Київ - 2015

Національна академія медичних наук України
Державна установа «Інститут геронтології ім. Д.Ф. Чеботарьова НАМН»
На правах рукопису
УДК 612.017.112.94 + 577.7
ШИТІКОВ ДМИТРО В’ЯЧЕСЛАВОВИЧ
МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ВІКОВИХ ЗМІН Т-КЛІТИННОЇ

ЛАНКИ ІМУННОЇ СИСТЕМИ НА МОДЕЛІ ГЕТЕРОХРОННОГО
ПАРАБІОЗУ ТА РОЗРОБКА СПОСОБУ ЇХ КОРЕКЦІЇ
03.00.09 – Імунологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
Пішель Ірина Миколаївна,

доктор медичних наук
Київ – 2015
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ,

СКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ………………………………………………… 5
ВСТУП ……………………………………………………………………... 6
Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ …………………………………………. 12
1.1. Роль Т-лімфоцитів в імунній системі та їх вікові зміни …………… 12
1.2. Мікрооточення Т-лімфоцитів у вторинних лімфоїдних органах ….. 20
1.3. Молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів ……………………. 27
Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ .……………………. 35
2.1. Дослідження стану імунної системи in vivo в експерименті на

тваринах ……………………………………………………………………. 35
2.1.1. Схеми експериментів та експериментальні моделі ………………. 35
2.1.2. Методи експериментальних досліджень стану імунної системи… 37
2.2. Дослідження стану імунної системи in vitro………………………… 40
2.2.1. Схеми експериментів та експериментальні моделі ………………. 40
2.2.2. Дослідження змін у функціональному стані Т-лімфоцитів ……… 41
2.2.3. Методи експериментальних досліджень впливу клітин

мікрооточення селезінки на функціональний стан Т-лімфоцитів …..…. 42
2.3. Дослідження впливу макрофагів селезінки на молекулярні

механізми активації Т-лімфоцитів селезінки парабіонтів in vitro…….... 47
2.3.1 Схеми експерименту та експериментальні моделі ……………….. 47
2.3.2 Методи експериментальних досліджень впливу макрофагів

селезінки на механізми активації Т-лімфоцитів селезінки
3
гетерохронних парабіонтів in vitro ………………………………………. 47
2.4. Статистичний аналіз результатів ……………………………………. 50
Розділ 3. ОСНОВНІ ПОРУШЕННЯ Т-КЛІТИННОЇ ЛАНКИ ІМУННОЇ

СИСТЕМИ ТА ПОСЛІДОВНІСТЬ ЇХ ВИНИКНЕННЯ НА МОДЕЛІ
ГЕТЕРОХРОННОГО ПАРАБІОЗУ ………………………………………. 52
3.1 Зміни маси та клітинності тимусу молодих партнерів по

гетерохронному парабіозі після 12 тижнів сумісного існування………. 52
3.2 Зміни проліферативної активності спленоцитів та
субпопуляційного складу Т-лімфоцитів селезінки молодих партнерів
по гетерохронному парабіозі після 12 тижнів сумісного існування……. 56
3.3 Зміни фагоцитарної активності макрофагів селезінки молодих
партнерів по гетерохронному парабіозі після 12 тижнів сумісного
існування……………………………………………………………………. 63
3.4. Зміни маси та клітинності тимусу молодих партнерів по
гетерохронному парабіозі після 6 тижнів сумісного існування……… 69
3.5. Зміни проліферативної активності спленоцитів та
субпопуляційного складу Т-лімфоцитів селезінки молодих партнерів
по гетерохронному парабіозі після 6 тижнів сумісного існування… 73
3.6. Зміни фагоцитарної активності макрофагів селезінки молодих
існування……………………………………………………………………. 79
Розділ 4. ЗМІНИ В КОСТИМУЛЯТОРНЙ ДІЇ КЛІТИН ЛІМФОЇДНОЇ
НІШІ СЕЛЕЗІНКИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ Т-КЛІТИН
IN VITRO ПІД ВПЛИВОМ ГЕТЕРОХРОННОГО ПАРАБІОЗУ……….. 83
4.1. Зміни у проліферативній активності Т-лімфоцитів при їх
стимуляції за допомогою ФГА in vitro…………………………………… 83
4.2. Зміни у здатності клітин лімфоїдної ніші селезінки костимулювати
проліферацію Т-лімфоцитів при їх стимуляції за допомогою ФГА in
vitro………………………………………………………………………….. 86
4
4.3. Зміни у проліферативному відгуку Т-лімфоцитів тварин різних
експериментальних груп при наявності костимуляторних стимулів з
боку клітин лімфоїдної ніші селезінки молодих інтактних тварин……. 89
Розділ 5. ЗМІНИ У МОЛЕКУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМАХ АКТИВАЦІЇ
Т-ЛІМФОЦИТІВ IN VITRO ПІД ВПЛИВОМ КЛІТИН ЛІМФОЇДНОЇ
НІШІ СЕЛЕЗІНКИ ПРИ ГЕТЕРОХРОННОМУ ПАРАБІОЗІ…………... 94
5.1 Зміни у молекулярних механізмах регуляції проліферації Т-
лімфоцитів тварин різних експериментальних груп при сумісній
культивації з аутологічними МФ селезінки ………………………..….. 94
5.2 Зміни у молекулярних механізмах регуляції проліферації Т-
лімфоцитів тварин різних експериментальних груп при сумісній
культивації з МФ селезінки молодих інтактних тварин in vitro………... 101
5.3. Коефіцієнти кореляції між експресією ключових сигнальних
регуляторних молекул та проліферативною активністю Т-лімфоцитів
старих ізохронних парабіонтів при сумісному культивуванні з МФ
селезінки тварин різних експериментальних груп………………………. 107
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ………………………… 110
ВИСНОВКИ ……………………………………………………………….. 130
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………………………….……… 132

5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ, СКОРОЧЕНЬ
І ТЕРМІНІВ
АПК Антигенпрезентуючі клітини

АТ Антитіло
ВЛО Вторинні лімфоїдні органи
ВФ Відсоток фагоцитозу, %
ДІ Довірчий інтервал
ДК Дендритні клітини
ІЛ Інтерлейкін
ІС Індекс стимуляції, у.од.
МФ Макрофаги
НК Натуральні кілери
ТКР Т-клітинний рецептор
ФГА Фітогемаглютинін
ФІ Фагоцитарний індекс, у.од.
ФЧ Фагоцитарне число, у.од.
CD Cluster of differentiation, кластер диференціації
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
IκBα Іnhibitor of nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in
B-cells
МНС Major histocompatibility complex, Головний Комплекс
Гістосумісності
MTT 3-(4,5-dіmethylthіazol-2-yl)-2,5dіphenyl tetrazolіum bromіde
NFκB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
TNFα Tumor Necrosis Factor α, фактор некрозу пухлин α
6
ВСТУП
Актуальність теми. З віком імунна система підлягає значним

негативним змінам. Як відомо із сучасних літературних джерел, старіння
імунної системи супроводжується інволюцією тимусу та зниженням процесів
утворення у тимусі наївних Т-лімфоцитів, відбувається накопичення
лімфоцитів з фенотипом клітин імунологічної пам’яті, що призводить до
значного зниження ефективності роботи адаптивної ланки імунної системи
[Nikolich-Žugich J., 2012]. Посилюється роль утворення Т-лімфоцитів поза
тимусом [Allen S. et al., 2011]. Т-лімфоцити є одним з найважливіших
елементів захисної системи організму, а їх функції підлягають найбільш
значним негативним змінам при старінні: порушується антигензалежна
проліферація, знижується кількість CD4+-клітин та збільшується кількість
CD8+-клітин в організмі, знижується ефективність елімінації патогенів. Цей
комплекс процесів призводить до розвитку численних вікових захворювань
та негативно впливає на тривалість та якість життя [Castelo-Branco C. еt al.,
2014].
Розглядаються три можливих причини вікового зниження функцій Т-
лімфоцитів: 1) атрофія тимусу і зниження продукції наївних Т-лімфоцитів
[Castelo-Branco C. еt al., 2014]; 2) зміна костимуляції клітин лімфоїдної ніші
[Wong C. et al, 2013, Agrawal A. et al, 2011]; 3) порушення
внутрішньоклітинних сигнальних механізмів [Garg S.K. et al., 2014, Moro-
Garcia M.A. et al, 2012].
Однак, механізми розвитку вікових порушень у роботі Т-клітинної
ланки імунної системи все ще залишаються невідомими. Аналіз більшості
вікових змін проводиться, як правило, порівнянням показників у молодих і
старих тварин, що не дає можливості аналізувати динаміку виникнення цих
процесів. Цікавою з точки зору дослідження динаміки виникнення вікових
змін стану імунної системи є модель гетерохронного парабіозу [Губрий И.Б.,
7
1982, Бутенко Г.М. та ін., 1980, Бутенко Г.М. та ін., 1981, Бутенко Г.М. та ін.,
1984]. У даній експериментальній моделі хірургічним шляхом об’єднуються
кровоносні системи двох тварин різного віку, що дає їм можливість
обмінюватись клітинними та гуморальними факторами між собою. Це дає
можливість оцінити взаємний вплив системних середовищ організмів різного
віку. Було встановлено, що об’єднання молодих тварин зі старими в
гетерохронні парабіотичні пари приводить до взаємного заселення
донорськими лімфоїдними клітинами та, у подальшому, до вірогідного
зниження функцій імунокомпетентних клітин молодого партнера. У той же
час не виявлено позитивного впливу молодого організму на імунологічні
показники старого [Г.М.Бутенко та ін., 1980].
При роз’єднанні гетерохронних парабіотичних пар відновлення
імунологічних параметрів у молодого партнера не спостерігалось протягом 3
місяців [Г.М.Бутенко та ін., 1981], а протягом 7 місяців після роз’єднання 90
% молодих партнерів гинули, що свідчить про існування активного
механізму супресії показників імунної відповіді молодого партнеру старим.
Летальна доза рентгенівського опромінення значно знижувала
супресорний вплив старого організму на імунну систему молодого у
парабіотичній парі. Було висловлено припущення, що опромінення старої
тварини імовірно викликає загибель певних клітин та пошкоджує супресорні
механізми [Г.М.Бутенко та ін., 1981].
Таким чином було встановлено, що модель гетерохронного парабіозу
являє собою модель прискореного та необоротного старіння імунної системи,
індукованого міграцією клітин, та обміном гуморальними факторами крові
між партнерами різного віку. Механізм індукції вікових змін не описано.
Активація Т-клітин вимагає залучення ряду внутрішньоклітинних
сигнальних механізмів, зокрема активації низки сигнальних каскадів
протеїнкіназ, фосфорилювання і подальшої транслокації у ядро
транскрипційних факторів родини NFκB, що необхідно для ініціювання
8
проліферації Т-клітин, блокування апоптозу та ефекторних функцій
лімфоцитів [Maciolek J.A. et al., 2014].
Активація Т-клітин вимагає не лише стимуляції їх специфічного
антигенрозпізнавального рецептору, але й залучення додаткових молекул на
поверхні клітини як шляхом контактних взаємодій з клітинами строми
(наприклад, костимуляторні молекули типу CD4/CD8, CD28 та інші), так і за
допомогою стимуляції розчинними факторами (цитокіни) [Scandiuzzi L. et al.,
2011].
Ключовим джерелом факторів, що регулюють роботу Т-клітин, є
елементи їх ніші у лімфоїдних органах. До них належать фібробласти та
компоненти сполучнотканинної строми лімфоїдних органів, а також
антигенпрезентувальні клітини (АПК), зокрема макрофаги (МФ) та дендритні
клітини (ДК) [Schlitzer A. et al., 2014]. Дані щодо функцій АПК при старінні
досить суперечливі, але загалом вказують на зниження ефективності
презентації антигенів Т-клітинам та стимуляції Т-клітинної відповіді [Stout
R.D. et al., 2005, Grolleau-Julius A. еt al., 2006, Grolleau-Julius A. еt al., 2009].
Роль вікових змін клітин АПК периферичних лімфоїдних органів у розвитку
вікових порушень Т-клітинної ланки імунної системи на даний момент
досліджені недостатньо.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась в рамках планової НДР («Дослідити механізми індукованого
старіння імунної системи на моделі гетерохронного парабіозу») лабораторії
патофізіології та імунології ДУ «Інститут геронтології імені Д. Ф.
Чеботарьова НАМН України» (реєстраційний номер 0109U001723, строк
виконання 2009-2011 рр.).
Мета дослідження: встановлення механізмів розвитку вікових змін у
параметрах функціонування Т-клітинної ланки імунної системи молодих
партнерів по гетерохронному парабіозу та розробка експериментального
підходу їх корекції.
В рамках поставленої мети було сформульовано такі завдання:
9
1. Дослідити характер вікових змін Т-клітинної ланки імунної
системи на моделі гетерохронного парабіозу після 12 тижнів сумісного
існування тварин у парабіотичних парах.
2. Провести порівняльну оцінку характеру вікових змін у
функціонуванні Т-клітинної ланки після шести та дванадцятитижневого
гетерохронного парабіозу.
3. Оцінити вікові зміни костимуляторного впливу
антигенпрезентувальних клітин селезінки на проліферативну активність Т-
клітин in vitro.
4. Дослідити вікові зміни у впливі антигенпрезентувальних клітин
селезінки на молекулярні механізми регуляції Т-клітин.
5. Розробити експериментальний підхід для корекції вікових змін у
функціональних властивостях Т-лімфоцитів.
Об’єкт дослідження – активація Т-лімфоцитів периферичних
лімфоїдних органів в умовах in vitro.
Предмет дослідження – вікові зміни у механізмах активації Т-
лімфоцитів in vitro на моделі гетерохронного парабіозу.
Методи досліджень: для реалізації поставлених завдань
використовувалися сучасні методи експериментальної геронтології,
імунологічні методи, проточна цитометрія, методи ізоляції клітин для
досліджень in vitro, молекулярно-біологічні методи досліджень та
статистичний аналіз отриманих даних.
Наукова новизна отриманих результатів.
Вперше на моделі гетерохронного парабіозу протягом 12 тижнів було
продемонстровано розвиток дисфункції периферичної Т-клітинної ланки
імунної системи, що виражається у зниженні імунорегуляторного індексу у 2
рази та підвищення відносної кількості Т-лімфоцитів з фенотипом клітин
імунологічної пам’яті у 1,7-2 рази. При цьому було продемонстровано
відсутність негативного впливу гетерохронного парабіозу на макроскопічні
10
показники тимусу та субпопуляційний склад тимоцитів молодих
гетерохронних парабіонтів.
Вперше на моделі прискореного старіння виявлено, що важливими
механізмами вікових порушень у функціонуванні периферичних Т-
лімфоцитів є негативні зміни костимуляторних властивостей аутологічних
антигенпрезентувальних клітин.
На моделі співкультивування вперше показано негативний вплив
аутологічних антигенпрезентувальних клітин молодих гетерохронних
парабіонтів на експресію білків-компонентів активаційних сигнальних
каскадів Т-лімфоцитів.
Практичне значення отриманих результатів.
Проведені експериментальні дослідження мають теоретичну та
практичну значимість для сучасної імунології та геронтології. Отримані дані
демонструють важливість ролі макрофагів селезінки у розвитку вікових змін
Т-клітинної ланки імунної системи, що може бути використано при
подальшій розробці підходів корекції вікових змін імунної системи.
Розроблено та запропоновано новий метод корекції вікових змін
проліферативної активності Т-клітин на моделі in vitro шляхом
співкультивування Т-лімфоцитів старих тварин з макрофагами селезінки
сингенних молодих тварин (Патент України на корисну модель, МПК G01N
33/48 (2006.01), № 94103 від 27.10.2014 року).
Особистий внесок здобувача. Автором разом з науковим керівником
було здійснено розробку теоретичних положень роботи. Автор особисто
проводив підготовку основних практичних положень запланованої роботи,
готував самі експерименти. У подальшому координував проведення усіх
серій експериментів та брав активну участь у проведенні самих дослідів.
Автор особисто брав участь у створенні парабіотичних пар, дослідженні
проліферативної активності спленоцитів, проводив виділення Т-лімфоцитів
та макрофагів за описаними методиками, а також аналіз змін у молекулярних
механізмах активації Т-лімфоцитів методом імуноблотинга. Аналіз
11
фагоцитарної активності та субпопуляційного складу клітин селезінки, а
також виділення ДК селезінки проводився разом із співробітниками
лабораторії імунології та патофізіології Державної установи «Інститут
геронтології ім. акад. Д. Ф. Чеботарьова НАМН України». Також автор
особисто проводив статистичний аналіз отриманих результатів, написав усі
розділи дисертації та сформулював висновки з отриманих даних. Спільно з
науковим керівником проведено оформлення наукових праць.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати
дисертаційної роботи доповідались на: науковій конференції молодих вчених
з міжнародною участю «Актуальні питання геронтології і геріатрії» (Київ,
Україна, 2011); 14 конгресі Міжнародної Асоціації Біомедичної Геронтології
(Брайтон, Велика Британія, 2011); міжнародній конференції за участю SENS
Research Foundation (Кембрідж, Велика Британія, 2011); Х міжнародному
симпозіумі «Биологические механизмы старения» (Харків, Україна, 2012);
науково-практичній конференції з міжнародною участю «Прискорене
старіння: механізми, діагностика, профілактика» (Київ, Україна, 2012);
Євросимпозиумі по здоровому старінню ЕНА 2012 (Брюссель, Бельгія, 2012).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць. Із них
6 статей у фахових виданнях, 8 тез у матеріалах конференцій, 1
деклараційний патент.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 147
сторінках машинописного тексту. Вона складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів досліджень, трьох розділів власних
досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження,
висновків та списку використаних джерел. Текст дисертації ілюстровано 6
таблицями та 38 рисунками. Список використаної літератури містить 165
літературних джерела, з них 153 написано латиницею, 12 – кирилицею.
12
РОЗДІЛ 1
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Роль Т-лімфоцитів в імунній системі та їх вікові зміни

