Фармакологія

Лабораторна робота №4

Дослідження ролі М2 та М3 підтипів мускаринових рецепторів в активації

мускаринового катіонного струму гладеньких м‘язів кишечнику

Ацетилхолін є головним нейротрансмітером, який викликає збудження і

скорочення гладеньком’язових клітинах (ГМК) вісцеральних органів шляхом активації
М2 та М3 рецепторів. При дії ацетихоліну відбувається вивільнення Са 2+ з
внутрішньоклітинних запасників і одночасно відбувається деполяризація мембрани,
яка супроводжується генерацією потенціалів дії, відкриванням потенціалзалежних Са 2+
каналів L-типу та входом іонів кальція для активації скорочення.
Таким чином, вхід іонів кальцію є наслідком деполяризуючого ефекта активації
неселективних катіонних каналів (TRPC4 та TRPC6 канали), які спряжені з
мускариновими рецепторами через G-білки. М2 рецептори взаємодіють в основному з
G-білками родини Go/і, тоді як М3 рецептори сапяжені з G-білками родини Gq/11.
Загальна схема активації мускаринових катіонних каналів гладеньких м’язів кишечнику
наведена на Рис. 1.

Рис. 1. Молекулярні механізми активації мускаринового катіонного струму і скорочення

гладеньких м’язів кишечнику (Ambudkar I.S. Unraveling smooth muscle contraction: The
TRP link. Gastroenterology 2009; 137(4): 1211–1214).

Мета роботи: дослідити роль підтипів мускаринових рецепторів в активації катіонної

провідності ГМК тонкого кишечнику морської свинки.

Об’єкт та методи досліджень. Досліди проводилися на поодиноких ізольованих ГМК

тонкого кишечнику морської свинки, які отримували з поздовжнього шару ileum
морської свинки за допомогою методу ферментативної та механічної ізоляції. Іонні
струми вимірювалися за допомогою метода петч-клемп в конфігурації whole-cell.

Матеріали. В роботі аналізуються реєстрації мускаринових катіонних струмів, які були

отримані при різних концентраціях карбахоліна в контролі, а також в присутності
блокаторів мускаринових холіноцепторів. Дані наведені в форматах Axon binary file
(*.abf), для аналіза яких використовується програма pClamp, а також в таблиці Excel.

1
Теоретична частина роботи
З використанням рекомендованих джерел озайомтесь з наступними темами та дайте
стислі (~0,5 стор.) відповіді:
1. Антагоністи мускаринових рецепторів.
2. Теорія Шілда: основні постулати та застосування.

Практична частина роботи

1. Проаналізуйте експеримент з М2 антагоністом гімбацином, результати якого
наведено у файлі Himbacine.abf (Рис. 2) та побудуйте залежність середньої
нормованої амплітуди катіонного струму (I/Imax) від концентрації карбахоліну в
контролі і в присутності гімбацина. Умови експерименту:
- Контроль: 1, 3, 5, 7, 9 і 11 аплікації карбахоліну кумулятивним чином в
концентраціях 3, 10, 30 і 300 µМ.
- В присутності гімбацина (100 нМ): 2, 4, 6, 8, 10 і 12 аплікації карбахоліну
кумулятивним чином в концентраціях 30, 100, 300 і 3000 µМ.

Виконайте апроксимацію експериментальних точок рівнянням Хілла (Clampfit – функція

“Hill (4 parameter logistic)”) та отримайте величину відношення доз (DR) для наступного
аналіза з використанням рівняння Шілда.

Рис. 2. Антагоністична дія гімбацина на мускариновий катіонний струм ГМК кашечника.

А – 12 серій аплікацій карбахоліна в зростаючих концентраціях в контролі (1, 3, 5, 7, 9 і
11 відповіді) і після додавання гімбаціна в концентрації 100 нм (2, 4, 6, 8, 10 і 12
відповіді). Б – перша відповідь за розтягнутою часовою шкалою.

2. Відкрийте Excel файл “DR data.xlsx” і для кожного з проаналізованих антагоністів

побудуйте графікі залежностей відношення доз DR від концентрації антагоністу в
коордінатах Шілда, а саме: log(DR-1) – log[концентрація антагоніста]:
log(DR-1) = log[B] – log(KB) (рівняння Шілда),
де рА2= -log(KB)

2
Проведіть лінійну апроксимацію точок та отримайте величину рА2 для кожного
антагоніста як його концентрацію в точці перетину прямої з віссю абцис Х, де
виконується умова: log(DR1)=0.
Занесіть отримані експериментальні величини рА2 у таблицю.

3. Порівняйте отримані величини рА2 з табличними значеннями для цих антагоністів.

Для цього побудуйте графіки залежностей рА2 (експеримент) - рА2 (табличне
значення) окремо для М2 і М3 рецепторів та проведіть кореляційний аналіз цих
залежностей.

Антагоніст рА2 рА2 рА2

М2 рецептор М3 рецептор експериментальна
величина
Метоктрамін 7,8 6,2
Гімбацин 8,2 7,3
Трипітрамін 9,5 6,7
4-DAMP 7,9 9,0
p-F-HHSiD 6,3 7,8
заміфенацин 6,8 9,2
Атропін 9,0 9.1 9,0

Запитання 1. Який з цих антагоністів є найбільш селективним блокатором

а) М2 рецептора;
б) М3 рецептора?
перші три антагоніста – селективні до М2, другі три – до М3, атропін – не селективно.

Запитання 2. Який висновок щодо ролі М2 і М3 підтипів мускаринових рецепторів в

активації катіонних каналів мембрани ГМК можна зробити на підставі проведеного
фармакологічного аналізу? Який рецептор є основним?

Оформлення роботи
Дайте відповіді на поставлені в теоретичній та практичних частинах запитання, коротко
опишіть хід роботи, наведіть отримані графіки з підписами до них.

Рекомендована література та ресурси інтернета

1. Arunlakshana O & Schild HO (1959). Some quantitative uses of drug antagonists. Br
J Pharmacol 14, 48-58.
2. Caulfield MP & Birdsall NJM (1998). International Union of Pharmacology. XVII.
Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev 50, 279-290.
3. Johnson C.R. et al. (2022). Drug design targeting the muscarinic receptors and the
implications in central nervous system disorders. Biomedicines 10:398.
4. Tanahashi Y. et al. (2021). Functions of Muscarinic Receptor Subtypes in
Gastrointestinal Smooth Muscle: A Review of Studies with Receptor-Knockout Mice.
J. Mol. Sci. 22(2):926.
5. Wess J, Eglen RM, & Gautam D (2007). Muscarinic acetylcholine receptors: mutant
mice provide new insights for drug development. Nat Rev Drug Discov 6, 721-733.
6. The International Union of Basic and Clinical Pharmacology (IUPHAR): Acetylcholine
receptors (muscarinic). IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology.
7. The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2021/22. British Journal of Pharmacology
Volume 178, Issue 1.