‫بسم هللا الرحمن الرحيم‬

‫‪251‬حدق‬
‫األحياء الجزيئية‬
‫المعمل الرابع‬
‫• عند عزل الحمض النووي ‪ ,‬نالحظ انه قد يحتوي عل العديد من الملوثات ‪ ،‬مثل‬
‫احتوائه على كميات كبيرة من البروتينات او الحمض النووي ‪. RNA‬‬

‫• هناك إجراءات متعددة يمكن استخدامها إلزالة هذه الملوثات وترك الحمض‬
‫النووي بشكل نقي ‪.‬‬
 ‫‪ .1‬التخلص من البروتينات ‪ :‬عن طريق اضافة خليط من‬
‫( الفينول‪ :‬الكلوروفورم‪ :‬كحول ايزواميل )‬

‫‪ .2‬ويمكننا التخلص من ‪ RNA‬عن طريق اضافة انزيم الريبونيوكليز ‪.‬‬

‫• السبكتروفوتومتر هو جهاز لقياس كمية الضوء للمادة‬
‫المستعملة عن طريق طول الموجة التي توجه للجهاز‪.‬‬
 ‫‪ -1‬يحسب درجة االمتصاص عند كل من االطوال الموجية (نانومتر‪)nm‬‬
‫‪230-240-250-260-270-280-290-300‬‬
‫‪ -2‬نسجل نسبة االشعة الممتصة والصادرة عن المحلول‪.‬‬
‫‪ -3‬يتم عمل منحنى من العالقة بين محورين السيني يمثل االطول الموجية والصادي‬
‫مقدار االشعة الممتصة‪.‬‬
 ‫التأكد من نقاء الحمض النووي ‪:‬‬
‫‪ -‬قياس االمتصاص عن الطول الموجي ‪ 260‬و ‪nm 280‬‬
‫‪Concentreation of DNA=O.D x 260 x 50 x dilution factor‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪ -‬وتكون قيمة الناتج ‪1.8 -1.7‬‬
‫‪ -‬اما إذا كان تركيز ‪ DNA‬خارج هذا المدى ال تكون العينة صالحة ‪ ،‬وهذا‬
‫يعني عدم ذوبان الحمض النووي او وجود شوائب مثل البروتينات ‪.‬‬
 DNA Sample
‫الفصل الكهربائي لعينة‬
DNA
Gel Electrophoresis ‫بواسطة‬
‫♣ الفصل الكهربائي بواسطة الجل من أكثر التقنيات استعماالً‬ ‫•‬
‫لتحليل األحماض النووية والبروتين‪.‬‬
‫♣ جل األجاروز يستعمل غالبا ً لتحضير وتحليل الحمض‬ ‫•‬
‫النووي ‪.DNA‬‬
‫♣ الفصل الكهربائي بواسطة الجل يعمل على فصل‬ ‫•‬
‫الجزيئات على الحركة داخل الجل تحت تأثير المجال‬
‫الكهربائي‪.‬‬
‫♣ نستعمل الفصل الكهربائي بواسطة الجل لتحديد النواتج‬ ‫•‬
‫بعد عملية تضخيم الدنا بواسطة تفاعل البلمرة التسلسلي‪.‬‬
 ‫▪الحمض النووي الدنا يحمل شحنة سالبة‪.‬‬
‫▪عندما نضع الحمض النووي الدنا في مجال كهربي فإنه سوف يهاجر أو(يرحل)‬
‫للقطب الموجب“المصعد“‪.‬‬
‫▪ جل األجاروز يستعمل لفصل وتحرك جزيئات الدنا إعتماداً على حجم الحمض النووي‬
‫الدنا ‪DNA .‬‬
‫‪H‬‬ ‫‪O2‬‬
‫‪‬‬ ‫‪‬‬