Імунна система відіграє надзвичайно важливу роль у забезпеченні та
регуляції нормальної роботи нашого організму, є комплексом органів та
клітин, основна задача яких полягає у підтриманні антигенного гомеостазу
організму та у захисті організму від загроз зовнішнього та внутрішнього
походження – збудників захворювань та онкологічно перероджених клітин.
Окрім того, імунна система відіграє важливу роль у багатьох аспектах
функціонування нашого організму, зокрема у контролі нервової діяльності та
поведінкових реакцій [13], морфогенезі органів [14, 15], кісткової тканини
тощо [16]. Коректна робота імунної системи відіграє надзвичайну роль у
нормальному житті людини.
За останнє століття завдяки успіхам медицини людству вдалося значно
підвищити максимальну й середню тривалість життя, скоротивши смертність
від інфекційних хвороб та нещасних випадків [17]. Різке підвищення
тривалості життя викликало появу іншої проблеми – збільшення долі людей
літнього віку серед населення розвинених країн і, відповідно, підвищення
частоти патологій, пов’язаних з віком [17, 18].
На сьогоднішній момент, згідно даних літературних джерел, смертність
та травматичність від хвороб, асоційованих з віком, займає провідне місце
серед усіх причин смертельних випадків у розвинутих країнах, причому
основна маса випадків подібних захворювань припадає саме на людей
старших вікових груп [19].
Патогенез вікових захворювань включає в себе зміни в обміні речовин
та накопичення продуктів їх обміну, що не можуть бути еліміновані з
організму. Так, зміни у механізмах регулювання обміну вуглеводів
викликають фонове підвищення рівня вуглеводів у крові. Це відіграє важливу
13
роль у процесах не ферментативного глікозилювання білків тканин [20], що,
у свою чергу, сприяє погіршенню нормального функціонування тканин та
розвитку хронічного запалення [21, 22]. Вважається, що негативні зміни у
механізмах обміну та утилізації ліпідів відіграють значну роль у розвитку
серцево-судинних захворювань. Показано, що гіперліпідемічний стан
характерний для атеросклерозу [23]. Патогенез цукрового діабету ІІ типу
включає в себе погіршення чутливості клітин до інсуліну та зниження
захоплення цукру з крові [24]. У розвитку інсулінорезистентності значну
роль відіграє стан хронічного запалення, що також характерний для
представників старших вікових груп [25].
До факторів, що сприяють розвитку остеопорозу, можна віднести не
лише генетичні особливості даного конкретного індивіду [26], а й його спосіб
життя, наявність запальних та аутоімунних процесів, серцево-судинних
захворювань [27, 28]. З віком також підвищується ризик розвитку
аутоімунних патологій [29]. Аутоімунний компонент відмічається при
серцево-судинних, онкологічних та неврологічних захворюваннях [30, 31].
З викладеного вище видно, що роль вікових змін імунної системи та
стану хронічного запалення організму значна. Саме тому розуміння основних
механізмів розвитку вікових змін імунної системи є дуже важливою задачею
для дослідників. Для кращого розуміння проблеми важливо навести основні
відомості про імунну систему та механізми її старіння.
Органи імунної системи поділяються на первинні та вторинні. У
первинних органах відбувається утворення клітин імунної системи. До таких
органів відносять тимус та червоний кістковий мозок. Вторинні органи
імунної системи представлені селезінкою, лімфовузлами, а також
локальними утворами імунної системи, де відбувається базування дозрілих
імунокомпетентних клітин.
За механізмами своєї роботи та виконуваними функціями імунну
систему можна розділити на такі основні функціональні ланки: набутий та
вроджений імунітет.
14
Клітини системи вродженого імунітету виконують основні захисні
реакції організму, своєчасно презентують антигени клітинам адаптивної
ланки імунної системи та елімінують патогени, що потрапили в організм.
Сюди відносять фагоцитуючі клітини (МФ і моноцити, ДК, клітини
Лангерганса), гранулоцити [32], НК-клітини (натуральні кілерні клітини) та
НКТ-клітини (натуральні кілерні Т-клітини), що виконують багато реакцій
імунної системи; до системи вродженого імунітету відносяться також
кератиноцити, які відповідають за захисні реакції шкіри [33].
Обмеженість системи вродженого імунітету полягає у неможливості
більш ефективно реагувати на повторну появу того ж самого антигену.
Можливість «запам’ятати» характерний антигенний профіль певного
патогену та швидко реагувати на його повторну появу в організмі наявна у
клітин адаптивної ланки імунної системи.
Високоспецифічна відповідь до патогенів відбувається за участю клітин
адаптивної ланки імунної системи, які здатні проводити специфічне
розпізнання антигенів та боротьбу із зовнішьо- або внутрішньоклітинними
загрозами, а також формувати імунологічну пам’ять [32]. Адаптивна ланка
імунної системи представлена лімфоцитами, що також розділяються на
В-лімфоцити та Т-лімфоцити [34]. В-лімфоцити відповідають за продукцію
антитіл, що зв’язують та нейтралізують антигени – за гуморальну ланку
імунітету. Т-лімфоцити виконують різноманітні функції, зокрема клітинні
реакції та регуляцію розвитку імунної відповіді.
Т-лімфоцити – досить неоднорідна популяція клітин, що у ссавців
походить зі специфічного органу – тимуса, вилочкової залози. Процес
тимопоезу досить складний і його описано у численних роботах [35]. Ранні
тимічні попередники народжуються у червоному кістковому мозку, мігрують
по крові у тимус. У випадку успішного дозрівання у тимусі утворюється
наївна Т-клітина, що має зрілий та готовий до розпізнання певного антигену
унікальний Т-клітинний рецептор (далі ТКР). Кожний такий білок є
гетеродимером, складається з α та β або γ та δ субодиниць [36]. Існує
15
2 популяції Т-лімфоцитів – αβ та γδ Т-лімфоцити, але найбільш
розповсюдженою та найбільш дослідженою є популяція αβ Т-клітин, і у
подальшому розглядатися буде саме ця популяція.
Кожна субодиниця ТКР складається з так званих
імуноглобуліноподібних доменів, один з яких є константним (С домен), а
другий – варіабельним доменом (V домен) [37]. Розпізнавання унікальних
антигенів відбувається за допомогою сайту зв’язування антигену (Antigen
Binding Site), сформованого двома V доменами обох субодиниць ТКР. Сайт
зв’язування антигену для більшості ТКР є унікальним завдяки унікальності
окремих ділянок молекули рецептора. Фактично, більшість Т-лімфоцитів
мають Т-клітинні рецептори з унікальною специфічністю (окрім тих, що
сформували окремі популяції клітин-клонів) [38]. Унікальність у структурі
сайту зв’язування антигену підтримується за рахунок специфічних
механізмів спрямованого мутагенезу у варіабельних сегментах генів
Т-клітинного рецептора, що відбувається при дозріванні лімфоцитів, а саме:
рекомбінації окремих ділянок генів ТКР, негомологічного приєднання кінців
ДНК під час рекомбінації, зсувів рамки зчитування та інших [39].
Після свого дозрівання в тимусі у кровообіг потрапляє наївна Т-клітина
(що ще не зустрічалася зі специфічним антигеном), і проводить пошук сайту
базування у вторинних лімфоїдних органах, у яких підтримується стала
популяція Т-лімфоцитів. У нормі відбувається постійний пошук антигену у
комплексі з АПК. Також можливий вихід лімфоцитів та циркуляція у
периферичному кровообігу [32]. У випадку знаходження специфічного
антигену відбувається активація поділів відповідного Т-лімфоцита з
формуванням пулу клонів клітини з даним типом рецептора.
αβ Т-лімфоцити поділяються на Т-хелперів (CD4+-Т-клітини) та
Т-кілерів (CD8+-Т-клітини). Перші відповідають за регулювання розвитку
імунної відповіді та диференціювання інших клітин, що беруть участь в
імунній відповіді, регуляції роботи В-лімфоцитів та дозріванні антитіл. Другі
– за клітинні реакції імунітету, противірусний та протипухлинний імунітет.
16
Особливо важливу роль в роботі імунної системи відіграють Т-хелпери.
Їх роль полягає у регулюванні дозрівання В-клітин у потрібному напрямку і
загальна регуляція напрямку та інтенсивності імунної відповіді, залучення до
неї якомога більше ефекторних клітин, у тому числі різних популяцій
лейкоцитів та синтез цитокінів, сигнальних білків, необхідних для активації
ефекторних функцій МФ, моноцитів, НК-клітин, зокрема інтерферону-γ, що
активує кілерну активність у всіх цих клітин; ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-10 та ІЛ-13, що
запускають процеси синтезу і дозрівання антитіл В-клітинами; ІЛ-10 та
трансформуючого ростового фактору β, що пригнічують активність клітин
імунної системи і сприяють розвитку імунної толерантності; ІЛ-17, що
викликає розвиток більш активної запальної реакції тощо [40].
Існує декілька популяцій Т-хелперів, кожна з яких експресує свій певний
унікальний набір регуляторних білків – цитокінів. Так, нині достатньо добре
описано вже 5 функціональних популяцій Т-хелперів: Т-хелпери 1 типу (що
регулюють розвиток імунної реакції за клітинним типом [41]), Т-хелпери 2
типу (відповідають за розвиток гуморальної імунної реакції [41]), Т-хелпери
17 типу (що рекрутують клітини імунної системи у сайт запалення та
активують механізми протимікробного захисту [42]), Т-регуляторні клітини
(основна задача яких полягає у інгібуванні надмірної імунної відповіді та
підтриманні толерантності до власних антигенів [43]). Врахування
особливостей функціонування кожної популяції Т-лімфоцитів має
надзвичайне клінічне значення.
Диференціація Т-хелперів знаходиться під контролем сигналів, наявних
навколо даної Т-клітини, а саме: цитокінів, інтерлейкінів та костимуляції з
боку клітин мікрооточення лімфоїдних органів, де відбувається
диференціація Т-хелперів.
Т-кілери – основні клітини, що знищують патологічні або інфіковані
внутрішніми паразитами клітини власного організму. Механізм знищення
цільової клітини полягає у атаці клітини спеціальними молекулами, що
ушкоджують її клітинну мембрану (перфорини) та запускають процес
17
апоптозу (гранзими). Це відбувається за допомогою розпізнавання на
поверхні клітин цільових антигенів у комплексі з білками гістосумісності
І типу і вважається канонічним механізмом цитотоксичної атаки клітини-
мішені [32].
В процесі активації Т-лімфоцити активно діляться та значно підвищують
власну кількість для того, щоб ефективно елімінувати наявний антиген. Після
закінчення фази активного запалення відбувається скорочення пулу клітин
імунної системи, у тому числі й Т-лімфоцитів [44]. Відомо, що протягом
проліферації Т-клітин при імунній відповіді відбувається утворення
ефекторних Т-лімфоцитів та Т-лімфоцитів з фенотипом клітин імунологічної
пам’яті, що мають різні функціональні властивості та різний час існування
[45].
У подальшому саме пул клітин імунологічної пам’яті й активується
швидше та активніше елімінує антигени, що повторно потрапили в організм.
За функціональними параметрами та поверхневими маркерами відрізняють
Т-клітини центральної імунологічної пам’яті та ефекторні Т-клітини
імунологічної пам’яті [45].
Як вже вказувалося вище, більшість вікових патологій пов’язана з
дисфункцією імунної системи та активацією хронічних інфекцій.
Розглядається концепція старіння «INFLAMMAGING» (Inflammation +
Aging), що характеризує старіння як процес постійного системного,
хронічного та малоактивного запалення [46]. Було продемонстровано, що
тварини-довгожителі, а також і люди-довгожителі, підтримують відносно
високий рівень наївних Т-клітин в організмі [47].
Достовірним та з давніх часів відомим фактом є вікова інволюція
тимуса. При цьому відбувається його зменшення у масі та заміщення
функціональної тканини жировою. Вже з народження відбувається початок
фактичної атрофії тимуса, оскільки навіть з урахуванням збільшення його
абсолютної маси, відносна маса лімфопоетичної епітеліальної тканини по
відношенню до нефункціональної тканини постійно знижується [48]. У
18
людей віком старше 70 років епітеліальна тканина тимуса складає лише 10%
від початкового об’єму [49].
При старінні тимуса відбувається втрата тимічного епітелію, і як
наслідок, розвиваються дефекти у дозріванні попередників Т-лімфоцитів.
Стан системного хронічного запалення, що характеризується збільшенням
синтезу фактору некрозу пухлин α (далі TNFα, Tumor Necrosis Factor α), ІЛ-6,
викликає виснаження проліферативних можливостей та посилення
чутливості клітин тимуса до апоптозу [50]. Тимус є мішенню для цілого ряду
патогенів, котрі використовують його для своєї персистенції та редагування
репертуару наївних Т-клітин [51].
Приблизний час повної зупинки тимопоезу становить по прогнозам
приблизно 105-120 років. Існує погляд, що атрофія тимуса з віком не є
негативним явищем [52]. Наївні Т-клітини мають багато рис, що притаманні
стовбуровим клітинам, зокрема низька проліферативна активність у спокої та
тривалий строк життя клонів.
Зі старінням знижується проліферативний потенціал В-клітин [53],
відбувається зниження продукції антитіл і натомість посилення утворення
аутоантитіл, рівень соматичних гіпермутацій генів імуноглобулінів при
імунній відповіді знижується. При цьому роль дефектної костимуляції
В-клітин з боку Т-клітин вважається чи не основною причиною порушення
функціонування В-лімфоцитів [54].
У вторинних лімфоїдних органах (далі ВЛО) відбувається зменшення
кількості лімфоїдних фолікулів та підвищення кількості елементів сполучної
тканини. У селезінці відмічається порушення її нормальної морфології з
порушенням структури маргінальної зони [54]. Самим головним є зміна у
популяціях Т-клітин у ВЛО. Дещо знижується кількість наївних CD4+
Т-клітин при збільшенні CD4+ Т-клітин пам’яті. При цьому відмічається
дефективність роботи наївних Т-клітин від старих особин [55]. При старінні
має місце значне збільшення долі CD8+ Т-клітин з фенотипом ефекторних
клітин пам’яті, що мають обмежені функціональні властивості [56, 57].
19
З віком відбуваються значні зміни у компартменті Т-клітин: а саме
експансія клітин пам’яті та одночасне скорочення кількості наївних Т-клітин,
накопичення CD28 Т-клітин [58], змінюється співвідношення CD4+/CD8+-
клітин (імунорегуляторний індекс) у бік збільшення кількості кілерних
клітин. Накопичуються нефункціональні клітини, що характеризуються
зниженою здатністю до апоптозу і проліферації [59] та ознаками
реплікативного стресу. При їх активації відбувається менш активна
проліферація та знижена продукція цитокінів. Наслідки збільшення кількості
CD28- T-клітин є негативними. Як правило, такі Т-клітини представляють
лише окремі популяції клонів певного ТКР [58] з обмеженими
функціональними властивостями і при цьому конкурують з іншими клонами
Т-клітин за простір у ВЛО. Так, in vivo було показано, що кількість цих
клітин у периферійній крові негативно корелювала з успішністю вакцинації
проти вірусу грипу у людей старшої вікової групи [60].
З викладеного матеріалу видно, що у високоефективному захисті
організму від патогенів Т-лімфоцити відіграють значну роль. З віком імунна
система втрачає свої захисні властивості і найбільш значущими є зміни у
компартменті Т-лімфоцитів, що сприяє розвитку вікових патологій. Вікові
зміни відбуваються як у первинних органах імунної системи, зокрема у
тимусі, так і у периферичних органах імунної системи. Це виражається
порушенням продукції наївних Т-клітин і накопиченням Т-лімфоцитів з
порушеними функціональними властивостями у ВЛО. Перспективними
підходами для корекції вікових змін імунної системи є корекція стану
первинних органів імунної системи або ВЛО.
Для подальшого викладення матеріалу бажаним є ознайомлення з
останніми даними, що описують лімфоїдну нішу периферичних органів,
оскільки вона має значний вплив на стан периферичних Т-лімфоцитів.
Особливу роль серед них відіграє селезінка, оскільки це є найбільший
лімфоїдний орган в організмі, необхідний для фільтрації крові від патогенів.
20
1.2. Мікрооточення Т-лімфоцитів у вторинних лімфоїдних органах
Регуляція Т-лімфоцитів під час імунної відповіді здатна спрямовувати
напрямок імунної реакції. Подібні регуляторні механізми вимагають
правильну структурну організацію лімфоїдних органів. Як відомо, основним
місцем базування зрілих Т-лімфоцитів є вторинні, або периферичні лімфоїдні
органи. ВЛО мають складну будову та створюють унікальні анатомічні сайти
[61, 62], де чи не найважливішу роль у регулюванні роботи Т-лімфоцитів
виконує їх мікрооточення, лімфоїдна ніша.
До периферичних лімфоїдних органів відносять селезінку, лімфовузли,
Пейєрові бляшки та локальні лімфоїдні утворення слизових оболонок, а
також шкіру. Селезінка є найбільшим лімфоїдним органом, слугує фільтром
крові, очищаючи її від антигенів та застарілих клітин, виконує функції депо
еритроцитів та інших клітин крові [63], у ряду видів цей орган здатний
виступати сайтом еритропоезу та лімфопоезу [64], що вказує на
багатофункціональність та важливість цього органу для нормальної роботи
імунної системи.
У більшості видів, у тому числі у ссавців, селезінка має видовжену
сплощену форму, розташовується у лівому підребер’ї і ззовні оточена
щільною сполучнотканинною капсулою. Сама ж селезінка умовно ділиться
на 2 структурних компартмента: білу та червону пульпу [65].
Кровопостачання органу відбувається через селезінкову артерію та вену.
Після входження у селезінку артерія розгалужується на окремі артеріоли, що
розпадаються на синуси, судинні утвори з нещільною стінкою, що має
численні перфорації, а клітини ендотелію нещільно прилягають одне до
одного. Саме тут відбувається фільтрація крові від застарілих форменних
елементів.
Червона пульпа являє собою пухку тканину, що займає більшу частину
органу. Утворена червона пульпа численними синусами між тяжів сполучної
тканини, так званими тяжами Більрота. У цьому компартменті відбувається
очистка організму від старих еритроцитів за допомогою спеціального
21
фільтруючого апарату, утвореного макрофагами та клітинами, що
вистилають синуси. Завдяки специфічній структурі цього фільтру його
пройти можуть лише такі еритроцити, які здатні змінювати свою форму,
тобто еритроцити без дефектів. Старі та ушкоджені клітини затримуються і у
подальшому поглинаються макрофагами. Окрім цього, червона пульпа є
важливим сайтом дозрівання В-лімфоцитів та утворення антитіл
плазматичними клітинами [61].
Біла пульпа оточує артеріоли, утворюючи периартеріолярну лімфоїдну
муфту, в якій розташовані Т-клітинна зона та В-клітинні фолікули. Межа між
білою та червоною пульпою називається маргінальною зоною; там же
проходить маргінальний синус. Саме у цій зоні відбувається фільтрація крові
від антигенів та початок фільтрації нефункціональних еритроцитів.
Будова білої пульпи селезінки принципово дуже схожа на будову
лімфовузлів. Тканина лімфовузлу складається з кортексу, що збагачений на
макрофаги та В-лімфоцити, паракортексу, або глибинного кортексу, що є
Т-клітинною зоною лімфатичних вузлів, а також медули, або серцевини
лімфовузла, де розташовуються макрофаги та плазматичні клітини. Там же
відбувається і утворення антитіл плазматичними клітинами [66]. Лімфатичні
вузли розділені на окремі дольки за допомогою сполучнотканинних
перегородок, септ. На своєму шляху лімфа перетинає субкапсулярний синус
та товщу лімфовузла. Аналогічні структури наявні й у білій пульпі селезінки.
Функції, аналогічні субкапсулярному синусу лімфовузлів, у селезінці
виконує маргінальна зона, що відділяє білу та червону пульпу [66].
В-клітинний компартмент селезінки представлений лімфоїдними фолікулами
у білій пульпі, і відповідає за функції кортексу лімфоїдних вузлів, де також
розташовуються В-лімфоцити. Т-клітинний компартмент селезінки по своїй
структурі значною мірою схожий на паракортекс лімфатичних вузлів [61].
Він утворений фібрилами білків позаклітинного матриксу, за допомогою
яких створюються унікальні структури, своєрідні трубопроводи, що
використовуються для транспорту сигнальних молекул [67], а також утворює
22
структурну основу Т-клітинної зони селезінки. Елементи позаклітинного
матриксу Т-клітинної зони оточують специфічні фібробластні ретикулярні
клітини та інші типи клітин, що складають нішу Т-лімфоцитів: дендритні
клітини і макрофаги [68].
Останнім часом значний науковий та практичний інтерес представляють
професійні АПК: макрофаги та дендритні клітини.
МФ відносяться до системи вродженого імунітету, а саме до системи
мононуклеарних фагоцитів. Вперше були описані ще 1884 року Іллею
Мєчніковим [69], що досліджував явище фагоцитозу. З того часу знання про
функції МФ були розширені, кількість виділених типів цих клітин за
функціональними та анатомічними ознаками значно збільшилась,
охоплюючи як реалізацію захисту організму, так і репарацію ушкоджених
тканин.
МФ є клітинами, що утворюються при диференціації кістково-мозкових
стовбурових клітин або моноцитів периферичних органів та тканин [70].
Головною функцією МФ є участь у захисних реакціях організму як
фагоцитів, що атакують, захоплюють і перетравлюють чужорідні частинки та
антигени, а також при певних умовах і як антигенпрезентуючих клітин [71].
Поверхневі маркери МФ поки що досконально не описані. МФ
характеризуються експресією загального маркера мієлоїдних клітин СD11b
(інтегрин). Останнім часом специфічним пан-макрофагальним маркером
виділено поки що досконально не описаний білок F4/80 [72]. Гомолог білка
F4/80 в людини не описаний.
МФ виявляються у наступних тканинах: сполучній тканині (гістіоцити),
легенях (альвеолярні макрофаги), жировій тканині, мозку (мікроглія), печінці
(клітини Купфера), кістках (остеокласти), селезінці та лімфовузлах,
очеревині, крові (моноцити та периферичні мононуклеарні клітини крові)
[71].
За типом диференціювання виділяють наступні типи МФ [71]:
прозапальні макрофаги, або макрофаги 1 типу (М1), що є продуцентами
23
прозапальних цитокінів (ІЛ-12, IFN I типу, TNFα, ІЛ-1, ІЛ-6 та інших) та
активних форм кисню у випадку їх стимуляції; репаративні макрофаги, або
макрофаги 2 типу (М2), що беруть участь у репарації тканин, утворюють
матрикс та сприяють проростанню судин; регуляторні макрофаги, або RMф,
що інгібують розвиток запалення.
У певних анатомічних сайтах МФ мають свої особливості. У різних
зонах білої пульпи розташовуються популяції МФ з неоднаковими
функціями. Виділяють наступні типи МФ селезінки [71]: макрофаги червоної
пульпи, макрофаги білої пульпи, макрофаги маргінальної зони та
металофільні макрофаги. Кожний з цих типів клітин виконує свої окремі
функції. МФ червоної пульпи є високоактивними фагоцитуючими клітинами,
МФ білої пульпи та маргінальної зони беруть участь у презентації антигенів
та очистці тканини від загиблих клітин.
Але професійними АПК вважаються дендритні клітини.
Даний клас клітин вперше вдалося виділити та описати 1973 року [73].
У подальшому було показано, що ці клітини мають найбільший потенціал у
порівнянні з іншими клітинами-елементами ВЛО в якості стимуляції
проліферації та активації Т-клітин. ДК – це особливий тип професійних АПК.
Основна їх функція – виявлення та презентація антигенів, що потрапили у
організм. ДК – це свого роду вартові на шляху патогенів до нашого
організму. На стадії незрілої клітини мають високий рівень ендоцитозу
антигенів та здатності відповідати на прозапальні цитокіни, але мають
низький рівень експонування антиген–рецептор головного комплексу
гістосумісності (Major Histocompatibility Complex, далі МНС) [74].
ДК належать до мієлоїдних клітин імунної системи. Основний сайт їх
утворення – кістковий мозок, де вони також диференціюються з
гемопоетичних стовбурових клітин. Разом з МФ вони мають спільне
походження, але у процесі диференціації попередники обох типів клітин
втрачають схожі риси та відгалужуються від спільного попередника [74].
24
Попередників ДК вдається виділити з кісткового мозку, тимуса, селезінки,
лімфовузлів та кровоносного русла (моноцити) [75, 76].
У нормі ДК мають толерогенні функції [77]. При появі ознак вторгнення
патогенів та ураження тканин, ДК разом з іншими клітинами імунної системи
мігрують до сайту запалення за градієнтом хемокінів, де й відбувається їх
функціональне дозрівання. При цьому окрім змін у поверхневому фенотипі,
відбувається також втрата ендоцитозної активності та збільшення
експонування комплексів антиген-МНС, одночасно з підвищенням експресії
костимуляторних молекул, зокрема CD80 та CD86, підвищується тропність
до тканини ВЛО [78].
У мишей виділяють численні типи ДК [79]. Основні поверхневі маркери
є CD11c та МНС ІІ. Інші маркери, що дозволяють виділяти окремі підтипи:
CD4, CD8αα (маркер лімфоїдних ДК), CD11b (маркер мієлоїдних клітин),
CD205 (маркер інтердигітатних клітин). В селезінці миші виділяють такі
популяції резидентних ДК: CD4-CD8+CD205+CD11b- – це так звані
резидентні лімфоїдні ДК (20% всіх ДК селезінки), CD4+CD8-CD205-CD11b+ –
це так звані резидентні мієлоїдні ДК (40% всіх ДК селезінки, доволі
гетерогенна популяція), а також CD4-CD8-CD205-CD11b+ мієлоїдні ДК (сюди
відносять до 15% ДК селезінки) та плазмацитоїдні ДК (CD11b-
CD11c+CD205+).
Різні типи ДК виконують різні функції [80]. Так, мієлоїдні ДК
стимулюють розвиток Тх2 відповіді. Лімфоїдні ДК розташовуються в
основному у Т-клітинній зоні селезінки та виконують толерогенні функції у
нормі, а у випадку початку розвитку запалення вони індукують Тх1
відповідь. Плазмоцитоїдні ДК миші як правило є постійно мігруючими
клітинами з відносно слабкою здатністю стимулювати Т-клітинну
проліферацію у нормі, та значним підвищенням її при активації разом з
різким підвищенням секреції інтерферонів І типу, що говорить про їх значну
участь у противірусному імунітеті.
25
З урахуванням вищенаведених даних стає зрозумілим, що ніша Т-клітин
у периферичних лімфоїдних органах – це дуже складна та важлива структура
організму, від коректної роботи якої залежить правильна робота всієї імунної
системи. Відомо, що при старінні відбувається дисфункція імунної системи.
Але робіт, ще описують механізми розвитку вікової дисфункції імунної
системи, для повного розуміння цих процесів недостатньо.
Велика доля серед клітин, що складають лімфоїдну нішу, припадає на
клітини системи вродженого імунітету, зокрема ДК і МФ. У особин старших
вікових груп (як в людей, так і в тварин) спостерігається дерегуляція роботи
системи вродженого імунітету і самим характерним наслідком цієї
дерегуляції є сильно виражений прозапальний фенотип, підвищення синтезу
прозапальних цитокінів, що, як правило, позитивно асоційовано зі
смертністю у старших вікових групах [80]. Наприклад, у статті [81]
вказується на наявність позитивної та статистично значимої асоціації між
кількістю прозапальних цитокінів (TNFα та ІЛ-1) і смертністю у період
спостереження (13 місяців) у пацієнтів віком приблизно 89 років.
Одними з основних ефекторних клітин ланки вродженого імунітету є
МФ. Так, у той час як фагоцитарна активність даних клітин з віком майже не
змінюється, спостерігається зниження бактерицидної активності, наявне
певне зменшення сигнал-залежної експресії генів прозапальних цитокінів з
підвищенням рівня базальної експресії ІЛ-1, TNFα, ефективність
внутрішньоклітинного перетравлення патогенів різко знижується [82]. З
віком змінюється профіль цитокінів та ефекторних молекул, секретованих
МФ [83]. Активовані МФ від старих особин мають знижене експонування
костимуляторних білків на своїй поверхні, МНС ІІ [82], порівняно з МФ від
молодих особин.
Завдяки прозапальному фенотипу старого організму та порушенню
ефекторних функцій МФ відіграють активну участь у патогенезі багатьох
вікових захворювань. Дисфункція МФ відіграє надзвичайну роль у патогенезі
атеросклерозу, серцево-судинних патологій, нейродегенеративних хвороб
26
[84, 85]. Надзвичайна роль МФ у патогенезі онкологічних захворювань, де їм
належить подвійна роль. Активовані МФ можуть активно вбивати пухлинні
клітини та гальмувати розвиток пухлини. Проте часто наявна протилежна
ситуація, коли новоутворення створює специфічне мікрооточення, що
гальмує активацію МФ та стимулює диференціацію клітин за
протизапальним або репаративним фенотипом [86].
На даний момент робіт, що описують вплив старіння на ДК та, що
важливіше, механізми цих змін недостатньо, при всій необхідності
проведення таких робіт. Показано, що АПК шкіри та слизових оболонок при
старінні зменшують свою кількість та змінюються морфологічно, у них
відбуваються дегенеративні зміни [87, 31]. Також показано зниження
ефективності стимуляції імунної відповіді ДК від старих особин [88, 89].
Використання ДК від молодих тварин у старому організмі (й у старому
мікрооточенні, відповідно) у системі in vivo не давало значного покращення
виживаємості мишей [90].
Загальна кількість ДК в організмі з віком, як правило, не знижується у
порівнянні з молодими особинами, а зміни у субпопуляційному складі ДК
ВЛО не відмічені у старих людей без виражених вікових патологій [91]. На
противагу цьому, в людей старших вікових груп з певними віковими
патологіями, навпаки, спостерігаються негативні зміни у популяціях ДК [7].
З віком знижується кількість експонованих на поверхні ДК молекул МНС ІІ
та молекул адгезії, що знижує ефективність стимуляції лімфоцитів та
підвищує час ефективної стимуляції клітин [7], а також знижуються
міграційні властивості ДК шкіри [92].
Взаємодії між молекулами адгезії необхідні для формування контактів
між АПК і Т-клітиною та для подальшої стимуляції їх і диференціації у
ефекторні клітини. Взаємодії між інтегринами та їх лігандами направляють у
клітину проліферативний та костимуляторний сигнал, що значно впливає на
функціональний стан клітин, котрі його сприймають. У роботах вказується
на незначні зміни у експресії більшості молекул адгезії на ДК [93], у тому
27
числі й DC-SIGN [94]. Відмічено, що час, необхідний для продуктивної
взаємодії Т-клітини з ДК, підвищується [95]. Але експресія основних
костимуляторних молекул (CD80, CD40, CD54) та молекул МНС І та ІІ на ДК
з віком в основному не змінювалася [90]. Дані про стимуляцію проліферації
Т-клітин ДК від старих тварин дещо суперечливі і показують, що вони здатні
стимулювати проліферацію Т-клітин навіть не гірше від ДК молодих тварин
[90].
У крові з віком відмічаються значні зміни у субпопуляційному складі
ДК, зокрема відбувається зниження кількості та функціональної активності
плазмоцитоїдних ДК [96]. Рядом робіт показано відсутність змін у стані ДК,
отриманих з моноцитів периферичної крові донорів старшого віку
(експозиція МНС ІІ, молекул адгезії) [97]. Дослідження іn vivo показують
зниження ефективності роботи ланки противірусного та протипухлинного
захисту, за яку відповідають ДК [98]. Експресія таких костимуляторинх
молекул, як CD80/CD86, CD40, з віком не змінюються [97]. Про зміну у
експресії інгібіторних молекул на ДК при старінні достовірних даних поки
що немає.
Таким чином, ефективність функціонування ДК та МФ з віком
змінюється, що може мати значний вплив на вікові зміни Т-клітинної ланки
імунної системи. Саме зміни у мієлоїдних клітинах ніші Т-клітин у
вторинних лімфоїдних органах можуть слугувати тригером наступних змін
імунної системи. Це і стало однією з задач нашої роботи – дослідити вплив
змін у резидентних ДК та МФ селезінки, що виникають в процесі
парабіотичного співіснування тварин, на функціонування Т-клітин.
1.3. Молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів

Т-клітини є важливим контрольним пунктом у розвитку імунної
відповіді, оскільки саме вони в кінцевому результаті дають команду до
початку адаптивної відповіді імунної системи. Механізми їх активації
28
складні, тому перш ніж переходити до експериментальної частини дисертації
варто коротко охарактеризувати механізми їх активації.
Головним етапом початку відповіді Т-клітин є активація їх антиген-
специфічного Т-клітинного рецептора. Антиген Т-клітинам може бути
презентований АПК, що описано вище. Але лише одного цього сигналу
недостатньо для повноцінної активації та проліферації Т-клітин. Необхідною
є додаткова стимуляція їх за рахунок інших сигналів, що виробляються АПК.
У ВЛО Т-клітини перебувають у тісних контактах з клітинами їх ніші,
зокрема з АПК. У нормі Т-лімфоцити дуже активно мігрують в межах ВЛО у
пошуках нових антигенів, що презентуються АПК. За секунду Т-клітина
здатна контактувати з великою кількістю молекул МНС [99].
При зв’язуванні ТКР з білками МНС І чи ІІ (в залежності від типу
Т-клітин) може відбутися впізнання антигенного пептиду, презентованого у
комплексі з молекулою МНС. При цьому відбувається формування
імунологічного синапсу [100], розпізнавання типу молекули МНС основними
костимуляторними молекулами Т-лімфоцитів, CD4 та CD8, що зразу ж
посилають слабкий костимуляторний сигнал всередину клітини [101]. Сам
ТКР не передає активаційний сигнал, а робить це за допомогою
трансмембранного білка CD3.
Цей білок активується за рахунок фосфорилювання залишків тирозину у
зета-ланцюгах білка CD3 у спеціальних активаторних мотивах, так званих
Immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ІТАМ), тирозинкіназами,
зокрема Lck, Nck та іншими, що пов’язані з костимуляторними молекулами
Т-клітин CD4 та CD8. Після цього до фосфорильованих мотивів
приєднується кіназа ZAP70, яка далі активується і фосфорилює адаптерні
білки LAT та SLP-76. LAT та SLP76 при активації ТКР зв’язують велику
кількість білків, зокрема фосфоліпазу С γ1 (PLC-γ1), p85 PI3K, адаптери
GRB2, Gads, формуючи великий мультимолекулярний комплекс [101].
Активація Т-клітин багато залежить від змін у цитоскелеті [102]. У сайті
контакту Т-лімфоцитів з АПК відбувається полімеризація актину та
29
формується мережа мікротрубочок, що також бере участь в утворенні
імунологічного синапсу. Відомо, що взаємодії молекул адгезії між
Т-лімфоцитом та клітиною-партнером сприяють виживанню Т-лімфоцитів
(інтегрини та молекули адгезії здатні давати антиапоптозний сигнал) [103].
Іншою важливою функцією перебудови цитоскелету при активації
Т-лімфоцитів є організація як міжклітинної взаємодії, так і
внтурішньоклітинного простору Т-лімфоцита. У подальшому відбувається
активація численних сигнальних механізмів усередині клітини, зокрема:
активація Са2+-залежного каскаду, активація каскаду Akt та NFκB, каскадів
кіназ родини мітогенактивованих протеїнкіназ (МАРК), протеїнкінази С θ
(PKC-θ) [101, 104].
Активована протеїнкіназа С активує PLC-γ1, що гідролізує фосфатидил-
інозитол до утворення діацилгліцеролу, ліпіду, що залишається з
внутрішнього боку мембрани, та інозитол-3-фосфат, що дифундує у
цитоплазму і стимулює вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних сховищ
[105]. Діацилгліцерол, у свою чергу, не дифундує у цитоплазму, а
залишається у мембрані та слугує сайтом для посадки білків родини PKC
(зокрема РКС-θ) [106].
Активація протеїнкінази В (Akt) відбувається за рахунок її
фосфорилювання іншою кіназою, так званою PDK-1, та взаємодії з
фосфорильованим за рахунок РІ3К мембранними молекулами фосфатидил-
інозитолом. Кіназа Akt фосфорилює велику кількість субстратів, посилюючи
обмін речовин, активуючи антиапоптозні механізми та синтез інгібіторів
апоптозу, стимулюючи проліферацію тощо [107].
Са2+-залежний каскад активується завдяки збільшенню у клітині йонів
кальцію, що також активують численні сигнальні механізми. Інозитол-3-
фосфат, котрий утворюється при гідролізі фосфатидил-інозитолу, зв’язується
з відповідними рецепторами на поверхні гладенького ендоплазматичного
ретикулуму та вивільнює акумульовані йони кальцію [108]. Кальцій є
30
кофактором кальмодуліну, який регулює роботу численних білків, зокрема
ядерного фактору активованих Т-клітин (NFAT) [109].
Все це дає потужний антиапоптозний та проліферативний сигнал.
Транскрипційні фактори, які підлягають активуванню при активації каскаду
ТКР: NFkB, AP-1, NFAT [101].
Ключовою подією активації Т-лімфоцита є активація ядерного
транскрипційного фактору NFκB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B cells). Родина білків NFκB складається з 5 членів: NFκB p65
(RelA), c-Rel, RelB, NFκB1 (p105/p50), NFκB2 (p100/p52). Характерною
структурною особливістю є Rel-домен [110]. Регулювати транскрипційну
активність ці білки можуть у димерній формі. В принципі можливі будь-які
комбінації мономерів, але транскрипційною активністю володіють лише
певні з них. Одним з найважливіших білків цієї родини, що активують
транскрипцію, є NFκB p65, або RelA, що зустрічається практично у всіх
проліферуючих клітинах [111].
Активація каскаду NFκB відбувається за допомогою димеризації білків
цієї родини та зв’язування ДНК для регулювання транскрипції цільових
генів. Для цього кінази родини IKK фосфорилюють білки родини інгібіторів
NFκB (далі IκB), знімаючи інгібіторний вплив даних білків. Фосфорильовані
білки родини IκB підлягають подальшій протеосомній деградації [110].
Основні представники родини IκB включають в себе білки IκBα, IκBβ, IκBε.
IκBα та IκBβ, які відіграють ключову роль у регуляції стану каскаду NFκB
[112]. При деградації інгібіторів фактори NFκB вивільнюються, мігрують у
ядро та утворюють димери, що здатні регулювати транскрипцію цільових
генів [110], як описано вище. Активаторами кіназ IKK є достатньо великий
спектр білків, серед них протеїнкінази В та С.
Надлишок білків ІκB, або нестача самих транскрипційних факторів
NFκB, або порушена робота цих механізмів здатні негативно впливати на
функціонування Т-лімфоцитів [113, 114].
31
Відомо, що ряд вірусів здатні використовувати у своїх цілях порушення
у функціонуванні каскаду NFκB [115].
Т-лімфоцити людини, інкубовані з культуральним супернатантом
ракових клітин або сироваткою людини, що має клінічно доведену
неоплазму, мають набагато менший рівень мітоген-індукованої проліферації,
у порівнянні з Т-лімфоцитами, що не отримували такого впливу [116].
Недостатня та аберантна експресія самих факторів родини NFκB відіграє
важливу роль в патогенезі ряду захворювань, зокрема саркоїдозу та
імунодефіцитних станів [117, 118].
Стимуляція ТКР лімфоцита без правильної додаткової костимуляції
призводить не до проліферації Т-лімфоцита, а як правило до апоптозу чи
анергії даного лімфоцита, оскільки такий активаторний сигнал не забезпечує
повноцінні активацію та захист від апоптозу [119]. Для повноцінної активації
та проліферації Т-клітина вимагає костимуляції з боку АПК. Нині
загальноприйнятою концепцією є наявність наступних активаторних сигналів
Т-лімфоцита:
1. Стимуляція ТКР.
2. Ко-стимуляція за допомогою поверхневих молекул.
3. Ко-стимуляція за допомогою розчинних факторів (цитокінів,
інтерлейкінів).
Найдослідженішими серед численних костимуляторних молекул, що

впливають на роботу Т-клітин, є пара CD80/CD86-CD28 [120]. Активація цих
рецепторів дає потужний стимул каскаду РІЗК-Akt. Показано, що стимуляція
лише ТКР викликає в Т-клітин апоптоз та анергію, а стимуляція лише CD28
дає слабкий антиапоптичний стимул та не здатна викликати проліферацію
Т-клітини [121]. При комбінованій дії цих сигнальних механізмів на
Т-лімфоцит останній отримує потужний стимул до проліферації [121]. Така
побудова сигнальних механізмів клітин має велике практичне значення для
32
організму і порушення у такій регуляції може мати великі клінічні наслідки.
Неадекватне гальмування каскаду Akt може призвести до розвитку неоплазії
[121, 122, 123] та аутоімунних реакцій [124, 125].
Існують також й інгібіторні молекули, що, навпаки, пригнічують занадто
високу активацію Т-лімфоцитів. До таких молекул відносять зокрема пару
СВ80/86-CTLA4, де рецептором важливих костимуляторів активації виступає
вже молекула, що має значний інгібіторний вплив на активацію Т-лімфоцитів
[126]. Більш докладно про поверхневі костимуляторні молекули можна
прочитати у літературних джерелах, оскільки їх характеризація не входила до
задач дослідження [127]. Адекватна експозиція костимуляторних молекул
Т-клітинам сприяє правильній та адекватній роботі імунної системи.
Вікові зміни включають значну проліферацію ефекторних Т-лімфоцитів
з фенотипом клітин імунологічної пам’яті, особливо CD8-клітин
імунологічної пам’яті, що супроводжується зниженням кількості CD4 +-
клітин та збільшенням кількості CD8+-клітин; відбувається збільшення
кількості CD28--клітин, які мають дефектний фенотип та знижені
функціональні якості; при активації Т-лімфоцитів наявне зниження експресії
цитокінів [59]. Старіння накладає свій вплив на Т-клітини [128, 129],
змінюючи їх молекулярні механізми активації.
Відомо, що з віком проліферативна активність Т-лімфоцитів у відповідь
на стимуляцію ТКР падає. Вважається, що це зниження викликане
підвищенням числа дефектних Т-лімфоцитів, а саме Т-лімфоцитів з
фенотипом клітин імунологічної пам’яті. У роботі Tsukamoto et al [55]
показано, що наївні Т-клітини зі старих тварин мають також погіршені
функціональні якості. Разом з цим такі клітини мають знижену чутливість до
стимулів, що викликають апоптоз. В роботі [130] показано, що Т-лімфоцити
від старих тварин мають значні функціональні порушення. Ці порушення
призводять до підвищення ступеня загибелі клітин при їх активації. У цій же
статті [130] проводиться аналіз змін молекулярних механізмів активації
Т-лімфоцитів і вказується на наявність дефектної активації каскаду NFκB, що
33
може виражатися у погіршеній активації Т-лімфоцитів. В багатьох роботах
було показано, що Т-лімфоцити від старих донорів мають порушення у
ранніх явищах після стимуляції ТКР [131, 132], а також у структурі
імунологічного синапсу та цитоскелету [133, 134]. Основна увага в цих
роботах приділяється висвітленню дисфункції у проксимальних явищах
активаційного каскаду ТКР та активації фактору NFκB. Показано також
наявність негативного впливу старіння на активацію сигнальних каскадів
костимуляторних молекул у Т-лімфоцитів [135].
З наведеного вище матеріалу стає зрозуміло, що активація Т-лімфоцита
є складним процесом, який включає в себе активацію численних сигнальних
механізмів, серед яких ключову роль грає активація транскрипційного
фактору NFκB та блокада апоптозу. З віком молекулярні механізми активації
Т-клітин зазнають негативних змін, що призводять до порушення
проліферативної здатності та чутливості до апоптозу. До явищ, що негативно
впливають на функціонування Т-лімфоцитів, відносять порушення експресії
або функціонування транскрипційного фактору NFκB, порушення в
деградації інгібіторних білків ІκВ, порушення в інших сигнальних
механізмах.
Дослідження питань, описаних вище, на даний момент поки що
проведені в недостатній кількості, а тому напрямок роботи, що був
розпочатий у нашій лабораторії може частково закрити цю інформаційну
проріху, що наявна у сучасній імунології старіння.
У роботах, проведених Г.М. Бутенко та колегами, було показано, що
контакт системного середовища молодого організму з системним
середовищем старого організму шляхом об’єднання тварин у гетерохронні
парабіотичні пари здатен викликати розвиток вікової дисфункції імунної
системи молодої тварини [12]. Але механізми розвитку цього ефекту
залишилися нерозкритими. Метою даної роботи було дослідити механізми
розвитку вікових змін Т-клітинної ланки імунної системи в експерименті на
моделі гетерохронного парабіозу та розробити спосіб корекції цих змін. Для
34
досягнення поставленої мети було проведено дослідження популяційного
складу Т-лімфоцитів, перевірено проліферативну активність Т-клітин в
умовах in vitro та охарактеризовано вплив на цей параметр з боку різних
популяцій клітин мікрооточення ВЛО, досліджено зміни у молекулярних
механізмах активацій Т-клітин.
35
РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для реалізації поставлених завдань використовувались сучасні методи

лабораторних досліджень, у тому числі молекулярно-біологічні. Для
визначення змін субпопуляційного складу Т-клітин лімфоїдних органів in
vivo було використано метод імунофлуоресцентного аналізу. Для визначення
імунологічних параметрів in vitro використовувались рутинні імунологічні
методи, зокрема реакція бласттрансформації Т-лімфоцитів лімфоїдних
органів, а також аналіз фагоцитарної активності макрофагів селезінки. Вплив
клітин мікрооточення селезінки на проліферативну відповідь Т-лімфоцитів
проводився за допомогою сумісного культивування Т-лімфоцитів при
наявності різних популяцій лімфоїдних органів – дендритних клітин та
макрофагів. Для визначення молекулярних механізмів передачі сигналу у Т-
клітинах проводився аналіз білків, які приймають участь у процесах активації
Т-клітин (NF-κB, IκB, каспаза 3) за допомогою методу імуноблотингу. Усі
маніпуляції з тваринами проводилися згідно норм чинного законодавства
України (стаття 26 Закону України «Про захист тварин від жорстокого
поводження» від 21.02.2006 р.), біоетики (згідно вимог Європейської
Конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються з
експериментальною та іншою метою (Страсбург, 1986)). Наявний
позитивний висновок комітету з біоетики ДУ «Інститут геронтології ім. Д.Ф.
Чеботрьова НАМН України» (протокол №1 від 18 січня 2012 р. та протокол
№5 від 19 вересня 2014 р.).
2.1 Дослідження стану імунної системи in vivo в експерименті на

тваринах
2.1.1 Схеми експерименту та експериментальні моделі
Для вивчення змін в імунній системі гетерохронних парабіонтів
експерименти були проведені на молодих (3-4 міс, n = 39) і старих (23-25 міс,
36
n = 37) мишах-самцях лінії CВА/Са, взятими з розпліднику ДУ «Інститут
геронтології ім. Д. Ф. Чеботарьова НАМН». У мишей досліджувалися зміни
імунологічних параметрів та субпопуляційного складу Т-лімфоцитів
селезінки. Принципову схему експериментальної моделі наведено на рис. 2.1.
Операції по парабіозу здійснювали відповідно методу, розробленого Bunster
et al [136].
Рис. 2.1. Опис експериментальної моделі.
Тварин було розподілено на наступні експериментальні групи:
Молоді ізохронні парабіонти (n = 20).

Старі ізохронні парабіонти (n = 18).
Молоді гетерохронні парабіонти (n = 19).
Старі гетерохронні парабіонти (n = 19).
До експерименту тварин брали через 6 або 12 тижнів після операції.

Операції здійснювали під кеталаровим наркозом в дозі 10 мкг/г маси тіла
37
мишей. У день забору матеріалу мишам вводили тіобарбіталовий наркоз (30
мкг/г маси тіла мишей) й знекровлювали.
2.1.2 Методи експериментальних досліджень стану імунної системи

Дослідження стану імунної системи проводили з використанням
рутинних імунологічних методів, а також аналізів субпопуляційного складу
клітин лімфоїдних органів методом проточної цитометрії.
Забір матеріалу проводили під тіобарбіталовим наркозом.
Знекровлення відбувалося після декапітації. Селезінку виймали в асептичних
умовах і поміщали у стерильне середовище RPMІ-1640, що містило 10 %
ембріональної телячої сироватки, 20 ммоль НЕPES, 100 од/мл
бензилпеніциліну, 0,1 мг/мл стрептоміцину. У подальшому селезінку
гомогенізували у скляному гомогенізаторі, а отриману суспензію
спленоцитів використовували для проведення тесту проліферативної
активності спленоцитів in vitro, фагоцитарної активності та визначення
субпопуляційного складу.
Кількість клітин селезінки після гомогенізації її в 2 мл розчині RPMI-
1640 та підраховували в розчині 3 % оцтової кислоти з 0,1 % вмістом
генціанвіолету (розчин Тюрка) у співвідношенні 1:20 в камері Горяєва за
загальноприйнятим методом.
Тимус досліджувався на масу тимусу, кількість тимоцитів (клітинність)
та субпопуляційний склад. Масу тимусу вимірювали на торсійних вагах.
Клітинність тимусу визначали після гомогенізації цілого тимусу в 1 мл 0,9 %
фізіологічного розчину аналогічним чином.
Відсотковий склад субпопуляцій Т-лімфоцитів у селезінці та тимусі
оцінювали імунофлюоресцентним методом з використанням таких антитіл
(далі АТ): anti-mouse CD4-PE (клон RM4-5, PісkCell Laboratorіes), anti-mouse
CD8α-TxRD (клон 53-6.7, PісkCell Laboratorіes), anti-mouse CD44-APC (клон
IM7, PісkCell Laboratorіes). Інкубацію з АТ проводили протягом 30 хв на
38
льоді в сольовому розчині Дюльбекко (pH 7,6) з додаванням 15 ммоль
HEPES, 0,1 % азиду натрію й 2 % телячої сироватки. Після відмивання
клітини фіксували в 2 % розчині параформальдегіду. Підрахунок відносної
кількості пофарбованих лімфоцитів проводили з використанням проточного
цитофлуориметра CyAn™ ADP (DAKO). Далі визначалася відносна кількість
Т-клітин у органі та вміст окремих субпопуляцій Т-клітин у загальній
популяції Т-лімфоцитів досліджуваного органу.
Проліферацію спленоцитів іn vіtro оцінювали після їх стимуляції ФГА
(10 мкг/мл, Sigma-Aldrich GmbH). 2•106 клітин культивували в середовищі
RPMІ-1640, що містило 10 % ембріональної телячої сироватки, 20 ммоль
НЕPES, 10 ммоль 2-меркаптоетанолу, 100 од/мл бензилпеніциліну, 0,1 мг/мл
стрептоміцину протягом 72 годин при температурі 37 °С у присутності або
відсутності ФГА. Індекс стимуляції (далі ІС), що відповідає інтенсивності
проліферації лімфоцитів, вимірювали колориметрично за допомогою методу,
що ґрунтується на здатності живих клітин до хімічної редукції МТТ
тетразолія [Mosman T., 1983]. А саме, за 2 години до кінця інкубації в кожну
лунку планшету, що містить 2•106 клітин, додавали по 10 мкл 5 % розчину
МТТ (3-(4,5-dіmethylthіazol-2-yl)-2,5dіphenyl tetrazolіum bromіde, Sіgma),
профільтрованого через мембранний фільтр із діаметром пор 0,22 мкм. Через
2 години в кожну лунку додавали по 150 мкл 0,04 N розчину HCl в
ізопропіловому спирті, ретельно перемішували (до повного розчинення
осаду, що утворився) і вимірювали оптичну щільність надосадової рідини на
планшетному фотометрі Ascent фірми Labsystems (Фінляндія) при довжині
хвилі 540 нм. Результати розраховували за формулою та виражали в
умовних одиницях індексу стимуляції:
(2.1)
39
де ІС – індекс стимуляції, Dx – оптична щільність досліджуваного
зразку (мітогенактивовані клітини), DK – оптична щільність контрольного
зразку (клітини без мітогену).
Параметри фагоцитозу МФ селезінки визначали з використанням

методу, що заснований на морфологічному визначенні кількості часточок
латексу, які поглинаються МФ іn vіtro. Для цього, 1,5 • 107 спленоцитів у 2 мл
середовищі RPMІ-1640, що містить 10 % ембріональної телячої сироватки,
вносили в чашки Петрі діаметром 35 мм й інкубували 2 години при 37 °С.
Після закінчення інкубації всі неадгезовані клітини видаляли інтенсивним
змиванням розчином Хенкса. До клітин, що прилипли, вносили 0,5 % розчин
латексу (у концентрації 2,5 • 108/ мл), витримували в термостаті при 37 °С
протягом 30 хв, змивали непоглинений латекс розчином Хенкса. Препарат
висушували при кімнатній температурі, фіксували в метанолі 10 хв і
фарбували за Романовським-Гімза. При мікроскопії пофарбованих мазків
підраховували 100 макрофагів. При цьому визначали такі параметри
фагоцитарної активності МФ: відсоток фагоцитозу (далі ВФ), індекс
фагоцитозу (далі ФІ), фагоцитарне число (далі ФЧ).
Відсоток фагоцитозу визначали за такою формулою:
• 100% (2.2)
де ВФ – відсоток фагоцитозу, NФ – кількість МФ, які поглинули

латексні частки, NМф – загальна кількість підрахованих МФ.
Індекс фагоцитозу визначали за наступною формулою і виражають
через умовні одиниці:
(2.3)
40
де ФІ – індекс фагоцитозу, nФ – кількість часток латексу у
фагоцитуючих МФ, NФ – кількість МФ, які поглинули латексні частки.
Фагоцитарне число виражали через умовні одиниці і визначали за
такою формулою:
(2.4)
де ФЧ – фагоцитарне число, nФ – кількість часток латексу у

фагоцитуючих МФ, NМф – загальна кількість підрахованих МФ.
2.2 Дослідження стану імунної системи in vitro

Для визначення впливу гетерохронного парабіозу на костимуляторні
властивості клітин мікрооточення Т-лімфоцитів використовувалися миші-
самці лінії CВА/Са, взяті з розпліднику ДУ «Інститут геронтології ім. Д. Ф.
Чеботарьова НАМН України». У дослідженні використовувалися молоді (3-4
міс, n = 70 ) і старі (23-25 міс, n = 44 ) миші. Експерименти було проведено у
2-х блоках. Перший блок експериментів було присвячено дослідженню змін
функціонального стану Т-лімфоцитів селезінки при гетерохронному
парабіозі, а також впливу гетерохронного парабіозу на костимуляторні
властивості дендритних клітин селезінки. Другий блок було присвячено
дослідженню змін у костимуляторних властивостях макрофагів селезінки.
Операції було проведено за методом Bunster et al [136].
Для першого блоку тварин було розподілено на такі експериментальні
групи:

41
Молоді інтактні тварини (n = 5).
Для другого блоку тварин було розподілено на такі експериментальні

групи:

Молоді інтактні тварини (n = 19).
В експеримент тварин брали зі строком співіснування протягом 6

тижнів, оскільки попередніми роботами було показано, що саме в цей час
спостерігаються найбільш значні зміни в імунній системі. Операції
здійснювали під кетоларовим наркозом в дозі 10 мкг/г маси тіла мишей. У
день експерименту мишам вводили тіобарбіталовий наркоз (30 мкг/г маси
тіла мишей) й знекровлювали.
2.2.2 Дослідження змін у функціональному стані Т-лімфоцитів

Дослідження функціонального стану Т-лімфоцитів селезінки
проводили на основі вивчення їх проліферативної активності.
Забір матеріалу проводили під кетоларовим наркозом за описаним
вище методом. Знекровлення відбувалося після декапітації. Селезінку
виймали в асептичних умовах і поміщали у стерильне середовище RPMІ-
1640, що містило 10 % ембріональної телячої сироватки, 20 ммоль НЕPES,
100 од/мл бензилпеніциліну, 0,1 мг/мл стрептоміцину. У подальшому
селезінку гомогенізували у скляному гомогенізаторі, а спленоцити
використовували для виділення Т-лімфоцитів для визначення
проліферативної активності спленоцитів in vitro. Кількість спленоцитів після
42
гомогенізації підраховували у камері Горяєва з використанням розчину
Тюрка.
Виділення Т-клітин проводилося з отриманої суспензії спленоцитів за
допомогою колонок з нейлоновою ватою (Polyscience, Inc.) за методикою,
наданою виробником. Для цього попередньо активовану нейлонову вату
розміщували у колонках та урівноважували за допомогою 5-разового
промивання середовищем RPMI-1640 з 10% ембріональною телячою
сироваткою та інкубації протягом 1 години при температурі 37 °С. Після
цього колонки додатково промивалися стерильним середовищем та на них
наносилася отримана суспензія з 2,5 • 106 спленоцитів. Колонку інкубували
протягом 1 години при температурі 37 °С, після чого клітини, що не
прилипли до вати, обережно вимивалися 2-ма промивками RPMІ-1640.
Кількість клітин підраховували у камері Горяєва з використанням розчину
Тюрка.
Визначення проліферацітивної активності Т-лімфоцитів іn vіtro
проводили аналогічно до методу визначення проліферації спленоцитів,
описаного вище.
2.2.3 Методи експериментальних досліджень впливу клітин

мікрооточення селезінки на функціональний стан Т-лімфоцитів
Дослідження впливу на функціональний стан Т-лімфоцитів селезінки з
боку клітин їх мікрооточення проводили з використанням тесту на
проліферативну активність при сумісному культивуванні з клітинами, що
складають мікрооточення Т-лімфоцитів – дендритними клітинами та
макрофагами.
Для перевірки впливу дендритних клітин селезінки на проліферативну
активність Т-лімфоцитів проводилися наступні маніпуляції:
Селезінку виймали в асептичних умовах і поміщали у стерильне
середовище RPMІ-1640, що містило 10 % ембріональної телячої сироватки,
20 ммоль НЕPES, 100 од/мл бензилпеніциліну, 0,1 мг/мл стрептоміцину.
43
Cелезінку розділяли на 2 частини, одна частина використовувалася для
виділення Т-лімфоцитів, а друга – для виділення дендритних клітин.
Виділення Т-клітин проводилося з першої половини отриманої
селезінки за допомогою колонок з нейлоновою ватою (Polyscience, Inc.) за
методикою, наданою виробником та описаною вище. Кількість клітин
підраховували у камері Горяєва з використанням розчину Тюрка.
ДК виділялися з іншої половини селезінки. Половину селезінки
подрібнювали на маленькі частинки у стерильних умовах та лізували до
утворення суспензії клітин розчином, що містив колагеназу D та ЕДТА.
Виділення ДК з суспензії відбувалося за допомогою позитивного відбору за
маркером CD11c на магнітні наночастинки набором EasySep (Stemcell
Technology) за протоколом, наданим виробником. Кількість клітин
У пробірки, де проходила стимуляція Т-лімфоцитів, вносилися Т-
лімфоцитів та ДК у співвідношенні 100/1 і додавався ФГА (20 мкг/мл, Sigma-
Aldrich GmbH). Сумісне культивування проводилося за такими схемами (рис.
2.2):
1. Т-клітини селезінки парабіонтів та аутологічні ДК селезінки.
2. Т-клітини селезінки парабіонтів та ДК селезінки молодих інтактних
тварин.
А
44
Б
Рис. 2.2. Схеми сумісного культивування Т-лімфоцитів і ДК селезінки
експериментальних тварин. А – Т-клітини селезінки парабіонтів та
аутологічні ДК селезінки. Б – Т-клітини селезінки парабіонтів та ДК
селезінки сингенних молодих інтактних тварин.
Визначення проліферативної активності Т-лімфоцитів іn vіtro

проводили аналогічно до методу визначення проліферації спленоцитів, що
описано вище.
Для перевірки впливу МФ селезінки на проліферативну активність Т-
лімфоцитів проводилися наступні маніпуляції:
середовище RPMІ-1640, що містило 7,5 % ембріональної телячої сироватки,
виділення Т-лімфоцитів, а друга – для виділення макрофагів.
селезінки за допомогою колонок з нейлоновою ватою (Polyscience, Inc.), за
МФ виділялися з іншої половини селезінки за загальноприйнятою
методикою [Дѐрфлинг П., 1987] з модифікацією методу.
45
Для цього іншу половину селезінки гомогенізували до отримання
однорідної суспензії спленоцитів. Далі 10 • 106 спленоцитів у об’ємі 500 μl
нашаровувались на пластик ємності, де буде проводитись сумісна
культивація з Т-клітинами. Там суспензія спленоцитів інкубувалася протягом
2 годин при 37° С у середовищі RPMІ-1640 з вмістом 10% ембріональної
телячої сироватки.
Клітини, що не прилипли до пластику, відбиралися разом з
середовищем, а пробірку промивали 2-ма промивками RPMІ-1640 для змиву
клітин, що не адгезували до пластику.
У подальшому у пробірки, де були нанесені макрофаги, вносилися Т-
лімфоцити у співвідношенні до МФ 10/1 та вносився ФГА (20 мкг/мл, Sigma-
Aldrich GmbH). Сумісне культивування проводилося за такими схемами (рис.
2.3):
3. Т-клітини селезінки парабіонтів та аутологічні МФ селезінки.

