Mіністерство освіти i науки України

Чорноморський національний університет імені Петра Могили

ДИПЛОМНА РОБОТА

Швидкий аналіз біолюмінесценції для моніторингу активності CES1 у

щурів та її активноi зміни при використанні традиційної китайської
медицини

Виконав

студент 3 курсу фармацевтичного факультету заочного відділення

Марашлець В.П. група 326 З

Миколаїв – 2022
1. Введение

Карбоксилестераза (CES) належить до широко поширеного надсемейству

білків a,b-гідролаз. Це суперсемейство має висококонсервативну
каталітичну триаду амінокислот і відіграє ключову роль у
біотрансформації широкого спектру ендогенних та екзогенних сполук,
включаючи складні ефіри, тіоэфіри, карбамати та аміди, у відповідних
свободних кислотах і спиртах [1]. Відзначається, що близько 20 %
лікарських засобів і 50 % пролекарств метаболізуються CES [2].
Основними изоферментами CES, участвующими в метаболізмі ліків, є
CES1 і CES2, з яких широко експрессуються в печі людини, собак і крис
[3,4]. У печі людини CES1 (hCE1) забезпечує близько 80-95% загальної
гідролітичної активності [5].

У печені крис доминирующее сімейство CES1 включає чотири різних

ізоферментів: гідролазу A, гідролазу B, гідролазу C і крисиний газин, серед
яких гідролаза A найбільш близька до каталітичної функції людини hCE1,
з приблизно 78% збігом послідовностей [6,7]. . Четире трави традиційної
китайської медицини (ТКМ): Radix Salviae Miltiorrhizae (корень червоного
шалфея, Danshen, DS) [8e10], Radix Puerariae Lobatae (корень кудзу, Gegen,
GG) [10e12], Radix Angelicae Danguдягіля, DG. ) ) [9,13] і Rhizoma
Chuanxiong (корневище любістка сичуанського, Chuanxiong, CX) [9,13]
широко використовуються для профілактики та лікування серцево-
судинних захворювань. Таким чином, вони мають високий потенціал для
спільного застосування із західними препаратами [9,12]. Наприклад, в
реальному дослідженні 84 697 захворювання з ішемічною хворобою серця,
43,46% пацієнтів, які отримували антитромбоцитарну терапію, одночасно
приймали ТКМ [14]. Крім того, TCM використовували з інгібіторами
рецепторів P2Y12, такими як клопідогрель або тикагрелор, для мінімізації
побічних ефектів, непереносимості ліків, ризику тромбозу та соціально-
економічних проблем [15,16]. Вплив трав TCM на активність CES1 у щурів
у крові та фракціях S9 тканин не розглядався. Наші останні результати
свідчать про те, що одночасне застосування GG та DG може призвести до
зміни фармакокінетики клопідогрелю та аспірину зі значним пригніченням
активності ЦЕС [17]. Враховуючи, що CES є основним гідролізуючим
ферментом для великої кількості лікарських засобів, особливо проліків,
таких як еналаприл, озельтамівір і клопідогрель [18], і що фармакокінетика
препаратів, визначена в доклінічних експериментах на щурах, широко
використовується як еталон для клінічні дослідження, подальше уточнення
розподілу CES1 та тканиноспецифічного впливу TCM на активність CES1
у щурів необхідне не лише для інтерпретації доклінічної фармакокінетики
ліків, але й для безпечного використання препаратів у практиці
інтегративної медицини. У сучасній практиці ТКМ гранули формули
китайської materia medica (CMM) стали популярними як альтернатива
препаратам відварів. Оскільки ці гранули не тільки зберігають властивості,
але й вирішують загальні проблеми контролю якості, приготування та
введення, їх клінічне використання поступово збільшується в усьому світі.
У Китаї існує понад 600 видів трав’яних гранул і 200 видів трав’яних
сумішей [19]. Крім того, в Японії існує понад 400 препаратів рослинних
гранул [20] та 300 видів у Південній Кореї [21]. Недавній огляд 56
клінічних досліджень не продемонстрував суттєвої різниці в ефективності
та безпечності між гранулами та відварами китайської фітотерапії [22].
Таким чином, для нашого поточного дослідження були прийняті трав’яні
гранули з чотирьох досліджуваних ТКМ. Активність CES вимірюється як
зменшення специфічного субстрату або утворення його відповідних
метаболітів протягом певного часу за допомогою рекомбінантних
ферментів CES, мікросом печінки, фракцій S9 та плазми різних видів.
Активність вимірюють за допомогою фотометричного аналізу,
флуорометричного аналізу та хроматографічного аналізу для виявлення
сигналу, створеного субстратами або продуктами, що утворюються
[23e26]. У цих методах зазвичай використовують п-нітрофенілацетат, п-
йодонітрофенілтетразолієвий фіолетовий, бутанілікаїн, ацил-КоА, 5,50-
дітіобіс-(2-нітробензойна кислота), фенацетин, ацетанілід і клопідогрель. У
нашому попередньому дослідженні ми повідомляли про два селективні
датчики (2-(2- бензоїлокси-3-метоксифеніл)бензотіазол) (BMBT) і (S)-4,5-
дигідро-2-(6-гідрокси-2-бензотіазоліл)-4-тіазол-арбонової кислоти-
метиловий ефір (DME), обидва з яких можуть використовуватися для
кількісного виявлення активності hCE1 в мікросомах печінки людини
[26,27]. Проте було виявлено, що флуоресцентний аналіз на основі BMBT
страждає від сильної фонової інтерференції та потенційної
фототоксичності. На основі хімічної структури BMBT і DME, (S)-2-(2-(6-
диметиламіно)-бензотіазол)-4,5-дигідро-тіазол-4-карбоксилат (NLMe),
новий специфічний субстрат hCE1 з було розроблено мінімальне фонове
втручання та відсутність фототоксичності та метод синтезу, ідентифікація
та застосування NLMe та його гідролізованого продукту (S)-2-(2-(6-
диметиламіно)-бензотіазол)-4,5-дигідро-тіазол-4- карбонової кислоти (NL)
повідомлялося в наших попередніх дослідженнях [27e29]. Конструкція
NLMe як біолюмінесцентного датчика для виявлення активності ферменту
була заснована на стратегії, згідно з якою люциферин-люциферазна
реакція світлячка є найважливішою і широко використовуваною системою
для виявлення біолюмінесценції, а вільний люциферин можна замаскувати
за допомогою відмітних замінників [29]. NLMe є складноефірним
похідним люциферину, що містить велику карбоксильну групу та малу
спиртову групу, і, таким чином, може служити хорошим субстратом для
CES1, оскільки CES1 переважно гідролізує субстрати з малими
спиртовими групами та великими ацильними групами, тоді як CES2 віддає
перевагу субстратам з великим вмістом спирту. групи та малі ацильні
групи [30]. Було виявлено, що NLMe є специфічним субстратом для CES1 і
може специфічно метаболізуватися за допомогою hCE1 до NL, тоді як інші
гідролази, такі як ацетилхолінестераза, бутирилхолінестераза,
параоксоназа 1, людський параоксигенфосфат 2, карбоангідраза, бичачий
альбумін, ліпаза, C-реактивний білок , міоглобін, трансгенний феритин,
лізоцим, пепсин, трипсин, альбумін людини, пріонний білок, людська
карбоксилестераза 2 і фосфатний буфер не могли каталізувати реакцію.
Гідроліз NLMe у мікросомах печінки може бути помітно пригнічений
специфічним інгібітором карбоксилестерази BNPP, але не іншими
інгібіторами естерази, такими як піперазин, гуперзин А, галантамін та
етилендіамін тетраетиламоній [28]. Швидкість метаболізму NLMe в
мікросомах з легенів, нирок, кишечника і печінки людини під час
попереднього біолюмінесцентного тесту була виявлена узгодженою з
експресією hCE1 у відповідних мікросомах за допомогою вестерн-блот-
аналізу, що демонструє специфічність NLMe як субстрату для CES1 [28 ].
Нинішнє дослідження додатково розвиває та підтверджує комплексний
аналіз біолюмінесценції з використанням NLMe як зонда для прямого
виявлення активності CES1 у різних біоматрицях, таких як плазма та різні
тканини у щурів. На основі цього аналізу було отримано профіль розподілу
активності CES1, що надає важливу інформацію для доклінічної розробки
проліків, а також дозволяє нам безпосередньо контролювати активність
CES1 та зміни, спричинені лікуванням лікарськими засобами та/або
травами, що сприяє кращому прогнозуванню трав. /лікарські взаємодії для
забезпечення їх безпечного використання.

