Антропогенні сполуки, що використовуються як пестициди,

розчинники та вибухові речовини, часто зберігаються в навколишньому

середовищі і можуть викликати токсичність для людей та дикої природи.
Стійкість антропогенних сполук обумовлена їх недавнім потраплянням в
навколишнє середовище; у мікробів в грунті і воді було відносно мало
часу, щоб виробити ефективні механізми розкладання цих нових сполук.

Деякі антропогенні сполуки легко розкладаються, тоді як інші

розкладаються дуже повільно або лише частково, що призводить до
накопичення токсичних продуктів. У цьому індивідуальному завданні
розглядаються фактори, що впливають на здатність мікробів розкладати
антропогенні сполуки, і механізми, за допомогою яких в природі
виникають нові шляхи. Нові підходи до створення мікробів з підвищеною
здатністю до розкладання включають збірку шляхів з використанням
ферментів з безлічі організмів, спрямовану еволюцію неефективних
ферментів і перетасовку геному для поліпшення пристосованості
мікроорганізмів до складних умов, створюваних забрудненим
середовищем

Антропогенні хімічні речовини широко використовуються в

сільському господарстві, промисловості, медицині та військових
операціях. Приклади включають пестициди, такі як атразин,
пентахлорфенол (далі ПХФ), 1,3-дихлорпропен та
дихлордифенілтрихлоретан (ДДТ); вибухові речовини, такі як
тринітротолуол (ТНТ); розчинники, такі як трихлоретилен; та діелектричні
рідини, такі як поліхлоровані дифеніли (ПХБ). Доля антропогенних
хімічних речовин в навколишньому середовищі викликала мало
занепокоєння до тих пір, поки кінець двадцятого століття. Несприятливий
вплив на дику природу в кінцевому підсумку привернув увагу до того
факту, що деякі антропогенні хімічні речовини зберігаються в
навколишньому середовищі, оскільки вони нелегко розкладаються
мікробами. Однак деякі антропогенні сполуки, такі як атразин,
розкладаються напрочуд швидко. Інші, такі як параоксон, ефективно
виводяться з організму, хоча і не розкладаються. Цей огляд буде про те, як
мікроби створюють нові шляхи для детоксикації або розкладання
антропогенних сполук і як ефективність біодеградації може бути
підвищена шляхом оптимізації природних шляхів і об'єднання нових
шляхів з використанням ферментів з різних організмів.

Мікробні ферменти, які діють на антропогенні сполуки, є

результатом невпорядкованої активності вже існуючих ферментів.
Різнорідні ферменти можуть еволюціонувати, щоб стати більш
ефективними каталізаторами в результаті селективного тиску для
детоксикації токсичної сполуки або використання нового джерела
вуглецю, азоту або фосфору. Детоксикація часто вимагає лише одного
етапу. Наприклад, ПХФ токсичний, оскільки він розсіює трансмембранні
градієнти протонів і тим самим роз'єднує окисне фосфорилювання 1,2.
Phanerochaete chrysosporium виводить токсини ПХФ шляхом метилювання
гідроксильної групи, тим самим усуваючи його здатність транспортувати
протони через ліпідний бішар 3.

Повна деградація антропогенних сполук є більш бажаною, ніж

детоксикація, але також є більш складною, оскільки вимагає еволюції
багатоступеневих шляхів для перетворення антропогенної сполуки в
проміжний продукт у стандартному метаболічному шляху. Шляхи, які
мінімізують антропогенні сполуки, введені на початку двадцятого вони
були виявлені в мікробах, виділених із забруднених ґрунтів. Два приклади
показані на малюнку 1. Атразин є найбільш широко використовуваним
пестицидом у світі. Три стадії, при яких заступники в кільці замінюються
гідроксильними групами, перетворюють атразин в ціанурову кислоту, яка
легко метаболізується або всередині того ж мікроба (наприклад, штам
Pseudomonas sp. ADP), або іншими мікробами. Пенталохлорфенол (далі
ПХФ)-це використовується в основному в якості консерванту для
деревини. Перетворення ПХФ у звичайний проміжний продукт-кетоадипат
вимагає декількох стадій, на яких видаляються три хлорні заступники,
розщеплюється кільце,а потім видаляються решта два хлорні заступники 5,
6. Дослідження еволюційного походження та якості функціонування
ферментів у таких шляхах розширюють наше розуміння того, як нові
метаболічні шляхи виникали протягом всієї історії життя, і дають
рекомендації для зусиль щодо поліпшення біодеградації стійких
забруднювачів.

