‫قياس االحماض النووية‬

‫‪Nucleic Acids Quantification‬‬

‫الجزء العملي‬
‫المحاضرة الخامسة‬
‫د‪ .‬اسامة انور سعيد‬
‫قسم االنتاج الحيواني ‪ -‬جامعة االنبار‬
 ‫الهدف من المحاضرة‬ ‫•‬
‫في نهاية المحاضرة سوف يتعلم الطالب‬ ‫•‬
‫معرفة اليات تنقية وقياس تركيز الحمض النووي‪.‬‬ ‫•‬
‫مجاالت استخدامها‪.‬‬ ‫•‬
‫االليات المتبعة في تحليل ‪. DNA‬‬ ‫•‬
 ‫تقدير تركيز ونقاوة ‪ DNA‬او ‪RNA‬‬
‫• تقدر األحماض النووية ‪ Nucleic acids‬للتحقق من تركيز ونقاء الحمض النووي ‪ DNA‬او‬
‫‪ RNA‬الموجود في العينة‪.‬‬
‫• من المهم معرفة تركيز ونقاوة الحمض النووي ليسهل استخدامة في تطبيقات أخرى مثل‬
‫‪. Restriction digestion ،PCR‬‬
‫• التحليل باستخدام المطياف الضوئي ‪ Spectrophotometer‬هومن اكثر الطرق شيو ًعا‬
‫لقياس ‪. DNA‬‬
‫• يمكن استخدام ‪ Agarose Gel Electrophoresis‬لتحليل عينة ‪ DNA‬من أجل النقاء‬
 ‫‪ .1‬طريقة المطياف الضوئي ‪Spectophotometric Method‬‬

‫• لقياس ‪ DNA‬او ‪ 260( RNA‬نانومتر) اما في حالة قياس تركيز البروتين (‪ 280‬نانومتر) وتكون نسبة النقاوة (‪.) 280\260‬‬
‫• نسبة (‪ ) 280\260‬تعطي مؤشر على نقاوة العينة بالتالي فان المحاليل النقية ‪ DNA‬او ‪ RNA‬بقيمة الكثافة الضوئية للطولين الموجيين ‪260‬‬
‫مقسوم على ‪ 280‬وهي ‪ DNA 1.8‬و ‪ RNA 2‬وتقل القيمة في حالة وجود ملوثات لعينة الحامض النووي كالبروتينات وغيرها عن تلك القيم‪.‬‬

