Самопідготовка

студента 2 курсу, 21 групи

Краснокутського Олексія
Тема № 5. Обмін речовин та енергії. Дослідження функціонування циклу
трикарбонових кислот.
1. Поняття про обмін речовин та енергії. Характеристика катаболічних,
анаболічних та амфіболічних шляхів метаболізму, їх значення.
1.1 Обмін речовин (метаболізм) - це перетворення речовин в організмі з моменту
потрапляння їх в клітини до утворення кінцевих продуктів обміну, тобто сукупність
хімічних реакцій, які проходять в живих клітинах і забезпечують організм речовинами
і енергією для його життєдіяльності, росту і розмноження.
Катаболічні перетворення - це розщеплення складних молекул, які поступили з їжею, і
тих, що входять до складу клітини, до простих компонентів; ці процеси є окисними
(використовуються окиснені форми коферментів) і супроводжуються виділенням
вільної енергії (екзергонічні реакції).
Анаболічні процеси скеровані на утворення і оновлення структурних елементів клітин
і тканин, процес полягає в синтезі складних молекул із простіших. Ці процеси відновні
(використовуються відновлені форми коферментів, утворюються окиснені) і
супроводжуються затратою вільної хімічної енергії (ендергонічні процеси). Джерело
енергії - АТФ. У процесі анаболізму з однакових вихідних речовин утворюються різні
кінцеві продукти. Кінцеві продукти анаболізму служать вихідними речовинами
катаболізму.
Амфіболічні шляхи, які містяться на "перехрестях" катаболізму та анаболізму;
метаболіти цього процесу можуть перетворюватися як в катаболічних, так і в
анаболічних процесах, наприклад, в циклі Кребса.
Метаболічні шляхи здебільшого лінійні, але можуть бути й циклічними. Із
різноманітних метаболічних шляхів складається метаболізм. Метаболічні шляхи
поділяють на:
 Анаболічні процеси
 Катаболічні перетворення
 Амфіболічні шляхи
2. Екзергонічні та ендергонічні біохімічні реакції; роль АТФ та інших
макроергічних фосфатів у їх спряженні.
2.1 Енергетика процесів біологічного обміну речовин ґрунтується на трьох основних
принципах, які відрізняються від енергетичних реакцій, що здійснюються в неживій
природі.
Першою, дуже важливою особливістю енергетичного обміну речовин в біологічних
системах є перехід хімічної енергії в інші форми без попереднього її перетворення в
теплову енергію. Тому живу систему розглядають як хімодинамічну, а не як тепловий
двигун. Так, коефіцієнт (ККД) в звичайного двигуна становить 20-25 %, реактивного -
до 45 %, а мітохондрій (силові станції) організму - 60-70 %.
Другою особливістю біоенергетики є те, що звільнення енергії при хімічних
окиснювапьних процесах проходить поступово, малими порціями, поки всі атоми
водню і вуглецю не перетворяться в кінцеві продукти окиснення - воду і вуглекислий
газ. Наприклад, при окисленні 1 моля глюкози виділяється 2881,2 кДж енергії. Якщо б
ця енергія виділилась одномоментно, то пройшов би вибух, і організм не зміг би її
засвоїти за такий короткий період.
Третьою особливістю біоенергетики є те, що потенціальна хімічна енергія, яка
знаходиться в хімічних зв`язках молекул вуглеводів, ліпідів, білків тощо при звільнені
може нагромаджуватися в інших речовинах, які є акумуляторами енергії. Вони дістали
назву високоергічних або макроергічних сполук. Акумульована енергія є легко
доступною в різних процесах життєдіяльності організму.
2.2 Екзергонічні (екзотермічні) біохімічні реакції – це реакції, які проходять з
витратою і зменшенням вільної енергії. Вони будуть мати від'ємне значення (–∆F) і
можуть здійснюватися самовільно.
Ендергонічні (едотермічні) біохімічні реакції – це реакції, які проходять з
поглинанням енергії і збільшенням вільної енергії. Вони буде мати від'ємне значення
(+∆F) і можуть проходити за рахунок інших реакцій. Ендергонічні реакції в
біологічних системах здійснюються при участі ферментів.