2.1. Матеріали та інструменти

NLMe і NL (рис. 1) були синтезовані нашою групою з чистотою >98%.

Таблетки з фосфатним буфером (PBS), набір для аналізу білка
біцинхонинової кислоти (BCA) і мікросоми печінки щурів (RLM) були
придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Місурі, США). Реагент для
виявлення люциферину (LDR), продукт Promega Corporation (Медісон,
Вісконсін, США), був приготований шляхом додавання буфера для
відновлення до ліофілізованого реагенту люциферину та обережного
перемішування для розчинення. Перед використанням була необхідна
регідратація реагенту при кімнатній температурі протягом 1 години. Біс-п-
нітрофенілфосфат (BNPP), флуоксетин і лоперамід були придбані в TCI
(Токіо, Японія). Ультрачиста вода була отримана за допомогою системи
ультрачистої води Milli-Q від Millipore (Мілфорд, Массачусетс, США). Білі
полістиролові пластини Nunc™ F96 були від Thermo Scientific (Рокфорд,
Іллінойс, США). У дослідженні на тваринах використовували диспергатор
Ultra-Turrax T25 (IKA, Boutersem, Бельгія) та універсальну охолоджену
центрифугу CT15RT (Techcomp Ltd., Шанхай, Китай). Для визначення
загальної концентрації білка та аналізу біолюмінесценції використовували
пристрій для зчитування мікропланшетів CLARIOstar® (BMG LABTECH,
Ортенберг, Німеччина). Гранули ШМ DS (серія № 1007), GG (серія №
1027), CX (серія № 1019) і DG (серія № 1017) були люб’язно надані
PuraPharm International Limited (Гонконг). Співвідношення концентрації
трав до трав’яних гранул становило 5:1 для гранул DS, гранул GG, гранул
CX і 3:1 для гранул DG. Вміст представлених біоактивних маркерних
сполук у гранулах було визначено у нашому попередньому дослідженні
[17] так: 25 мг/г сальвіанової кислоти в гранулі DS, 114 мг/г пуерарину в
гранулі GG, 0,63 мг/г ферулової кислоти в DG. гранули та 1,81 мг/г
ферулової кислоти в гранулі CX. Суворо дотримувався специфічний
контроль якості, як описано для чотирьох обраних трав TCM як у
Китайській фармакопеї Китайської Народної Республіки [31], і в
Гонконгських китайських стандартах Materia Medica [32]. Зразки ваучерів
для чотирьох трав’яних гранул зберігалися в Фармацевтичній школі
Китайського університету Гонконгу, Китай.
2.2. Розробка та валідація аналізу біолюмінесценції

(рис 1) Структура та МС/МС спектри (A) NLMe та (B) NL.

2.2.1. Перевірка NLMe як субстрату CES1 у плазмі щурів

На відміну від відсутності CES у плазмі людини, повідомлялося про

високу експресію CES у плазмі щурів [33]. Оскільки було
продемонстровано, що NLMe є селективним субстратом hCES1, для
підтвердження специфічності NLMe щодо CES1 у плазмі щурів, аналізи
потенційного інгібування різних інгібіторів CES щодо гідролізу NLMe
були проведені в пустій плазмі щурів. Оцінку проводили шляхом
порівняння активності за наявності або відсутності різних зареєстрованих
інгібіторів CES, включаючи BNPP (загальний інгібітор CES) [34],
флуоксетин (селективний інгібітор CES1) [35] та лоперамід (селективний
інгібітор CES2) [36]. Дослідження проводили в 96-лунковому
мікропланшеті в загальному об’ємі 100 мл. BNPP розчиняли в
диметилсульфоксиді, а флуоксетин і лоперамід розчиняли в етанолі з
отриманням вихідних розчинів з концентрацією 40 мМ. Для отримання
розчинів 0,5, 1,0, 2,0, 3,9, 7,8, 15,6, 31,3, 62,5, 125 і 250 мМ робили серійні
розведення PBS (100 мМ, рН 7,4). 25 мл об’єму розведеного розчину
попередньо інкубували з 25 мл плазми щура (концентрація білка 4 мг/мл)
при 37°С протягом 60 хв, а потім додавали 25 мл розчину NLMe (500
нг/мл) для початку. реакція. Через десять хвилин після інкубації при 37°С
реакцію припиняли додаванням 25 мл LDR. Після ще 20 хвилин інкубації
суміші генеровані біолюмінесцентні сигнали вимірювали за допомогою
зчитувача мікропланшетів CLARIOstar® для вимірювання активності
CES1. Також використовували розчинники та контрольні зразки без
інгібіторів. Було отримано та порівняно залишкову активність (%), що
представляє відсоток активності CES1 для різних груп лікування порівняно
з контролем. Для оцінки інгібіторних ефектів інгібіторів CES, таких як
BNPP і флуоксетин, була оцінена напівмаксимальна інгібуюча
концентрація (IC50) на основі їх кривих концентрація-відповідь за
допомогою програмного забезпечення GraphPad 7.0 (GraphPad Software
Inc, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). 2.2.2. Визначення NL методом
біолюмінесценції

Як показано на рис. 2, NLMe можна гідролізувати за допомогою CES1 до

NL, який служив специфічним субстратом люциферази і може бути
визначений кількісно шляхом вимірювання біолюмінесценції, отриманої в
результаті реакцій з LDR. Коротше кажучи, до 25 мл аликвоти
стандартного розчину NL додавали 50 мл PBS (100 мМ, рН 7,4) з
наступною інкубацією суміші при 37°С з обережним струшуванням
протягом 10 хв. Згодом до реакційної суміші додавали 25 мл LDR з
наступною 20-хвилинною інкубацією при 37°C. Згенеровані
біолюмінесцентні сигнали вимірювали за допомогою зчитувача для
мікропланшетів CLARIOstar®.

