• Đánh giá sự sinh trưởng thông qua hoạt tính sinh khối
- Mức độ sử dụng cơ chất
- Mức độ hình thành sản phẩm
2.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng đối với chủng vi khuẩn và nấm men (thời gian
thế hệ 2 giờ)
2.1.1. Nguyên tắc
Mật độ tế bào có thể được xác định bằng các phương pháp trực tiếp (sử dụng buồng
đếm hồng cầu) gián tiếp bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đo mật độ quang
OD610
Phương pháp đo OD610 để gián tiếp theo dõi sự gia tăng của mật độ tế bào theo thời
gian nuôi cấy, phương pháp này dựa trên sự tương quang tuyến tính giữa OD610 và log
(N/ml).
2.1.2. Tiến hành:
❖ Xây dựng đường chuẩn tường quan giữa OD610 và mật độ tế bào
+ Huyền phù hóa một ít sinh khối giống (thu từ môi trường rắn như ống thạch nghiên
hoặc hộp petri) trong nước cất. Thực hiện pha loãng sao cho thu được các huyền phù có giá
trị OD610 gần bằng 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.
+ Dùng phòng đếm hồng cầu hoặc đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào tương ứng
với các huyền phù có OD610 khác nhau 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.
❖ Khảo sát sự tăng trưởng của giống theo thời gian
+ Giống vi khuẩn hoặc nấm men đã được phân lập và làm thuần, được hoạt hóa bằng
cách cấy một ít sinh khối từ giống thạch nghiên vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường
cao thịt pepton hoặc môi trường hansen. Lắc ở nhiệt độ thích hợp 28-35ºC 100-130
vòng/phút trong 1 ngày
 + Chuyển một lượng giống đã hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng sao cho
OD610 đạt xấp xỉ 0,05.
+ Nuôi cấy lắc ở 28-35ºC. Sự tăng trưởng của giống được theo dõi trong 24 h bằng cách
thu lấy mẫu sau những khoảng thời gian nuôi nhất định: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 giờ.
+ Pha loãng mẫu nếu cần thiết sao cho OD610 sau khi pha loãng nằm trong khoảng 0,1-
0,5.
+ Nhân trị số OD610 đo được với độ pha loãng để suy ra giá trị OD610 của huyền phù tế
bào.
Trường hợp không thể theo dõi sự tăng trưởng của giống qua đêm, có thể thực hiện như
sau:
+ Cấy giống đã hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng tương tự như trên
vào chiều ngày hôm trước. Sau 12 giờ hoăc 14 giờ ( sáng hôm sau), bắt đầu thu mẫu để
đo OD610.
+ Ống giống đã được hoạt hóa ở trên được bảo quản ở 4ºC để ức chế sự tiếp tục tăng
trưởng của giống. Ngày hôm sau, thực hiện cấy giống vào một ống nghiệm khác chứa
20 ml môi trường lỏng tương tự như trên.
+ Song song với việc theo dõi sự tăng trưởng của giống sau 12 giờ nuôi cấy, tiến
hành theo dõi sự tăng trưởng của giống từ 0 – 12 giờ sau nuôi cấy.
2.1.3. Tính toán kết quả
2.1.3.1. Tương quan giữa log (N/ml) theo OD610
- Lập bảng kết quả xác định mật độ tế bào của huyền phù có OD610 khác nhau.
- Vẽ đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610
- Nhận xét khoảng tương quan tuyến tính giữa log(N/ml)và OD610.
2.1.3.2. Vẽ đường cong tăng trưởng của giống
- Lập bảng kết quả theo dõi tăng trưởng của giống (dựa theo OD610 và dựa theo log(N/ml)
theo thời gian nuôi cấy.
- Vẽ đường cong tăng trưởng của giống trong môi trường lỏng khảo sát bằng đồ thị biểu
diễn hàm số OD610 hoặc log(N/ml) theo thời gian nuôi cấy.
- Xác định các đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian của pha log,
thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào ở pha ổn định...
2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng đối với nấm (thời gian thế hệ 4-12 giờ)
2.2.1. Đánh giá thông qua lượng sinh khối
❖ Nguyên tắc:
Để khảo sát biến dưỡng ở vi sinh vật, thường phải nuôi cấy chúng trên môi trường lỏng
và thu sinh khối. Đối với vi sinh vật đa bào dạng sợi như nấm mốc, xạ khuẩn ... có thể
dùng phương pháp lọc để tách sinh khối ra khỏi dịch nuôi và sấy khô 105ºC cho đến khi
trọng lượng không đổi.
❖ Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường PDA lỏng (thay nguồn đường bằng CMC)
- Nuôi cấy nấm:
 + Thay đổi thành phần dinh dưỡng (đường, đạm...) hoặc pH môi trường hoặc thời
gian nuôi cấy.
+ Chuẩn bị và bình tam giác 250 (môi bình 30ml môi trường PDA lỏng)
+Sau khi khử trùng, nghiên lọ để mặt môi trường nằm ngang. Cấy miếng thạch có
sợi nấm ở sát mép nước, sau đó để đứng lại từ từ.
+ Nuôi cấy tĩnh trong 4 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 g, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 54 giờ
+ Sinh khối sợi được vớt ra và đặt lên giấy lọc (được cân để trừ). Sấy ở nhiệt độ
105ºC cho đến khi trọng lượng không đổi.
❖ Tính toán kết quả
Vẽ đường cong tăng trưởng của giống
- Lập bảng kết quả theo dõi tăng trưởng của giống dựa vào sinh khối nấm theo thời
gian nuôi cấy.
- Vẽ đường cong tăng trưởng của giống trong môi trường lỏng khảo sát bằng đồ thị
biểu diễn hàm sinh khối theo thời gian nuôi cấy.
- Xác định các đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian của pha
log, thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào ở pha ổn định...
BÀI 3:
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PROTEIN, TINH BỘT VÀ CELLULOSE

Vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi... có khả năng sinh enzyme ngoại bào
nhờ đó chúng có thể thủy giải các cơ chất tự nhiệ như protein, tinh bột, cellulose,
hemicellulose...để thành những thành phần đơn giản hơn cho quá trình hấp thu và dinh
dưỡng của chúng.
3.1. Nguyên tắc
Cấy chấm điểm vi sinh vật lên môi trường thạch có chứa cơ chất tương ứng (đối với
enzyme cellulose, sử dụng cơ chất Carboxymethyl cellulose (CMC); enzyme amylase,
sử dụng cơ chất tinh bột tan). Sau thời gian nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ thích hợp,
khuẩn lạc vi sinh vật hình thành, các enzyme được tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường
sẽ thủy phân cơ chất và tạo thành vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc. Dựa vào hiệu
số giữa đường kính của vòng thủy phân và đường kính khuẩn lạc, ta đánh giá khả năng
sinh tổng hợp enzyme (cellulose, amylase) của loài vi sinh vật quan tâm.
- Để quan sát rõ vòng thủy phân, sử dụng thuốc nhuộm protein (Amido – Black). Dựa
vào việc có xuất hiện vòng thủy phân ta xác định hoạt tính sinh enzym protease.
- Để quan sát rõ vòng thủy phân đối với khả năng thủy phân tinh bột và cellulose sử
dụng thuốc thử lugol.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch chiết enzyme thô do vi sinh vật tiết ra trong môi
trường lỏng, sử dụng phương pháp đục lỗ thạch và xác định hoạt tính của enzyme thông
qua hiệu số giữa đường kính của vòng thủy phân và đường kính lỗ thạch.
3.4. Thực hành
3.4.1. Chuẩn bị:
- Môi trường:
Chuẩn bị môi trường chọn lọc thích hợp đối với từng chủng vi sinh vật, thay nguồn carbon
duy nhất bằng protein (gelatin hoặc cazein), tinh bột, hoặc cellulose
 Nuôi cấy
Tiến hành cấy chấm điểm khuẩn lạc vào các đĩa Petri đã có bổ sung môi trường
tương ứng như trên, mỗi đĩa có thể cấy 3 vị trí (tạo thành tam giác đều).
Nuôi đĩa đã cấy ở 300C, qua đêm.
3.4.2. Quan sát và ghi nhận kết quả
Để tính toán đường kính thủy phân, ta đổ thuốc thử lên mặt thạch, tráng đều. Môi
trường có màu xanh đậm (hoặc tím do tinh bột kết hợp với iod), hoặc nâu tím
(cellulose kết hợp với iod) còn vòng thủy phân xung quanh vị trí cấy khuẩn lạc thì
không màu.