Залучення різнорідних ферментів для виконання нових функцій

біодеградації

Ферменти, що діють на антропогенні сполуки, виникли внаслідок

невпорядкованої активності ферментів, які виконували різні ролі в інших
шляхах, протікаюча активність виникає як випадковий наслідок збирання
реакційноздатних амінокислот, іонів металів та кофакторів в активних
центрах. Протікаючі активності, як правило, неефективні — значення для
ккат і Ккат/Км (катал на константу михаеліса) часто на порядки нижче, ніж
для фізіологічно значущої активності ферменту. Наприклад, N-ацил
гомосеринлактонацилаза з Rhodococcus erythropolis гідролізує різні
лактони зі значеннями ккат / Км до 1,7 × 10 6 М−1С-1; вона гідролізує
параоксон, фосфотріефірний інсектицид, з ккат / Км 0,5 М -1с-1. Лужна
фосфатаза Escherichia coli гідролізує р-нітрофенілфосфат з Ккат / Км,
рівним 3× 107 М-1 с-1; Ккат / Км для нерозбірливого гідролізу біс-р-
нітрофенілфосфату використовується 0,05 М-1 с-1. Однак навіть відносно
слабкі протікаючі активності часто істотно прискорюють реакції в
порівнянні з некаталізованими реакціями; гідроліз біс-р-
нітрофенілфосфату лужною фосфатазою прискорюється на 3 × 10 11. Таким
чином, протікаюча активність забезпечує чудову відправну точку для
вироблення нових ферментів, коли нова активність стає важливою для
фізичної форми або виживання в забрудненому середовищі.

Нестабільна активність часто є результатом неоднозначності

субстрату-здатності зв'язувати та перетворювати молекули, що нагадують
звичайний субстрат (рис. 2а). Однак протікаючі дії також можуть
призвести до хімічних перетворень, які сильно відрізняються від тих, що
здійснюються за допомогою звичайних субстратів (рис. 2b). У таких
випадках фермент каталізує одну або кілька елементарних стадій в
нерозбірливій реакції, які нагадують стадії в звичайній реакції. Наприклад,
дегідратація о-сукцинілбензоату і рацемізація N-ациламінових кислот за
допомогою о-сукцинілбензоатсинтази (рис. 2b) обидва вимагають
видалення протона, який пов'язаний з карбоксилатом, з подальшою
стабілізацією отриманого енолата. На щастя, N-ациламінокислоти
зв'язуються в активному центрі в положенні, яке поміщає протон в
безпосередній близькості від каталітичного механізму (рис. 3).

Рисунок 2, 3

Наша здатність використовувати змішані види діяльності для

розробки нових шляхів деградації була б посилена, якби ми могли
ідентифікувати попередників ферментів, які були залучені для виконання
нових функцій при деградації антропогенних сполук. Це рідко можливо.
Враховуючи величезну складність мікробних екосистем, немає шансів
знайти предка мікроба, який розвинув новий шлях у забрудненому
середовищі, і дізнатися, що змінилося. Як правило, ми повинні отримати
ключі до розуміння функції ферменти-попередники шляхом порівняння
послідовностей. Атразинхлоргідролаза Pseudomonas sp. штаму ADP є
особливо вражаючим випадком. Цей фермент на 98% ідентичний
меламіндезаміназі Pseudomonas sp. штаму NRRL B - 12227. Обидва
ферменти каталізують нуклеофільну атаку води на S-триазиновий
субстрат; специфічність субстрату абсолютно різна, хоча ферменти
відрізняються лише в дев'яти положеннях. Однак частіше порівняння
послідовностей ідентифікують лише суперсімейство, до якого належать
нові ферменти належавши. Наприклад, дегалогеназа цис-3-хлоракрилової
кислоти (cis-CAAD) та дегалогеназа транс-3-хлоракрилової кислоти
(CAAD) беруть участь у шляху в Pseudomonas cichorii 170 для розкладання
нематоциду 1,3-дихлорпропену. Ці ферменти належать до суперсімейства
4-оксалокротонат таутомераз, але низький рівень ідентичності
послідовностей між ними та іншими членами суперсімейства ускладнює
ідентифікацію специфічних функцій їх попередників.

Ключі до розуміння походження ферментів у шляхах, що

розкладають антропогенні сполуки, також можуть бути отримані в
результаті їх невпорядкованої діяльності. Наприклад, бактеріальна
фосфотриестераза (PTE), яка гідролізує антропогенний пестицид
параоксон з надзвичайно високим ккат/Км > 4×107 М −1 с−1, має
перспективну лактоназну активність. Три гомологи PTE мають високу
лактоназну активність з чутливими до кворуму лактонами, а також нижчий
рівень фосфодіестеразної активності. Ці результати дозволяють
припустити, що він, можливо, розвинувся з ферменту, який пригнічує
сигнал від лактонів, чутливих до кворуму.

Потенціал залучення різнорідних ферментів для виконання нових

функцій у новому шляху залежить від кількох факторів. По-перше, склад
ферментів різний в різних організмах, і, отже, набір різнорідних
активностей також повинен бути різним. Таким чином, мікроби можуть
з'єднати різні нові шляхи, оскільки вони мають різні колекції різнорідних
ферментів. Наприклад, деградація 4-нітротолуолу відбувається різними
шляхами у грамнегативної бактерії Pseudomonas sp. штам 4NT і
грампозитивної бактерії Mycobacterium sp. штам HL 4-NT-1 (рис. 4).
 Рисунок 4

Другим важливим фактором є рівень протікаючої активності, яка

повинна досягти певного порогу, щоб бути фізіологічно значущою. Рівні
протікаючих активностей в ортологічних ферментах значно відрізняються
через нейтральну дрейф. Наприклад, о-сукцинілбензоат синтаза з
Amycolatopsis sp. має відносно високу активність N-ациламінокислотних
рацемаз (рис. 2б). Активності N-ациламінокислотних рацемаз в ензимах E.
coli та Bacillus subtilis в більш ніж чотири порядки менше. Варіабельність
змішаних активностей означає, що деякі організми матимуть потенціал для
еволюції нового ферменту з змішаної активності, тоді як інші цього не
зможуть зробити, оскільки змішана активність є занадто слабкою, щоб
бути корисною.

