‫استخدام جهاز ‪ PCR‬في تعريف الكائنات‬ ‫عالية علي المري‬

‫الحية الدقيقة بواسطة ‪S16 RRNA‬‬ ‫‪MBIO521‬‬

‫لتقليل مدة العال ج بالمضادات الحيوية‬

‫‪OUTCOMES‬‬

‫‪ .1‬لماذا تستخدم طريقة ‪ 16S rRNA‬في تعريف البكتيريا ؟‬

‫‪ .2‬ماذا يعني ‪ 16S rRNA‬؟‬

‫‪ .3‬ما هو جهاز ‪ PCR‬وكيف يعمل ؟‬

‫‪ .4‬تعريف الـ ‪ amplicons‬؟‬

‫‪ .5‬ماهي قواعد ‪ BLASTA , Gane Bank‬؟‬

 ‫مقدمة ‪:‬‬
‫قد يوفر استخدام تقنية ‪ 16S rRNA‬طريقة بديلة أو مكملة لعمليات تحديد المظاهر الظاهرية للبكتيريا ذات‬
‫الصلة سريرًيا في بيئة المرضى ‪.‬‬

‫في البكتيريا ‪ ،‬يحتوي جين ‪ rRNA 16S‬على مناطق شديدة التباين تحيط بها مناطق محفوظة تسمح‬
‫بمضاعفة‪ PCR‬للتسلسالت المستهدفة‪.‬‬

‫ويمكن استخدام هذه المتواليات داخل المناطق شديدة التباين لتحديد العالقات الجينية للبكتيريا‪.‬‬
‫تحليل تسلسل الجين ‪ 16S rRNA‬هو أداة مقبولة للتحديد الجزيئي للبكتيريا ويمكن استخدام إما مستعمرات‬
‫مثقفة أو عينة مريضة مباشرة‪.‬‬

‫تم إجراء تسلسل ‪ PCR‬لـ ‪ 16S rRNA‬وتسلسل ‪ amplicon‬للمساعدة في تحديد الكائنات الحية التي‬
‫يصعب استزراعها ‪ ،‬في تحديد الكائنات الحية التي يمكن تربيتها ولكن لم يتم التعرف عليها بسهولة ‪ ،‬وفي‬
‫اكتشاف الكائنات الحية في النتيجة السلبية للمستعمرات حيث تكون العدوى مشتبه بها ‪.‬‬

‫قد يحقق اختبار ‪ PCR 16S rRNA‬نتيجة إيجابية أو نتيجة سالبة دون اكتشاف أي كائن حي‪.‬‬
 ‫الهدف‪: ) )WHAT‬‬

‫كانت أهداف هذه الدراسة لتقييم التأثير االيجابي لـ ‪ 16S rRNA‬في تحديد طول المعالجة بالمضادات الحيوية‬
‫(‪ ) LOT‬ومعدل وقف المضادات الحيوية‪.‬‬

‫‪ amplicon‬قد يساعد في توجيه‬ ‫الكشف عن الكائنات الحية بواسطة ‪ 16S rRNA‬متبوًع ا بتحديد متسلسل‬
‫العالج المضاد للميكروبات في المرضى الذين يعانون من ثقافة سلبية‬
 ‫األهمية ‪: ) ) WHY‬‬
‫التقنيات المستندة إلى الثقافة التقليدية ‪ ،‬مثل نمو الكائنات الحية الدقيقة في الوسائط الصلبة أو المرق ‪ ،‬وتقنيات تحديد الهوية ‪ ،‬مثل التلوين‬
‫البكتيري (على سبيل المثال ‪ ،‬صبغة غرام) والتفاعالت الكيميائية ‪ ،‬تساعد في تحديد الكائنات الدقيقة في المرضى الذين يشتبه في‬
‫‪.‬إصابتهم بالعدوى‬
‫قد يعزى الفشل في التعرف على الكائنات الحية إلى عدم قدرة الكائن على التكاثر في المختبر ‪ ،‬أو تلقي المريض للمضادات الحيوية قبل‬
‫‪ .‬اخذ العينة وزراعها‬
‫‪.‬من دون التعافي والتعرف على الكائنات الحية بنجاح ‪ ،‬قد يتلقى المرضى دورات ممتدة أو غير ضرورية من العالج المضاد للميكروبات‬
‫قد يتلقى المريض أيًضا عالًج ا واسع النطاق بدون داع ‪ ،‬حيث أنه بدون بيانات واضحه‪ ،‬لن يكون هناك قدرة على اختيار نظام مضاد‬
‫‪.‬للميكروبات محدد وضيق‬