2.2.3. Перевірка біолюмінесценції

 Рис 2
Ілюстрація поточної ферментативної реакції NLMe, опосередкованої CES1, та
біолюмінесцентного аналізу утвореного NL.

Розроблений аналіз біолюмінесценції був підтверджений на специфічність,

лінійність, точність, точність і надійність. Специфічність аналізу
оцінювали шляхом виявлення можливих перешкод за допомогою
сканування спектрів випромінювання NLMe, NL та реакційних сумішей
ферментів (RLM). Лінійність оцінювали шляхом аналізу стандартних
розчинів NL в концентраціях 15,62, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 і 1000 нг/мл у
трьох примірниках; стандартні розчини свіжоприготували шляхом
серійних розведень 2 мг/мл NL вихідного розчину 100 мМ PBS буфера.
Біолюмінесцентні сигнали були побудовані в залежності від концентрації
NL, і калібрувальне рівняння було отримано за допомогою зваженого
аналізу лінійної регресії. Межа виявлення (LOD) і межа кількісної оцінки
(LOQ) були відповідно розраховані з використанням нахилу (S)
калібрувальної кривої та стандартного відхилення відповіді (s) за такими
формулами: LOD = 3,3 с/S і LOQ = 10 s/S. Точність оцінювали за
допомогою внутрішньо- та міжденної точності та виражали як відносне
стандартне відхилення (RSD %). Точність протягом доби оцінювали
шляхом виконання трьох повторних аналізів стандартних розчинів NL в
концентраціях 125, 500 і 1000 нг/мл в один і той же день. Що стосується
точності між днями, ті самі аналізи проводилися в три різні дні. Точність
виражали у відсотках відхилення між номінальною та виміряною
концентрацією зразка з ±15% як критерій прийнятності. Оскільки всі
аналізи проводили в 96-лункових мікропланшетах, оцінку надійності
проводили протягом трьох днів із обробкою трьох планшетів щодня.
Кожна планка планшета складалася з NL стандартних розчинів при 125,
500 і 1000 нг/мл для імітації низького, середнього та високого
біолюмінесцентних сигналів відповідно. Зразки низького, середнього та
високого сигналу розподілялися всередині пластин у форматі
перемежованого сигналу з різним порядком по стовпцях: високий-
середній-низький для пластини A, низький-високий-середній для пластини
B і середній-низький-високий для пластина C (n ¼ 32). Виміряні сигнали
потім використовувалися для розрахунку коефіцієнта варіацій (CV), вікна
сигналу (SW) і значення Z’ для оцінки надійності (див. Додаткову
інформацію: S1) [37].

2.3. Оцінка активності CES1 після перорального введення обраного

Трави TCM (китайські народні трави) з аналізом біолюмінесценції

2.3.1. Лікування тварин

Щоб оцінити вплив обраних трав TCM на активність CES1 у щурів,

тридцять самців щурів Sprague Dawley (12–14 тижнів, 150–200 г) були
випадковим чином розділені на дев’ять груп (G1–G9, n = 6 для G1, n = 3
для G2–G9 ). G1 служив контрольною групою, в якій щурам перорально
вводили 1 мл фізіологічного розчину двічі на день протягом 14 днів, тоді
як щури від G2 до G9 отримували еквівалентну для людини дозу трав’яних
гранул двічі на день протягом 14 днів. На основі рекомендованої дози для
людини (60 кг на людину) для чотирьох трав (сушена трава DS: 10e15 г;
сушена трава GG: 10e15 г; DG сушена трава: 6e12 г; і CX сушена трава:
3e10 г) [31] і коефіцієнт корекції дози для щурів на основі площі поверхні
тіла, як рекомендовано FDA США [38], еквівалентні дози трав для щурів
(г/кг) були розраховані на рівні 1,03 г/кг DS (G2, DSL), 1,55 г /кг DS (G3,
DSH), 1,03 г/кг GG (G4, GGL), 1,55 г/кг GG (G5, GGH), 0,62 г/кг DG (G6,
DGL), 1,24 г/кг DG (G7, DGH), 0,31 г/кг CX (G8, CXL) і 1,03 г/кг CX (G9,
CXH). Виходячи з співвідношення екстракції трав до трав’яних гранул,
наданого виробником (5:1 для гранул DS, гранул GG і гранул CX; 3:1 для
гранул DG), дози гранул CMM у кожній групі лікування були розраховані
так: 0,21 г/кг гранул DS (G2, DSL), 0,31 г/кг гранули DS (G3, DSH), 0,21
г/кг гранул GG (G4, GGL), 0,31 г/кг гранул GG (G5, GGH) , 0,21 г/кг гранул
DG (G6, DGL), 0,41 г/кг гранул DG (G7, DGH), 0,062 г/кг гранул CX (G8,
CXL) та 0,21 г/кг гранул CX (G9, CXH). Вибрану кількість кожної
трав’яної гранули суспендували в 30 мл теплої води з наступною 30-
хвилинною обробкою ультразвуком при кімнатній температурі для
приготування вихідного розчину 0,0441 г/мл для DSL, GGL, DGL і CXH,
0,0651 г/мл для DSH і GGH, 0,0882 г/мл для DGH і 0,0130 г/мл для CX (на
основі 210 г щура). Остаточний об’єм перорального зонда вихідного
розчину для кожного щура (від 0,4 до 0,8 мл) додатково коригували на
основі маси тіла. Усі експерименти на тваринах були проведені після
схвалення Комітетом з етики тварин Китайського університету Гонконгу
(Ref. № 14-171-MIS), а щури Sprague Dawley були надані Центром
обслуговування лабораторних тварин Китайського університету Гонконгу.

2.3.2. Збір проб та обробка

Зразки крові відбирали в день 0, день 2, день 4, день 6, день 8, день 10 і

день 12 з хвостової вени кожного щура. На 14 день усіх щурів умертвили
через 2 години після останньої дози, відбирали кров за допомогою пункції
серця, а серце, печінку, нирки, селезінку, легені, підшлункову залозу,
кишечник, мозок і шлунок відбирали після швидкої перфузії серця 200 мл
фізіологічного розчину. Зразки плазми відокремлювали від крові негайним
центрифугуванням при 8000g протягом 3 хв. Плазму та всі зібрані зразки
тканин заморожували при 80°С. Для приготування фракцій S9 кожної
зібраної тканини заморожені тканини розморожували в крижаному буфері
для гомогенізації (0,1 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA та 150 мМ KCl), а потім
гомогенізували. на бані з льодом. Потім гомогенати центрифугували при
10 000 g протягом 20 хвилин при 4 C для отримання супернатантів (фракції
S9) зі зберіганням при -80 C. Загальну концентрацію білка в плазмі та
підготовлених фракціях S9 визначали за допомогою пристрою для
зчитування мікропланшетів з використанням білка BCA. набір для аналізу,
як описано в технічному бюлетені, що додається до набора.