4. Т-клітини селезінки парабіонтів та МФ селезінки молодих інтактних
тварин.
А
46
Б
Рис. 2.3. Схеми сумісного культивування Т-лімфоцитів і МФ селезінки
експериментальних тварин. А – Т-клітини селезінки парабіонтів та
аутологічні МФ селезінки. Б – Т-клітини селезінки парабіонтів та МФ
Визначення проліферативної активності Т-лімфоцитів іn vіtro

проводили аналогічно до методу визначення проліферації спленоцитів, що
описано вище.
Проліферацію Т-лімфоцитів іn vіtro оцінювали після їх стимуляції ФГА
(10 мкг/мл, Sigma-Aldrich GmbH). 2•106 клітин культивували в середовищі
RPMІ-1640, що містило 10 % ембріональної телячої сироватки, 20 ммоль
НЕPES, 10 ммоль 2-меркаптоетанолу, 100 од/мл бензилпеніциліну, 0,1 мг/мл
стрептоміцину протягом 72 годин при температурі 37 °С у присутності або
відсутності ФГА. ІС, що відповідає інтенсивності проліферації Т-лімфоцитів,
вимірювали колориметрично за допомогою методу, що ґрунтується на
здатності живих клітин до хімічної редукції МТТ тетразолію [Mosman T.,
1983]. Результати розраховували за формулою 2.1.
47
2.3 Дослідження впливу макрофагів селезінки на молекулярні механізми
активації Т-лімфоцитів селезінки парабіонтів in vitro
Для визначення змін у впливі гетерохронного парабіозу на
костимуляторні властивості МФ селезінки у контакті з Т-лімфоцитами
селезінки використовувалися миші-самці лінії CВА/Са, взяті з розпліднику
ДУ «Інститут геронтології», що брали участь у другому блоці попереднього
експерименту. У дослідженні використовувалися молоді (3-4 міс, n = 45) і
старі (23-25 міс, n = 24) миші. Операції було проведено за методом Bunster et
al [136]. Тварин було розподілено на наступні експериментальні групи згідно
другого блоку попереднього етапу дослідження:

Молоді інтактні тварини (n = 19)
В експеримент тварин брали зі строком співіснування у парабіотичних

парах протягом 6 тижнів. З тваринами проводились маніпуляції, аналогічні
описаним вище.
2.3.2 Методи експериментальних досліджень впливу макрофагів

селезінки на молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів селезінки
гетерохронних парабіонтів in vitro.
Дослідження впливу на молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів
селезінки з боку МФ проводили за допомогою активації Т-лімфоцитів in vitro
та подальшим аналізом вмісту сигнальних білків у Т-лімфоцитах шляхом
імуноблотингу.
48
середовище RPMІ-1640, що містило 7,5 % ембріональної телячої сироватки,
виділення Т-лімфоцитів, а друга використовувалась для виділення МФ.
селезінки за допомогою колонок з нейлоновою ватою (Polyscience, Inc.), за
МФ виділялися з іншої половини селезінки за методикою, описаною
вище. У подальшому у пробірки, де були нанесені МФ, вносилися Т-
лімфоцити у співвідношенні до МФ 10/1 та вносився ФГА (20 мкг/мл, Sigma-
Aldrich GmbH). Т-лімфоцити сумісно культивувалися з МФ селезінки
протягом 2 або 18 годин та у подальшому лізувалися для визначення змін у
молекулярних механізмах активації методом імуноблотингу. Сумісне
культивування проводилося згідно схем, аналогічним до попереднього етапу
досліджень (рис. 2.3), але з різним часом стимуляції, що наведено вище, та з
подальшим лізисом суспензії клітин:
5. Т-клітини селезінки парабіонтів та аутологічні МФ селезінки з часом

стимуляції 2 або 18 годин та подальшим лізисом.
6. Т-клітини селезінки парабіонтів та МФ селезінки сингенних молодих
інтактних тварин з часом стимуляції 2 або 18 годин та подальшим лізисом.
Аналіз змін вмісту сигнальних білків проводився за використанням АТ

до наступних білків: NFκB p65, ІκВα, caspase 3 (поліклональні АТ кроля,
Santa Cruz), та β-Actin (поліклональні АТ кроля, Abcam, використано у якості
референтного білку). У якості вторинних АТ використовувалися
поліклональні АТ козла, кон’юговані з пероксидазою хріну, що були
специфічними до кролячих імуноглобулінів (Abcam).
49
Клітинні лізати готувалися згідно [Kaufmann W.K., 2001, Ong C.T.,
2008]. Т-лімфоцити культивували разом з макрофагами у співвідношенні
10:1. Перед лізисом клітини відмивалися від середовища за допомогою
промивки 0,9 % розчином NaCl та центрифугування на 1000 g 10 хв. Після
цього супернатант відбирався та клітини лізувалися у 35 μl лізисного буферу
для отримання цільноклітинного екстракту (150 мМ NaCl, 20 mM Tris, 1 %
Triton X100, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 % glycerol, 1 mM PMSF) на льоду
протягом 30 хв, після чого відбувалося центрифугування на 12000 g протягом
12 хв. У подальшому отримані екстракти заморожувалися та трималися при
температурі -20° С до моменту використання у роботі. Визначення
концентрації білку проводилося за допомогою колориметричного методу з
використанням пірогалолу червоного «Монореагент» (ТОВ НВП «Філісіт-
Діагностика»). Перед нанесенням білків на гель проводилося визначення
концентрації білку та денатурація білкового екстракту у буфері Лемлі.
У подальшому відбувалося розділення білків з даних екстрактів за
допомогою 1D електрофорезу у 10 % поліакриламідному гелі у
денатуруючих умовах за методикою, наданою виробником (Abcam). У лунки
гелю вносилось 10 μg білку і проводилось розділення білків за молекулярною
масою. У подальшому проводився електроперенос білків з гелю на PVDF-
мембрани (Carl Roth GmbH). Мембрани блокувались у розчині РВS-T з 5 %
сухого знежиреного молока (Sigma-Aldrich GmbH) протягом 1 години. У
подальшому мембрани інкубувались послідовно у розчинах первинних та
вторинних антитіл (РВS-T з 5 % і 1 % сухого знежиреного молока
відповідно). Візуалізація комплексу «первинні антитіла – цільовий білок»
відбувалася за допомогою реакції ECL з використанням хемілюмінесценції
на рентгенівську плівку (AGFA).
Оцінювання експресії досліджуваних білків проводилося за допомогою
оцінювання інтенсивності засвічення бендів на плівці. Денситометричний
аналіз бендів на плівці проводився з використанням програми GelAnalyzer
2010. Нормалізація денситограми досліджуваних білків у зразках відбувалася
50
по відношенню до оптичної густини бенду референтного білку цього ж
зразку за такою формулою (2.5):
nDx • 100% (2.5)
де nDx – нормалізована оптична густина бенду досліджуваного білку,

Dx – оптична густина бенду досліджуваного білку, Dβ-Actin – оптична густина
бенду β-Actin на цій же плівці.
Відносна експресія досліджуваного білку у лізатах Т-лімфоцитів,
розраховувалася згідно формули 2.6:
Еx (2.6)
де Ex – відносна експресія досліджуваного білку у зразку, nDx –

нормалізована оптична густина бенду досліджуваного білку у
досліджуваному зразку, nDК – нормалізована оптична густина бенду
досліджуваного білку у контрольному зразку.
Одиницями виміру відносної експресії були відсотки. У якості
контрольного зразку використовувалися лізати стимульованих Т-лімфоцитів
селезінки від молодих ізохронних парабіонтів (схема культивування 5) або
лізати Т-лімфоцитів молодих інтактних тварин (схема культивування 6).
2.4. Статистичний аналіз результатів.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням
двостороннього t-критерію Стьюдента та U-критерію Манна-Уітні. Різницю
між середніми арифметичними параметрів виражали за допомогою 95%
довірчого інтервалу (далі ДІ) різниці середніх значень. Також проводився
кореляційний аналіз за методом лінійної кореляції Пірсона. Розраховувалися
51
наступні параметри описальної статистики: середнє значення (М) та
стандартна похибка середнього (m), що вказано у коментарях до рисунків.
Рівність дисперсій при порівнянні виборок досліджувалася F-тестом
Фішера. Нормальність розподілу перевірялася згідно методу Плохинського
для дослідження показників асиметрії та ексцесу розподілу [137]. У випадку
визнання тестами відсутності значимих відхилень від нормального
відхилення для аналізу використовувався t-критерій Стюдента. У іншому
випадку використовувався U-критерій Манна-Уітні. В окремих випадках t-
тест Стьюдента використовувався при порушенні оптимальних умов
використання, але такі випадки оговорюються в тексті.
При проведенні кореляційного аналізу за методом Пірсона
розраховувалися значення коефіцієнту r, статистична значимість
кореляційного зв’язку досліджуваних параметрів виражалася через значення
Р. Кореляційний зв’язок вважався помірним при r > ǀ 0,6ǀ та сильним при r
> ǀ 0,9ǀ . Розрахунки проводилися з використанням програмного пакету
―STATISTICA 7.0‖ та MS Excel 2007.
52
РОЗДІЛ 3
ОСНОВНІ ПОРУШЕННЯ Т-КЛІТИННОЇ ЛАНКИ ІМУННОЇ
СИСТЕМИ ТА ПОСЛІДОВНІСТЬ ЇХ ВИНИКНЕННЯ НА МОДЕЛІ
ГЕТЕРОХРОННОГО ПАРАБІОЗУ

гетерохронному парабіозу після 12 тижнів сумісного існування
Згідно попередніх даних, що були отримані раніше на цій
експериментальній моделі, можна сказати, що гетерохронний парабіоз
індукує розвиток вікових змін у молодого партнера та відсутність корекції
або слабка вираженість корекції вікових змін у старого партнера. Можливим
механізмом може бути обмін певними факторами, клітинними або
гуморальними, або їх комбінацією, за допомогою крові між старим і молодим
організмами.
Метою даного етапу досліджень було виявлення змін в імунній системі
тварин різного віку при тривалому співіснуванні у парабіотичній парі.
Припускалася можливість як корекції вікових змін імунної системи у старих
тварин, так і індукція вікових змін у досліджуваних параметрах у молодих
партнерів по гетерохронній парабіотичній парі.
Як відомо, найбільш драматичні вікові зміни в імунній системі
спостерігаються у центральних імунних органах. Раніше вказувалося, що
тимус є органом, який більш за все страждає від вікових змін через
інволюцію розміру та заміщення функціональної лімфопоетичної тканини
нефункціональною жировою [49]. Очікувалося, що тривалий час сумісного
існування у гетерохронній парабіотичній парі буде мати значний негативний
вплив на параметри тимусу молодих тварин, об’єднаних зі старими. За
попередніми припущеннями, існування у парабіотичній парі зі старою
твариною мало би справляти негативний вплив на розміри тимусу.
53
Виявилося, що співіснування протягом 3 місяців у парабіотичних парах
не мало негативного впливу на клітинність та масу тимусу молодого
партнера по гетерохронному парабіозу, хоча й не викликало відновлення цих
параметрів в старих гетерохронних парабіонтів.
Різниця у масі тимусу між старими та молодими ізохронними
парабіонтами була статистично достовірною (рис. 3.1, P (t) <0,005), і у
молодих ізохронних парабіонтів була в середньому на 10,95 мг більше, ніж у
старих (95% ДІ: 5,44 : 16,46); тимус молодих партнерів по гетерохронним
парабіотичним парам у порівнянні зі старими партнерами був на 11,12 мг
більше (95% ДІ: 3,495 : 18,754).
Рис. 3.1. Маса (мг) тимусу в тварин різних експериментальних груп

після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Позначення груп: 1 – молоді ізохронні парабіонти; 2 – молоді
гетерохронні парабіонти; 3 – старі гетерохронні парабіонти;
4 – старі ізохронні парабіонти.
Примітки:
** − Р (t) < 0,005 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
## – Р (t) < 0,005 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
54
Не було відмічено негативних змін у клітинності тимусу молодих
партнерів по гетерохронній парабіотичній парі по відношенню до молодих
ізохронних тварин, хоча різниця у цьому параметрі між молодими та старими
тваринами була статистично дуже достовірною (рис. 3.2, P (t) < 0,005) і склала
між молодими та старими ізохронними парабіонтами 19,93 • 10 6 клітин (95%
ДІ: 2,69 : 37,17), а між старими і молодими гетерохронними парабіонтами
25,09 • 106 клітин (95% ДІ: 5,613 : 44,58).
Рис. 3.2. Клітинність (106 клітин) тимусу в тварин різних

експериментальних групах після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
* − Р (t) < 0,005 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
# – Р (t) < 0,005 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Аналізувався також вплив гетерохронного парабіозу на

субпопуляційним склад тимоцитів тварин різних експериментальних груп.
Не було виявлено значних значних відмінностей у складі тимоцитів між
тваринами різних експериментальних груп, хоча було виявлено статистично
55
+ -
значиму різницю у кількості CD8 4 тимоцитів між молодими та старими
ізохронними парабіонтами (P(t) < 0,05). Дані викладено у таблиці 3.1.
Таблиця 3.1
Субпопуляційний склад тимоцитів тварин різних експериментальних
груп після 12 тижнів гетерохронного парабіозу, (M ± m)
Показники Молоді парабіонти Старі парабіонти
Ізохронні Гетерохронні Гетерохронні Ізохронні
CD4-8- клітини, % 11,93 ± 2,44 12,15 ± 5,22 10,56 ± 5,91 19,84 ± 4,51
(n = 7) (n = 3) (n = 3) (n = 6)
CD4+8+ клітини, % 53,11 ± 5,04 58,68 ± 12,56 51,47 ± 22,13 39,96 ±5,83
(n = 7) (n = 3) (n = 3) (n = 6)
CD4+8- клітини, % 20,97 ± 3,16 15,99 ± 4,16 13,96 ± 2,72 18,46 ± 1,8
(n = 7) (n = 3) (n = 3) (n = 6)
CD4-8+ клітини, % 6,26 ± 0,95 4,97 ± 2,22 18,5 ± 14,36 10,95 ± 1,79 *
(n = 7) (n = 3) (n = 3) (n = 6)
Примітки:
* − Р (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів
Такі параметри, як маса та клітинність тимусу, не мають абсолютного

прямого зв’язку з функціонуванням тимуса та тимопоезом, оскільки
тимчасова дія факторів, які індукують стрес або підвищення концентрації
глюкокортикоїдів у крові, здатна викликати негативні зміни у
функціонуванні тимуса без змін маси або клітинності органу. Проте вікові
зміни тимусу, особливо у гризунів, показують чіткий зв’язок змін у розмірах
органу та погіршенням тимопоезу. Не було виявлено статистично значимих
відмінностей у макроскопічних параметрах тимусів молодих ізохронних та
гетерохронних парабіонтів. Також не було виявлено значних змін у
субпопуляційному складі тимоцитів між тваринами різних
експериментальних груп, що вказує на невисокий вплив парабіозу на дані
параметри. Це свідчить про відсутність значних змін у тимусі молодих
56
партнерів по гетерохронному парабіозу порівняно з молодими ізохронними
парабіонтами.
Варто відмітити, що попередніми роботами, проведеними Бутенко Г.М.
та співробітниками [138], було показано, що гетерохронний парабіоз
негативно впливає на параметри тимусу. Це не зовсім узгоджується з
отриманими результатами. Частково різницю в отриманих результатах
можна пояснити використанням мишей іншої статі та іншої генетичної лінії,
оскільки у наведеній роботі автори використовували самиць лінії Balb/c. Ці
фактори могли вплинути на отримані результати.
Також у попередніх роботах Бутенко Г.М. та співавторів наводяться
ознаки порушень параметрів імунної відповіді на введені антигени
[4], що вказує на порушення у роботі периферичного компартемнту імунної
системи. Було проаналізовано стан Т-клітинної ланки імунної системи
тварин різних експериментальних груп.

субпопуляційного складу Т-лімфоцитів селезінки молодих партнерів по
Т-лімфоцит при наявності активаторного стимулу (через стимуляцію Т-
клітинного рецептора) починає процес антиген-стимульованої проліферації.
Проліферація Т-лімфоцитів при їх активації є важливою характеристикою їх
функціонального стану. З віком відмічається порушення антиген-
стимульованої проліферації Т-клітин [59]. Відомо, що однією з причин
погіршення здатності Т-лімфоцитів до проліферації, що супроводжує
старіння імунної системи, є підвищення кількості Т-лімфоцитів з фенотипом
клітин імунологічної пам’яті.
Подальше дослідження стану Т-клітинної ланки імунної системи
показало наявність негативного впливу старого парабіонту на
проліферативну активність та субпопуляційний склад Т-клітин селезінки
молодого партнера по гетерохронному парабіозу (рис. 3.3 та рис. 3.4).
57
Проліферативна активність спленоцитів молодого партнера по
гетерохронному парабіозу при їх стимуляції Т-клітинним мітогеном ФГА
була знижена лише тенденційно (на 0,39 у.од. (95% ДІ: -0,056 : 0,836)) у
порівнянні з молодими ізохронними тваринами (рис. 3.3, P (t) = 0,088).
Рис. 3.3. Індекс стимуляції клітин селезінки після їх стимуляції за

допомогою ФГА у досліджуваних групах тварин після 12 тижнів парабіозу,
(М ± m).
Примітка.
& − P (t) < 0,1 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Важливим показником, що характеризує стан Т-клітинної ланки імунної

системи, є співвідношення CD4+/CD8+-клітин селезінки. Наступним кроком
було проведення субпопуляційного аналізу клітин селезінки. Було виявлено
статистично достовірне вікове зниження співвідношення CD4 +/CD8+-клітин в
селезінці старих тварин по відношенню до молодих тварин (рис. 3.4,
P (t) < 0,05) без жодних ознак корекції цього несприятливого за даними
58
літератури явища [59]. При цьому у молодих тварин, об’єднаних зі старими,
також відмічалося зниження співвідношення CD4+/8+-клітин селезінки (рис.
3.4, P (t) < 0,05). Різниця у співвідношенні CD4+/CD8+-клітин між молодими
ізохронними парабіонтами та старими ізохронними тваринами склала 0,694
у.од. (95% ДІ: 0,165 : 1,223), а між молодими гетерохронними парабіонтами
1,22 у.од. (95% ДІ: 0,08 : 2,529).
Рис. 3.4. Співвідношення CD4+/CD8+ клітин селезінки у досліджуваних

груп тварин після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітка.
* − Р (t) < 0,05 відносно молодих ізорохронних парабіонтів.
Зміни у співвідношенні CD4+/CD8+-спленоцитів відбуваються за

рахунок змін у кількості різних субпопуляцій Т-лімфоцитів, зокрема
Т-хелперів та Т-кілерів. Наступним кроком був аналіз змін у популяційному
складі Т-клітин селезінки.
59
+
Було відмічено статистично достовірне зниження кількості CD4 -клітин
(на 12,41% (95% ДІ: 3,242 : 21,577)) в селезінці молодих партнерів по
гетерохронній парабіотичній парі по відношенню до молодих ізохронних
парабіонтів (рис. 3.5, P (t) < 0,01). Варто відмітити, що кількість CD4+-клітин
селезінки у молодих гетерохронних парабіонтів була також нижче (на 9,84%
(95% ДІ: 1,09 : 18,584)) у порівнянні зі старими ізохронними парабіонтами
(рис. 3.5, P (t) < 0,01).
Рис. 3.5. Вміст CD4+ клітин (%) у селезінці досліджуваних тварин різних
експериментальних груп після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
* − Р (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
** − Р (t) < 0,01 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
# − Р (t) < 0,05 відносно старих ізохронних парабіонтів;
## − Р (t) < 0,01 відносно старих ізохронних парабіонтів.
Також було виявлено тенденцію до підвищення кількості CD8 +-клітин в

селезінці молодих партнерів по гетерохронному парабіозу по відношенню до
молодих ізохронних парабіонтів, але дана тенденція не була статистично
60
+
достовірною (рис. 3.6, Р (t) = 0,15, Р (U) = 0,57). Хоча кількість CD8 -клітин
селезінці старих ізохронних парабіонтів була достовірно вище (на 3,88%
(95% ДІ: 1,06 : 6,7)), ніж у молодих ізохронних парабіонтів (рис. 3.6,
Р (t) < 0,05), що показує вікову різницю у параметрі.
Рис. 3.6. Вміст CD8+ клітин (%) у селезінці досліджуваних тварин різних
Примітка:
* − Р (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Численними роботами було показано, що у периферичних лімфоїдних

органах з віком збільшується кількість CD8+-клітин, які мають фенотип
клітин імунологічної пам’яті, причому ці клітини мають обмежені
функціональні властивості [139]. Накопичення нефункціональних або
обмежено функціональних Т-лімфоцитів вважається однією з причин вікової
дисфункції імунної системи.
Відомо, що в мишей маркерний білок клітин імунологічної пам’яті – це
поверхневий маркер адгезії CD44. Аналіз складу Т-лімфоцитів з фенотипом
клітин імунологічної пам’яті селезінки з фенотипом клітин імунологічної
61
пам’яті показав підвищення кількості даних клітин у молодих партнерів по
гетерохронному парабіозу.
Абсолютна кількість CD8+44+-клітин селезінки (рис. 3.7А), а також
відносна кількість CD4+44+-клітин селезінки (рис. 3.7Г) у молодих партнерів
по гетерохронній парабіотичній парі підвищувалася (для CD8+44+-клітин на
1,25% (95% ДІ: 0,097 : 2,403), для CD4+44+-клітин на 7,251% (95% ДІ: 3,86:
10,64)) у порівнянні з молодими парабіотичними ізохронними тваринами, що
виступали як відповідні вікові контролі (рис. 3.7, Р (t) < 0,05).
А Б
В Г
Рис. 3.7. Відносний вміст CD8+44+ клітин селезінки ( А, % ), відносна
кількість CD8+44+ клітин серед популяції CD8+ клітин селезінки ( Б, % ), а
також та відносний вміст CD4+44+ клітин ( В, % ) та відносна кількість
CD8+44+ клітин серед популяції CD8+ клітин селезінки ( Г, % ) парабіонтів
62
Примітки:
** − Р (t) < 0,01 відносно молодих ізохронних парабіонтів
Зниження кількості CD4+-клітин та збільшення кількості CD8+-клітин в

селезінці молодих партнерів по гетерохронному парабіозу могли б пояснити
негативні зміни в проліферативному відгуку спленоцитів молодої тварини у
відповідь на стимуляцію їх ФГА. Результати кореляційного аналізу, проте,
вказують на відсутність статистично значимої кореляції між
проліферативною активністю спленоцитів in vitro та субпопуляційним
складом спленоцитів у молодих партнерів по гетерохронним парабіотичним
парам (таблиця 3.2). Хоча, для порівняння, у молодих ізохронних парабіонтів
наявний негативний та статистично значимий зв’язок між проліферативною
активністю та кількістю CD4+-спленоцитів (r = -0,988, P < 0,05) та
CD8+-спленоцитів (r = -0,944, P < 0,06).
Таблиця 3.2
Коефіцієнт кореляції r між індексом стимуляції спленоцитів
та субпопуляційним складом спленоцитів молодих партнерів
по гетерохронному парабіозу та молодих ізохронних парабіонтів
після 12 тижнів сумісного існування
Співвідношення Кількість Кількість
Експеримен-
CD4+/CD8+- CD4+-клітин CD8+-клітин
тальні групи
клітин селезінки селезінки селезінки
Індекс Молоді
r = 0,832 r = - 0,988 * r = - 0,944 #
стимуляції ізохронні
(n = 3) (n = 4) (n = 4)
спленоцитів парабіонти
63
Продовження таблиці 3.2

Індекс Молоді
r = - 0,72 r = 0,14 r = 0,752
стимуляції гетерохронні
(n = 3) (n = 3) (n = 3)
спленоцитів парабіонти
Примітки:
Р < 0,05
Р < 0,1
Отримані дані вказують на розвиток негативних змін в Т-клітинній ланці

імунній системі молодих партнерів по гетерохронному парабіозу після 3
місяців сумісного існування. Негативних змін зазнають показники
субпопуляційного складу Т-лімфоцитів селезінки та, у меншій мірі, їх
проліферативна активність. Проте безпосередній зв’язок між
субпопуляційним складом спленоцитів та їх проліферативною активністю
при стимуляції ФГА не був виявлений, що може вказувати на складну
залежність між досліджуваними параметрами.