Нейтральний дрейф впливає на еволюційність змішаної діяльності

двома іншими способами. Здатність до еволюції підвищується за рахунок
нейтральних мутацій, які підвищують термостабільність. Мутації, які
змінюють функції, часто дестабілізують білки, тому нейтральні мутації, що
підвищують стабільність, дозволяють білкам справлятися з подальшими
дестабілізуючими мутаціями. Крім того, "прийнятність" мутацій,
необхідних для посилення змішаної активності, залежить від структурного
контексту; мутації, які корисні в одному контексті, можуть бути
шкідливими в іншому. Дослідження можливих траєкторій накопичення
п'яти мутацій в α-лактамазі, які в сукупності підвищують стійкість
бактерій до цефотаксиму в 100 000 разів, показало, що були доступні
тільки 18 з 120 можливих траєкторій - тобто кожна мутаційна стадія
продукувала фермент, який або підтримував, або посилював придатність.
Такі ефекти, ймовірно, впливають на можливість розвитку порівнянних
змішаних видів діяльності у різних мікробів.
 Третім фактором, що впливає на потенціал рекрутування різнорідних
ферментів, є вимога до експресії ферменту в умовах, при яких необхідна
різнорідна активність. Конститутивно експресовані ферменти можуть бути
найбільш доступними для набору, навіть якщо є потенційно кращі
каталізатори. Показано, що мутації, що призводять до конститутивної
експресії, дозволяють набирати похідні ферменти для виконання нових
функцій. Альтернативно, ферменти можуть бути рекрутовані з числа тих,
які експресуються в умовах навколишнього середовища. Це є основою
для" спільного метаболізму", випадкової трансформації хімічних речовин
різнорідними ферментами в метаболічному шляху в присутності хімічної
речовини, яка зазвичай індукує експресію ферментів в цьому шляху. Тому
що є різні способи, за допомогою яких ферменти можуть стати
доступними для рекрутування, більше одного нового шляху можуть бути
об'єднані з різнорідних ферментів в одній бактерії. Дійсно, Pseudmonas
putida OU83 перетворює 3-нітротолуол двома шляхами; 70%
відновлюється до 3-амінотолуолу, а 30% перетворюється в 3-нітрофенол, з
якого нітрогрупа видаляється невідомим способом.

Четвертим фактором, що впливає на залучення різнорідних

ферментів, є необхідність того, щоб залучений фермент продовжував
виконувати свою первісну функцію. Субстрати для нормальної і
протікаючої реакцій будуть конкурентними інгібіторами іншої реакції.
Оскільки спорідненість нормального субстрату до активного сайту,
ймовірно, буде вищою, ніж у проліферуючого субстрату, навіть надійна
перспективна активність може виявитися нерелевантною in vivo, і
рекрутинг може бути неможливим, якщо не відбудеться дублювання генів
і мутації в одній копії гена не зменшать спорідненість активного сайту до
оригінальна підкладка. Дублювання генів легко відбувається у мікробів,
коли підвищена дозування генів забезпечує більш високу придатність, і це
часто спостерігається після тривалого впливу пестицидів на мікроби.
Наприклад, після зростання Pseudomonas sp. штам ADP, що використовує
атразин як єдине джерело азоту протягом 320 поколінь, еволюціонувала
популяція швидше розщеплювала атразин і несла тандемну дуплікацію
atzB, яка кодує другий фермент шляху катаболізму атразину. Аналогічним
чином, вирощування штаму Ralstonia sp. TFD41 у присутності 2,4-
дихлорфеноксиоцтової кислоти як єдиного джерела вуглецю протягом
1000 поколінь призвело до ампліфікації tfdA, який кодує перший фермент
у шляху деградації 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти. Подібні процеси
можуть призвести до дублювання гена, що кодує фермент зі слабкою, але
критично важливою змішаною активністю.

Залучення багатьох ферментів до нових шляхів біодеградації

Необхідність залучення декількох ферментів для перетворення

антропогенної сполуки в метаболіт стандартним шляхом піднімає питання
про те, чи повинні всі ферменти залучатися одночасно, або еволюція
шляху може відбуватися поетапно. Відповідь залежить від природи
вихідної сполуки та інших проміжних продуктів на шляху. Розглянемо
гіпотетичний шлях, показаний у рівнянні (1), який перетворює
антропогенну сполуку а в проміжний продукт у загальному метаболічному
шляху (Е).

Схема 1.