d D

Khi ghi nhận kết quả, cần đo đường kính khuẩn lạc d (mm), và đo đường
kính thủy phân D (mm). Tính hiệu số giữa D-d (mm).
BÀI 4
HIỆN TƯỢNG LÊN MEN CỦA VI SINH VẬT

Vi sinh vật có thể sử dụng nhiều chất hữu cơ khác nhau để thu năng lượng, quá
trình phân giải hợp chất hữu cơ không có oxy gọi là quá trình lên men. Tùy sản phẩm cuối
cùng của quá trình lên men để gọi tên chúng như: lên men etylic, lactic, acetic.

I. LÝ THUYẾT CHUNG
4.1. Lên men etylic
Trong quá trình này, đường bị biến đổi thành rượu Etylic và CO2, đồng thời sản sinh
năng lượng.
C6H12O6 + H3PO4 → CH3CH2OH + H2O + CO2 + FDP
Nhiều vi sinh vật có khả năng lên men rượu, mạnh nhất là nấm men
(Saccharosemyces). Ngoài ra, một số nấm mốc Mucor hoặc vi khuẩn (Sarcrina ventriculi)
cũng có khả năng lên men, nhưng nồng độ etanol không cao.
Quá trình lên men có thể thực hiện với các cơ chất khác đường như: phế thải gỗ, ngũ
cốc, khoai củ, hoa quả, rỉ đường...
4.2. Lên men lactic
Trong quá trình này đường bị biến đổi thành acid lactic. Có 2 kiểu lên men lactic: đồng
hình và dị hình
- Lên men lactic đồng hình: sản phẩm chính là acid lactic (90%), một lượng nhở acid
bay hơi, rượu etylic và sản phẩm khác.
- Lên men lactic dị hình: ngoài acid lactic, còn một lượng đáng kể acid acetic, rượu
etylic, CO2...
4.3. Lên men acetic
Là quá trình oxy hóa rượu etylic
CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O + Năng lượng
Vi khuẩn lên men acid acetic thuộc 2 nhóm: Acetobacter và Acetomonas. Nhiều loài khi
phát triển lâu trên môi trường dễ sinh ra hình thái đặc biệt như: tế bào phình to, kéo dài,
phân nhánh....
- A. aceti: hình que, xếp thành chuổi, có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao
(11%). Nhiệt độ thích hợp 34 ºC.
- A. pasteurianum: Hình que, có thể xếp thành chuổi dài, tạo váng khô nhăn nheo, bắt
màu xanh với iod.
- A.orleance: hình que, nhỏ, đôi khi dị hình không di động, tạo váng dày trên cơ chất,
có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao (10 -12%) và tích lũy 9.5% acid
acetic.
- A. xylinum: hình quem không di động, tạo váng dày trên cơ chất, có chứa nhiều
hemmicellulose, đồng thời tích lũy 4,5 % acid acetic. Đây là loại vi khuẩn sống
cộng sinh với nấm men và thường được gọi là thủy hoài sâm, được dùng ở Nga,
Trung Quốc.
 - A. schutzenbachii: hình que dài, khi già mới tạo thành váng, không bền. Có khả
năng tích lũy 11,5% acid acetic, để sản xuất giấm theo phương pháp cột
II. THỰC HÀNH
4.4. Lên men bia
Dùng nấm men để chuyển hóa các chất có trong dịch lên men thành rượu và CO2 và một
số sản phẩm khác. Trong quá trình lên men dưới ảnh hưởng của nhiệt độ thấp, áp suất cao
và một số yếu tố khác đã xảy ra nhiều biến đổi trong dịch lên men để rồi ta thu được bia.
4.4.1. Nguyên liệu
- Dịch lên men gồm: malt đại mạch, gạo, hoa hoặc cao hoa houblon
- Men giống
- Dụng cụ đo nồng độ chất khô, Nhiệt kế, Bình tam giác các loại, can nhựa, tủ lạnh,
nồi, bếp điện, rá nhựa, nhiệt kế, vải màn
4.4.2. Tiến hành
a) Chuẩn bị dịch lên men
- Lấy 500g malt và 200g gạo đem nghiền nhỏ. Yêu cầu khi nghiền, giữ cho vỏ malt
càng nguyên càng tốt, độ mịn vừa phải, gạo nghiền mịn hơn malt.
- Lấy chính xác 150 g bột gạo và 15 g bột malt cho vào nồi có đựng sẵn 800ml nước
30-32ºC (cho malt vào trước, cho gạo vào sau). Dùng đũa thủy tinh vừa khuấy vừa
nâng nhiệt của hỗn hợp lên đến 72-75ºC (tốc độ nâng nhiệt 1ºC một phút) và giữ
nhiệt độ này trong khoảng 20- 25 phút. Tiếp theo nâng nhiệt độ của khôi dịch lên
đến sôi và cho sôi khoảng 30 phút.
- Song song với việc nấu gạo thì cũng tiến hành chuẩn bị nồi malt (khi bắt đầu nâng