‫‪DNA‬‬

‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬

‫‪Power‬‬ ‫الفراغات بين جل األجاروز يسمح بمرور جزيئات‬

‫مصدر الطاقة‬ ‫الدنا‪DNA .‬‬
‫صورة من المجهر اإللكتروني الماسح لجل‬
‫‪‬‬
‫األجاروز )‪Amal Alghamdi-MIC251-2011 (1×1 µm‬‬ ‫‪10‬‬
 ‫س‪ :‬كيف سيرحل الدنا بسرعة ؟؟؟‬
‫اعتماداً على‪-:‬‬
‫‪ -1‬قوة المجال الكهربي‪.‬‬
‫‪ -2‬المحلول الدارئ‪.‬‬
‫‪ -3‬كثافة جل األجاروز‪.‬‬
‫‪ -4‬حجم الحمض النووي الدنا‪.‬‬
‫‪DNA‬‬

‫‪small‬‬
‫‪large‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬

‫‪Power‬‬
‫▪الجزيئات الصغيرة الحجم من الدنا سوف تتحرك بسرعة أكثر‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫من الجزيئات الكبيرة‪11.‬‬
‫‪DNA‬‬ ‫‪Sample‬‬
‫‪DNA Sample‬‬
‫•عينة بها بعض الخاليا المكتسبة‬

‫•غمر الخاليا في محلول مغذي‬

‫على الطبق ‪ ،‬وتترك لتنمو‬
‫وتتضاعف ‪.‬‬

‫•الخاليا المتجمعة تجمد لالستعمال‬

‫المستقبلي ‪.‬‬
‫•الـ ‪ DNA‬يكون مكتسب من هذه‬
‫الخاليا ‪.‬‬
Restriction Enzyme

‫•نستعمل‬
restriction enzyme
. ‫ إلى أجزاء‬DNA ‫لتقطيع الـ‬
‫‪Apply Enzyme‬‬

‫•عينة الـ ‪ DNA‬وانزيم القطع‬

‫توضع في األنبوب ‪.‬‬

‫• تعريض األنبوبة للهز‬

‫والدوران حتى يخلط الـ ‪DNA‬‬
‫األنزيم‪.‬‬
Water Bath
‫‪Preparing the Gel‬‬

‫•في هذه األثناء يحضر‬

‫الجل ‪ ،‬وذلك باستخدام‬
‫مسحوق الـ ‪.Agarose‬‬
 ‫الصيغة البنائية لجا األجاروز‬

‫جاالكتوز منزوع الماء جاالكتوز‬

‫▪ األجاروز عبارة عن متبلمر خطي يستخرج من الطحالب البحرية‪.‬‬

‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪18‬‬
‫▪ يحضر جل األجاروز بواسطة مزج‬
‫بودرة األجاروز مع المحلول الدارئ‪.‬‬
‫‪Buffer‬‬
‫محلول دارئ‬

‫‪Flask for boiling‬‬

‫دورق للغليان‬

‫‪Agarose‬‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬
‫بودرة األجاروز‬
‫‪19‬‬
‫•خلط المسحوق مع‬
‫الماء في دورق ‪.‬‬
 ‫بودرة األجاروز‬ ‫المحلول الدارئ‬

‫▪نمزج بودرة األجاروز مع المحلول الدارئ باستخدام الدورق مع مراعاة أن يكون‬

‫الدورق أكبر من الحجم المذاب‪.‬‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪21‬‬
‫‪Preparing the Gel‬‬
‫• يسخن الدورق في‬
‫المايكرويف عند الحاجة‬
‫حتى يذوب المسحوق‬
‫بالكامل في الماء ‪.‬‬

‫•يصبح المحلول صافي‬

‫‪.‬‬
 ‫غليان األجاروز‬

‫محلول األجاروز غير ذائب في‬ ‫محلول األجاروز يصبح صافي‬

‫درجة حرارة الغرفة‪.‬‬ ‫بعد غليانه‪.‬‬

‫مالحظة‪-:‬‬
‫نحرص وننتبه عند عملية الغليان فمحلول األجاروز سيصبح ساخنا ً جداً ‪ ,‬والزيادة في التسخين ممكن أن‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪23‬‬
‫يبخر محلول األجاروز‪.‬‬
 ‫أجزاء جهاز الفصل(الرحالن)الكهربائي‬