Якщо основною перевагою цього шляху є використання нового

джерела вуглецю, то для проходження цим шляхом потрібні всі ферменти.
Марно перетворювати А в В за відсутності ферментів, які перетворюють В
в Е. Аналогічно, марно перетворювати D в E за відсутності ферментів, які
перетворюють А в D. Однак в деяких випадках придатність може бути
підвищена шляхом поетапного набору персоналу. Наприклад,
перетворення A в В буде корисним, якщо B менш токсичний, ніж A, або
якщо при перетворенні a в b утворюється корисний побічний продукт.
 Імовірність об'єднання декількох ферментів в новий шлях зростає,
якщо їх нормальні функції взаємопов'язані. Наприклад, кілька ферментів,
необхідних для деградації PCP, кодуються регулоном, індукованим ПХФ.
Ці ферменти, ймовірно, були залучені до розкладання природного фенолу
і, ймовірно, були задіяні масово. Деградація ПХФ також вимагає відновної
дегалогенази для видалення хлорних замісників між початковою реакцією
гідроксилювання та реакцією розщеплення кільця, характерною для
шляхів розкладання фенолу, оскільки більшість ферментів, що
розщеплюють гідрохінони та катехоли, не можуть обробляти субстрати з
декількома хлорними замісниками. Збірка цього багатоступеневого шляху,
можливо, була відносно простою, оскільки кілька ферментів із вже
існуючого шляху могли бути задіяні одночасно разом з однією відновною
дегалогеназою.

Фактори, що впливають на ефективність біодеградації

Ефективність біодеградації антропогенних сполук сильно різниться.

Атразин і 1,3-дихлорпропен розкладаються дуже ефективно. ПХФ
розкладається повільно, але може бути повністю мінералізований.
Поліхлорований дифеніл (далі ПХД) і тротил розкладаються дуже
повільно, і частково розкладені продукти накопичуються. Ці відмінності
пояснюються багатьма факторами, включаючи структуру та фізичні
властивості сполуки, умови навколишнього середовища, в яких
накопичується сполука, та примхи процесу складання шляхів розкладання
з різнорідних ферментів.

Наявність різнорідних ферментів з досить високою активністю і

здатністю до виділення є одним з найбільш важливих факторів, що
впливають на ефективність біодеградації. Напрочуд ефективне
розщеплення атразину можна пояснити легкістю залучення ферментів, які
перетворюють атразин у звичайний метаболіт (Рис. 1). Ферменти, що
перетворюють атразин в ціанурову кислоту, виникли на основі вже
існуючих ферментів широкої специфічності. Амідогідролази, що
каталізують гідролітичну заміну заступників на ароматичні та
гетероароматичні кільця широко поширені в природі. Активні центри в
цьому суперсімействі розташовані в гирлі α/β бочки і містять один або два
іони металу, які активують воду для атаки на різних субстратах,
включаючи амінокислоти, нуклеїнові кислоти, цукру і фосфорорганічні
ефіри. Адаптація активного сайту до нового субстрату супроводжується
точковими мутаціями і врізками в петлі, що оточують активний центр.
Розвитку більш ефективних ферментів для розкладання атразину сприяла б
перевага росту, що забезпечується вивільненням аміаку із заступників і S-
триазинового кільця, а також вивільненням вуглецю із заступників (атоми
вуглецю в кільці атразину вивільняються у вигляді CO 2, тому сам s-
триазин не виділяє аміак та служать джерелом вуглецю).

Еволюція ефективних шляхів затруднена у випадках, коли

утворюється токсичний проміжний продукт. Деградація ПХФ надзвичайно
неефективна, ймовірно, з цієї причини. Погані каталітичні здібності
гідроксилази ПХФ обмежують потік шляхом розкладання. ПХФ-
гідроксилаза є членом сімейства флавіномонооксигеназ, які ініціюють
розкладання фенолів, які є широко поширеними природними продуктами.
Ферменти цього сімейства гідроксилюють широкий спектр субстратів,
тому в ґрунтових мікроорганізмах повинно бути багато ферментів, які
можна використовувати для гідроксилювання ПХФ. Однак два аспекти
реакції, каталізованої ПХФ-гідроксилазою, роблять цей етап
проблематичним. По-перше, ферменти цього сімейства стають
"незв'язаними" під час обороту бідних субстратів, коли проміжний продукт
С4a-гідропероксифлавін не здатний гідроксилювати субстрат і замість
цього усуває H2O2 (Рис. 5). Цей процес призводить до розтрати нікотинамід
аденіндинуклеотидфосфату (далі NADPH) та утворення токсичних сполук;
таким чином, залучення флавіномонооксигенази для гідроксилювання
бідного субстрату неминуче призводить до певної токсичності. Проблема
посилюється коли субстрат гідроксильований у положенні, яке несе хлор.
У таких випадках вихідний продукт усуває HCl і утворює електрофільний
бензохінон. Тетрахлорбензохінон високотоксичний для сферопластів E.
Coli в концентраціях всього 0,5 мкм. Причиною того, що Sphingobium
chlorophenolicum не еволюціонувала кращу версію ПХФ-гідроксилаза,
може бути в тому, що токсична дія H 2O2 і тетрахлорбензохінону, а також
непродуктивне виснаження NADPH пригнічують клітини, в яких
виникають більш ефективні ферменти.