Спряження ендергонічних процесів з екзергонічними здійснюється за рахунок синтезу
протягом екзергонічної реакції сполук з високим енергетичним потенціалом, які в
подальшому використовуються в ендергонічнихреакціях, що забезпечує передачу
хімічної енергії від екзергонічного до ендергонічного процесу.
3. Внутрішньоклітинна локалізація метаболічних шляхів, компартменталізація
метаболічних процесів в клітині. Виділення субклітинних структур методом
диференційного центрифугування.
3.1 У теперішній час завдяки електронно-мікроскопічним та гістологічним дослідам, а
також методу диференційованого центрифугування досягнуті значні успіхи у
визначенні внутрішньоклітинної локалізації ферментів, що беруть участь у
метаболічних процесах. Окремі метаболічні шляхи містяться у визначених
внутрішньоклітинних ділянках – компартментах, що відокремлені біологічними
мембранами.
Досліджено, що в ядрі (точніше, в ядерці) локалізовані РНК-полімерази, тобто
ферменти, які каталізують утворення мРНК. У ядрі містяться ферменти, які беруть
участь у процесі реплікації ДНК.
З мітохондріями пов'язані ферменти ланцюга біологічного окиснення (тканинного
дихання) і окисного фосфорилування, а також ферменти піруватдегідрогеназного
комплексу, циклу трикарбонових кислот, синтезу сечовини, окиснення жирних кислот
тощо.
У лізосомах містяться в основному гідролітичні ферменти з оптимумом рН приблизно
5. Тут відбуваються реакції розщеплення білків, нуклеїнових кислот та чужорідних
сполук, що поглинаються певними клітинами за рахунок ендоцитозу.
У рибосомах локалізовані ферменти білкового синтезу, в цих частинках проходять
процеси трансляції мРНК і зв'язування амінокислот у поліпептидні ланцюги із
утворенням молекул білка.
В ендоплазматичній сітці зосереджені ферменти синтезу ліпідів, а також ферменти,
які беруть участь у реакціях гідроксилювання.
З плазматичною мембраною передусім зв'язані: АТФаза, аденілатциклаза і ряд інших
ферментів.
У цитозолі локалізовані ферменти гліколізу, пентозофосфатного циклу, синтезу
жирних кислот і мононуклеотидів, активації амінокислот, а також ферменти
глюкогенезу.
3.2 Дослідження субклітинних структур (органел) проводять за допомогою
диференційного ультрацентрифугування. Для отримання гомогенату тканину
дезінтегрують у спеціальному гомогенізаторі. Субклітинні фракції одержують
суспендуванням гомогенату в 0,25 М розчині сахарози та фракціонуванням
багаторазовим цетрифугуванням. Застосовуючи різну швидкість обертання ротора
ультрацетрифуги та збільшуючи, відповідно, фактор седиментації, що кількісно
визначається в одиницях прискорення знмного тяжіння – g, досягають фракціонування
тканинного гомогенату на окремі фракції.
Центрифугування з прискоренням 700 g осаджує уривки клітинних мембран та ядра.
Надосадову рідину центрифугують знову при 10 000 g – одержують мітохондрії та
лізосоми. Із надосадової рідини при другому центрифугуванні зі швидкістю 100 000 g
осаджують мікросоми і рибосоми. Остання надосадова рідина містить цитозоль
(розчинні компоненти у розчині сахарози).
4. Етапи катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів; їх характеристика.
4.1 Схема загальних шляхів катаболізму біомолекул
4.2 Перший етап, підготовчий. В цій фазі
високомолекулярні сполуки, які поступають із їжею, в
травному тракті, а також у клітинах організму
перетворюються на прості сполуки. На цьому етапі в
основному діють ферменти гідролази і вивільняється
приблизно до 1% енергії субстратів, яка розсіюється у
вигляді тепла.
На другому етапі мономери розпадаються в клітинах
тканин і органів на більш прості сполуки, такі як,
наприклад, піровиноградна, лимонна, ізолимонна, α-кетоглутарова, янтарна, яблучна,
оксалоацетатна, ацетатна кислоти, амінокислоти перетворюються на ацетил-КоА.