2.3.3. Визначення активності CES1 за допомогою біолюмінесцентного

аналізу активності CES1

в біоматрицях визначали за утворенням NL з NLMe в оптимізованій

інкубаційній системі. Коротше кажучи, 25 мл розчинів зразків з
оптимальною концентрацією білка попередньо інкубували в 25 мл PBS
(100 мМ, рН 7,4) при 37 С з обережним струшуванням протягом 10 хв.
Після цього реакції ініціювали додаванням 25 мл NLMe (500 нг/мл) і далі
інкубували протягом 10 хв. Нарешті, активність CES1 у зразках фракції S9,
отриманих з розділу 2.4.2, була виражена як швидкість утворення NL за
допомогою нещодавно розробленого аналізу біолюмінесценції.

2.4. Аналіз даних

Для визначення активності CES1 фонові біолюмінесцентні сигнали,

отримані з контрольних зразків (n = 3), що містять NLMe і PBS, віднімали
від сигналів, отриманих із зразків біоматриці. Дані представлені як середнє
± SD (стандартне відхилення середнього значення) трьох незалежних
експериментів. Для порівняння активності CES1 між різними групами
лікування використовувався t-критерій Велча з р < 0,05, який вважається
статистично значущим.
3. Результати та обговорення

Рис3 Оптимізація біолюмінесцентного аналізу з демонстрацією (А)

біолюмінесцентних спектрів (400-700 нм) NL (500 нг/мл), NLMe (500 нг/мл) та
інкубаційної суміші ферменту (RLM, 2 мг/мл), співвідношення між
біолюмінесцентними інтенсивність та (B) час інкубації (0e90 хв) і (C) концентрації NL
та температури інкубації (25 C, 30 C і 37 C).

Хоча зміни активності ферментів не завжди є результатом змін рівня

ферментів [39], зміни в експресії є найпоширенішим засобом, за
допомогою якого клітини регулюють активність ферменту. Розроблений
тут аналіз біолюмінесценції дозволяє швидко визначати активність
ферменту CES1 у різних тканинах, препаратах, крові та плазмі. Щоб
гарантувати, що зміни активності були нормалізовані на вміст білка в
кожній біоматриці, концентрацію білка в кожному зразку біоматриці
визначали за допомогою BCA-аналізу. Оптимізована концентрація білка
для визначення активності CES1 була обрана для кожної тканини або
зразка крові на основі лінійного діапазону та інтенсивності сигнальної
реакції за допомогою графіка залежності концентрації білка від
люмінесцентного сигналу, отриманого гідролізом NLMe. При цій
оптимізованій концентрації білка для кожної плазми/тканини активність
CES1 кожного органу визначали як швидкість утворення NL після
коригування концентрації білка (мМ/мг білка/хв). У попередніх
дослідженнях для вимірювання активності CES використовували
фотометричні, флуорометричні та хроматографічні методи [23e26].
Фотометричний аналіз вважався простим і швидким (1 або 2 хв), але
недостатня специфічність для активності CES1 була проблемою [23].
Флуорометричний аналіз з використанням флуоресцентного зонда для
hCE1 забезпечив високу чутливість з LOD 1,29 нг/мл, але страждав від
перешкод, викликаних домішками та нестабільністю продуктів під
впливом світла [26]. Хроматографічні аналізи за допомогою ВЕРХ або
UPLC є селективними та чутливими, але трудомісткими, вимагаючи до 30
хв для кожного запуску зразка [25,26]. Наш нещодавно розроблений аналіз
біолюмінесценції має переваги: простіша процедура, стабільний сигнал,
менший час аналізу зразка та менша вартість. Крім того, поточний метод
забезпечує більш високу селективність і чутливість з LOD всього 1,15
нг/мл, що у 8 разів більш чутливим, ніж наш раніше зареєстрований
біолюмінесцентний метод на основі DME (LOD 10 нг/мл) [27]. Ми
застосували цей аналіз активності CES1 для вимірювання змін активності
CES1 у біоматрицях щурів після лікування TCM. Видові варіації існують
майже для кожного ферменту, включаючи CES. Попередні звіти, засновані
на зміні рівнів субстрату, продемонстрували різницю видів у діяльності
CES. Наприклад, для проліків діетилентриамін пентаоцтової кислоти
ступінь його CES-опосередкованого гідролізу та результуючий
метаболічний профіль у фракціях S9 печінки людини та собаки значно
відрізнялися від такого у щурів [40]. Також було помічено значне
відхилення гідролізу клопідогрелю у різних видів, що визначається
швидкістю утворення неактивного метаболіту клопідогрелю карбонової
кислоти [41]. Оскільки зміни в рівнях субстрату можуть бути результатом
інших метаболічних шляхів, ніж гідроліз, опосередкований CES,
очікується, що наш біолюмінесцентний аналіз забезпечить більш точний і
прямий моніторинг змін активності CES.

3.1. Розробка та підтвердження біолюмінесцентного аналізу

3.1.1. Оптимізація умов аналізу біолюмінесценції та валідація методу.

Максимальна довжина хвилі біолюмінесцентного випромінювання NL та

розчину ферментативної реакції були на 618 нм без перешкод
біолюмінесцентного сигналу від NLMe (рис. 3A), що вказує на те, що
метод визначення був специфічним. Оскільки 20-хвилинна інкубація
генерувала найсильніший сигнал, стабільний до 50 хв., це вважалося
оптимальним часом інкубації (рис. 3В). Було також виявлено, що
інтенсивність генерованого біолюмінесцентного сигналу була пропорційна
концентрації NL до 1000 нг/мл при досліджуваних трьох температурах
інкубації, причому 37 C генерувала вищу інтенсивність сигналу, ніж 25 C і
30 C. Таким чином, інкубація при 37 C була відібрано для аналізу зразків
(рис. 3C). Аналіз активності CES1 з використанням біолюмінесцентного
аналізу вимагав стандартної кривої, що побудовує графік інтенсивності
біолюмінесценції проти відповідної концентрації NL. Для отримання
калібрувальної кривої була прийнята зважена (зважування 1/x) лінійна
регресійна модель найменших квадратів. Зв'язок між інтенсивністю
біолюмінесценції та концентрацією NL був лінійним у діапазоні його
концентрацій 15,63e1000 нг/мл з квадратом коефіцієнта кореляції Пірсона
(r 2) 0,9996. Розраховані LOD і LOQ NL становили 1,15 і 3,48 нг/мл
відповідно, що демонструє виняткову чутливість для поточного аналізу.
Таблиця 1 показує, що точність і точність, визначені на трьох рівнях
концентрації NL у три різні дні, були в межах 15%, що підтверджує
надійність розробленого аналізу. Оцінки надійності були засновані на
однорідності пластини та оцінці мінливості сигналу. Таблиця 2 показує,
що значення CV були меншими за 20%, значення SW та Z були не менше 2
та 0,4 відповідно, що підтверджує, що аналіз був надійним із достатньою
надійністю.