Рисунок 5

Еволюція ефективних шляхів розкладання також, ймовірно, буде

повільною, коли розкладання здійснюється шляхом спільного метаболізму
консорціумом мікробів. Наприклад, кілька мікробів каталізують
перетворення тротилу в результаті метаболічного процесу, який
призводить до зменшення нітрозаміщених елементів або, рідше, до
видалення нітрозаміщеного елемента. Жоден окремий мікроб не проводить
достатньої кількості реакцій, щоб отримати користь від його розкладання.
Еволюція ефективного шляху розкладання може бути більш швидкою,
коли кілька послідовних реакцій або навіть весь шлях виявлений в межах
одного мікроба, який може скористатися перевагами доступу до нового
джерела вуглецю, азоту або фосфору.

Біодеградація може бути утруднена, коли різні реакції, необхідні для

мінералізації, відбуваються в різних середовищах. Це відноситься і до
друкованих плат. Комерційні препарати ПХД містили складні суміші
сполук зі змінною кількістю хлору в заміщувачах. Кожен з 209 можливих
конгенерів представляє різну проблему для біодеградації. Відомо, що
жоден природний мікроб не мінералізує друковану плату. Видалення
хлорних заступників відбувається повільно в безкисневих заміщувачах за
допомогою реакцій відновного дегалогенування, які обумовлені
використанням ПХД в якості кінцевих акцепторів електронів. Цей процес
найбільш ефективний, коли присутні кілька заступників хлору. Таким
чином, ПХД в відкладах перетворюються в суміші менш сильно
хлорованих сполук, але подальшого розкладання не відбувається. Один раз
велика частина хлорних заступників видаляється, аеробні організми
можуть атакувати біфенільні кільця за допомогою O2-залежних
діоксигеназ. Однак ПХД в безкисневих відкладеннях недоступні для
аеробних мікробів, які могли б ініціювати руйнування структури
біфенільного кільця.

Стратегії покращення існуючих шляхів біодеградації

Ефективність природних шляхів розкладання антропогенних сполук

може бути підвищена різними методами. Спрямована еволюція може бути
використана для поліпшення поганої каталітичної ефективності ферментів.
Цей процес передбачає створення великої бібліотеки варіантів ферментів з
використанням мутагенної ПЛР, перетасовки ДНК або варіантів цих
методів з подальшою ідентифікацією вдосконалених варіантів шляхом
відбору або скринінгу. Ферменти, отримані таким чином, зазвичай не
настільки ефективні, як природні ферменти, просто тому, що метод не
дозволяє проводити широке дослідження простору послідовностей, яке
відбувається у великих популяціях мікроорганізмів у геологічних
масштабах часу. Проте, підвищення каталітичної ефективності в 10 або
100 разів могло б значно підвищити ефективність шляху розкладання.

Ефективність розкладання антропогенних сполук також може бути

обмежена токсичністю проміжних продуктів метаболізму. Токсичність
може бути результатом очевидних механізмів, таких як ковалентна
модифікація клітинних макромолекул або утворення активних форм
кисню. Токсичність також може виникати внаслідок випадкових взаємодій
між метаболітами і клітинними білками. Такі проблеми, імовірно, були
зведені до мінімуму для природних метаболітів за допомогою мутацій, які
усувають безладне зв'язування, але природний відбір надав мало
можливостей пом'якшити вплив нових метаболітів, що утворюються в
результаті антропогенних сполук. Обидві проблеми, принаймні частково,
піддаються технологічному виправленню.

Багато природних метаболічних шляхів включають проблемні

проміжні продукти, які є токсичними, нестійкими або летючими. Такі
проміжні продукти, як правило, доставляються безпосередньо з активного
центру, в якому вони утворюються, до активного центру, в якому вони
споживаються, або тунелями (наприклад, амідотрансферазами, в яких
аміак, що утворюється при гідролізі глутаміну, переноситься тунелем до
наступного активного центру, щоб запобігти втраті від випаровування),
або шляхом утворення комплексів між двома ферментами (наприклад,
запропонована асоціація, яка може дозволити нестійкому глутамілфосфату
переноситися з активного центру глутамілкінази до
глутамілфосфатредуктази). Розробка таких складних рішень виходить за
рамки наших нинішніх можливостей. Однак вплив токсичних проміжних
продуктів може бути зменшено шляхом налаштування рівнів експресії
ферментів, які робляють токсичні проміжні продукти та ферменти, які їх
споживають. Нещодавно розроблені методи обіцяють визначити ідеальні
рівні експресії ферментів у тому чи іншому шляху. Для декількох мікробів
були розроблені бібліотеки синтетичних промоторів, що містять варіанти
промоторів, які призводять до цілого ряду рівнів експресії. Оцінка ефектів
різних комбінацій рівнів експресії може бути проведена шляхом
встановлення різних промоторів вище за течією кожного гена на шляху,
далі йде комбінаторна повторна збірка шляху та оцінка фенотипових
наслідків. Альтернативна стратегія підказується поширеністю
біфункціональних ферментів, які каталізують послідовні етапи
метаболічних шляхів. Ці ферменти, можливо, еволюціонували тому, що
висока локальна концентрація проміжного продукту поблизу першого
ферменту збільшує швидкість наступної стадії. Злиття генів, що кодують
ферменти, які генерують і використовують токсичний проміжний продукт,
може дозволити більш ефективну конверсію токсичного проміжного
продукту, перш ніж він може пошкодити інші макромолекули.