партнерів по гетерохронному парабіозу після 12 тижнів сумісного
існування
Наступним етапом був аналіз змін у клітинах ніші селезінки. Для цього
було проаналізовано зміни у фагоцитарній активності адгеретних клітин
селезінки, велику кількість яких складають макрофаги. Використовувався
метод морфологічного визначення кількості фагоцитуючих клітин.
Середня кількість поглинутих часточок латексу усією популяцією
(фагоцитарне число) фагоцитів селезінки молодих партнерів по
64
гетерохронній парабіотичній парі була статистично значимо нижче (на
0,97 у.од. (95% ДІ: -0,327 : -1,61) порівняно з цим показником МФ селезінки
молодих ізохронних парабіонтів (рис. 3.8, P (t) < 0,01).
Рис. 3.8. ФЧ популяції МФ селезінки тварин різних експериментальних

груп після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітка.
** − Р (t) < 0,01 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
МФ селезінки старих ізохронних та старих гетерохронних парабіонтів

мали достовірно нижчу ФЧ у порівнянні з МФ селезінки молодих ізохронних
парабіонтів (рис. 3.8, P (t) < 0,01). Інші експериментальні групи не
відрізнялися між собою за даним параметром (рис. 3.8).
Відсоток фагоцитозу МФ селезінки молодих партнерів по
гетерохронному парабіозу виявився також достовірно нижче (на 13% (95%
ДІ: -3,92 : -22,08)) порівняно з відсотком фагоцитозу МФ селезінки молодих
ізохронних парабіонтів (рис. 3.9, P (t) < 0,01).
65
Рис. 3.9. ВФ (%) МФ селезінки у досліджуваних групах тварин після 12

тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітка.
МФ селезінки молодих ізохронних парабіонтів мали також статистично

вищий ВФ у порівнянні як з МФ селезінки старих ізохронних парабіонтів (на
10,6% (95% ДІ: 3,47 : 17,73)), так і порівняно з МФ селезінки старих
партнерів по гетерохронній парабіотичній парі (на 14,625% (95% ДІ: 4,87 :
24,38)). Це показує індукцію вікових змін у МФ селезінки молодих
гетерохронних парабіонтів та відсутність корекції даного параметру у старих
Фагоцитарний індекс МФ селезінки молодих партнерів по
гетерохронному парабіозу виявилось статистично значимо нижче порівняно з
фагоцитарним індексом МФ селезінки молодих ізохронних парабіонтів (рис.
3.10, P (t) < 0,05) на 0,85 у.од. (95% ДІ: -0,21 : -1,48). Фагоцитарний індекс МФ
селезінки старих ізохронних парабіонтів було нижче на 0,796 у.од. (95% ДІ: -
0,29 : -1,304) від фагоцитарного індексу МФ селезінки молодих ізохронних
66
парабіонтів (рис. 3.10, P (t) < 0,01), що вказує на вікову різницю у цьому
параметрі.
Рис. 3.10. Фагоцитарний індекс МФ селезінки у досліджуваних груп

тварин після 12 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
Дещо несподіваним виявилося, що фагоцитарний індекс МФ селезінки

старих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі значимо не
відрізнялося від даного показника у молодих ізохронних парабіонтів (рис.
3.10, P (t) = 0,29), що може вказувати на наявність окремих активних МФ.
Проте, беручи до уваги ВФ та ФЧ (рис. 3.8 та рис. 3.9) старих партнерів по
гетерохронній парабіотичній парі, про корекцію функціональних
властивостей МФ говорити не можна.
Цікавим було тенденційне підвищення фагоцитарного індексу МФ
селезінки у старих тварин, об’єднаних з молодими у гетерохронні
парабіотичні пари, аж до рівня молодих ізохронних тварин (рис. 3.10,
67
P (t) = 0,291, різниця середніх статистично недостовірна (95% ДІ:
-0,311 : 0,96)), яке не досягало статистичної значимості у порівнянні також як
з МФ селезінки молодих гетерохронних парабіонтів, так і з МФ старих
ізохронних парабіонтів (рис. 3.10, P (t) = 0,117 та P (t) = 0,078 відповідно).
Зміни у даному параметрі МФ селезінки старого партнера по гетерохроній
парабіотичній парі не варто розглядати як суттєве поліпшення
функціональних параметрів МФ, оскільки такі параметри як відсоток
фагоитоза та фагоцитарне число були на рівні показників МФ старих
ізохронних парабіонтів.
Дані кореляційного аналізу між параметрами фагоцитозу МФ селезінки
молодих ізохронних та молодих гетерохронних парабіонтів та ІС і
субпопуляційним складом спленоцитів викладно у таблиці 3.3.
Таблиця 3.3
Коефіцієнт кореляції r між індексом стимуляції і популяційним складом
спленоцитів та параметрами фагоцитозу МФ селезінки молодих
ізохронних парабіонтів після 12 тижнів сумісного існування
Молоді ізохронні Молоді гетерохронні
Параметри для кореляції
парабіонти парабіонти
ВФ / ІС спленоцитів r = 0,047 (n = 4) r = - 0,42 (n = 7)
ВФ / Співвідношення
r = 0,19 (n = 5) r = 0,998 * (n = 3)
CD4+/CD8+-клітин селезінки
ВФ / CD4+-клітини селезінки r = 0,019 (n = 7) r = 0,6333 (n = 3)
ВФ / CD8+-клітини селезінки r = - 0,134 (n = 7) r = - 0,9945 # (n = 3)
ФЧ / ІС спленоцитів r = 0,14 (n = 4) r = - 0,44 (n = 7)
ФЧ / Співвідношення
r = - 0,12 (n = 5) r = 0,94 (n = 3)
ФЧ / CD4+-клітини селезінки r = - 0,142 (n = 7) r = 0,83 (n = 3)
ФЧ / CD8+-клітини селезінки r = - 0,16 (n = 7) r = - 0,92 (n = 3)
68
Продовження таблиці 3.3
ФІ / ІС спленоцитів r = 0,39 (n = 4) r = - 0,44 (n = 7)
ФІ / Співвідношення
r = - 0,19 (n = 5) r = 0,98 (n = 3)
ФІ / CD4+-клітини селезінки r = - 0,15 (n = 7) r = 0,744 (n = 3)
ФІ / CD8+-клітини селезінки r = - 0,06 (n = 7) r = - 0,97 (n = 3)
Примітки:
* – Р < 0,05
# – Р = 0,067
Статистично значимих кореляційних зв’язків між субпопуляційним

складом та індексом стимуляції спленоцитів молодих ізохронних парабіонтів
виявлено не було.
Був виявлений сильний позитивний та статистично значимий зв’язок
між співвідношенням CD4+/CD8+-клітин селезінки та відсотком фагоцитозу
МФ селезінки молодих гетерохронних парабіонтів (r = 0,998, P = 0,036).
Також був виявлений сильний негативний зв’язок між відсотком фагоцитозу
та кількістю CD8+-клітин селезінки, хоча статистична значимість даного
зв’язку дуже посередня (r = - 0,9945, P = 0,067).
Отримані дані свідчать про наявність змін у клітинах ніші селезінки
(зокрема параметрів фагоцитозу МФ селезінки) молодих партнерів по
гетерохронному парабіозу. Наявність кореляційного зв’язку між
субпопуляційним складом клітин селезінки та параметрами фагоцитозу МФ
селезінки молодих гетерохронних парабіонтів вказують на зв’язок у стані
Т-лімфоцитів та клітин ніші селезінки досліджуваних тварин.
При цьому фізіологічні параметри тимуса у тварин різних
експериментальних груп показували лише характерні специфічні вікові зміни
(вікове зменшення розмірів та клітинності органу), але значного впливу на
69
розміри тимуса молодих тварин при співіснуванні у парабіотичній парі зі
старою твариною протягом 3 місяців виявлено не було.
Таким чином, зміни у ніші селезінки могли бути причиною негативних
змін в імунній системі молодих тварин при гетерохронному парабіозі та
виявлятися причиною дисфункції периферичної Т-клітинної ланки імунної
системи. На це вказує зниження проліферативної відповіді спленоцитів
молодих тварин, об’єднаних зі старими у парабіотичні пари; зниження
співвідношення CD4+/CD8+-клітин селезінки, цілком імовірно, з-за
збільшення кількості CD8+-клітин та зниження CD4+-клітин селезінки. Також
відмічалося підвищення кількості Т-лімфоцитів селезінки з фенотипом
клітин імунологічної пам’яті. Відмічалося погіршення параметрів фагоцитозу
МФ селезінки у молодих партнерів по гетерохронному парабіозу та показано
зв’язок між параметрами фагоцитозу та субпопуляційним складом Т-
лімфоцитів селезінки.

Більш ніж імовірно, що негативні зміни при гетерохронному парабіозі
можуть розвиватися набагато раніше протягом 12-тижневого співіснування, і
початковий етап формування цих змін може містити важливу інформацію
про регуляторні механізми, залучені у розвитку описаних ефектів.
На даному етапі аналізувалися зміни у Т-клітинній ланці імунної
системи після існування тварин різних експериментальних груп у
парабіотичних парах протягом 6 тижнів, а саме: макроскопічні показники
тимусу та субпопуляційним склад органу, субпопуляційним склад
спленоцитів та аналіз проліферативного відгуку спленоцитів у відповідь на
ФГА, а також показники фагоцитарної активності макрофагів селезінки.
Було проаналізована розмір та клітинність тимусу тварин різних
експериментальних груп після 6 тижнів сумісного існування у парабіотичних
парах (рис. 3.11 та 3.12).
70
Рис. 3.11. Маса (мг) тимусу в тварин різних експериментальних груп

гетерохронні парабіонти; 3 – старі гетерохронні парабіонти; 4 – старі
ізохронні парабіонти.
Примітки:
*** − Р (t) < 0,001 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
### − P (t) < 0,001 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
& – Р (t) < 0,1 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Співіснування молодих та старих тварин у гетерохронних парабіотичних

парах протягом 6 тижнів мало певний негативний вплив на масу та
клітинність тимуса молодих гетерохронних парабіонтів (рис. 3.11, Р (t) = 0,063
та рис. 3.12, Р (t) < 0,05 відповідно).
Варто відмітити лише тенденцію до зменшення маси тимуса молодих
гетерохронних парабіонтів, що не була статистично значимою при рівні
α = 0,05 (рис. 3.11) порівняно з масою тимуса молодих ізохронних
парабіонтів (на 4,53 мг (95% ДІ: -0,243 : 9,29)).
71
Рис. 3.12. Клітинність (106 клітин) тимусу в тварин різних

Примітки:
* – Р (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
*** − Р (t) < 0,001 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
### − P (t) < 0,001 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
## − P (t) < 0,01 відносно молодих гетерохронних парабіонтів.
Клітинність тимусів молодих гетерохронних парабіонтів була

достовірно нижче від клітинності тимусу молодих ізохронних парабіонтів (на
25,93 • 106 клітин (95% ДІ: 3,89 : 47,97)). Хоча при цьому клітинність тимусів
цих тварин була достовірно значно вище від клітинності тимусів старих
гетерохронних парабіонтів (на 20,87 • 106 клітин (95% ДІ: 9,67 : 32,07)) та
старих ізохронних парабіонтів (на 21,68 • 106 клітин (95% ДІ: 9,53 : 33,83)).
Як видно, різниця між клітинністю тимусів молодих гетерохронних
парабіонтів та старих тварин статистично значима, параметри старих
гетерохронних парабіонтів не підвищуються, порівняно з показниками
старих ізохронних парабіонтів.
72
Аналізувався також субпопуляційним склад тимоцитів тварин різних
експериментальних груп (таблиця 3.4). Не було виявлено статистично
значимих відмінностей між субпопуляційним складом тимоцитів молодих
ізохронних та гетерохронних парабіонтів.
Таблиця 3.4
Субпопуляційний склад тимоцитів тварин різних експериментальних
груп після 6 тижнів гетерохронного парабіозу, (M ± m)
Показники Молоді парабіонти Старі парабіонти
Ізохронні Гетерохронні Гетерохронні Ізохронні
CD4-8- клітини, % 8,24 ± 1,75 11,31 ± 2,74 15,1 ± 2,61 * 13,55 ± 2,68
(n = 8) (n = 8) (n = 7) (n = 6)
CD4+8+ клітини, % 56,12 ± 1,5 56,06 ± 5,89 51,28 ± 5,25 57,36 ± 6,87
(n = 8) (n = 8) (n = 7) (n = 6)
CD4+8- клітини, % 15,7 ± 1,1 14,22 ± 1,57 12,26 ± 1,69 α 17,95 ± 1,92
(n = 8) (n = 8) (n = 7) (n = 6)
CD4-8+ клітини, % 6,4 ± 1,15 5,13 ± 0,91 7,85 ± 1,32 7,05 ± 1,52
(n = 8) (n = 8) (n = 7) (n = 6)
Примітки:
* − Р (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів
# − Р (t) < 0,05 відносно старих ізохронних парабіонтів
Як відомо, зниження маси та клітинності тимуса з віком призводять до

його дисфункції [49]. Нами були відмічені певні статистично значимі зміни у
клітинності тимуса молодих партнерів по гетерохронному парабіозу (рис.
3.12). У подальшому (3 місяці гетерохронного парабіозу) різниці у
клітинності та масі тимусів між молодими ізохронними та гетерохронними
парабіонтами не спостерігалося, що може вказувати на корекцію виявленого
зниження цих показників. Можна говорити, що отриманий ефект (певне
зниження маси та клітинності тимусів молодих партнерів по гетерохронних
парабіотичних парах у порівнянні з молодими ізохронними парабіонтами) є
73
тимчасовим та імовірно викликаний травматичністю операції по створенню
парабіотичних пар. Відсутність змін у субпопуляційним складом тимоцитів
між парабіонтами також вказує на відносну інтактність процесів тимопоезу.

субпопуляційного складу Т-лімфоцитів селезінки молодих партнерів по
Було проаналізовано зміни у субпопуляційному складі Т-лімфоцитів
селезінки та проліферативній активності спленоцитів після 6 тижнів
співіснування тварин у парабіотичних парах.
Так, показано, що ІС спленоцитів при стимуляції їх ФГА in vitro не має
достовірних відмінностей між тваринами різних експериментальних груп
(рис. 3.13).
Рис. 3.13. Індекс стимуляції клітин селезінки у досліджуваних групах

тварин після 6 тижнів парабіозу при стимуляції їх за допомогою ФГА,
(М ± m).
74
+ +
Співвідношення CD4 /CD8 -клітин селезінки виявилося зниженим
порівняно з цим показником у молодих ізохронних парабіонтів (на 0,645
(95% ДІ: -0,12 : -1,18), у молодих гетерохронних парабіонтів до рівня старих
ізохронних парабіонтів (рис. 3.14, P (t) < 0,05; різниця середніх статистично
недостовірна (95% ДІ: -0,33 : 0,46)). Згідно результатів попереднього етапу
дослідження, після 3-х місяців співіснування у гетерохронній парабіотичній
парі у молодих тварин відбувається зниження співвідношення
CD4+/CD8+-клітин селезінки завдяки зниженню кількості CD4+ та
збільшенню кількості CD8+ клітин на периферії кровообігу, що може бути
причиною розвитку дисфункції імунологічних параметрів.
Рис. 3.14. Співвідношення CD4+/CD8+ клітин селезінки у досліджуваних

групах тварин після 6 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
* − P (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
& – Р (t) < 0,1 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
75
Подальший аналіз субпопуляційного складу клітин селезінки не показав
статистично достовірних змін у популяційному складі Т-клітин селезінки,
зміни мали лише тенденційний характер.
Так, у молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі
відмічалося певне тенденційне зниження кількості CD4 + клітин та, навпаки,
підвищення кількості CD8+ клітин селезінки, але ці процеси не досягали
рівня достатньої статистичної значимості (рис. 3.15). Значимість
відмінностей між молодими ізохронними і гетерохронними парабіонтами
становила для CD4+- та CD8+-клітин селезінки P (t) = 0,11 та
P (t) = 0,086 відповідно, та не була статистично значимою.
А Б
Рис. 3.15. Вміст CD4+ (А, %) та CD8+ (Б, %) клітин селезінки у
досліджуваних групах тварин після 6 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
* − P (t) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
& − P (t) < 0,1 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
# − P (t) < 0,1 відносно старих гетерохронних парабіонтів.
76
+ +
Проте, співвідношення CD4 /CD8 клітин селезінки у молодих
гетерохронних парабіонтів після 1,5 місяців парабіозу було статистично
достовірно зниженим по відношенню до молодих ізохронних парабіонтів
(рис. 3.14, P (t) < 0,05). Як видно з матеріалу, викладеного раніше, на більш
пізніх строках існування гетерохронних парабіотичних пар (3 місяці)
відбуваються значніші зміни, а тому ефекти, отримані на цьому етапі
досліджень, можна розцінити як ранні прояви дисфункції імунної системи.
Наступним етапом було визначення зв’язку між субпопуляційним
складом Т-лімфоцитів і їх функціональними властивостями. Результати
кореляційного аналізу індексу стимуляції та субпопуляційного складу
спленоцитів наведено у таблиці 3.5.
Таблиця 3.5
Коефіцієнт кореляції r між індексом стимуляції спленоцитів та
субпопуляційним складом спленоцитів молодих партнерів по
гетерохронному парабіозу та молодих ізохронних парабіонтів
після 6 тижнів сумісного існування
Молоді
r = - 0,11 r = 0,8 # r = 0,35
ізохронні
Індекс (n = 6) (n = 6) (n = 6)
парабіонти
стимуляції
Молоді
спленоцитів r = 0,63 r = 0,36 r = - 0,398
гетерохронні
(n = 6) (n = 7) (n = 8)
парабіонти
Примітка.
Р < 0,1
Статистично значимого зв’язку між субпопуляційним складом Т-клітин

селезінки та проліферативною активністю спленоцитів молодих партнерів по
77
гетерохронному парабіозу після 6 тижнів існування у парабіотичних парах
виявлено не було (дані не показано). Був наявний лише тенденційний зв’язок
між проліферативною активністю та кількістю CD4+-клітин селезінки у
молодих ізохронних парабіонтів, але на даному етапі загалом не було
виявлено значимих зв’язків між досліджуваними параметрами.
Відмічалося статистично значиме підвищення выдносної та абсолютної
кількості СD8+44+-клітин (на 1,02% (95% ДІ: 0,26 : 1,78)) в селезінці молодих
партнерів по гетерохронному парабіозу у порівнянні з молодими
ізохронними тваринами (рис. 3.16, Р (t) < 0,05).
А Б
В Г
Рис. 3.16. Відносний вміст CD8+44+ клітин селезінки ( А, % ), відносна
кількість CD8+44+ клітин серед популяції CD8+ клітин селезінки ( Б, % ), а
також та відносний вміст CD4+44+ клітин ( В, % ) та відносна кількість
78
+ + +
CD8 44 клітин серед популяції CD8 клітин селезінки ( Г, % ), (М ± m).
Примітки:
** − Р (t) < 0,01 відносно молодих ізохронних парабіонтів
Навпроти, не було відмічено значимих відмінностей у кількості CD4 +44+

клітин селезінки між тваринами різних експериментальних груп. (рис. 3.16В
та 3.16Г).
Таким чином можна вважати, що найпершими змінами у
субпопуляційному складі Т-лімфоцитів селезінки молодих гетерохронних
парабіонтів є зміщення співвідношення CD4+/8+-клітин селезінки,
підвищення кількості CD8+ та CD8+44+ клітин селезінки без зниження
загальної кількості CD4+-клітин селезінки та без значимого підвищення
CD4+44+-клітин селезінки.
Раніше було вказано, що підтримання нормальної кількості
Т-лімфоцитів у периферичному кровообігу та вторинних лімфоїдних органах
відбувається за рахунок так званої гомеостатичної проліферації [139].
Трофічні фактори, необхідні для повільної проліферації Т-клітин,
синтезуються клітинами ніші вторинних лімфоїдних органів. На
попередньому етапі дослідження було показано, що функціональні
властивості адгерентних клітин селезінки (що складають лімфоїдну нішу
селезінки) молодих тварин підлягають негативним змінам при
гетерохронному парабіозі (зниження здатності до фагоцитозу) протягом 3-х
місяців сумісного існування, а тому наступним етапом дослідження було
визначення параметрів фагоцитозу МФ селезінки тварин.
79
існування
Для перевірки функціонального стану клітин мікрооточення селезінки
був проведений аналіз фагоцитарної активності макрофагів.
Після 6 тижнів парабіозу не було виявлено статистично значимих змін у
параметрах фагоцитозу (відсоток фагоцитозу, фагоцитарний індекс,
фагоцитарне число) МФ селезінки тварин різних експериментальних груп.
Дані наведено у таблиці 3.6.
Таблиця 3.6
Показники функціонального стану адгерентних клітин селезінки тварин
різних експериментальних груп після 6 тижнів парабіозу, (M ± m)
Показники Експериментальні групи
Молоді Старі
Ізохронні Гетерохронні Ізохронні Гетерохронні
Відсоток 53,00 ± 13,6 48,71 ± 13,87 52,71 ± 13,79 58,33 ± 3,94
фагоцитозу, % (n = 10) (n = 7) (n = 7) (n = 6)
Фагоцитарне 2,19 ± 0,81 1,92 ± 0,94 2,14 ± 0,56 2,42 ± 0,56
число, у. од. (n = 10) (n = 7) (n = 7) (n = 6)
Фагоцитарний 4,00 ± 0,59 3,80 ± 0,86 4,03 ± 0,22 4,17 ± 0,9
індекс, у. од. (n = 10) (n = 7) (n = 7) (n = 6)
Через 1,5 місяці існування у гетерохронних парабіотичних парах було

відмічено ранні зміни у субпопуляційному складі Т-лімфоцитів селезінки,
але змін у функціональних параметрах Т-лімфоцитів або клітин лімфоїдної
ніші селезінки відмічено не було.
Дані кореляційного аналізу функцій МФ та Т-лімфоцитів селезінки
наведено у таблиці 3.7. У молодих партнерів по гетерохронним
парабіотичним парам не було виявлено кореляційного зв’язку між
80
проліферативною активністю і субпопуляційним складом Т-лімфоцитів
селезінки та показниками фагоцитозу МФ селезінки.
Таблиця 3.7
Коефіцієнт кореляції r між індексом стимуляції і популяційним складом
клітин селезінки та параметрами фагоцитозу МФ селезінки молодих
ізохронних парабіонтів після 6 тижнів сумісного існування
ВФ / ІС спленоцитів r = 0,59 (n = 8) r = - 0,6 (n = 6)
ВФ / Співвідношення
r = 0,29 (n = 6) r = - 0,81 (n = 3)
ВФ / CD4+-клітини селезінки r = - 0,28 (n = 6) r = - 0,94 (n = 4)
ВФ / CD8+-клітини селезінки r = - 0,46 (n = 6) r = 0,1 (n = 5)
ФЧ / ІС спленоцитів r = 0,72 * (n = 8) r = - 0,57 (n = 6)
ФЧ / Співвідношення
r = - 0,06 (n = 6) r = - 0,49 (n = 3)
ФЧ / CD4+-клітини селезінки r = 0,06 (n = 6) r = - 0,71 (n = 4)
ФЧ / CD8+-клітини селезінки r = - 0,055 (n = 6) r = - 0,017 (n = 5)
ФІ / ІС спленоцитів r = 0,86 ** (n = 8) r = - 0,21 (n = 6)

ФІ / Співвідношення
r = - 0,58 (n = 6) r = - 0,35 (n = 3)
ФІ / CD4+-клітини селезінки r = 0,58 (n = 6) r = - 0,59 (n = 4)
ФІ / CD8+-клітини селезінки r = 0,61 (n = 6) r = - 0,032 (n = 5)
Примітки:
* – Р < 0,05;
** – Р < 0,01.
У підсумку, на моделі гетерохронного парабіозу тривалістю 12 тижнів

було отримано індукцію вікових змін у Т-клітинній ланці імунної системи,
81
що виражалася у порушенні субпопуляційного складу Т-клітин селезінки та у
зниженні їх проліферативної активності в умовах in vitro. Також було
виявлено негативні зміни у функціональних властивостях МФ селезінки
молодих партнерів по гетерохроній парабіотичній парі. Було
продемонстровано наявність зв’язку між змінами у фагоцитарних
властивостях МФ селезінки та субпопуляційного складу Т-клітин селезінки.
Це супроводжувалося відсутністю статистично значимих змін у масі та
клітинності тимуса молодих гетерохронних парабіонтів. Згідно попередніх
робіт [138], існування у гетерохронних парабіотичних парах негативно
впливало на показники імунної реактивності молодих тварин (зниження
ефективності продукції та цитотоксичності антитіл при імунізації). Отримані
дані вказують на важливість в розвитку вікових змін
Т-клітин у периферичних лімфоїдних органах.
Співіснування тварин у гетерохронній парабіотичній парі протягом 6
тижнів не викликало таких значимих змін у стані Т-лімфоцитів, як при більш
тривалому парабіозі, хоча відмічалася індукція змін виключно у
субпопуляційному складі Т-лімфоцитів і, що важливо, це супроводжувалося
статистично значимим підвищенням кількості CD8+44+ клітин у селезінці. У
численних роботах показано, що утворення та підтримання популяції клітин
цього типу значною мірою залежить від клітин їх ніші у периферичних
лімфоїдних органів [45], що вказує на можливі зміни у стані клітин ніші Т-
лімфоцитів периферичних лімфоїдних органів.
Протягом наступного етапу дослідження розкриваються зміни у
здатності клітин лімфоїдної ніші ВЛО впливати на проліферативну
активність Т-лімфоцитів в умовах in vitro.
Результати цього розділу роботи опубліковані в наступних виданнях:

1. Пишель И. Н., Дубилей Т. А., Родниченко А. Е., Утко Н. А., Леонов Ю.
И., Мигован С. А., Азарскова М. В., Кирик В. М., Шитиков Д. В., Бадова
Т. А., Евтушенко О. А., Клименко П. П., Ахаладзе Н. Г., Варус В. И.,
82
Мурадян Х. К., Бутенко Г. М. Прогрессивное снижение
иммунологических функций при гетерохронном парабиозе (результаты
предварительного исследования). // Проблемы старения и долголетия. –
2008. – Т. 17, №2. – С. 164-172.
2. Шитиков Д.В., Янкова Т. Н., Родниченко А.Е., Пишель И.Н. Индукция
возрастных изменений в Т-клеточном звене иммунной системы у
молодых партнеров по гетерохронному парабиозу // Проблемы старения и
долголетия. – 2013. – Т. 22, №1. – С. 29–39.
3. Шитиков Д.В., Родниченко А.Е., Пишель И.Н. Ранние проявления
индукции возрастных изменений Т-клеточного звена иммунной системы
молодого животного при гетерохронном парабиозе // Аллергология и
иммунология: наука и практика. – 2013. – Т. 1, №1. – С. 71–75.
4. Pishel I., Shytikov D., Orlova T., Peregudov A., Artyuhov I., Butenko G.
Accelerated aging versus rejuvenation of the immune system in heterochronic
parabiosis // Rejuvenation Res. – 2012. – Vol. 15, № 2. – Р. 239–248.
83
РОЗДІЛ 4
ЗМІНИ В КОСТИМУЛЯТОРНЙ ДІЇ КЛІТИН ЛІМФОЇДНОЇ НІШІ
СЕЛЕЗІНКИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ Т-КЛІТИН
IN VITRO ПІД ВПЛИВОМ ГЕТЕРОХРОННОГО ПАРАБІОЗУ
4.1. Зміни у проліферативній активності Т-лімфоцитів тварин різних