‫‪Power supply‬‬ ‫‪Cover‬‬

‫مصدر الطاقة‬ ‫الغطاء‬
‫‪Gel tank‬‬
‫حوض‬
‫الرحالن‬

‫‪Electrical leads‬‬
‫الوصالت الكهربائية ‪‬‬

‫‪Gel combs‬‬
‫‪Casting tray‬‬ ‫أمشاط الجل‬
‫الرحالن‬ ‫طبق‬
‫‪Amal‬‬ ‫‪Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪24‬‬
‫طبق الرحالن واألمشاط‬

‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪25‬‬

‫‪Preparing the Gel‬‬
‫• صب الجل السائل في الصندوق‬
‫الداخلي ‪.‬‬
‫• توضع قطعة مثل المشط في‬
‫الصندوق الداخلي ‪.‬‬
‫• يترك الهالم السائل حتى يبرد‬
‫ويتصلب‬
‫(ويمكن استخدام الثالجة ) ‪.‬‬
‫• عندما يتصلب الجل‪ ،‬هذا المشط‬
‫يصنع اآلبار التي يوضع فيها‪DNA‬‬
‫‪.‬‬
 ‫نحضر طبق الرحالن‬

‫▪ نلف حواف الطبق بلصق ثم نضع األمشاط‪.‬‬

‫لمس األمشاط لسطح طبق‬ ‫سطح مستوي ‪ ,‬مع مالحظة عدم‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪27‬‬
‫▪ نضع الطبق على‬
 ‫نصب الجل‬

‫▪محلول األجاروز يجب أن يغمر األمشاط ولكن ليس كليا ً‪.‬‬

‫عملية التسخين‪.‬‬ ‫الفقاعات الهوائية الناتجة عن‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫▪الحرص على إزالة ‪28‬‬
 ‫ً‬
‫مقارنة مع شكله قبل‬ ‫▪عندما يبرد األجاروز فإنه سوف يكون جل مرن‪ ,‬وشبه شفاف‬
‫التبريد‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪29‬‬
‫أنزع األمشاط واللصق‪.‬‬
‫نضع الجل مع الطبق داخل حوض الرحالن الكهربائي‪.‬‬

‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪30‬‬

 ‫‪Gel Ready‬‬

‫• الجل أصبح جاهز‪.‬‬

‫• يصب الماء في الحاوية ‪.‬‬

 ‫‪DNA‬‬

‫‪buffer ‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬

‫‪Wells‬‬
‫المحلول الدارئ‬ ‫الفتحات‬
‫المصعد‪Anode‬‬
‫‪Cathode‬المهبط‬ ‫)‪(positive‬‬
‫)‪(negative‬‬
‫نصب المحلول الدرئ في حوض الرحالن الكهربائي حتى نغطي سطح الجل‪ ,‬نتأكد أن‬
‫المحلول تخلل داخل جميع الفتحات‪.‬‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪32‬‬
‫• يـزال الـمـشـط ‪.‬‬
 ‫‪Putting DNA on the Gel‬‬
‫• يخلط الـ ‪ DNA‬مع محلول‬
‫ملون ( مشع ) حتى يرى تحت‬
‫الـ ‪. U.V‬‬
‫• تدخل عينات الـ ‪ DNA‬إلى‬
‫اآلبار ‪.‬‬
‫• وضع محلول يحتوي على قطع‬
‫من الـ ‪DNA‬‬
‫‪ladder 1‬‬
‫‪ladder 2‬‬
‫)‪(called ladder‬تستعمل‬
‫‪original‬‬ ‫‪DNA cut by‬‬ ‫للمقارنة ‪.‬‬
‫‪uncut DNA‬‬ ‫‪Hind III‬‬
 ‫تحميل الجل‬

‫‪ -‬عينة الدنا في الغالب تكون شفافة‪ ,‬لذلك نمزج معها صبغة (‪3‬مايكروليتر ‪ 5 +‬مايكروليتر‬
‫من العينة)‪.‬‬
‫‪ -‬بحرص شديد أنزل العينة بالماصة اإللكترونية داخل فتحات الجل‪.‬‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪35‬‬
‫‪Run the Gel‬‬
‫• وصل التيار الكهربائي ‪.‬‬