На цьому етапі в анаеробних умовах звільняється приблизно 25-30 % енергії вихідної

речовини. Частина цієї енергії акумулюється у вигляді макроергічних зв`язків
(субстратне фосфорилування), а частина розсіюється у вигляді тепла. Перетворення
мономерів проходить в гіалоплазмі, а кінцеві реакції - в мітохондріях.

Третій етап - кінцевий розпад речовин до СО2 і Н2О з участю кисню із повним
вивільненням енергії. Звільнений водень в складі своїх перенощиків під дією
ферментів тканинного дихання розділяється на Н + і електрон (ē). Електрон, переходить
на більш низьку орбіталь кисню, активує його, з`єднується з протонами, утворює воду,
а енергія, яка звільняється, акумулюється в молекулах АТФ. В утворенні цієї енергії
приймає участь АДФ, фосфат та фермент АТФ -синтетаза.

Приблизно 70-80 % усієї енергії хімічних сполук виділяється в цій фазі. Всі реакції
цієї фази локалізовані в мітохондріях.

5. Найважливіші метаболіти шляхів обміну білків, вуглеводів, ліпідів (піруват, ацетил-

S-КоА); їх роль в інтеграції метаболізму клітини.
5.1  Вивільнення енергії вуглеводів, ліпідів і білків відбува-ється при їх катаболізмі, в
якому виділяють три стадії (за умов наявності кисню). Стадії аеробного катаболізму
білків, вуглеводів та ліпідів схематично зображені на рис. 2.
 Перша стадія
Катаболізм біомолекул починається з того, що відбувається розщеплення більш
складних молекул до простих їх складових:
- білків – до амінокислот,
- вуглеводів (полісахаридів) – до моносахаридів,
- ліпідів (триацилгліцеролів)– до гліцеролу та жирних кислот.
Реакції цієї стадії відбуваються в цитозолі клітин і не супроводжуються виділенням
енергії.
Друга стадія
Далі структурні компоненти біополімерів, що утворилися на першій стадії
(амінокислоти, моносахариди, жирні кислоти, гліцерил), поступово розщеплюються до
спільного ключового метаболіту для всіх видів обміну – ацетил-КоА (активна форма
оцтової кислоти).
Реакції другої стадії до утворення піровиноградної кислоти (ПВК, або піруват)
відбуваються в цитозолі, переворення пірувату в ацетил-КоА – у мітохондріях.
До процесів катаболізму цієї стадії належать:
для моносахаридів (основним є глюкоза) – це реакції гліколізу до пірувату і далі до
ацетил-КоА;
для амінокислот – це реакції дезамінування, які для деяких з них супроводжуються
утворенням пірувату, а потім ацетил-КоА; для інших – одразу утворюється ацетил-
КоА;
для жирних кислот – реакції β-окиснення, кінцевим продуктом яких є ацетил-КоА;
для гліцеролу – реакції розщеплення з утворенням пірувату й ацетил-КоА.

 
Рисунок - Стадії катаболізму білків, вуглеводів, ліпідів.
Друга стадія супроводжується виділенням енергії, кіль-кість якої значно поступається
кількості енергії третьої стадії.
Третя стадія
На цій стадії відбувається окиснення ацетил-КоА до кінцевих продуктів Н2О та СО2,
що супроводжується генерацією значної кількості енергії (70-80% енергії).
Третя стадія відбувається в мітохондріях і складається з таких процесів, як ЦЛК (цикл
лимонної кислоти) та функ-ціонування електронтранспортного мітохондріального
ланцюга (дихальний ланцюг мітохондрій), робота якого пов’язана з окисним
фосфорилюванням – основним процесом синтезу АТФ у клітинах.
Перша та друга стадії належать до специфічних шляхів катаболізму – розпад паливних
молекул до ацети-КоА  відбувається власними шляхами, які для білків, вуглеводів та
ліпідів не збігаються, тобто є специфічними. Третя стадія – загальні шляхи
катаболізму, оскільки відбувається подальший розпад ацетильного залишку, -
загального проміжного метабо-літу, до кінцевих продуктів.  Тобто загальні шляхи
катаболізму – це ЦЛК та окисне фосфорилювання.
6. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК): внутрішньоклітинна локалізація ферментів
ЦТК; послідовність реакцій ЦТК; характеристика ферментів та коферментів ЦТК;
реакції субстратного фосфорилування в ЦТК; вплив алостеричних модуляторів на
регуляцію ЦТК; енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот.
6.1 Цикл трикарбонових кислот (цикл лимонної кислоти, цикл Кребса) — циклічна
послідовність ферментативних реакцій, у результаті яких ацетил-КоА (CH3-CO~S-
KoA) — продукт катаболізму основних видів метаболічного палива (вуглеводів,
жирів, амінокислот), окислюється до двоокису вуглецю з утворенням атомів водню,
які використовуються для відновлення первинних акцепторів дихального ланцюга
мітохондрій — нікотинамідних або флавінових коферментів.
Цикл трикарбонових кислот (ЦТК) — це загальний кінцевий шлях окислювального
катаболізму клітини в аеробних умовах. Реакції і ферменти ЦТК локалізовані в
матриксі та внутрішній мембрані мітохондрій.
6.2 ФЕРМЕНТАТИВНІ РЕАКЦІЇ ЦИКЛУ ТРИКАРБОНОВИХ КИСЛОТ
1. Утворення лимонної кислоти (цитрату) за рахунок конденсації ацетил-КоА з
щавлевооцтовою кислотою (оксалоацетатом):