експериментальних груп при їх стимуляції за допомогою ФГА in vitro
Центральним питанням, яке постало в результаті попередніх етапів
дослідження, було виявлення причин дисфункції Т-клітинної ланки імунної
системи, що було отримано раніше, та охарактеризувати роль у цьому
процесі клітин їх ніші у периферичних лімфоїдних органах. При парабіозі
відбувається об’єднання кровопостачання між партнерами, і це дає змогу їм
обмінюватись клітинними та гуморальними факторами. Причина дисфункції
імунної системи при гетерохронному парабіозі може полягати у змінах
клітин лімфоїдної ніші селезінки молодих гетерохронних парабіонтів.
Метою даного етапу досліджень було виявлення популяції клітин, що
відповідає за розвиток порушень Т-клітинної ланки імунної системи при
гетерохронному парабіозі.
Основною характеристикою функцій Т-лімфоцитів було обрано
проліферативну активність при стимуляції, оскільки цей параметр підлягає
негативним змінам при старінні. На попередніх етапах дослідження ми
спостерігали прояви порушень проліферації спленоцитів при їх стимуляції за
допомогою Т-клітинного мітогену ФГА.
Було проаналізовано проліферативну активність популяції спленоцитів
при стимуляції їх ФГА (рис. 4.1). Як і на попередньому етапі досліджень, ми
не отримали статистично достовірних відмінностей у рівні проліферації
спленоцитів ані між молодими і старими гетерохронними парабіонтами, ані
між гетерохронними парабіонтами взагалі, ані між старими або молодими
ізохронними парабіонтами.
84
Рис. 4.1. Індекс стимуляції спленоцитів досліджуваних груп тварин після

6 тижнів парабіозу у відповідь на стимуляцію ФГА, (М ± m).
Примітка.
Статистично значима різниця у індексі стимуляції (на 1,5 у.од. (95% ДІ:
0,3 : 2,7)) спостерігалася між стимульованими спленоцитами старих та
молодих ізохронних парабіонтів (рис. 4.1, Р (t) < 0,05). Зниження
проліферативної активності спленоцитів молодих гетерохронних парабіонтів
у порівнянні з молодими ізохронними було лише тенденційним (Р (t) = 0,11).
Це може вказувати на те, що після 6 тижнів сумісного існування зміни в
Т-клітинній ланці імунної системи в молодих гетерохронних парабіонтів
лише починали розвиватися; це також узгоджується з даними, отриманими
раніше (рис. 3.13).
Оскільки цільна популяція спленоцитів складається з великої кількості
типів клітин, то роль дисфункції саме Т-лімфоцитів залишалася
невисвітленою на такій модельній системі.
85
Саме тому було перевірено зміни у проліферативній відповіді саме Т-
лімфоцитів селезінки, очищених за допомогою нейлонової вати. Було
виявлено, що статистично значиме зниження проліферативної активності Т-
лімфоцитів селезінки молодих гетерохронних парабіонтів (на 0,71 у.од. (95%
ДІ: -0,041 : -1,63)) у порівнянні з проліферативною активністю Т-клітин
молодих ізохронних парабіонтів, що виступали як віковий контроль (рис. 4.2,
Р (t) < 0,05) аж до рівня проліферації старих тварин, у той час як Т-лімфоцити
старих гетерохронних парабіонтів не показували на відновлення рівня
проліферативної активності.
Рис. 4.2. Індекс стимуляції Т-клітин селезінки у досліджуваних групах

тварин після 6 тижнів парабіозу у відповідь на стимуляцію ФГА, (М ± m).
Примітка.
Це вказує на порушення функцій Т-лімфоцитів селезінки молодих

86
4.2. Зміни у здатності клітин лімфоїдної ніші селезінки
костимулювати проліферацію Т-лімфоцитів тварин різних
експериментальних груп при їх стимуляції за допомогою ФГА in vitro
Відомо, що функціонування Т-лімфоцитів значною мірою залежить від
їх мікрооточення [62]. Аналізуючи фагоцитарну активність загальної
популяції адгерентних клітин селезінки експериментальних тварин, в межах
даної роботи було перевірено функціональний стан клітин мікрооточення
селезінки. Після 12 тижнів гетерохронного парабіозу було відмічено значні
зміни у фагоцитарній активності МФ селезінки молодих гетерохронних
парабіонтів. Це дало можливість зробити припущення про наявність
важливих змін у інших функціональних параметрах цих клітин, у тому числі
й на більш ранніх етапах сумісного існування тварин у парабіотичних парах.
Функціонування Т-лімфоцитів значною мірою залежить від
костимуляторних сигналів від клітин їх мікрооточення [140]. Ці стимули
здатні впливати на диференціацію, міграційні процеси Т-клітин, а також на
проліферативну активність Т-лімфоцитів.
Метою даного етапу дослідження було виявлення популяції клітин ніші
селезінки, що мають найбільший вплив на проліферативну активність
Т-лімфоцитів. Саме тому було перевірено вплив різних популяцій клітин
ніші селезінки тварин різних експериментальних груп на костимуляцію
проліферативної активності Т-лімфоцитів селезінки тварин in vitro. Аналізу
підлягав проліферативний відгук Т-лімфоцитів при стимуляції їх ФГА та
сумісному культивуванні з цільною популяцією ДК (схема культивування 1)
або цільною популяцією МФ селезінки тварин цієї ж експериментальної
групи (схема культивування 3). Дані викладено на рис. 4.3 та 4.4 відповідно.
Було відмічено відсутність впливу гетерохронного парабіозу на
костимуляторні властивості ДК селезінки молодих партнерів по
гетерохронній парабіотичній парі. Т-клітини від молодих гетерохронних
парабіонтів мали достовірно вищий ІС у порівнянні як з Т-клітинами
селезінки старих гетерохронних парабіонтів (на 0,75 у.од. (95% ДІ:
87
0,07 : 1,44); Р (t) < 0,05), так і Т-клітинами селезінки старих ізохронних
парабіонтів (Р (t) < 0,05; різниця середніх: 1,23 у.од. (95% ДІ: 0,48 : 1,97)).
Дані наведено на рис. 4.3.
Рис. 4.3. Індекс стимуляції Т-клітин селезінки тварин різних

експериментальних груп у присутності цільної популяції аутологічних ДК
селезінки після 6 тижнів парабіозу, (М ± m).
Примітки:
# − P (t) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів.
Різниця у ІС Т-лімфоцитів молодих ізохронних та гетерохронних

парабіонтів не була достовірною (0,32 у.од., 95% ДІ: -0,29 : 0,93; рис. 4.3).
Однак ІС Т-лімфоцитів від молодих гетерохронних парабіонтів при їх
сумісному культивуванні з МФ селезінки тварин власної експериментальної
групи була значно знижена у порівнянні з Т-лімфоцитами селезінки молодих
ізохронних парабіонтів (на 1,51 у.од. (95% ДІ: 0,55 : 2,46)) аж до рівня
88
Т-лімфоцитів селезінки старих гетерохронних парабіонтів (Рис. 4.4,
Р (t) < 0,05).
Рис. 4.4. Індекс проліферації Т-клітин селезінки тварин різних

експериментальних груп у присутності тотальної популяції аутологічних МФ
Примітка.
*** − Р (t) < 0,005 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Видно, що властивості ДК селезінки молодих тварин, об’єднаних зі

старими, костимулювати проліферативну активність Т-лімфоцитів, не
зазнають таких виражених змін, які зазнали костимуляторні властивості МФ
селезінки молодих партнерів по гетерохроній парабіотичній парі. Даний
ефект можна пояснити неактивною міграцією ДК між партнерами по
парабіотичній парі [63].
Таким чином можна припустити, що зміни у стані популяції МФ
селезінки відіграють більш значну роль у розвитку негативних змін у
89
популяції Т-клітин селезінки молодого гетерохронного парабіонту, ніж зміни
у стані популяції ДК. Відкритим залишалося питання про можливість
корекції здатності клітин ніші ВЛО костимулювати проліферативну
активність Т-лімфоцитів при їх стимуляції.
4.3. Вплив клітин лімфоїдної ніші селезінки молодих інтактних

тварин на проліферативну активність Т-лімфоцитів тварин різних
експериментальних груп
Можливість корекції костимуляторних властивостей проліферативної
активності Т-лімфоцитів селезінки перевірялася сумісним культивуванням
Т-лімфоцитів з клітинами ніші селезінки молодих інтактних тварин,
цільними популяціями ДК або МФ селезінки (схема культивування 2 та 4
відповідно). Дані дослідження наведено на рис. 4.5 та 4.6 відповідно.

експериментальних груп після 6 тижнів парабіозу у присутності популяції
ДК селезінки сингенних молодих інтактних тварин, (М ± m).
90
Примітки:
# − P (t) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів
Виявилося, що навіть при сумісному культивуванні з ДК селезінки

молодих інтактних тварин індекс стимуляції Т-лімфоцитів селезінки старих
тварин (від старих гетерохронних або ізохронних парабіонтів) був все одно
статистично достовірно нижче від індексу стимуляції Т-лімфоцитів селезінки
молодих гетерохронних (на 0,54 у.од. (95% ДІ: 0,12 : 1,19)) та ізохронних
парабіонтів (на 0,69 у.од. (95% ДІ: 0,015 : 1,4)). Дані наведено на рис. 4.5,
Р (t) < 0,05. Різниця ІС Т-лімфоцитів селезінки молодих гетерохронних та
ізохронних парабіонтів була статистично не значимою (на 0,68 у.од. (95% ДІ:
-1,62 : 1,31)).
Вплив МФ селезінки молодих інтактних тварин на ІС Т-лімфоцитів
парабіонтів в умовах in vitro показано на рис. 4.6.

експериментальних груп після 6 тижнів парабіозу у присутності популяції
МФ селезінки сингенних молодих інтактних тварин, (М ± m).
91
Примітки:
# − P (t) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
& − P (t) < 0,01 відносно старих гетерохронних парабіонтів.
При культивуванні разом з МФ селезінки молодих інтактних тварин ІС

Т-лімфоцитів селезінки старих ізохронних парабіонтів був статистично
достовірно вищим у порівнянні з ІС Т-клітин тварин інших
експериментальних груп (рис. 4.6, Р (t) < 0,05), зокрема вище ІС Т-лімфоцитів
селезінки молодих ізохронних парабіонтів на 0,89 у.од. (95% ДІ: 0,25 : 1,53),
вище ІС Т-клітин молодих гетерохронних парабіонтів на 1 у.од. (95% ДІ:
0,23 : 1,78), та вище ІС Т-клітин селезінки старих гетерохронних парабіонтів
на 1,03 у.од. (95% ДІ: 0,34 : 1,71). ІС Т-лімфоцитів селезінки інших груп між
собою не відрізнялися (рис. 4.6, Р (t) > 0,05).
Аналіз змін проліферативної активності Т-лімфоцитів селезінки старих
ізохронних парабіонтів при різних умовах активації наведено на рис. 4.7.
Рис. 4.7. Індекс стимуляції Т-клітин селезінки старих ізохронних

парабіонтів після 6 тижнів парабіозу при різних умовах культивування, (М ±
m).
92
Позначення груп : 1 – спленоцити, 2 – Т-лімфоцити, 3 – Т-лімфоцити з
аутологічними макрофагами селезінки, 4 – Т-лімфоцити з макрофагами
Примітка.
* − Р (t) < 0,05 відносно групи 4
** − Р (t) < 0,01 відносно групи 4
Було показано статистично достовірне підвищення проліферативної

активності Т-лімфоцитів старих ізохронних парабіонтів при стимуляції у
присутності МФ селезінки молодих тварин порівняно з Т-лімфоцитами,
культивованими з МФ селезінки тварин своєї ж експериментальної групи (на
0,67 у.од., 95% ДІ: 0,013 : 1,36; P(t) < 0,05), а також порівняно з Т-
лімфоцитами, стимульованими у суспензії спленоцитів (на 1,14 у.од. (95% ДІ
: 0,52 : 1,76); P(t) < 0,01), або очищеної суспензії Т-лімфоцитів (на 1,34 у.од.,
(95% ДІ : 0,57 : 2,12); P(t) < 0,01). На основі цього був зроблений висновок про
можливість корекції вікових порушень Т-лімфоцитів з допомогою корекції
клітин, що складають їх нішу у периферичних лімфоїдних органах.
У висновку можна сказати, що розвиток вікових змін в імунній системі
може залежати від змін у клітинах ніші периферичних лімфоїдних органів,
зокрема селезінки. При цьому відбуваються зміни як у функціональній
активності клітин ніші, так і зміни у костимуляторних властивостях.
Виявилося, що при гетерохронному парабіозі костимуляторні
властивості МФ селезінки підлягали найбільш значним змінам порівняно зі
ДК і завдяки їх корекції можливим є відновлення функцій Т-лімфоцитів.
Дослідження внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, що можуть
відповідати за порушення роботи Т-лімфоцитів, було метою наступного
етапу роботи.
93
1. Шитіков Д.В., Шкумат М.С., Бальва О.В., Янкова Т.М., Пішель І.М.
Зміни рівня проліферації Т-лімфоцитів під впливом клітин лімфоїдної
ніші (дослідження на моделі гетерохронного парабіозу) // Проблемы
старения и долголетия. – 2014. – Т. 23, №2. – С. 113–125.
2. Dmytro W. Shytikov, Maryna S. Shkumat, Tetiana M. Yankova, Alex G.
Peregudov, Igor V. Artyuhov, Iryna M. Pishel. Splenic Niche Cells from
Young Heterochronic Parabionts Have Decreased Capability to Amplify T-cell
Proliferation in Vitro // American Journal of BioScience. – 2015. – Vol. 3, №.
2. – Р. 46-54.
94
РОЗДІЛ 5
ЗМІНИ У МОЛЕКУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМАХ АКТИВАЦІЇ
Т-ЛІМФОЦИТІВ IN VITRO ПІД ВПЛИВОМ КЛІТИН ЛІМФОЇДНОЇ
НІШІ СЕЛЕЗІНКИ ПРИ ГЕТЕРОХРОННОМУ ПАРАБІОЗІ
5.1 Зміни у молекулярних механізмах регуляції проліферації

Т-лімфоцитів тварин різних експериментальних груп при сумісній
культивації з аутологічними МФ селезінки
Протягом попереднього етапу роботи ми виявили, що при
гетерохронному парабіозі відбуваються зміни у Т-клітинній ланці імунної
системи та у клітинах ніші ВЛО, зокрема у популяції МФ селезінки. При
цьому виявилося, що обмін певними типами клітин між партнерами здатний
призвести до дисфункції імунної системи. Так, відомо, що при парабіозі
відбувається активне заселення вторинних лімфоїдних органів парабіонтів
клітинами, здатними до міграції, у той час як резидентні клітини ніші ВЛО і
ДК селезінки майже не підлягають обміну [63]. В ході нашого експерименту
виявилося, що при гетерохронному парабіозі костимуляторні властивості ДК
майже не змінюються, у той час як популяція МФ селезінки, навпаки, значно
змінила свою здатність костимулювати проліферацію Т-лімфоцитів.
У подальшому було перевірено можливість корекції проліферативної
активності Т-лімфоцитів тварин різних експериментальних груп при
сумісному культивуванні з ДК або МФ селезінки молодих інтактних тварин.
Виявилося, що саме МФ селезінки молодих тварин були здатні відновлювати
проліферативну активність Т-лімфоцитів селезінки старих тварин. Це вказує
на виключну роль змін у властивостях МФ лімфоїдних органів в розвитку
дисфункції імунної системи з віком, і що їх заміна або корекція може мати
значні практичні перспективи. Вікові зміни у молекулярних механізмах
активації Т-лімфоцитів вимагають подальшої характеризації.
95
Для цього ми провели культивування Т-лімфоцитів селезінки тварин
різних експериментальних груп in vitro разом з цільною популяцією МФ
селезінки тварин різних експериментальних груп (схема культивування 5)
протягом 2 та 18 годин для аналізу відносної експресії елементів каскаду
активації NFκB та активацію каспази 3. Дані викладено на рисунках 5.1-5.3
(2 години стимуляції) та на рисунках 5.4-5.6 (18 годин стимуляції).
Рис. 5.1. Зміни у відносній експресії білку NFκB p65 у Т-лімфоцитах

селезінки тварин різних експериментальних груп під впливом аутологічних
МФ селезінки протягом 2-х годин стимуляції, (M ± m).
Примітки:
* − Р (U) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
# − Р (U) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
& − Р (U) < 0,05 відносно старих гетерохронних парабіонтів.
Для цього аналізувався відносний вміст у цільноклітинному лізаті ряду

ключових сигнальних білків по відношенню до їх вмісту у цільноклітинному
лізаті Т-лімфоцитів молодих ізохронних парабіонтів. Аналізувався вміст
96
транскрипційного фактору NFκB p65 та його інгібітора IκBα, а також вміст
активованої форми каспази 3, а саме білку р20, який утворюється при
активації апоптозу під дією зовнішніх та внутрішніх стимулів, у
досліджуваних лізатах суспензії Т-лімфоцитів.
Рис. 5.2. Зміни у відносній експресії білку IκBα у Т-лімфоцитах

Примітка.
* − Р (U) < 0,05 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Було виявлено, що Т-лімфоцити старих ізохронних парабіонтів після 2-х

годин стимуляції ФГА мали знижену експресію NFκB p65 та знижену
експресію активованої форми каспази 3 (рис. 5.1 та 5.3 відповідно,
Р (U) < 0,05). В Т-лімфоцитах молодих гетерохронних парабіонтів відмічалося
зниження експресії NFκB p65 до рівня старих ізохронних парабіонтів, у той
час як експресія активованої форми каспази 3 була на рівні молодих
97
ізохронних тварин (рис. 5.1, Р (U) < 0,05 та рис. 5.3 відповідно). Також ми
виявили статистично достовірне підвищення експресії білка IκBα у
Т-лімфоцитах молодих гетерохронних парабіонтів (рис. 5.2, Р (U) < 0,05).
Рис. 5.3. Зміни у відносній експресії активованої каспази 3 у

Т-лімфоцитах селезінки тварин різних експериментальних груп під впливом
аутологічних МФ селезінки протягом 2-х годин стимуляції, (M ± m).
Примітки:
# − P (U) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів
Був відмічений досить високий рівень експресії активованої форми

каспази 3 у Т-лімфоцитів селезінки молодих ізохронних та гетерохронних
парабіонтів у порівнянні зі старими ізохронними та гетерохронними
парабіонтами (рис. 5.3). За даними літератури відомо, що активація каспази 3
при проліферації Т-лімфоцитів є критично необхідним сигнальним явищем
[141], що відбувається на ранніх етапах активації
98
Т-лімфоцитів, а порушення механізму розвитку апоптозу у Т-лімфоцитів
старих донорів є задокументованим фактом [10].
Результати стимуляції протягом 18 годин показано на рис. 5.4-5.6.
Рис. 5.4. Зміни у відносній експресії білка NFκB p65 у Т-лімфоцитах

Після 18 годин активації Т-лімфоцитів селезінки експериментальних

тварин при їх сумісній культивації з макрофагами селезінки відбулося
вирівнювання експресії NFκB p65 між Т-клітинами від різних
експериментальних груп (рис. 5.4). Статистично значимої різниці у відносній
експресії даного білку між групами виявлено не було.
99
Рис. 5.5. Зміни у відносній експресії білка IκBα у Т-лімфоцитах

Примітки:
** − Р (U) < 0,01 відносно молодих ізохронних парабіонтів;
# − P (U) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів
Було відмічено статистично достовірне підвищення експресії IκBα у

Т-лімфоцитах від молодих партнерів по гетерохронним парабіотичним парам
при їх культивації з МФ селезінки тварин своєї ж експериментальної групи
після 18 годин стимуляції in vitro (рис. 5.5, Р (U) < 0,01). Була відмічена
достовірно знижена відносна експресія ІκВα у Т-лімфоцитах старих
гетерохронних парабіонтів порівняно з експресією даного фактору у
Т-лімфоцитах молодих гетерохронних парабіонтів.
При цьому різниці у експресії цього фактору між Т-лімфоцитами
молодих та старих (ізохронних та гетерохронних) тварин відмічено не було.
100
Рис. 5.6. Зміни у відносній експресії активованої каспази 3 у

аутологічних МФ селезінки протягом 18-х годин стимуляції, (M ± m).
Примітки:
# − P (U) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів;
## − Р (U) < 0,01 відносно молодих гетерохронних парабіонтів.
Експресія активованої форми каспази 3 не вирівнялася між різними

віковими групами (старими і молодими тваринами), так і залишилася на
статистично достовірно вищому рівні саме у молодих тварин (рис. 5.6,
Р (U) < 0,05). Також нами не було відмічено слідів неактивованої форми
даного білка.
101
Даний експеримент висвітлював роль лише декількох ключових
факторів, що відіграють головну роль у стимульованої мітогеном
проліферації Т-лімфоцитів. Проте, було виявлено різницю між відповіддю
Т-лімфоцитів тварин різних експериментальних груп та було показано вплив
на молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів з боку МФ селезінки. Так,
у молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі відмічалася
знижена експресія NFκB p65 на початкових етапах активації та підвищена
експресії IκBα. Це могло мати негативні наслідки для розвитку
проліферативної відповіді Т-лімфоцитів селезінки молодих гетерохронних
парабіонтів у створених нами умовах in vitro.
5.2. Зміни у молекулярних механізмах регуляції проліферації

Т-лімфоцитів тварин різних експериментальних груп при сумісній
культивації з МФ селезінки молодих інтактних тварин in vitro
На попередньому етапі дослідження було виявлено, що при активації
Т-лімфоцитів у присутності МФ селезінки молодих інтактних тварин
Т-клітини тварин різних експериментальних груп мали однаковий рівень
проліферативної активності і, більш того, Т-лімфоцити старих ізохронних
парабіонтів мали індекс стимуляції вищий від індексу стимуляції Т-клітин
селезінки тварин інших експериментальних груп (рис. 4.6, Р (t) < 0,05).
Постало питання про зміни у молекулярних механізмах активації Т-клітин
при культивуванні їх з МФ молодих інтактних тварин.
Т-лімфоцити культивувалися згідно схеми культивації 6 протягом 2-х
або 18 годин. У подальшому проводився лізис Т-клітин та аналіз
молекулярних механізмів активації. Для цього вимірювався відносний вміст
аналізованих сигнальних білків (по відношенню до вмісту цих білків у
лізатах Т-клітин від молодих інтактних тварин). Клітини стимулювалися в
умовах in vitro таким же чином, як і на попередньому етапі дослідження.
Результати даного етапу досліджень наведено на рисунках 5.7-5.9 для
2 годин стимуляції і 5.10-5.11 – для 18 годин.
102
Рис. 5.7. Зміни у відносній експресії білка NFκB p65 у Т-лімфоцитах

селезінки тварин різних експериментальних груп під впливом МФ селезінки
сингенних молодих інтактних тварин протягом 2 годин стимуляції, (M ± m).
У Т-клітинах від старих ізохронних парабіонтів вже після 2-х годин

стимуляції у присутності МФ селезінки молодих тварин не відмічається
статистично значимих відмінностей у експресії NFκB p65 між групами (рис.
5.7). Проте це не може говорити про відновлення експресії NFκB p65 в Т-
клітинах старих ізохронних парабіонтів.
При цьому відмічається, що відносна кількість IκBα у Т-клітинах
селезінки старих ізохронних та молодих гетерохронних парабіонтів
достовірно вища (рис. 5.8, Р (U) < 0,05), ніж в Т-клітинах молодих ізохронних
тварин. Одночасно вміст ІκВα у Т-лімфоцитах старих партнерів по
гетерохронній парабіотичній парі знижувався, порівняно з молодими
ізохронними парабіонтами.
103
Рис. 5.8. Зміни у відносній експресії білка IκBα у Т-лімфоцитах

селезінки тварин різних експериментальних груп під впливом МФ селезінки
сингенних молодих інтактних тварин протягом 2 годин стимуляції, (M ± m).
Примітки:
& − P (U) < 0,1 відносно старих ізохронних парабіонтів.
При цьому рівень активації каспази 3 був однаково низьким у Т-клітин

селезінки тварин всіх експериментальних груп, порівняно з Т-клітинами
молодих ізохронних парабіонтів (рис. 5.9, Р (U) < 0,01). Достовірно низьким
(на рівні старих ізохронних парабіонтів) виявився рівень експресії
активованої форми каспази 3 і у Т-лімфоцитів молодих партнерів по
гетерохронній парабіотичній парі. Експресія каспази 3 р20 у активованих
Т-лімфоцитах селезінки старих партнерів по гетерохронній парабіотичній
парі була також статистично достовірно нижче від експресії каспази 3 р20 у
Т-лімфоцитах молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі
(Р (U) < 0,05).
104
Рис. 5.9. Зміни у відносній експресії активованої форми каспази 3 у

МФ селезінки сингенних молодих інтактних тварин протягом 2 годин
стимуляції, (M ± m).
Примітки:
# − P (U) < 0,05 відносно молодих гетерохронних парабіонтів.
Рівень сигнальних білків на більш пізніх етапах стимуляції, після 18

годин стимуляції, показав іншу картину. Відносний рівень експресії
транскрипційного фактору NFκB p65 був достовірно вище у Т-лімфоцитах
молодих ізохронних та гетерохронних парабіонтів, ніж у Т-клітин від старих
тварин (рис. 5.10А, Р (U) < 0,05), у той час як відносний рівень експресії ІκBα
не відрізнявся між Т-клітинами тварин різних експериментальних груп
(рис. 5.10Б). Експресія NFκB p65 не відрізнялася між
Т-лімфоцитами старих тварин (старих ізохронних та гетерохронних
парабіонтів).
105
А Б
Рис. 5.10. Зміни у відносній експресії білків NFκB p65 (A) та IκBα (Б) у
Примітки:
& − Р (U) < 0,1 відносно молодих ізохронних парабіонтів.
Рівень експресії активованої форми каспази 3 у Т-клітин старих