‫• بما أن الـ ‪DNA‬ذو شحنة‬

‫سالبة فهو يتحرك إلى القطب‬
‫الموجب من الحاوية ‪.‬‬

‫• واألجزاء الصغيرة تتحرك‬

‫أسرع ‪.‬‬
 ‫سريان الجل‬

‫‪ -‬أغطي حوض الرحالن بالغطاء الخاص بالجهاز مع مراعاة أن يكون كل قطب في‬
‫محله ‪.‬‬
‫‪ -‬نوصله مصدر الطاقة‪.‬‬
‫‪ . Amal‬السلك األحمر‬
‫المصعد)‬ ‫أو يهاجر للقطب الموجب(‬
‫‪Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪37‬‬
‫‪ -‬الدنا سوف يرحل‬
 ‫‪DNA Fragments Move‬‬

‫• يوضح لنا المحلول‬

‫الملون تحرك الـ‪DNA‬‬
‫في الجل ‪.‬‬
Cathode
‫المهبط‬
(-)
‫الفتحات‬ Wells
DNA
(-) Bromophenol 

Blue
Gel ‫الصبغة الزرقاء‬
Anode
‫المصعد‬
(+)

Amal Alghamdi-MIC251-2011 39
‫‪Viewing‬‬

‫• مشاهدة الجل تحت‬

‫الـ ‪. U.V‬‬
 ‫معيار مدرج‬DNA
-
 12,000 bp
 5,000
DNA
Migration
 2,000
‫هجرة الدنا‬  1,650

 1,000
 850
 650
 500
 400
bromophenol blue  300
 200
 100
+

Amal Alghamdi-MIC251-2011 41
 ‫اإلبقاء على الجل‬
‫‪ -‬بروميد اإليثيديوم يعمل على األرتباط مع الدنا ليساعد على عملية اإلشعاع‬
‫تحت األشعة الفوق بنفسجية‪.‬‬

‫مالاااااااااااحظة‪-:‬‬
‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪42‬‬
‫القفازين والحذر في التعامل معها‪.‬‬ ‫اإليثيديوم مادة مسرطنة يجب لبس‬ ‫مادة بروميد‬
 ‫‪Viewing‬‬
‫• عينة الـ ‪ DNA‬األصلي غير المقطع‬
‫كونت قطعة كبيرة في البداية‬
‫)‪. (one big fragment‬‬
‫• عينات الـ ‪ DNA‬مع انزيم القطع‬
‫كونت العديد من األجزاء ‪ ،‬أي أن‬
‫القطع ذات أحجام مختلفة ‪.‬‬
‫• استخدام الساللم للمقارنة ألنها‬
‫تحتوي على األجزاء المعينة المطلوبة‬
‫تترك عملية التحرك في الجل لوقت‬
‫طويل حتى نضمن تفرق الـ ‪. DNA‬‬
‫مادة اإليثيديوم تتطلب أشعة فوق بنفسجية حتى يضح الدنا أثناء عملية‬
‫التصوير‪.‬‬

‫‪Amal Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪44‬‬

 ‫الجل بعد عملية التصوير‬
‫‪DNA ladder‬‬ ‫‪DNA ladder‬‬
‫السلم المدرج‬
‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫المدرج ‪7‬‬
‫السلم ‪8‬‬
‫‪‬‬ ‫‪‬‬
‫‪Wells‬‬
‫الفتحات‬

‫‪5,000 bp‬‬
‫‪ 2,000‬‬
‫‪ 1,650‬‬
‫‪ 1,000‬‬
‫‪ 850‬‬
‫‪ 650‬‬
‫‪ 500‬‬
‫‪DNA‬‬ ‫‪ 400‬‬
‫‪ 300‬‬
‫‪ 200‬‬
‫‪ 100‬‬

‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪Amal‬بها الحمض النووي الدنا‬
‫تظهر‬ ‫العينات رقم‪6 , 4 ,1 :‬و ‪7‬‬
‫‪Alghamdi-MIC251-2011‬‬ ‫‪45‬‬
‫‪Good Luck‬‬
‫ا‪ .‬امل الغامدي‬
‫ا‪.‬شروق الشهراني‬
‫ا‪.‬رنا التركي‬