‫‪ .2‬طريقة ‪NanoDrop‬‬
‫• احدث نسخ موجودة لهذا الجهاز ‪ NanoDrop 2000/2000c NanoDrop 8000, NanoDrop Lite‬بمعدل تركيز – ‪(2 ng/µL‬‬
‫)‪ 15,000 ng/µL dsDNA‬بدون تخفيف للعينة‪.‬‬
‫‪ .3‬طريقة ‪Agarose Gel Electrophoresis‬‬
‫وهي طريقة تستخدم لفصل األحماض النووية بنا ًء على حجمها تحت تأثير التيار الكهربائي وبما أن األحماض النووية تحمل مشحنة سالبة‬
‫عند تطبيق المجال الكهربائي تنتقل من الكاثود ‪ Cathode‬إلى األنود ‪ Anode‬اعتمادًا على حجم جزيئة الحمض النووي المطلوب تحليله‬
‫الذي يمكن تحضير تركيز جل مناسب يعمل كمنخل ‪ sieve‬لفصل األحماض النووية بنا ًء على حجمها‪.‬‬
‫‪ .4‬طريقة القياس باستخدام ‪Agarose Gel‬‬
‫يمكن تحليل نقاء العينة باستخدام هذه الطريقة حيث يمكن إزالة الملوثة من ‪ DNA / RNA‬في بعض االحيان‪.‬‬
NanoDrop 2000/2000c Spectophotometric Method
 Required Instruments ‫األجهزة المطلوبة‬
Laboratory drying oven
Vortex mixers
Autoclave
Hotplate and magnetic stirrers
Micro-centrifuge
Micropipettes and tips
Safety cabinet class II
Balances (Analytical and Digital)
PCR Thermo-cycler
Incubator Shaker
Electrophoresis set
Ice Maker Machine
UV documentation system
Water Distiller
Bacterial growth incubator
pH Meter
Shaker
UV/VIS Spectrophotometer
Refrigerator (-20c and 4c)
Compound light microscopes
Microscope station
 ‫أنواع الهالم المستخدم في الترحيل الكهربائي ‪Types of Gel Using in Gel Electrophoresis‬‬
‫هالم األكاروز ‪ Agarose Gel‬يستخدم بشكل واسع في هذه التقنية عبارة عن سلسلة متشابكة من السكريات‬
‫المتعددة المكونة من الكالكتوز ومشتقاته والمرتبطة مع بعضها بأواصر هيدروجينية لتكوين شبكة معقددة‬
‫‪ Complex Net‬تعتمد فتحاتها ‪Pores‬على تركيز االكاروز فكلما كان التركيز عاليا كلما كانت الفتحات‬
‫اصغر والعكس صحيح‪ ،‬يتضح من ذلك ان قابلية الهالم على فصل القطع تعتمد على تركيزه فكلما زاد التركيز‬
‫كلما زادت قابلية الفصل‪ .‬إن تركيز هالم االكاروز يتراوح بين ‪ % 2 – 0.5‬وبطول ‪ 12‬سم ‪ ،‬واألكثر‬
‫استخداما" هو ‪ % 1 – 0.7‬والذي يستخدم لفصل قطع ‪ DNA‬كبيرة الوزن الجزيئي ‪20Kbp– 200bp‬‬
 ‫تشغيل الجهاز الترحيل ‪Electrophoresis‬‬
‫• يوضع غطاء الخزان بالشكل الصحيح لضمان الترحيل من القطب السالب الى القطب‬
‫الموجب ويتم تشغيل مجهز القدرة ‪Power Supply‬على فولتية ‪ V 45‬وامبيرية ‪180‬‬
‫‪ Mili-amber‬ولمدة ‪ 15‬دقيقة كمرحلة اولى‪.‬‬
‫• بعد انتهاء ال ‪ 15‬دقيقة نسمع صوت المنبه من مجهز القدرة‪ ،‬نعدل الفولتية الى ‪V 80‬‬
‫وامبيرية ‪ Mili-amber 180‬ولمدة ساعة‪.‬‬
‫• يتم مراقبة سير الترحيل من خالل حركة صبغة ال ‪ Bromophenol blue‬كمؤشر‬
‫‪DNA ladder‬‬
‫• عبارة معيار لقياس أطوال مختلفة لجزيئات ‪DNA‬‬
‫• يتألف ‪ DNA Ladder‬من أحجام (‪DNA ) size‬‬
‫معروفة تُستخدم لتحديد حجم عينة ‪ DNA‬المراد‬
‫دراستها‪.‬‬
‫• عادة ما يحتوي سلم الحمض النووي على عينات‬
‫ذات حجم متباعد بانتظام والتي عند تشغيلها على‬
‫هالم االكاروز والتي تبدو مثل السلم‬
Agarose gel with DNA ladders on a UV transilluminator
‫• عدد الطرق المستخدمة في تقدير تركز االحماض النووية؟‬
‫• ماهو هالم االكاروز؟‬
 ‫المصادر‬

‫‪• Payne, D. A. (2016). Basics of Molecular Biology. In Molecular‬‬

‫‪Pathology in Clinical Practice (pp. 1-17). Springer, Cham.‬‬
‫• قازانجي‪ ،‬محمد عمر؛ جبر‪ ،‬حميد عبود‪ .) 2017( .‬علم الحياة الجزيئي‪ .‬الطبعة االولى‪.‬‬
‫جامعة بغداد‪ ،‬كلية الزراعة‪ .‬الدار الجامعية للطباعة والنشر والترجمة‪.‬‬
‫• مصطفى‪ ،‬نشأت غالب‪ .) 2018( .‬البيولجي الجزيئي‪ .‬الطبعة االولى‪ .‬دار الكتاب الجامعي‪.‬‬