ізохронних парабіонтів після 18 годин стимуляції підвищувалася до рівня
молодих гетерохронних та ізохронних тварин (рис. 5.11, P (U) > 0,1).
Достовірно низькою була експресія каспази 3 р20 у Т-лімфоцитів старих
гетерохронних парабіонтів по відношенню до молодих ізохронних
парабіонтів (P (U) < 0,05). Різниця у експресії між Т-клітинами старих та
молодих гетерохронних парабіонтів була тенденційною (P (U) < 0,1).
Відсутньою вона була і при порівнянні відносної експресії каспази 3 р20
у Т-лімфоцитах старих гетерохронних та ізохронних парабіонтів.
106
Рис. 5.11. Зміни у відносній експресії активованої форми каспази 3 у

Показано середнє значення (центральний маркер) та стандартна похибка
середнього значення (вертикальні межі розкидів).
Примітки:
& − P (U) < 0,1 відносно молодих гетерохронних парабіонтів.
Ці дані показують, що проліферативна активність Т-лімфоцитів старих

ізохронних парабіонтів у присутності МФ селезінки молодих тварин
підвищується порівняно з умовами, коли стимуляцію проводили у
присутності МФ селезінки тварин своєї ж експериментальної групи. Але
видно, що це не супроводжується значимою відмінністю у експресії
сигнальних білків, зокрема транскрипційного фактору NFκB p65 або його
інгібітору, IκBα.
107
5.3. Rореляції між експресією ключових сигнальних регуляторних
молекул та проліферативною активністю Т-лімфоцитів старих
ізохронних парабіонтів при сумісному культивуванні з МФ селезінки
тварин різних експериментальних груп
Як було сказано раніше, проліферація Т-лімфоцитів старих ізохронних
тварин при їх культивації разом з макрофагами селезінки молодих тварин
вищою від проліферацію Т-клітин інших експериментальних груп,
культивованих у таких же умовах (рис. 4.6 та 4.7, P (t) < 0,05).
Для виявлення кореляційного зв’язку між експресією окремих
сигнальних білків та проліферативної відповіді Т-лімфоцитів селезінки
старих ізохронних парабіонтів при їх стимуляції у присутності МФ молодих
інтактних тварин або МФ тварин своєї ж експериментальної групи було
проведено аналіз за методом лінійної кореляції Пірсона (таблиця 5.1).
Таблиця 5.1.
Коефіцієнт кореляції r між ІС Т-лімфоцитів старих ізохронних
парабіонтів при стимуляції їх у присутності МФ тварин різних
експериментальних груп і відносною експресією сигнальних білків
ІС Т-лімфоцитів Відносна експресія сигнальних білків у цільноклітинних
при культивації лізатах після 18 годин стимуляції
разом з: NFκB p65, % IκBα, % Каспаза 3 р20, %
МФ селезінки
r = 0,256 r = - 0,97 ** r = 0,034
тварин своєї ж
(n = 3) (n = 4) (n = 3)
групи
МФ селезінки
r = 0,32 r = - 0,93 * r = 0,996 **
молодих
(n = 3) (n = 4) (n = 4)
інтактних тварин
Примітки:
* – Р < 0,05
** – Р < 0,01
108
Було показано наявність чіткого кореляційного зв’язку між експресією
каспази 3 р20 та проліферацією Т-лімфоцитів при їх стимуляції у присутності
МФ селезінки молодих тварин in vitro (таблиця 5.1, коефіцієнт кореляції
r > 0,9, P < 0,01), чого не було відмічено при сумісному культивуванні з МФ
селезінки старих же ізохронних парабіонтів. Це вказує на значний зв’язок
між досліджуваними показниками.
Було виявлено негативний та статистично достовірний зв’язок між
проліферативною активністю Т-лімфоцитів та відносною експресією білка
IκBα при їх сумісному культивуванні з МФ селезінки як молодих інтактних
тварин, так і старих ізохронних парабіонтів (таблиця 5.1, коефіцієнт
кореляції r > 0,9, P < 0,05).
Значимої та чіткої кореляції між проліферативною активністю
Т-лімфоцитів при обох схемах культивування та відносною експресією
транскрипційного фактору NFκB p65 не виявлено (таблиця 5.1).
У ході даного етапу досліджень було продемонстровано негативний
кореляційний зв’язок між експресією інгібіторного фактору ІκВα та
проліферативною активністю Т-лімфоцитів. Також було показано чіткий
позитивний кореляційний зв’язок між активацією каспази 3 у Т-лімфоцитах
селезінки старих ізохронних парабіонтів та їх проліферативною активністю у
присутності МФ селезінки молодих інтактних тварин.
Таким чином, на даному етапі ми побачили зміни у молекулярних
механізмах активації Т-лімфоцитів при їх сумісному культивуванні разом з
МФ селезінки молодих інтактних тварин, і виявили, що можливу роль у
відновленні проліферативної активності Т-лімфоцитів старих тварин може
відігравати відновлення проліферативних властивостей Т-лімфоцитів, що
супроводжується корекцією сигнальних механізмів, що контролюють
проліферативну активність Т-лімфоцитів, зокрема сигнального каскаду
транскрипційного фактору NFκB p65 і посилення активації каспази 3.
Отримані дані є перспективним напрямком для подальших досліджень та
розробки методів відновлення вікових змін імунної системи.
109
На основі отриманих результатів було подано заявку на отримання
деклараційного патенту на експериментальну модель «Спосіб корекції
вікових змін імунної системи тварин» (Патент України на корисну модель,
МПК G01N 33/48 (2006.01), № 94103 від 27.10.2014 року).

1. Шитіков Д.В., Шкумат М.С., Бальва О.В., Янкова Т.М., Пішель І.М.
Зміни рівня проліферації Т-лімфоцитів під впливом клітин лімфоїдної
ніші (дослідження на моделі гетерохронного парабіозу) // Проблемы
старения и долголетия. – 2014. – Т. 23, №2. – С. 113–125.
2. Dmytro W. Shytikov, Maryna S. Shkumat, Tetiana M. Yankova, Alex G.
Peregudov, Igor V. Artyuhov, Iryna M. Pishel. Splenic Niche Cells from
Young Heterochronic Parabionts Have Decreased Capability to Amplify T-cell
Proliferation in Vitro // American Journal of BioScience. – 2015. – Vol. 3, №.
2. – Р. 46-54.
110
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
У багатьох дослідженнях було показано, що від вікових змін найбільше