3.1.2. Оптимізація умов ферментативної реакції CES1

Активність CES1 оцінювали шляхом визначення швидкості

опосередкованого CES1 гідролізу NLMe, який був субстратом
люциферину і міг генерувати біолюмінесценцію під час реакції з LDR (рис.
2).

Для оптимізації умов проводили серійне розведення зразків

ферментативних реакцій in vitro. Як показано на рис. 4A, відсоток
споживання NLMe лінійно збільшувався, коли концентрація білка RLM
була нижчою за 16 мг/мл і мала тенденцію досягати плато, коли вона була
вище 40 мг/мл. Виходячи з отриманого лінійного діапазону та
інтенсивності сигнальної реакції, концентрацію білка 2 мг/мл вважали
достатньою для ферментативної реакції. Аналогічно, концентрації білка
були оптимізовані для зразків плазми (4 мг/мл) і S9 зразків серця (20
мг/мл), печінки (6 мг/мл), нирок (10 мг/мл), селезінки (50 мг/мл). ), легені
(20 мг/мл), підшлункова залоза (10 мг/мл), кишечник (20 мг/мл), мозок (50
мг/мл) і шлунок (30 мг/мл). У зазначених вище оптимізованих умовах
реакції було виявлено, що реакція гідролізу ферменту протікає дуже
швидко, а швидкість утворення NL стабілізується через 10 хв (рис. 4B).
Тому оптимальним часом реакції вважається 10 хв. З іншого боку,
швидкість утворення NL лінійно збільшувалася, коли концентрація
субстрату NLMe зросла з 7,81 нг/мл до 500 нг/мл (рис. 4C). Щоб
максимізувати генерований сигнал без впливу на лінійність відповіді, 500
нг/мл NLMe було обрано як оптимальну концентрацію субстрату. 3.1.3.
Перевірка селективності NLMe щодо CES1 у плазмі щурів

Для подальшої перевірки селективності NLMe щодо CES1 у плазмі щурів

було проведено аналіз інгібування різних інгібіторів карбоксилестерази.
Як показано на рис. 5, серед вибраних сполук як BNPP, так і флуоксетин
виявляли значний інгібуючий ефект на гідроліз NLMe з IC50 5,1 мМ та 2,6
мМ відповідно. Лоперамід, селективний інгібітор CES2, не
продемонстрував впливу на гідроліз NLMe при його кінцевих
концентраціях до 62,5 мМ, що також свідчить про специфічність NLMe як
субстрату CES1.

3.2. Вплив перорально введених TCM на активність CES1 у щурів

3.2.1. Вплив лікування TCM на активність CES1 у плазмі та різних

тканинах

Розуміння розподілу ізоферментів CES у тканинах має вирішальне

значення для прогнозування CES-опосередкованого метаболізму ліків.
Використовуючи наш розроблений біолюмінесцентний метод, ми виміряли
експресію CES1 у плазмі щурів та основних тканинах після двотижневого
введення вибраних TCM. У поточному дослідженні відстежували
активність CES1 у фракціях S9 замість мікросомальних фракцій. Примітно,
що фракції S9 містять як мікросомальні, так і цитозольні фракції, і було
виявлено, що ферменти CES1 високо експресуються в цитозолі печінки як
людини, так і щура [42]. Як показано на рис. 6, фермент CES1 був
виявлений в плазмі та всіх досліджуваних тканинах, включаючи серце,
печінку, нирки, селезінку, легені, підшлункову залозу, кишечник, мозок і
шлунок. Згідно з попередніми повідомленнями [43,44], виявлено, що
експресія ферменту CES1 у печінці, нирках та плазмі була вищою, ніж у
тонкій кишці. Крім того, активність CES1 була виявлена в серці та мозку.
Таким чином, активність CES1 у плазмі, серці, печінці та нирках була
набагато вищою, ніж у селезінці, легенях, підшлунковій залозі, кишечнику,
мозку та шлунку. Крім того, вплив двотижневого лікування TCM (за
винятком груп DSL і DSH) на активність CES1 щурів виявився
специфічним для тканин: у групі GGL було виявлено значне збільшення
легенів, а в групі GGH не було виявлено істотних відмінностей. Крім того,
значне зниження активності CES1 було виявлено в нирках як у групах
DGL, так і DGH. У групі DGL активність CES1 мала тенденцію до
зниження в плазмі та всіх досліджуваних тканинах, але без статистичної
значущості. У групі DGH значно знижена активність CES1 також була
виявлена в селезінці. Нарешті, значне підвищення активності CES1 було
виявлено в легенях як у групах CXL, так і CXH, тоді як активність CES1
значно знизилася в селезінці в групі CXH. Такі тканинно-специфічні зміни
активності CES1 при різних методах лікування TCM можуть бути
пов’язані з різним розподілом у тканинах компонентів TCM, які впливають
на експресію або активність CES1. Повідомлялося, що таншинон із Salvia
miltiorrhiza (DS) [45] та флавоноїди, такі як байкалін, байкалеїн, хризин та
галангін, можуть інгібувати CES [46]. У нашому попередньому
дослідженні [17] вивчався вплив цих трав на активність CES1 печінки
щурів після одночасного застосування з клопідогрелем та аспірином.
Подібні результати спостерігалися після введення DSL, DSH, GGL, DGL,
DGH та CXL. Однак замість зниження активності CES1 в печінці, у цьому
поточному дослідженні було виявлено підвищення активності CES1 як для
GGH, так і для CXH. Такі розбіжності можуть бути пов'язані з різними
підходами, прийнятими для визначення активності CES1. У нашому
попередньому дослідженні клопідогрель використовувався як субстрат для
CES1, тоді як у поточному дослідженні використовувалися більш
конкретні та прямі вимірювання активності CES1. NLMe, використаний у
нашому поточному дослідженні, був специфічним субстратом,
гідролізованим лише ферментом CES1, тоді як клопідогрель, використаний
у нашому попередньому дослідженні, мав два конкурентних метаболічних
шляхи: основний шлях гідролізу hCE1 до клопідогрелю карбонової
кислоти та шлях вторинного окислення ферментами CYP до клопідогрель
тіолактон, який потім може бути гідролізований до карбонової кислоти
тіолактону за допомогою hCE1 [47]. Наш поточний аналіз
біолюмінесценції має більшу специфічність, а також прямий моніторинг
активності CES1, що робить змінені активності CES1 після лікування TCM
in vivo більш актуальними.
3.2.2. Активність CES1 у плазмі щурів змінюється під час
двотижневого лікування TCM
 Рис. 4. Оптимізація умов ферментативної реакції за (А) концентрації білка RLM,
плазми, S9 серця, печінки, нирок, селезінки, легенів, підшлункової залози, кишечника,
мозку та шлунка відповідно (B) час реакції (2e80 хв) і (C) концентрації NLMe (7,81
нг/мЛе200 мг/мл).