nhiệt để đun sôi nồi gạo thì cũng là lúc bắt đầu nâng nhiệt nấu nồi malt). Để chuẩn
bị nồi malt thì cần 335 g bột malt cho vào nồi thứ 2 (lớn hơn nồi trên) có chứa sắn
1300ml nước 30-32ºC. Dùng đũa thủy tinh vừa khuấy vừa nâng nhiệt của hỗn hợp
lên đến 50 -52ºC (tốc độ nâng nhiệt là 1ºC/phút) và giữ nhiệt độ này khoảng 20
phút. Tính toán sao cho lúc này nồi gạo cũng vừa đun sôi.
- Sau đó vủa khuấy nồi malt vừa đổ từ từ nồi gạo sang nồi malt và phải chú ý khống
chế nhiệt độ của hỗn hợp đạt 60 -65ºC. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ này khoảng 30 phút.
Tiếp theo nâng nhiệt lên 72ºC và giữ cho đến khi đường hóa hoàn toàn (dùng dung
dịch iod để thử màu dung dịch thủy phân)
- Sau khi đường hóa xong nâng nhiệt của hỗn hợp lên 78ºC và đem lọc qua vải màn.
Trong quá trình lọc, dùng nước nóng 78ºC để rửa bã. Rửa cho đến khi nào nồng độ
chất khô của nước rửa vào khoảng 1% thì ngừng. Nước lọc ban đầu và nước rửa bã
nhập chung (hỗn hợp này được gọi là nước mout) phải trong, có nồng độ chất khô
nhỏ hơn nồng độ của dịch lên men ban đầu 0,5 -1 %
- Tiếp theo tiến hành đun sôi dịch đường với hoa houblon. Lượng hoa sử dụng 1,5 g/l
dịch đường. Nếu sử dụng cao hoa thì 1g cao có thể thay thế 5g hoa. Để houblon hóa
thì tất cả dịch đường cho vào nồi và nâng nhiệt đun sôi. Khi bắt đầu nâng nhiệt độ
thì cho ¾ lượng hoa và ¼ còn lại cho vào trước khi kết thúc quá trình đun sôi 30
phút. Thời gian đun sôi kéo dài 1,5-2 giờ.
- Sau khi houblon hóa xong thì lọc nhanh để tách bã hoa rồi làm nguội để thu dịch lên
men. Chú ý kiểm tra nồng độ dịch lên men bảo đảm theo yêu cầu.
b) Chuẩn bị giống men bia Sacharosemyces carlsbergensis
Tuần tự thực hiện như sau:
Ống giống gốc →ống nghiệm 10 ml →bình tam giác 50 ml → bình tam giác 250 ml
 Để nuôi cấy men giống dùng trong môi trường nước malt (100 %) có độ khô 10%.
Môi trường sau khi chuẩn bị xong phải được thanh trùng kỹ và làm nguội nhanh. Ống
nghiệm và các bình nhân giống phải được rửa sạch và sấy khô.
Lấy 10 ml môi trường cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy đã khử trùng và làm
nguội lấy 3 vòng men giống cho vào ống nghiệm.
Đặt ống nghiệm đã cấy giống vào tủ ấm 25ºC và nuôi trong 24 giờ. Sau đó chuyển
toàn bộ dịch giống cấp 1 vào bình tam giác có sẵn 40 ml môi trường (trước khi chuyển
cần lắc ống nghiệm để tránh nấm men bị lắng xuống đáy ống). Bình tam giác được tiếp
tục nuôi ở 25ºC trong 18 giờ. Chuyển toàn bộ giống sang bình tam giác 500 ml có chứa
200 ml môi trường. Tiếp tục nuôi bình giống ở 25ºC đến khi trên bề mặt xuất hiện lớp
bọt trắng mỏng thì chuyển vào can lên men.
c) Lên men
- Dùng can nhựa 1 lít để lên men. Trước khi lên men can cần được rửa sạch và sát
trùng kỹ. Dịch đường sau khi tách bã hoa houblon xong thẳng vào can (cho 750 ml
dịch đường) rồi làm nguội đến nhiệt độ lên men. Sau đó cho hết men giống ở bình
tam giác vào can và giữ can ở nhiệt độ lên men thích hợp để tiến hành lên men
chính.
- Trong quá trình lên men cần lấy mẫu để theo dõi sự giảm chất khô hằng ngày. Khi
nồng độ chất khô còn lại chỉ giảm 0,2% ngày đêm và lớp bọt trên bề mặt can xẹp
xuống thì coi như quá trình lên men chính kết thúc. Khi đó thu sản phẩm được gọi là
bia non.
- Lấy bia non đổ đầy chai và đóng chặt nắp đặt vào tủ lạnh nhiệt độ 1-2ºC để tiến
hành lên men phụ. Quá trình lên men phụ kéo dài 20 ngày và khi đó bia trong chai
đã trong.
4.4.3. Tính toán kết quả
- Tính hiệu xuất nấu bia (dịch lên men)
Để đánh giá quá trình thủy phân dưới tác dụng của enzyme phải xác định % chất
khô chuyển vào dịch lên men, so với lượng nguyên liệu ban đầu hay nói cách khác
là phải xác định hiệu xuất chiết E:

E - % chất khô chuyển vào dịch lên men

V - Thể tích của dịch đường sau khi lọc
ɳ - Nồng độ của dịch đường %
d - Khối lượng riêng của dịch đường kg/l
G - Khối lượng nguyên liệu đã dùng để nấu bia kg
0,96 hệ số hiệu chỉnh cho việc giảm thể tích của dịch đường do làm nguội
- Tính độ lên men: là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá quá trình lên men, nó được tính
bằng công thức sau:

V- Độ lên men %
E – Nồng độ chất khô có trong dịch lên men ban đầu
e – Nồng độ chất khô có trong bia non hoặc bia thành phẩm
Bài 5:
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG BIA

Nhằm đánh giá chất lượng bia của mình đã sản xuất, từ đó có thể so sánh với các
loại bia khác
5.1. Xác định hàm lượng CO2 trong bia
- Nguyên tắc: Cho CO2 có trong bia tác dụng với một thể tích NaOH đủ tạo muối
Na2CO3. Sau khi loại trừ lượng xút dư, dùng axit sulfuric có nồng độ xác định để
chuẩn lượng Na2CO3. Từ đó tính ra lượng CO2 có trong bia.
- Dụng cụ và hóa chất: Bình tam giác 250 ml, bình tam giác nút mài 200ml, hoặc
250ml, buret dung tích 25ml, pipet, ông đong 50 ml, 250ml, Dung dịch NaOH 2N,
Dung dịch H2SO4 0,1N, Phenolphtalein 1% trong cồn 60°, dung dịch metyl da cam
trong cồn 60°
- Tiên hành: Để đảm bảo tính chính xác khi tiến hành phân tích phải chuẩn bị dụng
cụ và mẫu làm thí nghiệm.
+ Chuẩn bị mẫu: Giữ chai bia trong tủ lạnh một ngày đêm hoặc 1 giờ trong bể đá.
Chuẩn bị 2 bình tam giác có nút mài dung tích 250ml. Rót vào mỗi bình 10 ml
NaOH 2N. Mở chai bia mẫu nhẹ nhàng, và rót nhanh đến mức 100-150ml. Đậy nút
bình và lắc đều trong 5 – 10 phút. Để yên 4 phút. Rót toàn bộ vào ống đông và đọc
chính xác kết quả (B).
+ Tiến hành thử: Dùng pipet hút chính xác 10 ml bia vừa chuẩn bị ở trên cho vào
bình tam giác 250ml, thêm 50ml nước cất và 1-3 giọt phenolphtalein , dung dịch sẽ
có màu hồng. Dùng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn độ lượng xút dư cho đến khi dung
dịch mất màu hồng và không tính lượng axit đã tiêu tốn lúc này. Thêm 1- đến 3 giọt
metyl da cam, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng. Tiếp tục chuẩn độ bằng H2SO4
0,1N cho đến khi dung dịch chuyển thành màu da cam, ghi thể tích H2SO4 đã tiêu
tốn (V1).
Song song với mẫu thí nghiệm phải tiến hành mẫu trắng bằng cách lấy 10 ml bia đã
loại bỏ hết CO2 cho vào bình nón rồi thêm 1ml NaOH 2N 50 ml nước cất và tiến
hành phân tích tương tự mẫu thật ở trên.
- Tính toán kết quả: Hàm lượng CO2 có trong bia (g/l) được tính theo công thức
sau:

X: hàm lượng CO2, g/l

0,0044: Số gam CO2 tương ứng với 1ml dung dịch H2SO4 0,1N
B: Thể tích bia đã kiểm hóa, ml.
V1, V2: thể tích dung dịch H2SO4 0,1N đã tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mẫu
trắng, ml
 1000: hệ số chuyển đổi ra lít
10 thể tích mẫu bia lấy kiểm tra, ml
10: thể tích dung dịch NaOH 2N đã dùng để kiểm hóa mẫu bia, ml
5.2. Xác định độ chua của bia
- Nguyên tắc: Dùng xút để chuẩn độ lượng axit có trong bia với chất chỉ thị là
phenolphtalein. Độ chua của bia được tính bằng số ml NaOH 0,1N dùng để trung
hòa 10 ml bia đã loại CO2
- Nguyên liệu: Bia đã loại bỏ CO2, Dung dịch NaOH 0,1N, Chỉ thị phenolphtalein
1%, Nước cất vô trùng, bình nón 100ml, buret, pipet.
- Tiến hành: Dùng pipet lấy 10ml bia cho vào bình nón 100ml, thêm 40ml nước cất,
và 5 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đã chuẩn bị sẵn ở
buret, cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Thể tích NaOH đã tiêu tốn khi chuẩn độ
chính là độ chua của bia.
5.3. Xác định hàm lượng rượu trong bia ( sử dụng cồn kế)
- Nguyên tắc: Việc thực hiện đo độ cồn trong nước rất dễ dàng. Người sử dụng chỉ
cần lấy cồn kế thả trong rượu hay cồn và căn cứ vào độ chìm/nổi của cồn kế mà đọc
chỉ số trên vạch. Tuy nhiên, chỉ số độ cồn chỉ chính xác ở một nhiệt độ thích hợp
(18-20 °C), còn trên hoặc dưới nhiệt độ đó, độ cồn trên cồn kế không chính xác
tuyệt đối và được gọi là độ cồn biểu kiến.
- Dụng cụ và hóa chất: Cồn kế, ống sinh hàn thẳng, bình định mức 100 ml, cốc
100ml, ống đong 100ml, đèn cồn.
- Tiến hành:
+ Dùng pipet hút 100-150ml bia đã loại CO2 cho vào bình đun, lắp ống sinh hàn
thẳng, chưng cho đến khi cạn bình. Dung dịch chưng hứng vào bình định mức dung
tích 100ml, và định mức đến đúng 100ml.
Cho ra bình tam giác hoặc cốc 100ml, thả cồn kết vào, đọc kết quả
Bài 6:
BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT

Giống được phân lập hoặc đã qua khảo sát, cần phải giữ trong thời gian nhất định,
để có thể tiếp tục nghiên cứu hoặc sản xuất. Tùy theo mục đích sử dụng mà cách bảo quản
khác nhau: Giữ ngắn hạn và giữ dài hạn
8.1. Nguyên tắc
Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của vi sinh vật, đồng thời ngăn cản sự sinh
sản của chúng
Phương pháp giữ giống gồm 2 bước:
Bước 1: Chọn chủng ở điều kiện và giai đoạn tối ưu cho bảo quản
Bước 2: Chọn phương pháp thích hợp cho bảo quản
8.2. Chọn chủng
- Đối với vi khuẩn và nấm men: nuôi cấy trên môi trường đặc để có khuẩn lạc riêng
rẽ. Chọn khuẩn lạc hình dạng đều và không tạp nhiễm
- Đối với xạ khuẩn và nấm sợi: tơ mọc mạnh, phân nhán đều, màu sắc sáng bình
thường không tạp nhiễm
- Ngoài ra, còn chọn gia đoạn thích hợp của chu trình sống để bảo quản, như: tế bào
dinh dưỡng hay bào tử tiềm sinh...
8.3. Các phương pháp giữ giống
Các phương pháp thường sử dụng:
- Giữ giống trên môi trường thạch hoặc môi trường thạch có lớp dầu khoáng.
- Giữ giống bằng đất cát hoặc các loại hạt
- Giữ giống bằng phương pháp đông khô.
- Giữ giống bằng phương pháp lạnh đông
8.3.1. Giữ giống trên môi trường thạch
Cấy chuyền định kỳ trên môi trường thạch cũng là một biện pháp giữ giống. Tuy
nhiên, cách giữ này chỉ được thời gian ngắn (vài tuần đến 1- 2 tháng). Ngoài ra, việc cấy
chuyền nhiều lần trên môi trường thạch cũng có thể làm thoái hóa giống.
Để kéo dài thời gian, có thể đặt các ống thạch giống ở nhiệt độ thấp (12-15ºC) hoặc
phủ lên môi trường thạch lớp dầu khoáng, như paraffin lỏng hay glycerol. Với cách này
môi trường chậm khô và vi sinh vật chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp.
8.3.2. Giữ giống trên cát hoặc hạt
- Giữ giống trên cát: Thường áp dụng cho các nhóm nấm tạo bào tử tiềm sinh. Cát
được xử lý bằng cách ngâm acid sulfuric đậm đặc khoảng 1 giờ. Rửa liên tục bằng
nước cho đến khi pH đạt trung tính. Sau đó rây để chọn các có đường kính trung
bình từ 1 -1,5 mm. Nếu giữu trong ống nghiệm, cho vào đáy ống một lớp bông
thấm dày 5-7mm. Cho cát vào đến nữa ống, và phủ lên bề mặt một lớp bông dày 2
mm. Nhỏ một ít giọt môi trường dinh dưỡng trên bề mặt lớp bông cho thấm dần
xuống cát vừa đến lớp bông dưới thì ngừng lại. Hấp khử trùng ở 121ºC/60 phút. Để
nguội cấy giống. Giống mọc lan qua cát sẽ hình thành bào tử. Phủ mặt nút bông
 ống nghiệm bằng paraffin đặc và bảo quản ở nhiệt độ thường. Thời gian giữu giống
có thể kéo dài một vài năm.
- Giữ giống trên hạt: thường dùng nuôi cấy và giữ nấm sợi. Hạt sử dụng có thể là hạt
lúa mì hoặc lúa gạo, nấu cho nứt nanh. Chia vào ống nghiệm, dưới đáy cũng để một
lớp nút bông, trên mặt phủ một lớp nút bông khác (tương tự như trên cát). Thêm
môi trường dinh dưỡng và khử trùng ở 121ºC/90 phút. Cấy giống và chờ tơ nấm lan
đầy phủ miệng ống nghiệm (phía trên nút bông) bằng paraffin đặc. Giữu nhiệt độ
mát hay phòng. Thời gian bảo quản có thể một năm
8.3.3. Giữ giống bằng phương pháp lạnh sâu
➢ Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu.
➢ Cách tiến hành: Nuôi vi sinh vật trên môi trường tăng sinh cho đến cuối giai đoạn
logarit rồi thu tế bào. Để bảo vệ vi sinh vật không bị chết ở nhiệt độ lạnh sâu do các
tinh thể nước gây ra chúng tôi phải trộn vi sinh vật vào một trong các chất bảo vệ sau
đây:
Bảng 2.1. Dung dịch và nồng độ chất bảo vệ lạnh được sử dụng
Chất bảo vệ Nồng độ
Glucose 10%
Lactose 10%
Glycerol 15%
Sữa gầy 10%
Saccarose + gelatin 10% + 1,5%
Không chất bảo vệ -