Реакція каталізується ферментом цитратсинтазою. Вона є регуляторним ферментом,

активність якого гальмується АТФ, НАДН, сукциніл-КоА та довголанцюговими ацил-
КоА.

2.    Перетворення (ізомеризація) цитрату на ізоцитрат. Реакція каталізується

ферментом аконітазою і складається з двох етапів:
2.1.    Дегідратація лимонної кислоти з утворенням цис-аконітової кислоти (цис-
аконітату):

 
2.2.    Приєднання до цис-аконітату молекули води. При приєднанні до подвійного
зв’язку в складі цис-аконітату Н+ та ОН- у транс-положенні результатом реакції є
утворення ізолимонної кислоти (ізоцитрату):

 
3.    Дегідрування та декарбоксилювання ізоцитрату. Реакція каталізується НАД-
залежною ізоцитратдегідрогеназою і призводить до утворення α-кетоглутарової
кислоти (α-кетоглутарату).
Ізоцитратдегідрогеназа є регуляторним ферментом, позитивний модулятор якого —
АДФ, негативний — НАДН.

 
Фермент має дві молекулярні форми — мономерну (молекулярна маса
ізоцитратдегідрогенази з мітохондрій серця дорівнює 330 кД) та димерну. В
присутності позитивного модулятора АДФ мономери агрегують між собою з
утворенням димеру. Негативний модулятор НАДН протидіє індукованій АДФ
агрегації мономерних форм ферменту. Обидві молекулярні форми
ізоцитратдегідрогенази мають каталітичні властивості, але за умов низької
концентрації АДФ димер значно більш активний.
4.    Окислення α-кетоглутарату до сукцинату.
Цей процес відбувається у дві стадії:
4.1.    Окислювальне декарбоксилювання α-кетоглутарату з утворенням сукциніл-
КоА — стадія, що каталізується мультиензимним а-кетоглутарат- дегідрогеназним
комплексом. Кінцевий продукт — високоенергетичний тіоефір сукциніл-КоА, в
макроергічному зв’язку якого акумульовано хімічну енергію окислювально-
відновлювальною реакцією, що мала місце:

НАДН, що утворився в цій реакції, окислюється в дихальному ланцюзі мітохондрій із

генерацією 3 молекул АТФ.
За механізмом реакції цей процес нагадує окислювальне декарбоксилювання пірувату
до ацетил-КоА; як і піруватдегідрогеназний, α-кетоглутаратдегідрогеназний комплекс
має у своєму складі коферменти тіаміндифосфат (ТДФ), ліпоєву кислоту (ЛК), КоА,
НАД+ та ФАД. Молекулярна маса цього комплексу з клітин E.Coli дорівнює 2,1-106.
4.2.    Деацилювання сукциніл-КоА (перетворення на янтарну кислоту (сукцинат).
Реакція каталізується ферментом сукцинілтіокіназою. У результаті розщеплюється
макроергічний зв’язок у молекулі сукциніл-КоА, та за рахунок цієї енергії
утворюється нова макроергічна сполука нуклеозидтрифосфат ГТФ: 

Потім ГТФ передає свою кінцеву фосфатну групу на АДФ у нуклеозидфосфокіназній

реакції з утворенням АТФ:

 
5.    Окислення янтарної кислоти до фумарової кислоти (фумарату). Реакція
каталізується ФАД-залежним ферментом сукцинатдегідрогеназою:

 
Окислення відновленого коферменту (ФАДН2) за допомогою коензиму Q дихального
ланцюга мітохондрій призводить до синтезу за рахунок окисного фосфорилювання 2
молекул АТФ.
6.    Перетворення фумарової кислоти на яблучну кислоту (малат) внаслідок
приєднання до фумарату молекули води.
Реакція каталізується ферментом фумаратгідратазою (фумаразою):

 
7.    Окислення малату до оксалоацетату (щавлевооцтової кислоти).
Реакція каталізується НАД-залежним ферментом — малатдегідрогеназою
мітохондрій:

Окислення НАДН, що утворився, в дихальному ланцюзі мітохондрій призводить до

генерації 3 молекул АТФ.
Малатдегідрогеназна реакція завершує цикл трикарбонових кислот. Оксалоацетат,
який є продуктом даної реакції, здатний до взаємодії з новими молекулами ацетил-
КоА.
Загальну метаболічну карту циклу трикарбонових кислот подано на рис. 