Виходячи з високого рівня експресії CES1 у плазмі щурів, зразки крові з

усіх груп лікування відбирали кожні два дні до 14 дня для моніторингу
змін активності CES1 протягом періоду лікування (рис. 7). Зміни
активності CES1 у плазмі протягом 14 днів лікування показано на рис. 7A.
Для справедливого порівняння змін активності CES1 у плазмі щурів
різними TCM, які вводяться перорально, протягом двотижневого
лікування, кратна зміна активності CES 1 виражається відносно дня 0, на
основі якого z-показники (див. Додаткову інформацію: S2). були
розраховані для графіка теплової карти (рис. 7Б). Як показано на рис. 7A,
порівняно з такою в контрольній групі, активність CES1 у плазмі в групах,
які отримували DSL, DSH, GGL та GGH, в основному знижувалася
протягом періоду лікування зі значним зниженням, що спостерігалося в
групах DSL, DSH та GGL на День 8, що свідчить про те, що тривале
пероральне введення DS і GG могло б інгібувати активність CES1 у плазмі
крові у щурів. З іншого боку, активність CES1 в плазмі в групах, які
отримували DG і CX, коливалася протягом періоду лікування зі значним
збільшенням активності CES1, що спостерігалося в групі DGL на 8 день і в
групі CXH на 2 і 8 день, без значну різницю на 14 день. Крім того,
порівняно з такою в день 0, було помічено, що активність CES1 у плазмі
контрольної, DSL, GGH та CXH груп коливалася протягом перших кількох
днів і продемонструвала тенденцію до стійкого зниження після 8 дня ( Рис.
7B), де тільки група DSL демонструвала значне зниження активності CES1
на 8-й, 10-й, 12-й і 14-й день (рис. 7A), без істотних відмінностей на 14-й
день у групах GGH та CXH. Для інших груп, включаючи DSH, GGL, DGL,
DGH та CXL, спостерігалося послідовне зниження активності CES1 у
плазмі крові після 2 дня (рис. 7B) зі значним зниженням, виявленим у
групах DGH та CXL на 10 день, у групі DGL на День 10 і день 12 і без
істотних відмінностей для всіх груп на 14 день (рис. 7A). Для
статистичного аналізу відмінностей активності CES1 в біометричних
показниках щурів з різних груп лікування, у нашому поточному
дослідженні було прийнято t-критерій Велча, адаптацію t-критерію
Стьюдента [48]. t-критерій Велча працює краще для контролю помилок
типу 1, ніж t-критерій Стьюдента, коли розміри вибірки нерівні, і діє
аналогічно, коли розміри вибірки та дисперсії рівні [48e50]. Наша
процедура аналізу була такою: Спочатку припущення про нормальність
було перевірено за допомогою тесту нормальності Шапіро-Уілка через
малий розмір вибірки контрольної групи (n = 6) і груп, які отримували дозу
TCM (n = 3). Ми виявили, що всі набори даних про активність CES1 у
плазмі щурів у всіх групах відповідали нормальним розподілам. По-друге,
припущення про однорідність дисперсії були перевірені за допомогою
Ftest: наприклад, дисперсія наборів даних активності CES1 у плазмі щурів
у групі DSL у день 2 проти дня 0 (n = 3) (сценарій A) виявилася рівною (p =
0,892), тоді як у групі DSH на 10 день проти дня 0 (n = 3) (сценарій B) було
нерівно (p = 0,006). Нарешті, набори даних були проаналізовані за
допомогою як t-критерію Стьюдента, так і t-критерію Велча. Для сценарію
А було виявлено, що не було суттєвої різниці між двома наборами даних (p
= 0,409 в обох тестах) з однаковим значенням t (t = 0,9218) і ступенем
свободи (df) (df = 4) з обох тести; для сценарію B були знайдені різні
результати між двома наборами даних за допомогою двох тестів: t-
критерій Стьюдента: p = 0,019, t = 3,828, df = 4; t-критерій Велча: p = 0,061,
t = 3,828, df = 2. Оскільки, коли дисперсії між групами були нерівними, t-
критерій Стьюдента міг бути сильно упередженим і призвести до
ненадійних результатів [49], тоді як критерій Велча забезпечує кращий
контроль типу 1 частота помилок [48e50], у нашому дослідженні було
обрано критерій Велча. Підсумовуючи, серед чотирьох трав TCM, DS і GG,
як правило, мали найбільший вплив на активність CES1 плазми, зі
зниженням активності CES1 у плазмі після тривалого перорального
прийому, тоді як DG і CX впливали на активність CES1 в органах,
включаючи нирки, селезінку. і легені. Виходячи з розподілу CES1 та змін у
його активності після лікування чотирма травами TCM, ми припускаємо,
що DS, GG і DG можуть значно змінити активність CES1 в тканинах, де
він найбільше виражений, включаючи кров і нирки. Серед досліджених
органів на активність CES1 в серці, печінці, підшлунковій залозі,
кишечнику, мозку та шлунку майже не впливали двотижневі пероральні
трави TCM. Враховуючи вищезгаданий вплив, велику кількість експресії
CES1 та зручність для відбору проб, CES1 у плазмі може слугувати
біомаркером у моніторингу зміни активності CES1 у щурів.

4. Висновки
 Рис. 5. Оцінка потенційних інгібуючих ефектів виділених сполук на гідроліз NLMe у
плазмі щурів. Дані є середніми ± SD, n = 3. (A) Гістограма залишку активності
порівняно з контролем для BNPP, флуоксетину та лопераміду в кінцевих
концентраціях 31,25 мМ; (B) Криві пригнічення дози BNPP і флуоксетину, значення
IC50 були представлені в дужках.