Зменшення токсичності, викликаної безладним зв'язуванням з

макромолекулами, вимагає різних стратегій, оскільки неможливо
передбачити, якими можуть бути мішені. Підхід до цієї проблеми, який
ідентифікує гени, надекспресія яких знижує токсичність, переважно
шляхом подолання інгібування функції через невпорядковане зв'язування,
це SCALEs (багатомасштабний аналіз збагачення наложностей).
Масштабування здійснюється шляхом введення належностей, що містять
вставки геномної ДНК змінного розміру, в бактерії і вирощування клітин в
селективних умовах. Вставки, що призводять до збільшення швидкості
росту, можна ідентифікувати за допомогою аналізу мікрочіпів популяції,
яка залишається в кінці відбору. Після виявлення цільових білків можна
використовувати підходи спрямованої еволюції для створення версій, які
більше не зв'язують токсичний проміжний продукт. Цей підхід
ефективний, але він обмежений штамами, для яких доступні мікрочіпи,
вектори експресії з високою копією та ефективні методи трансформації.

Перетасовка геному - це ще один неупереджений метод пом'якшення

впливу токсичних метаболітів, а також поліпшення фізичної форми за
допомогою інших непередбачених механізмів. Перетасовка геному
передбачає генерацію мутантів з посиленим фенотипом, за якими слідують
кілька раундів злиття протопластів, щоб забезпечити рекомбінацію між
геномами. Перетасовка геному відбувається швидше, ніж стандартні
підходи до поліпшення штаму, оскільки рекомбінація дозволяє швидше
накопичувати корисні мутації, а також надає можливості для усунення
шкідливих мутацій. Перемішування геному було використано для
поліпшення деградації ПХФ S. chlorophenolicum. Після трьох раундів
перемішування було отримано кілька штамів, які швидше розкладали ПХФ
і переносили більш високі рівні ПХФ, ніж штам дикого типу. Різні
комбінації мутацій, що призводять до підвищеної швидкості росту,
конститутивної експресії генів деградації ПХФ і підвищеної стійкості до
токсичності ПХФ і його метаболітів, сприяли поліпшенню фенотипів.
Недоліком цього підходу є те, що механізми, відповідальні за поліпшення
деформації, не виявлені. Однак, оскільки витрати на секвенування геному
та повторне секвенування зменшаться, можна буде ідентифікувати мутації,
що викликають покращені фенотипи, і використовувати ці знання для
раціонального проектування вдосконалених штамів.

Стратегії для розробки нових шляхів біодеградації

Розростання інформації про повні геномні послідовності, досягнення

в методах спрямованої еволюції та високопродуктивного скринінгу, а
також накопичення мудрості з десятиліть досліджень природних
метаболічних шляхів створили передумови для створення нових шляхів
для біорозкладу антропогенних сполук. Цей підхід може використовувати
ферменти, отримані з багатьох організмів, і дозволяє створювати нові
шляхи в мікробах, які легко вирощувати, піддаються генетичним
маніпуляціям і, для застосування в біоремедіації in situ, здатні виживати в
природному середовищі. Розроблені шляхи могли б уникнути багатьох
проблем, які обмежують ефективність біодеградації, таких як проміжний
продукт токсичних метаболітів та необхідність як відновних, так і
окислювальних перетворень, які часто не виявляються у мікробів в одному
екологічному компартменті.
 В результаті успішної реалізації цієї стратегії був створений штам
Pseudomonas putida, який розкладає параоксон, синтетичний
фосфотріефірний інсектицид. Відомо, що жоден мікроб не здатний
повністю мінералізувати параоксон. Де ла Пенья Маттоцці та ін. об'єднали
ферменти чотирьох організмів, щоб сконструювати штам P. putida, який
використовує параоксон як єдине джерело вуглецю та фосфору (Рис. 6).
Цей штам може бути корисним для знищення запасів інсектицидів та
токсичних нервових речовин, таких як соман та зарин, а також для
знезараження обладнання, що використовується при застосуванні
інсектицидів. Інші приклади такого підходу включають розробку S.
chlorophenolicum ATCC 39723 для розкладання гексахлорбензолу і штамів
Pseudomonas для розкладання 2-хлортолуолу.

Рисунок 6

Розробка нового шляху може стати складним завданням, коли

потрібна навіть невелика кількість перетворень. Звичайно, розмір
"простору шляхів" створює як проблеми, так і можливості. Найкращий
вибір із багатьох можливих шляхів буде залежати від таких факторів, як
термодинамічна стабільність проміжних продуктів та наявність ферментів
для каталізації необхідних стадій, але інші фактори, такі як запобігання
токсичним проміжним продуктам, також можуть бути важливими.