Trộn vi sinh vật với chất bảo vệ đã chuẩn bị sẵn. Hút dịch tế bào này cho vào các
ống nghiệm, đậy nút lại. Sau đó đưa vào bảo quản ở nhiệt độ -200C. Sau thời gian bảo
quản định kì hoạt hoá trở lại để kiểm tra tỉ lệ sống sót và hoạt tính của giống sau bảo quản.
8.3.4. Giữ giống bằng phương pháp đông khô
Bằng một thiết bị sấy đông khô, người ta làm đông nhanh tế bào ở -20ºC đến -40 ºC,
sau đó cho bốc hơi nước trong điều kiện chân không. NHư vậy có thể lấy nước trong tế
bào, nhưng không làm thay đổi hình dạng của chúng. Lúc này tế bào sẽ ngừng sự sinh sản
và trao đổi chất. Kết quả có thể chúng có thể chịu được của môi trường tốt hơn. Phương
pháp này giữu giống tương đối lâu, có thể vài chục năm.
➢ Nguyên tắc: Làm lạnh sâu môi trường nhũ hoá vi sinh vật, sau đó làm thăng hoa
phần nước có trong môi trường nhũ hoá ở điều kiện chân không
➢ Cách tiến hành: Nuôi vi sinh vật trên các môi trường thích hợp cho đến cuối giai
đoạn logarit, thu tế bào và trộn các chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2ml
huyền phù vi sinh vật vào các ống đông khô chuyên dùng loại Ø 10mm hoặc Ø
35mm. Các ống đông khô chứa vi sinh vật sau đó được lạnh đông ở nhiệt độ -20ºC
trong vài giờ. Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị đông khô, thời
gian làm khô tuỳ thuộc vào thiết bị và số lượng giống cần làm khô, trung bình 8 –
14 giờ. Sau đó các ống đông khô được hàn kín.
Bảo quản mẫu đông khô ở trong tủ lạnh.
8.4. Thực hành
8.4.1. Nguyên liệu
- Giống vi sinh vật nghiên cứu
- Môi trường dinh dưỡng tương ứng (môi trường lỏng và đặc)
- Dung dịch glycerol (vô trùng)
8.4.2. Đối với nấm men
- Bảo quản trên ống thạch nghiệm: Nuôi cấy giống nấm men trên môi trường Hansen
5 ngày ở nhiệt độ thường. Bảo quản ở tủ 2-15ºC
- Bảo quản trong glycerol: ống giống nấm men 5 ngày tuổi hòa với 1ml nước muối
sinh lý để tạo huyền phù tế bào. (hoặc nuôi cấy lắc tế bào nấm men trong môi
trường lỏng, sau 5 ngày). Lấy 0,5 ml dịch tế bào nấm men cho vào ống eppendorf,
thêm 0,5ml glycerol 40% (đã vô trùng). Bảo quản tủ -20ºC.
8.4.3. Đối với nấm mốc
- Bảo quản trên thạch: Nuôi cấy giống trên môi trường PGA 5 ngày ở nhiệt độ phòng.
Bảo quản trung tủ 2-15 ºC.
- Bảo quản trong glycerol: ống giống nấm mốc 5 ngày tuổi hòa với 1ml nước muối
sinh lý để tạo huyền phù tế bào. Lấy 0,5 ml dịch bào tử cho vào ống eppendorf,
thêm 0,5ml glycerol 40% (đã vô trùng). Bảo quản tủ -20ºC.
8.5. Báo cáo kết quả
Nộp ống thạch và giống trong glycerol

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Thực tập VI SINH CƠ SỞ, NXB Đại học quốc gia TP HCM
2. Phan Thị Bích Ngọc (1997), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men bia và hàm
lượng diacetyl của bia non, Luận án Thạc sỹ Khoa học kỹ thuật.
3. Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất bản giáo dục.
4. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh_Tập III_Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất
bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm Công
nghệ sinh học, tập 2, NXB, Đại học Quốc gia TP.HCM
 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH

(Phòng thí nghiệm CNSH)

Giáo viên hướng dẫn: Ths. PHẠM THỊ KIM THẢO

Sinh viên thực hiện:
Lớp sinh hoạt:
Nhóm học phần:
Nhóm thí nghiệm:

Đà Nẵng, 2020-2021
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………