Для моніторингу активності CES1 у різних тканинах розроблено та

підтверджено новий швидкий біолюмінесцентний аналіз із достатньою
чутливістю та зручністю. Вперше профілі розподілу активності CES1 у
тканинах щурів повністю охарактеризовані за допомогою нашого
біолюмінесцентного аналізу. Ми виявили, що фермент CES1 був присутній
у плазмі та всіх перевірених органах у щурів із набагато вищими рівнями в
плазмі, серці, печінці та нирках. Чотири досліджувані трави TCM показали
тканинно-специфічний вплив на активність CES1 після двотижневого
перорального введення щурам у еквівалентних для людини дозах, при
цьому DS і GG найбільшою мірою впливали на активність CES1 в плазмі,
тоді як DG і CX впливали на активність у тканинах більшою мірою. міра.
Лікування DS/GG призвело до тенденції до зниження активності CES1 у
плазмі, тоді як лікування DG та CX призвело до значного зниження
активності CES1 у нирках та легенях відповідно. Наш аналіз
біолюмінесценції не тільки надав вичерпні профілі розподілу CES1 в
тканинах in vivo у щурів, але також міг бути використаний для
ідентифікації потенційних інгібіторів або індукторів CES1, а також для
моніторингу активності CES1 під час лікування лікарськими
засобами/лікарськими засобами та лікарськими засобами/травами в
клінічній практиці. Конфлікт інтересів Автори заявляють, що конфлікту
інтересів немає. Підтвердити принципи Цю роботу підтримав Фонд
охорони здоров’я та медичних досліджень (довідковий номер: 12131521)
Бюро продовольства та здоров’я, уряд ПАР Гонконг, Гонконг, Китай,
Національний фонд природничих наук Китаю (грант №: 81973286 ,
81922070, 81703604 та 81973393), Китай, та Фонд загального дослідження
(CUHK2141142) від Університетської грантової ради САР Гонконг, Китай.
 Рис. 7. Активність CES1 у плазмі щурів під час двотижневого введення TCM. (A)
Гістограма активності CES1 у щурів на день 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 і 14. Дані є середніми ±
SD, n ¼ 6 для контрольної групи і n ¼ 3 для груп із застосуванням TCM. *p < 0,05, **P
< 0,01 порівняно з контролем. #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 у порівнянні з днем 0.
(B) Теплова карта для зміни кратної зміни активності CES1 у щурів на 2, 4, 6, 8, 10, 12
та 14 день відносно дня 0, відповідно
 Посилання

[1] S.C. Laizure, V. Herring, Z. Hu та ін., Роль карбоксилестераз людини в

метаболізмі ліків: чи не забули ми їх значення? Фармакотерапія 33 (2013)
210e222.

[2] Лі Д. Вплив карбоксилестераз на метаболізм та фармакокінетику ліків,

Curr. Метаболізм ліків. 19 (2018) 91e102.

[3] Т. Сато, П. Тейлор, В.Ф. Босрон та ін., Сучасний прогрес в області

естераз: від молекулярна структура для функціонування, Drug Metab.
Dispos. 30 (2002) 488e493.

[4] Д.Д. Ван, Л.В. Zou, Q. Jin, et al., Карбоксилестерази людини:

комплексний огляд, Acta Pharm. гріх. Б 8 (2018) 699e712.

[5] HJ Zhu, J.S. Марковіц, Генетичний поліморфізм карбоксилестерази 1

(CES1). та активація озельтамівіру, євро. J. Clin. Pharmacol. 69 (2013)
733e734.

[6] T. Imai, Y. Takase, H. Iwase та ін., Участь карбоксилестерази в гідролізі

проліків пропранололу під час проникнення через шкіру щурів,
Pharmaceutics 5 (2013) 371e384.

[7] М. Хосокава, Структура та каталітичні властивості ізоферментів

карбоксилестерази бере участь у метаболічній активації проліків,
Molecules 13 (2008) 412e431.

[8] Л. Чжоу, З. Цзо, М.С. Чоу, Danshen: огляд його хімії, фармакології,
фармакокінетики та клінічного використання, J. Clin. Pharmacol. 45 (2005)

1345e1359.

[9] З.Х. Чен, X.Q. Лю, В.Й. Гао та ін., Дослідження з фармакології,
токсикології та фармакокінетика хімічних компонентів гемореологічного
засобу, азіат J. Pharmacodyn. Фармакокінет. 8 (2008) 15e30.
[10] В.Й. Tam, P. Chook, M. Qiao та ін., Ефективність та переносимість
допоміжних альтернативна фітотерапія (Salvia miltiorrhiza і Pueraria lobata)
на функція та структура судин у коронарних пацієнтів, J. Alternative
Compl. мед. 15 (2009) 415e421.

[11] Z. Zhang, T.N. Lam, Z. Zuo, Radix Puerariae: огляд його хімії,

фармакологія, фармакокінетика та клінічне застосування, J. Clin.

Pharmacol. 53 (2013) 787e811.

[12] B. Ge, Z. Zhang, Z. Zuo, Radix Puerariae lobatae (Gegen) пригнічує

антикоагулянтну дію варфарину: фармакокінетика та фармакодинаміка
вивчення, Чин. мед. 11 (2016) 7.

[13] Z. Wen, Z. Wang, S. Wang та ін., Відкриття молекулярних механізмів

традиційна китайська лікарська формула Si-Wu-Tang з використанням
експресії генів мікрочип і карта підключення, PloS One 6 (2011), e18278.

[14] G.H. Лі, H.Y. Цзян, Ю.М. Xie та ін., Попереднє дослідження щодо
інтеграції традиційної китайської та західної медицини у пацієнтів із
коронарною хвороба серця в реальному світі, Чжунго Чжунъяо Цзажі 39
(2014) 3474e3478.

[15] Ф. Ролліні, Ф. Франчі, Д.Дж. Ангіолілло, Перемикання інгібіторів

P2Y12-рецепторів хворих на ІХС, нац. Преподобний Кардіол. 13 (2016)
11e27.

[16] М. Вальгіміглі, Х. Буено, Р.А. Byrne, et al., ESC зосередила увагу на

оновленнях подвійної антитромбоцитарної терапії при ішемічній хворобі
серця, розроблених у співпраці з діє: робоча група з подвійної
антитромбоцитарної терапії при ішемічній хворобі серця Європейське
товариство кардіологів (ESC) та Європейська асоціація для серцево-
торакальна хірургія (EACTS), Eur. Серце Дж. 39 (2017) 213e260, 2018.
[17] М. Сяо, Ч. Цянь, X. Луо та ін., Вплив китайських рослинних
препаратів на подвійний антитромбоцитарна терапія клопідогрелем і
аспірином: фармакокінетика і результати фармакодинаміки та пов’язані з
ними механізми у щурів, J. Ethnopharmacol. 235 (2019) 100e110.

[18] Дж. О, С. Лі, Х. Лі та ін., Новий варіант карбоксилестерази 1 c.662A>G

може зниження біоактивації озельтамівіру у людей, PloS One 12 (2017),
e0176320.

[19] Дж. Вей, Л.Х. Чжан, Натуральні продукти: відкриття ліків і

терапевтична медицина, Humana Press, Totowa, 2005, с. 229e250.

[20] L.C. Едвін, Ю. Нобуо, Додаткові та альтернативні підходи до

Biomedicine, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Нью-Йорк, 2004, стор.
27e28.

[21] Б.Г. Чжан, X.L. Ван, К.Ф. Лю, Сучасний стан і розвиток китайської
мови

гранули фітотерапії, Чин. Фармацевт. J. 35 (2000) 487e489.

[22] H. Luo, Q. Li, A. Flower та ін., Порівняння ефективності та безпеки між

гранули і відвар китайської фітотерапії: систематичний огляд
рандомізовані клінічні дослідження, J. Ethnopharmacol. 140 (2012) 555e567.

[23] М. Хосокава, Т. Сатох, Вимірювання активності карбоксилестерази

(CES), Curr. протокол. Токсикол. (Додаток 10) (2002) 4 7.1e4.7.14.

[24] Дж.А. Ворона, А. Боразжані, П.М. Гончар, М.К. Росс, Гідроліз

піретроїдів за тканини людини та щура: дослідження кишкової, печінкової
та сироваткової карбоксилестерази, Токсикол. Appl. Pharmacol. 221 (2007)
1e12.