Було розроблено ряд алгоритмів, що полегшують розробку нових

шляхів. Деякі з них в першу чергу призначені для прогнозування шляхів
біосинтезу цінних кінцевих продуктів на основі таких критеріїв, як вихід
продукту та субстрат для росту, але інші також корисні для прогнозування
шляхів розкладання. Деякі алгоритми генерують шляхи, використовуючи
відомі реакції, взяті з баз даних метаболічних шляхів, таких як MetaCyc та
KEGG. Інші генерують шляхи, засновані на відомих перетвореннях
функціональних груп, незалежно від того, чи відомо, що фермент каталізує
конкретну реакцію; прикладом може бути система прогнозування шляхів,
пов'язана з базою даних біодеградації Університету Міннесоти, яка
використовує 257 правил біотрансформації для 50 функціональних груп,
вилучених із 183 шляхів деградації забруднюючих речовин.

Репертуар ферментів для побудови нових шляхів розширюється за

рахунок наявності геномних ресурсів, які дозволяють інженерам білків
ідентифікувати ортологічні ферменти з різних мікробів і вибирати ті, які
найбільш підходять для особливого застосування з точки зору плинності,
стабільності або регулюючих властивостей. Додаткові ферментативні
можливості, ймовірно, будуть виявлені, коли ми досягнемо прогресу у
визначенні ролі приблизно 50% білків з невідомою функцією в мікробних
геномах. Крім того, некультурні мікроби сприяють біологічному
розкладанню антропогенних сполук і, таким чином, ймовірно, містять
корисні ферменти, які ще не виявлені.

Хоча розроблені шляхи найбільш легко можуть бути сконструйовані

з використанням ферментів, які ефективно каталізують необхідні реакції,
вони не обов'язково повинні обмежуватися стадіями, для яких відомі
ферменти. Якщо фермент, необхідний для каталізу бажаної реакції,
невідомий, можна використовувати фермент, змішаний з іншими,
особливо якщо методи спрямованої еволюції можуть підвищити його
каталітичну ефективність. Розроблений шлях розкладання цис-
дихлоретилену, в якому використовуються два перспективних ферменту,
активність яких була посилена спрямованої еволюцією або мутагенез
насичення сайту показаний на рисунку 7. Хлоровані етени, такі як
трихлоретилен та цис-1,2-дихлоретилен, широко використовуються як
розчинники та знежирювачі. Анаеробне розкладання призводить до
накопичення вінілхлориду, канцерогену; при аеробному розкладанні
утворюються токсичні хлоровані епоксіетани. Перший крок в цей
сконструйований шлях каталізується варіантом толуол-о-монооксигенази,
що генерується перетасовкою ДНК, яка має підвищену активність по
відношенню до цис-дихлоретилену. Другий етап каталізується
модифікованою епоксидною гідролазою з Agrobacterium radiobacter AD1,
яка приймає цис-1,2-дихлорепоксіетан як субстрат. Невідомо, чи є
заключні стадії, які вивільняють два хлорид-іони і утворюють гліоксаль,
неферментативними або каталізуються ферментами.

Рисунок 7

Завдання для майбутніх експериментів

Зберігаються проблеми з розробкою нових шляхів деградації стійких

забруднювачів. В даний час немає каталогу потенційно корисних
безладних дій або навіть дуже хорошого уявлення про типи безладних дій,
доступних серед природних ферментів. Прогнози ферментів, які могли б
мати відповідну неоднорідну активність, можуть бути зроблені на основі
пошуку ферментів, які каталізують подібні перетворення функціональних
груп, або надсімейств ферментів, які каталізують одну або кілька
елементарних хімічних стадій, необхідних для бажаної трансформації,
використовуючи базу даних структурно-функціональних зв'язків.
Альтернативною стратегією було б використання алгоритмів стикування
для ідентифікації ферментів, які могли б зв'язувати молекулу-мішень в
активному місці. Ферменти, які, за прогнозами, зв'язують субстрати
поблизу каталітичних груп, необхідних для бажаної трансформації,
можуть бути перевірені на їх здатність каталізувати бажану реакцію.