6.3 Фосфорилування може здійснюватись на рівні

субстрату (субстратне фосфорилування ). Це фосфорилування проходить шляхом
безпосередньої передачі молекули активного фосфату із субстратів, які містять
макроергічний зв’язок на АДФ з утворенням АТФ. Наприклад, проміжний продукт
розпаду глюкози і триацилгліцеринів 2-фосфоенолпіровиноградна кислота віддає свій
активний фосфат на АДФ з утворенням АТФ за реакцією:
Субстратне фосфорилування дає незначну кількість молекул АТФ. Основна її
кількість синтезується в процесі фосфорилування, яке спряжене з тканинним
диханням. Сумарно процес біологічного окиснення, спряжений з процесом
фосфорилування, можна записати:

6.4 Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот

Біохімічний підсумок циклу трикарбонових кислот полягає в утворенні двох молекул
СО2 (в ізоцитратдегідрогеназній та α-кетоглутаратдегідрогеназній реакціях) та
чотирьох пар атомів водню, три з яких акцептуються НАД+ та одна — ФАД.
Відновлені коферменти окислюються в дихальному ланцюзі мітохондрій, утворюючи
за рахунок окисного фосфорилювання по 3 молекули АТФ на кожну молекулу НАДН і
по 2 молекули АТФ на кожну молекулу ФАДН2. Крім того, одна молекула АТФ
утворюється в субстратному фосфорилюванні при перетворенні сукциніл-КоА в
сукцинат.

Сумарний баланс молекул АТФ, що утворюються при функціонуванні

цитратного циклу
Реакція Кофермен Кількість молекул АТФ, що
т утворюються
1 Ізоцитрат — а-кетоглутарат НАД 3
2 а-кетоглутарат — сукциніл- НАД 3
КоА
3 Сукциніл-КоА — сукцинат ГДФ 1
4 Сукцинат — фумарат  ФАД 2
5 Малат — оксалоацетат  НАД 3
Усього 12

Таким чином, при повному окисленні однієї молекули ацетил-КоА до СО2 та Н2О в
циклі трикарбонових кислот генерується 12 молекул АТФ.
7. Механізми регуляції ЦТК. Навести приклади.
Механізми регуляції:
Швидкість реакція циклу Кребса визначається енергетичними потребами клітини.
Безпосередньо регулюється активність дегідрогеназ циклу Кребса, яка залежить від
величини відносини НАДН • Н+/ НАД+: При нестачі НАД+ активність дегідрогеназ
знижується, оскільки саме окислена форма коферменту є акцептором відрядив для
субстратів ЦТК. Крім цього, існує алостеричний механізм регуляції: для
ізоцітрадегідрогенази алостеричними інгібіторами є АТФ і НАДН • Н+, Активатором -
АДФ. Сукцинатдегідрогеназа пригнічується надлишком субстрату.
7.1 Активатори й інгібітори регуляторних ферментів циклу Кребса
 Фермент Інгібітор Активатори
Цитратсинтаза АТФ, НАДН,  
сукциніл-
КоА
Ізоцитратдегідрогеназа АТФ, НАДН АДФ, АМФ
α- АТФ, НАДН,  
кетоглутаратдегідрогеназ сукциніл-
а КоА
 
При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів
циклу пригнічується. Таким чином, коли в клітині є високий рівень АТФ, робота
циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється.
Інгібітором цитратсинтази й альфа-кетоглутаратдегідрогенази служить також
сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу.
8. Анаплеротичні реакції ЦТК. Дати визначення і навести приклади.
8.1 Анаплеротичні реакції — реакції клітинного метаболізму, що підвищують
концентрацію субстратів трикарбонового циклу, утворюючи їх з інтермедіатів інших
метаболічних шляхів (зокрема, амінокислот, пірувату). Активуючи ЦТК,
анаплеротичні реакції сприяють посиленню інтенсивності катаболічних процесів в
організмі.