[25] М.К. Росс, А. Боразжані, Ферментативна активність карбоксилестераз

людини, Curr. протокол. Токсикол. (Додаток 33) (2007) 4 24.1e4.24.14.
[26] Д.Д. Wang, Q. Jin, J. Hou, et al., Високочутливе та вибіркове виявлення

Активність людської карбоксилестерази 1 за допомогою рідинної

хроматографії з визначенням флуоресценції, J. Chromatogr. B 1008 (2016)
212e218.

[27] Д.Д. Ван, К. Джин, Л.В. Zou, et al., Біолюмінесцентний датчик для
високої селективності і чутливе виявлення карбоксилестерази 1 людини в
комплексі біологічних зразки, хім. комун. (Camb.) 52 (2016) 3183e3186.

[28] Л. Янг, Д.Д. Ван, Г.Б. Ge та ін., Набір для виявлення біолюмінесценції
для hCE1 (Карбоксилестераза людини 1), а також спосіб використання та
застосування Комплект для виявлення біолюмінесценції, CN107271432A,
Китай, 2017 р.

[29] Л. Янг, Л.В. Зоу, Г.Б. Ge та ін., Субстрат біолюмінесцентного зонда

для людини Карбоксилестераза 1 та спосіб отримання та застосування,
CN105712987A, Китай, 2016.

[30] Т. Імай, М. Хосокава, Пролікарський підхід з використанням

активності карбоксилестерази: каталітичні властивості та регуляція генів
карбоксилестерази у ссавців тканини, Я. Пестик. наук. 35 (2010) 229e239.

[31] Фармакопея Китайської Народної Республіки, ume I, China Medical

Science and Technology Press, Пекін, 2015 р. Видання, 2015 р., с. 44
(Chuanxiong), 77 (Даньшен), 133 (Дангуй), 333 (Геген).

[32] Гонконгські китайські стандарти Medica Materia, том 1: Danggu,

Danshen; Том 2: Chuanxiong; Том 3: Gegen, D.o.H. Відділ китайської
медицини, уряд Особливого адміністративного району Гонконг, нар
Китайська Республіка, Гонконг, 2012. https://www.cmro.gov.hk/htmL/eng/
GCMTI/hkcmms/volumes.htmL.

[33] Б. Лі, М. Седлачек, І. Манохаран та ін., Бутирилхолінестераза,

параоксоназа,
і альбумінестераза, але не карбоксилестераза, присутні в плазмі людини,

біохім. Pharmacol. 70 (2005) 1673e1684.

[34] H. Eng, M. Niosi, T.S. Макдональд та ін., Корисність інгібітора

карбоксилестерази біс-пара-нітрофенілфосфат (BNPP) у незв'язаній
фракції плазми визначення гідролітично нестабільного похідного аміду та
агоніста рецептор TGR5, Xenobiotica 40 (2010) 369e380.

[35] HJ Zhu, D.I. Аппель, Ю.К. Петерсон та ін., Визначення обраних

терапевтичних засобів агенти як інгібітори карбоксилестерази 1:
потенційні джерела метаболічного препарату взаємодії, Токсикологія 270
(2010) 59e65.

[36] С.К. Куінні, С. П. Сангані, У. І. Девіс та ін., Гідроліз капецитабіну до

5'-

дезокси-5-фтороцитидин карбоксилестеразами людини та інгібування

лоперамідом, J. Pharmacol. Exp. Терапевт. 313 (2005) 1011e1016.

[37] П.В. Іверсен, Б. Бек, Ю.Ф. Чен та ін., Перевірка аналізу HTS:
рекомендації щодо аналізу Посібник [Інтернет], Eli Lilly & Company та
Національний центр розвитку Translational Sciences, Bethesda, 2012.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK83783/.

[38] Керівництво для промисловості, що оцінює максимальну безпечну

початкову дозу в початковій Клінічні випробування терапевтичних засобів
у дорослих здорових добровольців, Департамент США охорони здоров’я
та соціальних служб, 2015. Управління з контролю за продуктами і ліками,
Центр for Drug Evaluation and Research (CDER),
https://www.fda.gov/media/72309/

[39] М.К. Росс, А. Боразжані, Р. Ван та ін., Дослідження карбоксилестерази

фенотип у печінці людини, Arch. біохім. Біофіз. 522 (2012) 44e56.

[40] Дж. Фу, Є. Пациняк, М.Г.Д. Leed, et al., Міжвидові відмінності в
метаболізмі багатоефірного проліки карбоксилестеразами, J. Pharm. наук.
105 (2016) 989e995.

[41] Ю.К. Ван, X.F. Шан, Л. Ван та ін., Міжвидова варіація клопідогрелю
гідроліз у мікросомах печінки різних ссавців, Хім. біол. Взаємодіяти. 315
(2020) 108871.

[42] T. Tabata, M. Katoh, S. Tokudome та ін., Ідентифікація цитозольної

карбоксилестерази, яка каталізує утворення 5’-дезокси-5-фтороцитидину з
капецитабіну в печінці людини, Drug Metab. Dispos. 32 (2004) 1103e1110.

[43] Т. Сато, М. Хосокава, Карбоксилестерази ссавців: від молекул до

функції, Анну. Rev. Pharmacol. Токсикол. 38 (1998) 257e288.

[44] Т. Сато, М. Хосокава, Карбоксилестерази: структура, функція та

поліморфізм у ссавців, J. Pestic. наук. 35 (2010) 488e493.

[45] М. Дж. Хетфілд, Л.Г. Цуркан, Дж. Л. Хаятт та ін., Модуляція

етерифікованого лікарського засобу метаболізм таншинонами Salvia
miltiorrhiza (“Danshen”), J. Nat. Вироб. 76 (2013) 36e44.

[46] Д.Х. Сонце, Г.Б. Ге, П.П. Донг та ін., Інгібуюча поведінка плодів
psoraleae інгредієнти карбоксилестерази людини 1 (hCES1), Xenobiotica 46
(2016) 503e510.

[47] K. Hagihara, M. Kazui, H. Ikenaga та ін., Порівняння утворення

тіолактонів та активних метаболітів прасугрелю та клопідогрелю у щурів і
собак, Ксенобіотика 39 (2009) 218e226.

[48] Б.Л. Уелч, Узагальнення проблеми «студента», коли кілька різних

задіяні дисперсії населення, Біометрія 34 (1947) 28e35.

[49] M. Delacre, D. Lakens, C. Leys, Чому психологи повинні

використовувати за замовчуванням t-критерій Уелча замість t-критерію
Стьюдента, Int. Преподобний соц. Психологія. 30 (2017) 92e101.
[50] Г.В. Скло, П.Д. Пекхем, Дж. Р. Сандерс, Наслідки невиконання
припущень, що лежать в основі аналізу фіксованих ефектів дисперсії та
коваріації, Преосв. Res. 42 (1972) 237e288.