Друге завдання полягає в ідентифікації ферментів з поліпшеною

активністю в бібліотеках, створених методами спрямованої еволюції.
Ідентифікація поліпшених ферментів проста, коли ефективність ферментів
може бути безпосередньо пов'язана з обраним ознакою, таким як
виживання або швидкість росту, але це більш проблематично, коли
проводиться скринінг на поліпшені активність необхідна. Скринінг не є
складним, коли реакція генерує хромофор, зміну рН або сигнал
флуоресценції. Однак це часто не стосується метаболічних ферментів, які
перетворюють один невеликий метаболіт в інший і які можуть не
переносити аналоги субстрату, що містять об'ємні групи, необхідні для
генерації сигналу. Автоматизовані методи, що дозволяють проводити
аналізи з використанням обсягів мікролітрів на 1536-лункових планшетах,
збільшують розмір бібліотек, які можуть бути проаналізовані. Нові
підходи, які мініатюризують аналізи до нанолітрового масштабу на
слайдах, можуть заощадити витрати на реагенти, якщо доступний
чутливий метод виявлення. Однак ці методи все ще вимагають отримання
лізатів з тисяч окремих штамів. Кроком до вирішення цієї проблеми є
розробка методу "хімічного доповнення". Це пов'язує утворення продукту
реакції з експресією гена, який генерує впізнаваний фенотип у цілих
клітинах. Бейкер та Сенгупта розробили репортерну систему, в якій
невелика молекула використовується для з'єднання ДНК–зв'язуючого
домену з рецепторним злитим білком та активуючого домену з
рецепторним злитим білком, що призводить до активації експресії
лактозного оперону (далі lacZ) у дріжджах. Ферментативне розщеплення
маленької молекули зводить нанівець її здатність зв'язувати ДНК і домени
активації. Отриману втрату lacZ (Есті-галактозидази) можна виявити за
допомогою синьо-білого скринінгу на планшетах, що містять інді-
каторний субстрат X-Gal (колонії, у яких відсутній фермент, що
розщеплює субстрат, експресують lacZ і є синіми; колонії, які експресують
фермент, що розщеплює субстрат, позбавлені lacZ і є білими). Аналогічна
система виявляє ферменти, які утворюють димерну маленьку молекулу з
двох субстратів. Більш загальний підхід міг би базуватися на роботі Toppа
і Галлівана, які використовували спрямовану еволюцію для створення
рибоперемикача, який контролює експресію гена, необхідного для
рухливості в E. coli у відповідь на певний ліганд. У присутності ліганду
рухливість E. coli підвищується. Еволюція цього рибоперемикача для
розпізнавання продукту, утвореного ферментом, дозволила б створити
репортерну систему, в якій найбільш ефективні варіанти ферменту в
бібліотеці призводили б до найвищої рухливості на планшетах в
присутності субстрату.

Хоча нові технології та геномні ресурси покращили можливості для

розробки ефективних шляхів деградації антропогенних сполук, практичні
проблеми залишаються. Застосування штучних мікробів для переробки
відходів, безумовно, в межах досяжності, але потенціал біоаугментації-
додавання мікробів, що розкладають забруднюючі речовини — для
біоремедіації забруднених грунтів і водоносні горизонти є спірним
питанням. У більшості випадків штучно створені мікроби погано
виживають у природному середовищі, яке часто характеризується
мінливими умовами та інтенсивною конкуренцією з боку місцевих
мікробів. Біоаугментація, швидше за все, буде успішною, коли
використовуються штами, здатні виживати в певних умовах. Це може бути
досягнуто шляхом перенесення генів, що кодують сконструйований шлях
перетворення в штам, який дуже поширений в забрудненому середовищі.
Альтернативою є використання інтродукованих штамів як носіїв для
горизонтального перенесення деградуючих генів до місцевих мікробів. У
будь-якому випадку виникатимуть перешкоди, що виникають внаслідок
гетерологічної експресії генів деградації. Таким чином, збірка ефективних
метаболічних шляхів у лабораторних штамах є лише першим кроком до
розробки ефективних стратегій біоремедіації.
 Висновок

Зусилля щодо з'ясування шляхів біодеградації антропогенних сполук

та використання мікробів для біоремедіації розпочалися наприкінці ХХ
століття із збагачення та характеристики мікробів, здатних розкладати
забруднюючі речовини із забруднених ділянок. У деяких випадках можна
було виділити штами, здатні мінералізувати забруднювач, але в інших
випадках деградація (часто лише часткова) вимагала створення вибагливих
консорціумів. Ці ранні зусилля були обмежені вивченням шляхів
деградації у мікробів, які можна було культивувати, або невтішним
завданням ідентифікації метаболітів, які накопичувалися під час
деградації, без можливості приписувати конкретні процеси конкретним
мікробам. Оптимізація часто обмежувалася зусиллями щодо посилення
росту мікробів, що розкладають забруднюючі речовини, оскільки
генетичні маніпуляції з відносно екзотичними ґрунтовими мікробами були
утруднені. Поєднання нових технологій в даний час пропонує абсолютно
нові способи вирішення проблем біоремедіації. Секвенування всього
геному може полегшити ідентифікацію ферментів, що беруть участь у
шляхах деградації, і дозволити ідентифікувати гомологи в інших мікробах.
Транскрипційне профілювання може виявити фізіологічні зміни, які
дозволяють мікробам виживати в забрудненому середовищі.
Профілювання мікробної спільноти та метагеномічні підходи відкривають
потенціал для виявлення деградуючих ферментів у некультурних мікробах
із забрудненого навколишнього середовища. Нові шляхи, які дозволяють
уникнути обмеження природних шляхів можуть бути розроблені з
використанням обчислювальних підходів і можуть включати реакції, що не
зустрічаються в природі, з використанням каталітично різнорідних
ферментів, активність яких була поліпшена в результаті спрямованої
еволюції. Придатність мікробів, що експресують ферменти розкладання, як
природним, так і штучним шляхом, може бути підвищена за рахунок
неупереджених підходів до створення штамів, що володіють підвищеною
стійкістю до токсичності забруднюючих речовин і їх метаболітів, а також
здатністю виживати в складних умовах. Ці підходи потенційно дозволяють
створювати штами, які ефективно розкладають стійкі антропогенні
сполуки в різних забруднених середовищах, і тим самим забезпечують
екологічно безпечні і відносно недорогі методи очищення забруднених
ділянок і переробки промислових відходів.