‫‪ .‬هذا يضع المرضى في خطر الختيار مضادات لسالالت مقاومة للبكتيريا‬

‫‪.‬على هذا النحو ‪ ،‬فإن استكشاف طرق بديلة لتحديد الكائنات الحية وتحديد األنظمة المضادة للميكروبات األمثل للمرضى أمر بالغ األهمية‬
 ‫طريقة ‪. 16S PCR‬‬

‫النتائج‬ ‫تحليل البيانات‬ ‫تخزين العينة‬

‫معالجة العينة‬ ‫استخراج العينة‬

‫مضاعفة العينة‬ ‫تحضير العينة‬

 ‫تخزين العينة‬
‫تتم معالجة غالبية العينات في غضون ‪ 8‬ساعات من جمع العينات ‪.‬‬

‫إذا كان هناك أي تأخير ‪ ،‬يتم تخزين العينة في ‪ 8-2‬درجة مئوية ‪.‬‬
 ‫استخراج العينة‬
‫كمية العينة التي تخضع الستخراج الحمض النووي هي ما يقرب من ‪ 200‬ميكرولتر من السوائل‬
‫أو ‪ 0.03‬غرام من المادة الصلبة‪.‬‬

‫يتم استخراج الحمض النووي البكتيري من العينة باستخدام مجموعة قوالب وتضاف الى ‪ 100‬ميكرولتر من‬
‫الماء‪.‬‬

‫يتم استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري ثم يتم تضخيم جزء من ‪rDNA 16S‬عبر ‪ ، PCR‬ومن ثم يتم‬
‫عمل تسلسل ‪.amplicons‬‬
‫تحضير العينة‬
‫يتم تعيين ‪PCR‬‬
‫‪ .1‬باستخدام ‪ 16S‬بادئ امامي‬
‫‪ .2‬و ‪ 16S‬بادئ عكسي ‪.‬‬

‫‪PCR Master mix‬‬ ‫‪.3‬‬

 ‫الكونترول السلبي \ الكونترول اإليجابي‬
‫يتم تنقية منتجات ‪ PCR‬قبل التسلسل‪.‬‬

‫لضمان جودة استخالص الحمض النووي وعملية تفاعل البلمرة المتسلسل ‪ ،‬يتم تضمين ثالث مجموعات من‬
‫الضوابط مع كل عملية تفاعل بوليميراز متسلسل‪.‬‬

‫يؤكد الكنترول االيجابي على سالمة عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل‪.‬‬

‫يؤكد الكنترول السلبي للتأكد من عدم وجود تلوث خالل العملية بأكملها‪.‬‬
 ‫مضاعفة العينة ‪:‬‬
‫يتم تشغيل عينات المريض وعناصر التحكم بالشروط التالية‪:‬‬

‫تمسخ ‪ 95‬درجة مئوية لمدة ‪ 5‬دقائق ‪ 35 ،‬دورة من كل تمسخ لمدة ‪ 30‬ثانية ‪.‬‬

‫االلتصاق عند ‪ 55‬درجة مئوية لمدة ‪ 30‬ثانية ‪.‬‬

‫والتمديد عند ‪ 68‬درجة مئوية لمدة ‪ 1‬دقيقة‪.‬‬

 ‫معالجة العينة‬
‫بعد التضخيم ‪ ،‬يتم تنفيذ الترحيل الكهربائي لتحديد ما إذا كان هناك حمض نووي بكتيري موجود في العينة وأن‬
‫‪.‬عناصر التحكم تتم كما هو متوقع‬
 ‫تحليل البيانات‬
‫يتم التعرف على الكائن الدقيق عن طريق إدخال تسلسل الزوج المعزول األساسي في خوارزمية البحث عبر‬
‫اإلنترنت ‪ ،‬مثل أداة بحث المحاذاة المحلية األساسية ‪ BLAST‬التي تستعلم عن قاعدة بيانات مرجعية للعثور‬
‫على مناطق تشابه بين تسلسالت ‪.DNA‬‬

‫تقارن أداة ‪ BLAST‬تسلسالت ‪ nucleotide‬محددة إلى قاعدة بيانات ‪ GenBank‬وتحسب األهمية‬

‫اإلحصائية لمطابقة التتابع‬
‫لإلشارة إلى احتمال أن تكون هوية البكتيريا المعلنة هي الهوية الحقيقية للبكتيريا الموجودة في عينة المريض‬
 ‫النتائج ‪:‬‬
‫النسبة المئوية المقبولة للتشابه ‪ ،‬التي تعتمد على جودة تسلسل و مطابقة النوكليوتيدات ‪ ،‬لتعيين هوية إلى الكائنات‬
‫الحية الدقيقة المعزولة‪.‬‬

‫نسبة التشابه المقبول ‪ ٪ 97‬من تسلسل ‪ BLAST‬للجنس ‪ ،‬و‪ ٪ 99‬من تسلسل ‪ BLAST‬المقدمة لألنواع‪ .‬يجب أن‬
‫يتطابق التسلسالن األمامي والعكسي مع هوية الكائن الحي‪.‬‬

‫قد تشتمل أسباب عدم اإلبالغ عن النتائج للكائن‬

‫‪ .1‬عدم وجود تسلسل معرف سابق‬
‫‪ .2‬تلوث العينة‬
‫‪ .3‬احتمال إصابة المريض بهذه الميكروب ضئلةة‬
 ‫المناقشة ‪:‬‬
‫تساعد برامج اإلشراف على مضادات الميكروبات ( ‪ )ASPs‬على تحسين جودة رعاية المرضى من خالل العمل كمضيفين الستخدام‬
‫مضادات الميكروبات العقالنية والمناسبة ‪ ،‬وغالًبا ما يكون ذلك بهدف الحد من استخدام مضادات الميكروبات و ‪ LOT‬؛ هذا ‪ ،‬بدوره ‪،‬‬
‫يساعد على الحد من اختيار مضادات الميكروبات‬

‫ومع ذلك ‪ ،‬فإن اختبار ‪ 16S rRNA‬نفسه لديه بعض التحذيرات الستخدامه‪.‬‬

‫لم يتم اعتماد بعد من قبل ‪ ، FDA‬وقد ال يشعر األطباء باالرتياح الستخدام نتائج االختبار في الممارسة السريرية‪.‬‬

‫ليست ذات حساسية وخصوصية محددة بشكل جيد في جميع أنواع العدوى ‪.‬‬

‫ال يقدم درجة حساسية الكائن الحي ضد المضاد ‪ ،‬مما يتطلب من األطباء استخدام أنماط الحساسية المحلية أو بيانات المراقبة األوسع الختيار‬
‫أفضل عامل مضاد للميكروبات للمريض‬
 ‫تشكل اإلصابات الميكروبية مشكلة أيًض ا ألن اإلجراءات الموصوفة غير قادرة على التعرف على العديد من‬
‫الكائنات الحية في نفس العينة‬

‫قد تكون هناك حاجة للتسلسل العميق للتعرف بدقة على األنواع البكتيرية من عينات المرضى المعقدة‬

‫لم يكن باإلمكان اإلبالغ عن تفاعل إيجابي اذا تم اعتبار أن الكائن الحي منخفض االحتمالية إلصابة المريض أو‬
‫بأنه قد تم تلوثه‪.‬‬
 ANY Q ?

Reference:

Gilbert, Elise M., et al. “Use of Organism Identification by 16S Ribosomal RNA
Polymerase Chain Reaction to Shorten Antimicrobial Length of
Therapy.” Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol. 88, no. 2, June
2017, pp. 163–167., doi:10.1016/j.diagmicrobio.2017.03.013.