страждає адаптивна ланка імунної системи. Вікові зміни у функціонуванні
Т-лімфоцитів включають зниження кількості CD4+-клітин, збільшення
кількості CD8+-клітин; збільшення кількості Т-клітин імунологічної пам’яті з
обмеженими функціональними можливостями; зниження проліферативної
активності Т-лімфоцитів, індукованої мітогеном. Разом всі ці зміни
негативно впливають на функціонування адаптивної ланки імунної системи,
а отже й імунної системи загалом, хоча, як відомо, вроджена ланка імунної
системи у ряді випадків здатна компенсувати дисфункцію адаптивної ланки
імунної системи [59].
В даній роботі було проведено дослідження причин та механізмів
вікової дисфункції імунної системи. У якості експериментальної моделі було
використано модель гетерохронного парабіозу. При цьому відбувається
створення між тваринами ділянки спільного кровообігу, що дозволяє
проводити обмін різними факторами крові між партнерами, розчинними та
клітинними. Дана експериментальна модель дозволяє комплексно оцінити
вплив організмів різного віку одне на одного. Цікавою особливістю даної
моделі є природа сигналів, що передаються між партнерами – ці сигнали
повинні мати достатньо великий час існування, оскільки відомо, що період
напівобміну кров’ю між партнерами по парабіозу приблизно дорівнює 200 хв
[6]. За оцінками Wagers et al. приблизний об’єм крові, яким обмінюються
тварини при парабіозі, складає приблизно 16 мкл за годину [142]. Тому
можна припустити, що для успішного переносу факторів крові між
партнерами (клітинних або гуморальних), ці фактори мають бути достатньо
стабільними у часі.
Обмін кров’ю між парабіонтами приводить до поступового
врівноваження вмісту активно мігруючих клітин (клітини крові, лімфоцити)
партнерів у крові, але не приводить до міграції стовбурових клітин у тканини
111
за нормальних умов (тобто, за відсутності ушкоджуючого стимулу)
[142]. Хоча парабіонти активно обмінюються клітинами крові, у тому числі
еритроцитами та лімфоцитами, клітини ніші периферичних лімфоїдних
органів, наприклад, дендритні клітини, обміну як правило не підлягають [63].
Тобто, обмін факторами крові між парабіонтами можливий лише у тому
випадку, якщо ці фактори мають достатньо великий час існування, щоб
перенестись з кровообігу одного партнера до кровообігу іншого.
Численними дослідженнями було показано, що при гетерохронному
парабіозі відбувається індукція вікових змін у багатьох органах молодого
партнера по гетерохронній парабіотичній парі. При цьому корекція вікових
змін у старого партнера по гетерохронній парабіотичній парі набагато менш
виражена, ніж розвиток вікових змін у молодого. Встановлено, що при
гетерохронному парабіозі протягом 3 місяців і довше в молодого
гетерохронного парабіонта розвиваються вікові зміни у печінці (присутність
багатоядерних клітин у печінці, характерні зміні мікроструктури органу)
[143], розвивається надмірне не ферментативне глікозилювання стінок судин
[144]; вже після 1,5 місяців у молодих партнерів по гетерохронному
парабіозу спостерігалися вікові зміни у головному мозку, що були
характерними для мишей старших вікових груп [145]; у самиць при їх
об’єднанні зі старими тваринами спостерігалися порушення місячних циклів
[146]. У роботах Г.М. Бутенко та співробітників було показано, що
гетерохронний парабіоз негативно впливає на імунну систему молодих
тварин при їх парабіозі зі старими тваринами [10-12].
Варто відмітити, що при гетерохронному парабіозі протягом коротких
строків сумісного існування тварин відбувається деяке відновлення
регенераторних властивостей стовбурових клітин при ушкодженні м’язової
тканини у старих гетерохронних парабіонтів [147], відбувається певна
корекція вікових порушень нейрологічних параметрів та поведінкових
реакцій [148]. Це все вказує на здатність старого партнера по гетерохронній
парабіотичній парі активно викликати вікові зміни у багатьох системах
112
організму, у той час як молодий партнер здатний позитивно впливати на
лише певні параметри старого партнера. Таким чином, у роботах, наведених
вище, було показано розвиток вікових змін у молодої тварини при наявності
спільного кровообігу з старою твариною.
Висвітленню механізмів розвитку вікових змін імунної системи молодої
тварини при її парабіозі зі старою присвячена дана робота.
Як відомо, найбільш вираженим віковим змінам стану імунної системи
підлягає функціонування первинних лімфоїдних органів, зокрема тимуса і
кісткового мозку. Вважається, що активності Т-клітинної ланки імунної
системи найбільшої шкоди завдають порушення роботи тимуса та його
вікова інволюція. Це супроводжується зменшенням утворення наївних
Т-лімфоцитів, а також можуть мати місце і ряд інших негативних наслідків,
зокрема зниження продукції секретованих факторів, що мають системний
вплив на організм, зокрема гормоноподібні пептиди (тимулін, тимічний
стромальний лімфопоетин тощо), які відіграють значну роль у гомеостазі як
тимоцитів, так і лімфоїдних клітин периферії кровообігу [149, 150].
Інволюція тимуса також характеризується погіршенням контролю за
репертуаром Т-лімфоцитів [151]. Велика кількість експериментальних
підходів спрямована саме на відновлення його роботи. Відомо, що старіння
тимуса супроводжується зменшенням його маси, заміщенням функціональної
тканини жировою тканиною тощо. Це супроводжується змінами у
субпопуляційному складі тимоцитів [49], саме тому ми спочатку вирішили
перевірити вплив гетерохронного парабіозу на стан тимуса молодих та
старих гетерохронних парабіонтів.
Очікувалося, що міграція певних системних факторів зі старого
організму в молодий має призвести до погіршення роботи тимуса або
викликати значні зміни у кістковому мозку молодої тварини, і це може
відіграти ключову роль у розвитку дисфункції імунної системи у молодих
113
Або, навпаки, параметри тимуса (маса, клітинність) старої тварини,
поєднаної з молодою, могли відновитися хоча б частково.
Для аналізу ми обрали найбільш значимі параметри – загальну кількість
клітин в органі, масу органу та його субпопуляційним склад. Виявилося, що
негативний вплив на параметри тимусу після 12 тижнів гетерохронного
парабіозу виявлений не був. Ані клітинність, ані маса тимуса не відрізнялася
між тваринами одного віку (старими чи молодими парабіонтами, рис. 3.1 та
рис. 3.2), навіть якщо тварини були об’єднані у гетерохронні парабіотичні
пари. Субпопуляційний склад тимоцитів також не показав, статистично
значимих відмінностей між тваринами різних експериментальних груп
(таблиця 3.1). Хоча різниця у параметрах тимуса між тваринами різного віку
була присутня та статистично значима, що показує вплив з боку віку тварини
та відсутність значного впливу гетерохронного парабіозу на показники
тимусу молодих гетерохронних парабіонтів.
Таким чином, гетерохронний парабіоз, викликаючи дисфункцію
параметрів імунної системи на різних рівнях її функціонування в молодих
партнерів по гетерохронній парабіотичній парі, не мав значного негативного
впливу на параметри тимуса. Варто відмітити, що наразі концепція вікової
інволюції тимуса як головної причини вікових змін у Т-клітинній ланці
імунної системи підлягає переосмисленню [152]. Отримані результати
вказують на те, що головні зміни в імунній системі молодого партнера могли
відбуватися у периферичних лімфоїдних органах [6]. Саме тому нашу увагу
привернули зміни у периферичних лімфоїдних органах.
Відомо, що найбільшим периферичним лімфоїдним органом є селезінка.
Вона виконує різноманітні функції, у тому числі відіграє ключову роль у
фільтрації крові від антигенів, є депо еритроцитів, моноцитів, селезінка є
найбільшою базою для лімфоїдних клітин, де може розпочинатись імунна
відповідь за участю клітин адаптивної імунної системи [65]. Ми вирішили
провести аналіз змін у функціональних параметрах периферичної ланки
імунної системи, використовуючи в дослідах клітини селезінки. Як було
114
вказано раніше, зниження проліферативної активності Т-лімфоцитів та зміна
їх субпопуляційного складу є загальновідомими проявами вікових змін у
цьому клітинному компартменті.
Виявилося, що проліферативна активність спленоцитів молодих
гетерохронних парабіонтів при їх стимуляції ФГА, Т-клітинним мітогеном,
змінювалася лише тенденційно (рис. 3.3, P(t) = 0,088). І якщо зміни у
проліферативній активності спленоцитів молодих гетерохронних парабіонтів
не мали статистичної достовірності, то зміни у субпопуляційному складі
спленоцитів за маркерами CD4, CD8 та CD44 були чіткими та статистично
значимими.
Так, у молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі
співвідношення CD4+/CD8+-клітин селезінки значно знижувалося по
відношенню до молодих ізохронних парабіонтів аж до рівня старих тварин
(рис. 3.4, Р (t) < 0,05), що є загальновідомим маркером негативних змін в
імунній системі [59]. Відмічалося зниження кількості CD4+-клітин селезінки
(рис. 3.5). При цьому співвідношення CD4+/CD8+-клітин селезінки у старих
тварин, поєднаних з молодими, не підлягало відновленню.
Подальший аналіз субпопуляцій Т-клітин селезінки молодих
гетерохронних парабіонтів показав збільшення кількості Т-лімфоцитів з
фенотипом клітин імунологічної пам’яті як серед CD4 +-клітин селезінки
(хоча й тенденційне та статистично майже не достовірне), так і серед
CD8+-клітин селезінки (рис. 3.7, Р (t) < 0,05) у порівнянні з молодими
ізохронними парабіонтами, що також є ознакою вікових змін в імунній
системі. У багатьох роботах вказується, що накопичення нефункціональних
клітин імунологічної пам’яті є негативним прогностичним явищем [49].
Зв’язку між субпопуляційним складом спленоцитів та індексом
стимуляції у молодих партнерів по гетерохронним парабіотичним парам
знайдено не було (таблиця 3.2).
Всі ці дані вказують на значні вікові зміни у стані периферичної ланки
імунної системи молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі
115
після 12 тижнів сумісного існування. Як відомо, продукція Т-клітин тимусом
з віком знижується [49] і все більшу роль починає відігравати так звана
гомеостатична проліферація у периферичних лімфоїдних органах [45].
Порівнюючи молодих ізохронних та гетерохронних парабіонтів, ми не
отримали суттєвої зміни у таких характеристиках тимуса, як його маса та
клітинність (рис. 3.1 та рис. 3.2). Виявилося, що різниця у цих параметрах
відсутня між тваринами досліджуваних експериментальних груп. Нажаль,
проаналізувати продукцію наївних Т-клітин при гетерохронному парабіозі
нам не вдалося, але клітинність та маса тимуса є також показовими
параметрами.
У більш ранній роботі, проведеній під керівництвом Бутенко Г.М., було
показано, що гетерохронна пересадка кісткового мозку опроміненим мишам
різного віку (від старих донорів молодим реципієнтам та навпаки) не впливає
на функціональний стан імунної системи реципієнта після приживлення
кісткового мозку в його організмі [10]. Тобто молоді миші, що отримали
клітини кісткового мозку від старих донорів, розвивали таку ж ефективну
імунну відповідь як і молоді реципієнти, що отримали кістковий мозок від
молодих же донорів. І навпаки – імунна відповідь реципієнтів старшого віку
не корегувалася привнесенням в їх організм клітин кісткового мозку від
молодих донорів. Отже, роль лише кровотворного компартменту не варто
переоцінювати, у той час як зміни у периферичній лімфоїдній ніші молодих
гетерохронних парабіонтів можуть відіграти ключову роль у дисфункції
імунної системи. Отримані результати вказують на наявність вікових змін у
периферичній ніші імунної системи.
З ряду робіт відомо, що мікрооточення старого організму негативно
впливає на функціонування власних Т-лімфоцитів, у тому числі й наївних
[55-57]. Також відомо, що лімфоїдна ніша бере участь не лише у забезпеченні
Т-лімфоцитів костимуляторними сигналами та регулюванні репертуару
лімфоцитів, а й спрямовує їх диференціацію та проліферацію за умов
нормального гомеостазу [62, 153]. Так, відомо, що диференціювання у
116
клітини імунологічної пам’яті по суті не завжди вимагає попереднього
контакту з патогенами і може відбуватись по не повністю описаним на даний
момент причинам [154]. Проте вже відомо, що клітини ніші периферичних
лімфоїдних органів є для Т-лімфоцитів джерелом специфічних трофічних
факторів, наприклад ІЛ-7 та ІЛ-15 [45].
Характерною особливістю вікових змін імунної системи є поява та
поступова проліферація лімфоцитів з фенотипом клітин імунологічної
пам’яті та обмеженими функціональними властивостями, і це є однією з
головних причин дисфункції Т-клітинної ланки імунної системи [58]. Певну
роль у цьому можуть відігравати клітини ніші периферичних лімфоїдних
органів.
Логічним кроком була б перевірка функціонального стану клітин
периферичної лімфоїдної ніші парабіонтів. Як відомо, основну роль у
формуванні та функціонуванні ніші Т-лімфоцитів відіграють АПК [65], що
представлені ДК та МФ. Для аналізу функціонального стану ніші Т-клітин
селезінки ми вирішили перевірити параметри фагоцитарної активності МФ
селезінки, оскільки з віком відбувається зниження ефективності фагоцитозу,
бактерицидної активності та внутрішньоклітинного перетравлення
захоплених часточок. Відомо, що дана популяція клітин значно збагачена на
макрофаги та меншою мірою на дендритні клітини [9].
Встановлено, що МФ селезінки молодих партнерів по гетерохронній
парабіотичній парі мали нижчі показники фагоцитарного числа (рис. 3.8, P (t)
< 0,01), відсотку фагоцитозу (рис. 3.9, P (t) < 0,01) та фагоцитарного індексу
(рис. 3.10, P (t) < 0,05) аж до рівня старих тварин без ознак корекції цих
показників в старих партнерів по гетерохронному парабіозу. Це вказує на те,
що при гетерохронному парабіозі відбуваються зміни не лише у стані
Т-лімфоцитів парабіонтів, що мають можливість активно мігрувати між
партнерами [63], а й у клітинах, що складають периферичну лімфоїдну нішу.
Було показано наявність статистично значимих кореляційних зв’язків між
фагоцитарним індексом та субпопуляційним співвідношенням спленоцитів у
117
молодих партнерів по гетерохронному парабіозу (таблиця 3.2). Зокрема, було
виявлено позитивний кореляційний зв’язок (r = 0,998, P < 0,05) між
співвідношенням CD4+/CD8+-клітин селезінки та фагоцитарним індексом, а
також негативний кореляційний зв’язок між фагоцитарним індексом та
кількістю CD8+-клітин селезінки (r = - 0,9945, P = 0,067). Це показує
взаємозв’язок функцій МФ селезінки та Т-лімфоцитів.
Наступним завданням дослідження було охарактеризувати пускові
механізми розвитку описаних змін у Т-клітинній ланці імунної системи
молодогих гетерохронногих парабіонтів. Ці дані у подальшому мали б
допомогти виявити механізми, які призводять до дисфункції імунної
системи, що спостерігалася на попередньому етапі дослідження. Для цього
було проведено аналіз стану імунної системи при гетерохронному парабіозі
після 6 тижнів сумісного існування. Методологічні підходи наступного етапу
дослідження були такими же, як і на попередньому етапі.
Клітинність тимуса (рис. 3.12) молодих гетерохронних парабіонтів була
менше, ніж у молодих ізохронних тварин (P (t) < 0,05), також у молодих
партнерів по гетерохронному парабіозу була наявна тенденція до зниження
маси тимуса, але статистичної достовірності ця тенденція не досягала
(рис. 3.11, P (t) = 0,062). У той же час значення цих параметрів у молодих
гетерохронних парабіонтів було значно вищим, ніж у старих тварин
(гетерохронних та ізохронних), і ця різниця була статистично дуже значима
(P (t) < 0,001). Як видно з попереднього етапу дослідження, маса та кількість
клітин тимуса в молодих гетерохронних парабіонтів вирівнювалася між
молодими ізохронних та гетерохронними парабіонтами (рис. 3.1 та рис. 3.2, P
(t) > 0,05). У старих же тварин розміри та кількість клітин тимуса не
відновлювалися ні на ранніх, ні на більш пізніх строках сумісного існування
тварин у парабіотичних парах. Зниження розмірів тимуса молодих
гетерохронних парабіонтів після 1,5 місяців сумісного існування може також
бути пов’язаним з наслідками операції. Одним з наслідків стресу є
118
пригнічення роботи тимуса. Відповідно, цей ефект може спостерігатися й на
даному етапі дослідження.
Можна побачити, що параметри тимуса молодого партнера по
гетерохронній парабіотичній парі не підлягають значним віковим змінам.
Отримані дані ще раз підтверджують припущення про важливість вікових
змін у периферичних лімфоїдних органах і лімфоїдній ніші в процесах
розвитку вікових порушень імунної системи. Наступним кроком даного
етапу дослідження було виявлення змін у функціонуванні Т-клітин після
6 тижнів гетерохронного парабіозу.
Проліферативна активність спленоцитів при стимуляції їх ФГА не
відрізнялася між тваринами різних експериментальних груп (рис. 3.13).
Проте, було відмічено значне зниження співвідношення CD4+/CD8+-клітин
селезінки у молодих партнерів по гетерохронному парабіозу (рис. 3.14,
P (t) < 0,05).
Подальший аналіз популяційного складу Т-клітин селезінки показав, що
у молодих партнерів по гетерохронному парабіозу у порівнянні з молодими
ізохронними парабіонтами відбувалось збільшення кількості CD8+-клітин
загалом (рис. 3.15Б, P (t) < 0,05), а також CD8+44+-клітин селезінки (рис.
3.16А, P (t) < 0,05), що супроводжувалося певним (але статистично не
достовірним) зниженням кількості CD4+-клітин (рис. 3.15А, P (t) = 0,11). Все
це показує, що зміни, які були зареєстрованими після 12 тижнів
гетерохронного парабіозу, вже були наявними після 6 тижнів і, можливо,
саме на цьому етапі розпочалися ключові вікові зміни в імунній системі
парабіонтів.
Аналіз фагоцитарних властивостей адгерентних клітин селезінки
парабіонтів, що існували в парі протягом 6 тижнів, не виявив статистично
достовірних змін у параметрах фагоцитарної активності (таблиця 3.6). Це
може вказувати, що зміни в імунній системі, які відбулися протягом даного
строку сумісного існування гетерохронних парабіонтів, не мали значного
впливу на стан клітин периферичної лімфоїдної ніші, хоча й
119
характеризувалися змінами у Т-клітинному компартменті. У молодих
ізохронних парабіонтів було виявлено кореляційний зв’язок між індексом
стимуляції спленоцитів та фагоцитарною активністю МФ селезінки, чого не
було виявлено у молодих гетерохронних парабіонтів. Це може вказувати на
початок розвитку порушень у регуляції роботи імунної системи.
За даними літератури відомо, що утворення та підтримання популяції Т-
клітин імунологічної пам’яті залежить від клітин ніші ВЛО, що можуть
сприяти цьому процесу [154]. В результаті цього досліду після 6 тижнів
гетерохронного парабіозу ми не побачили значної різниці у функціонуванні
Т-лімфоцитів чи адгерентних клітин селезінки у молодого партнера по
гетерохронному парабіозу. Не було відмічено значної різниці у тих же
параметрах старого партнера по гетерохронному парабіозу. Однак, вже після
6 тижнів гетерохронного парабіозу, у молодого партнера були виявлені
значні зміни у субпопуляційному складі Т-лімфоцитів селезінки.
Враховуючи дані про субпопуляційний склад Т-клітин селезінки молодих
партнерів по гетерохронному парабіозу після 12 тижнів сумісного існування,
можна сказати, що на етапі 6 тижнів співіснування гетерохронних
парабіонтів розпочинають формуватись зміни в імунній системі, котрі були
відмічені на попередньому етапі роботи: відбуваються зміни в
субпопуляційному складі Т-клітин селезінки у молодої тварини. Варто
відмітити, що позитивний вплив гетерохронного парабіозу на стару тварину
виявити не вдалося.
Важливо звернути увагу на те, що у роботах, що досліджували модель
гетерохронного парабіозу, був виявлений негативний ефект контакту
молодого системного середовища зі старим не лише на імунну систему. Так,
після місяця сумісного існування були отримані дані, що свідчать про
негативний вплив гетерохронного парабіозу на роботу органів нервової та
серцево-судинної системи [144, 145]. У цитованій дещо раніше роботі був
отриманий, навпаки, позитивний ефект гетерохронного парабіозу на стару
тварину, зокрема на регенераторні властивості м’язових стовбурових клітин
120
[147]. Але варто відмітити, що досліджуваний авторами строк співіснування
був менше, ніж той, що досліджувався нами, а тому на даному етапі процеси
масивної регенерації після травматичної операції могли превалювати над
негативними змінами, що починали розвиватись.
Було показано, що на етапі 6 тижнів співіснування у парабіотичній парі
в імунній системі молодих тварин, об’єднаних зі старими, починають
розвиватися зміни, що призводять до її наступної дисфункції. Причиною
цього може бути обмін факторами крові між партнерами, клітинними чи
гуморальними, що призвели до зміни функціонування клітин лімфоїдної ніші
молодої тварини, або заміни її клітин на клітини старої тварини.
Таким чином, на першому етапі досліджень було продемонстровано
індукцію вікових змін у Т-клітинній ланці імунної системи та у популяції
МФ селезінки у молодих гетерохронних парабіонтів. Було показано, що після
6 тижнів сумісного існування молодих і старих тварин у гетерохронній
парабіотичній парі відбуваються зміни у субпопцляційному складі
Т-лімфоцитів. Саме тому наступним питанням було описання змін у
властивостях мікрооточення Т-лімфоцитів селезінки, зокрема у здатності
костимулювати проліферативну активність у Т-лімфоцитів.
Відомо, що периферична ніша Т-лімфоцитів складається головним
чином з АПК, до яких відносяться ДК, МФ та В-клітини [62, 65]. Зміни у Т-
клітинній ніші можуть бути однією з причин розвитку дисфункції імунної
системи молодих тварин, об’єднаних зі старими. Таким чином, метою даного
етапу дослідження було виявлення популяції клітин мікрооточення
селезінки, яка має найбільший ефект на зміни проліферативної відповіді Т-
лімфоцитів при гетерохронному парабіозі.
Для цього в умовах in vitro було створено систему сумісного
культивування попередньо виділених клітин ніші селезінки та Т-лімфоцитів.
У першу чергу ми перевірили проліферативну відповідь загальної популяції
спленоцитів у відповідь на ФГА (рис. 4.1). Статистично достовірна різниця
відмічалася лише між старими та молодими ізохронними парабіонтами
121
(рис. 4.1, P (t) < 0,05), що підтверджує дані з попереднього етапу дослідження.
При стимуляції ФГА очищених Т-лімфоцитів селезінки виявилося, що
Т-лімфоцити молодих ізохронних парабіонтів мали проліферативну
активність достовірно вищу, ніж Т-клітини тварин інших експериментальних
груп (рис. 4.2, P (t) < 0,05), зокрема і по відношенню до Т-лімфоцитів молодих
гетерохронних парабіонтів. Це може вказувати на дисфункцію Т-клітин, що
відбулася у зв’язку з перебуванням в гетерохронній парабіотичній парі у
молодого партнера.
Відомо, що при довготривалому парабіозі між обома партнерами
наступає момент повного химеризму по Т-лімфоцитам, коли співвідношення
між Т-лімфоцитами партнерів по парабіозу варіює у межах 1/1 або 3/2 [63,
142]. Оскільки проліферація Т-лімфоцитів молодих гетерохронних
парабіонтів достовірно нижче, ніж у молодих ізохронних та знаходиться на
рівні старих тварин, то можна припустити наявність порушення роботи Т-
лімфоцитів молодих тварин. Також видно, що проліферативна відповідь Т-
лімфоцитів старих гетерохронних парабіонтів не покращилась після обміну
факторами крові з молодим партнером. Таким чином, можна стверджувати,
що напрямок змін, що відбуваються при гетерохронному парабіозі, носить
однонаправлений характер у бік індукції вікових змін.
Ключовим питанням залишається вплив гетерохронного парабіозу на
зміни у костимуляторних властивостях клітин ніші Т-лімфоцитів у селезінці
та зміни у функціонуванні самих Т-лімфоцитів. Для цього ми вирішили
перевірити проліферативний відгук Т-лімфоцитів у in vitro системі, де
Т-лімфоцити культивувалися разом з клітинами, що формують їх нішу у
селезінці – ДК та популяцію МФ селезінки – у співвідношенні, що приблизно
відповідає фізіологічному у вторинних лімфоїдних органах [61]. З даних
літератури відомо, що при використанні такого методу виділяється
приблизно 1-2% від клітин, що спочатку вносились у культуральне
середовище [8]. З цього розрахунку підбиралися концентрації клітин для
системи сумісної культивації in vitro популяції МФ селезінки.
122
Як відомо з даних літератури, популяція спленоцитів складається більш
ніж на 30% з Т-лімфоцитів та більш ніж на 40% з В-клітин і деяких інших, у
тому числі й клітин ніші Т-лімфоцитів, і всі ці типи клітин можуть впливати
на проліферацію Т-лімфоцитів у суспензії спленоцитів [155]. Саме тому було
вирішено перевірити вклад кожної з популяцій клітин ніші Т-лімфоцитів. Ми
вирішили дослідити вплив загальної популяції ДК та МФ селезінки тварин
різних експериментальних груп на проліферативну активність Т-лімфоцитів
тварин своєї ж експериментальної групи (схеми співкультивації 1 та 3).
Отримані результати вказують на те, що гетерохронний парабіоз не
накладає значного вікового впливу на костимуляторні властивості ДК
селезінки тварин різних експериментальних груп, оскільки рівень
проліферації Т-лімфоцитів цих тварин не мав відмінностей між тваринами
однієї вікової групи у присутності ДК селезінки тварин тієї ж
експериментальної групи (рис. 4.3). Тобто, рівень проліферації Т-лімфоцитів
молодих ізохронних та молодих гетерохронних парабіонтів у присутності ДК
селезінки тварин відповідної експериментальної групи не відрізнявся між
собою, але був достовірно вище рівня проліферації Т-лімфоцитів старих
гетерохронних і старих ізохронних парабіонтів у присутності власних же ДК,
котрі також не відрізнялися між собою (рис. 4.3, P (t) < 0,05). Це підтверджує
дані, що вказують на неактивну міграцію ДК між партнерами [Swirski F.K.,
2009].
Сумісна культивація Т-лімфоцитів тварин різних експериментальних
груп разом з МФ селезінки відповідної групи показала абсолютно відмінну
ситуацію (рис. 4.4). Так, Т-лімфоцити молодих ізохронних парабіонтів у
присутності МФ селезінки тварин власної експериментальної групи
проліферували набагато активніше, ніж Т-лімфоцити тварин інших
експериментальних груп (рис. 4.4, P (t) < 0,05). Це може свідчити про те, що
саме МФ мають найбільший вплив на зміни у функціонуванні Т-лімфоцитів
при гетерохронному парабіозі.
123
Для того, щоб перевірити припущення про роль дисфункції
костимуляторних властивостей МФ селезінки, було вирішено перевірити
проліферативну активність Т-лімфоцитів селезінки тварин різних
експериментальних груп при їх сумісній культивації з ДК або МФ селезінки
молодих інтактних тварин (схеми співкультивації 2 та 4 відповідно).
Отримані дані показали, що лише культивація Т-лімфоцитів тварин різних
експериментальних груп з МФ селезінки молодих інтактних тварин мала
певний позитивний вплив на проліферацію Т-лімфоцитів старих тварин
(рис. 4.6). Так, сумісна культивація Т-лімфоцитів з МФ молодих інтактних
тварин показала, що статистично значима різниця у проліферативній
активності Т-лімфоцитів між групами відсутня, окрім проліферативної
активності Т-лімфоцитів старих ізохронних парабіонтів. Т-лімфоцити старих
ізохронних парабіонтів мали проліферативний відгук достовірно вищий, ніж
Т-лімфоцити тварин інших експериментальний груп (рис. 4.6, P (t) < 0,05) та
вищий від проліферативної активності Т-лімфоцитів селезінки старих
ізохронних тварин при їх культивації з МФ селезінки тварин своєї ж
експериментальної групи (рис. 4.7, P (t) < 0,05).
На основі отриманого матеріалу було показано, що дисфункція імунної
системи, що спостерігається при гетерохронному парабіозі, може бути
значною мірою викликана змінами у костимуляторних властивостях МФ.
Щоб зрозуміти механізми впливу МФ мишей різного віку на процеси
проліферації Т-лімфоцитів, ми вирішили перевірити експресію основних
факторів, що мають найбільший вплив, а саме: NFκB p65, який є ключовим
фактором активації процесу проліферації Т-лімфоцитів; інгібітор його
активності, білок IκBα; каспаза 3, що виконує роль екзекуторної каспази та за
певних умов має запускати апоптоз при активації Т-клітин.
Для цієї мети були використані модельні системи in vitro, аналогічні
використаним у попередньому етапі досліджень. Метою даного етапу було
виявлення змін у молекулярних механізмах активації Т-лімфоцитів як в
умовах їх власного мікрооточення, так і в умовах коректованого
124
мікрооточення, щоб зрозуміти, які саме сигнальні механізми могли бути
мішенями дисфункції при гетерохронному парабіозі або бути мішенями для
корекції. Для більш ґрунтовного аналізу змін у механізмах активації
Т-лімфоцитів було вирішено аналізувати зміни у кількості білків після 2-х
строків стимуляції, а саме: 2 години (ранні події після активації) та 18 годин
(пізні сигнальні події після активації).
Як було вже відзначено, рівень проліферації Т-лімфоцитів молодих
ізохронних парабіонтів при їх стимуляції у присутності МФ тварин своєї ж
експериментальної групи був достовірно вищий (схема культивації 3), ніж у
Т-лімфоцитів інших експериментальних груп в аналогічних умовах. Саме
тому було зроблено припущення, що зміни у функціональному стані МФ
селезінки викликають негативні вікові зміни у функціонуванні Т-лімфоцитів,
а отже й імунної системи загалом. Ми отримали дані, що вказують на
порушення експресії транскрипційного фактору RelA на ранніх строках
(2 години стимуляції) після активації та підвищена експресія IκBα у
подальшому (18 годин стимуляції), що може відігравати ключову роль у
порушенні функціонування Т-лімфоцитів у досліджуваній нами моделі (рис.
5.1 та рис. 5.5, Р (U) < 0,05).
Відомо, що проліферація Т-лімфоцитів значною мірою залежить від
активації каскаду NFκB [101]. Порушена експресія транскрипційного
фактору NFκB р65 відіграє важливу роль у ряді імунодефіцитних станів та у
порушенні роботи Т-лімфоцитів [156]. Було показано, що анергічні та
функціонально виснажені Т-лімфоцити мали знижену експресію ключових
сигнальних молекул, зокрема кіназ p56Lck, CD3ξ, а також транскрипційних
факторів родини NFκB, зокрема зниження експресії білка NFκB p65, а також
підвищення експресії білка NFκB р50, гомодимери якого є транскрипційно
неактивними [117, 118]. Було відмічено, що при онкологічних захворюваннях
Т-лімфоцити хворих людей мають знижене фосфорилювання сигнальних
протеїнкіназ, що відповідають за активацію Т-лімфоцитів (зокрема p56Lck та
CD3ξ) [157]. Отримані нами дані вказують на наявність зв’язку між
125
порушенням проліферації Т-лімфоцитів та порушенням сигнальних
механізмів їх активації клітинами лімфоїдної ніші, а саме популяції
макрофагів селезінки.
Ще одним молекулярним механізмом, який впливає на процеси
проліферації Т-лімфоцитів, є апоптоз. Апоптоз відіграє ключову роль у
елімінації потенційно небезпечних аутореактивних клонів лімфоцитів,
апоптоз є тією зброєю, за рахунок якої імунна система знищує власні
потенційно небезпечні клітини (інфіковані або трансформовані)
[158]. За допомогою апоптозу відбувається скорочення кількості клонів
лімфоцитів у фазі контракції після імунної відповіді [57, 65]. Порушення
апоптозу можуть бути причиною багатьох патологічних станів та процесів.
Зокрема недостатній або порушений апоптоз відіграє роль у розвитку
аутоімунних захворювань [159], а також у виживанні ракових пухлин [160].
Апоптоз є зброєю, яка використовується пухлинними клітинами для
уникнення імунної відповіді. Протягом проліферації клітин апоптоз є
механізмом, що обмежує їх поділи. Саме тому ми перевірили стан його
активації у стимульованих Т-лімфоцитах.
Реалізація запрограмованої клітинної загибелі залежить від напряму
роботи представників каспаз, особливих серинових протеїназ зі специфічним
колом субстратів [161], серед яких є ядерні та цитоплазматичні білки (мішені
екзекуторних каспаз), та самі каспази, що входять у каскад активації
апоптозу (мішені ініціаторних каспаз). Серед каспаз ключову роль займають
каспази 3 та 7, що є не лише екзекуторними, а також і такими, що регулюють
запуск апоптозу від зовнішніх або мітохондріальніх стимулів.
Активація каспаз відбувається за рахунок обмеженого протеолізу білка-
попередника з вивільненням та подальшою димеризацією активованого білка
[162]. Повноцінне розгортання апоптозу відбувається за рахунок активації
каспази 3. При цьому відбувається обмежений протеоліз її попередника,
білка р30, з наступним вивільненням фрагментів р10 та р20, що у
126
подальшому додатково розщеплюється до утворення білка р17. Ми вирішили
перевірити активацію каспази 3 за наявністю її активованої форми р20.
Виявити неактивовану каспазу 3 (у формі білка-прекурсора, р30) нам не
вдалося взагалі. Це є дещо несподіваним ефектом. Проте в літературі наявні
відомості про те, що активація Т-лімфоцитів не лише не обмежується
активацією каспази 3, але, більш того, значною мірою залежить від ступеня
активації каспази 3, що показано у роботах [163-165]. Конкретний механізм
поки що не досліджений (хоча є припущення про участь активації каспази 3 у
селективному протеолізі ряду субстратів, що мають вплив на сигнальні події
у Т-клітинах під час активації, зокрема селективний протеоліз білка NFκB
p65 [164]), але інгібування активації каспази 3 протягом активації Т-
лімфоцитів порушує їх проліферативну відповідь [141].
В наших дослідженнях несподіваною виявилася висока експресія
активованої форми каспази 3 у Т-лімфоцитах від молодих тварин (молодих
ізохронних та молодих гетерохронних парабіонтів) у порівнянні з
Т-лімфоцитами старих тварин на обох строках сумісного культивування
(рис. 5.3 та рис. 5.6, Р (U) < 0,05). У свою чергу низький рівень активації
каспази 3 у Т-лімфоцитах від старих тварин зафіксовано й у інших роботах,
присвячених дослідженню вікових порушень функціонування Т-лімфоцитів.
Так, Tsukamoto H. et al. виявили порушення у гомеостазі Т-клітин від старих
тварин. Виявилося зниження у механізмах підтримання сталої кількості
популяції периферичних Т-клітин, а також зниження чутливості до апоптозу
[55].
Таким чином, нами встановлено, що сигнали від МФ ніші селезінки
тварин різного віку мають різний вплив на проліферативний відгук
Т-лімфоцитів, що культивуються з ними в умовах in vitro. За результатами
даного етапу дослідження вдалося встановити, що порушення у нормальному
функціонуванні Т-лімфоцитів залежить від змін у костимуляторних
властивостях клітин їх мікрооточення, а саме від змін у функціонуванні МФ.
Негативні зміни у функціонуванні Т-лімфоцитів також були відображені й на
127
рівні сигнальних молекул, зокрема у дисфункції вісі NFκB/IκB, а саме
знижена експресія NFκB р65 на ранніх етапах активації у молодих партнерів
по гетерохронним парабіотичним парам.
Можливим методичним підходом у корекції вікових змін Т-лімфоцитів
може виступати заміна їх ніші периферичних лімфоїдних органів. Згідно
попередніх результатів дослідження можна припустити, що перспективним
об’єктом є корекція у популяції МФ периферичних лімфоїдних органів.
Результати аналізу можливості корекції функціонального стану
Т-лімфоцитів старих тварин за рахунок заміни клітин їх периферичної
лімфоїдної ніші клітинами ніші селезінки, зокрема МФ, молодих інтактних
тварин, було викладено вище. А саме, Т-лімфоцити від старих ізохронних
парабіонтів мали статистично достовірно вищий рівень проліферативної
активності у досліджуваних умовах сумісного культивування з МФ молодих
інтактних тварин in vitro. Саме тому у подальшому ми вирішили перевірити
зміни у сигнальних механізмах Т-лімфоцитів при їх активації у присутності
МФ молодих інтактних тварин (схема культивування 4).
Виявилося, що відносна кількість NFκB р65 в Т-лімфоцитах від старих
ізохронних парабіонтів на ранніх етапах активації була не відрізнялася від
рівню експресії білку у Т-лімфоцитах молодих тварин (рис. 5.7). На пізніх
строках стимуляції (18 годин) відносна кількість RelA у Т-лімфоцитах старих
тварин, була меншою, ніж у Т-лімфоцитів молодих тварин (рис. 5.10А), а
різниця в експресії IκBα ставала статистично не достовірною (рис. 5.10Б), у
той час як рівень активованої каспази 3 підвищувався достовірно у
порівнянні зі старими гетерохронними парабіонтами (рис. 5.11, Р (U) < 0,05).
Встановлено чіткий позитивний кореляційний зв’язок між рівнем
експресії активованої каспази 3 та проліферативною активністю Т-
лімфоцитів старих ізохронних парабіонтів, культивованих з МФ селезінки
молодих інтактних тварин (таблиця 5.1, r = 0,996, P < 0,01). Виявлений
зв’язок був статистично значимим та сильним, що вказує на можливу
128
залежність цих параметрів – проліферації Т-лімфоцитів та активації каспази 3
у Т-клітинах селезінки старих ізохронних парабіонтів.
Таким чином, підвищення рівня проліферації Т-лімфоцитів селезінки
старих ізохронних парабіонтів при їх культивуванні разом з МФ молодих
інтактних тварин супроводжувалося вирівнюванням експресії
транскрипційного фактору NFκB р65 між тваринами різних
експериментальних груп на ранніх етапах активації; також імовірно, що
певну роль у цьому процесі могло зіграти посилення активації каспази 3,
оскільки відомо, що її активація значно знижена не лише у «виснажених» Т-
лімфоцитах (що спостерігається при старінні) [117, 118, 157], а й у Т-
лімфоцитах старих донорів взагалі [55, 56].
Отримані дані свідчать про те, що порушений функціональний стан
клітин ніші ВЛО відіграє важливу роль у віковій дисфункції Т-лімфоцитів.
Було отримано дані, які свідчать про перспективність корекції вікових змін у
функціональних властивостях клітин ніші селезінки. При цьому видно
можливість відновлення функцій Т-лімфоцитів старих тварин. Як
вказувалося вище, вікові зміни у адаптивній ланці імунної системи, і у
Т-клітинах зокрема, мають значний вплив на функціонування всієї імунної
системи [59]. Таким чином, корекція вікових змін у функціонуванні ніші
периферичних лімфоїдних органів може бути перспективним напрямком для
подальших досліджень.
У ході дослідження були виявлені порушення у Т-клітинній ланці та МФ
селезінки імунної системи молодих тварин, об’єднаних зі старими у
парабіотичні пари строком у 3 місяці. При цьому не було зафіксовано змін у
тимусі молодих партнерів по гетерохронній парабіотичній парі. Після
6 тижнів існування у парабіотичній парі у Т-клітинній ланці імунної системи
відмічалися зміни у субпопуляційному складі Т-клітин селезінки, хоча інші
параметри, у тому числі проліферативна активність спленоцитів та
фагоцитарна активність МФ селезінки, не підлягали статистично значимим
змінам.
129
Було оцінені зміни у костимуляторних властивостях різних популяцій
ніші ВЛО, зокрема ДК та МФ селезінки, а також можливість корекції цих
змін. Було виявлено, що найбільш виражені негативні зміни у здатності
костимулювати проліферативну активність Т-лімфоцитів відбуваються у
популяції МФ селезінки.
Були досліджені молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів при їх
сумісній культивації разом з МФ селезінки, або тварин своєї ж
експериментальної групи, або з МФ селезінки молодих інтактних тварин.
Були виявлені зміни у експресії регуляторних білків на різних строках
стимуляції Т-лімфоцитів селезінки молодих партнерів по гетерохронному
парабіозу у присутності МФ тварин своєї ж експериментальної групи. А
саме, було показано знижену експресію транскрипційного фактору NFκB p65
на ранніх етапах активації та підвищену експресію інгібіторного білка ІκВα.
Сумісна культивація Т-лімфоцитів селезінки старих ізохронних
парабіонтів з МФ селезінки молодих тварин призводила до підвищення їх
проліферативної активності. На ранніх етапах активації їх активації експресія
фактору NFκB p65 не відрізнялася між тваринами різних експериментальних
груп (хоча у подальшому вона не досягала рівня молодих тварин); одночасно
рівень експресії інгібіторного білку ІκВα не відрізнявся між групами. Рівень
активації каспази 3 та проліферативна активність Т-лімфоцитів старих
ізохронних парабіонтів мали статистично значимий кореляційний зв’язок
(таблиця 5.1).
Одним з завдань дослідження було розробити експериментальний підхід
корекції функцій Т-лімфоцитів завдяки встановленню причин розвитку
вікової дисфункції Т-клітинної ланки імунної системи та визначення
послідовності виникнення вікових змін у функціонуванні Т-клітинної ланки
імунної системи у молодих партнерів по гетерохронному парабіозу.
На основі отриманих результатів було отримано деклараційний патент
«Спосіб корекції вікових змін імунної системи тварин» (Патент України на
корисну модель, МПК G01N 33/48 (2006.01), № 94103 від 27.10.2014 року).
130
ВИСНОВКИ
В дисертації наведено теоретичне узагальнення та представлено нове

вирішення наукового завдання сучасної імунології та біогеронтології, що
полягає у виявленні механізму розвитку вікових змін Т-клітинної ланки
імунної системи на моделі гетерохронного парабіозу та розробці
експериментального підходу корекції. Вирішення цього завдання може
допомогти у розробці нових методів лікування вікових захворювань.
1. Молоді тварини після 12 тижнів сумісного існування у парабіотичній

парі зі старою твариною мають у порівнянні з молодими ізохронними
парабіонтами виразні негативні зміни у Т-клітинній ланці імунної системи:
тенденційне зниження мітоген-індукованої проліферативної активності
спленоцитів при стимуляції ФГА на 22,8% (Р < 0,1), зниження
імунорегуляторного індексу на 50,6% (Р < 0,05), збільшення кількості клітин
з фенотипом CD8+44+ на 130% (Р < 0,05), а також відносної кількості CD4+44+
на 76% (Р < 0,05).
2. Виявлено вікове зниження фагоцитарних властивостей макрофагів
селезінки молодих партнерів по гетерохронним парабіотичним парам,
зокрема відсотку фагоцитозу на 20% (P < 0,05), індексу фагоцитозу на 18,9%
(P < 0,05), фагоцитарного числа на 33,7% (P < 0,05).
3. На більш ранніх термінах гетерохронного прабіозу (6 тижнів) у
молодих гетерохронних парабіонтів зареєстровано негативні зміни
показників Т-клітинного імунітету, менш виразні у порівнянні з
аналогічними показниками при пізніх термінах моделі прискореного старіння
(12 тижнів): зниження імунорегуляторного індексу на 32,4% (Р < 0,05),
збільшення на 77,3% кількості клітин з маркером CD8+44+ в селезінці (Р <
0,05).
131
4. Встановлено асоційоване з віком зниження на 34,3% (Р < 0,05)
костимуляторного впливу макрофагів селезінки на мітоген-індуковану
проліферативну активність аутологічних Т-лімфоцитів при
співкультивуванні in vitro.
5. Встановлено відсутність вікових змін костимуляторних властивостей
дендритних клітин селезінки на мітоген-індуковану проліферативну
активність аутологічних Т-лімфоцитів при співкультивуванні in vitro.
6. Порушення мітоген-стимульованої проліферації Т-лімфоцитів молодих
гетерохронних парабіонтів при костимуляції аутологічними макрофагами
селезінки in vitro супроводжується негативними змінами у молекулярних
сигнальних каскадах: зниженням експресії транскрипційного фактору NFκB
p65 на 75,4% (P < 0,05) та підвищенням експресії IκBα на ранніх етапах
активації на 36,4% (Р < 0,05).
7. Культивування Т-лімфоцитів селезінки старих ізохронних парабіонтів з
макрофагами селезінки сингенних молодих інтактних тварин відновлювало
їх мітоген-індуковану проліферативну активність у порівнянні як з Т-
лімфоцитами молодих ізохронних парабіонтів (на 31,7%, Р < 0,05), так і у
порівнянні з Т-клітинами старих ізохронних парабіонтів, культивованих з
аутологічними макрофагами селезінки (на 21,8%, Р < 0,05), що вказує на
можливість використання даного підходу для корекції вікових порушень Т-
клітинної ланки імунної системи.
132
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
1. Castelo-Branco C, Soveral I. The immune system and aging: a review. //

Gynecol Endocrinol. — 2014. — Vol. 30, №1. — Р. 16-22.
2. Maciolek J.A., Pasternak А.J., Wilson H.L. Metabolism of activated T
lymphocytes. // Curr Opin Immunol. — 2014. — № 27C. — Р. 60-74.
3. Scandiuzzi L, Ghosh K, Zang X. T cell costimulation and coinhibition:
genetics and disease. // Discov Med. — 2011. — Vol. 12, №63. — Р. 119-128.
4. Schlitzer A, Ginhoux F. Organization of the mouse and human DC network.
// Curr Opin Immunol. — 2014. — № 26. — Р.90-99.
5. Garg S.K., Delaney C., Shi H. et al. Changes in adipose tissue macrophages
and T cells during aging. // Crit Rev Immunol. — 2014. — Vol. 34, №1. — Р.1-
14.
6. Wong C., Goldstein D.R. Impact of aging on antigen presentation cell
function of dendritic cells. // Curr Opin Immunol. — 2013. — Vol. 25, №4. — Р.
535-41.
7. Agrawal A., Gupta S. Impact of Aging on Dendritic Cell Functions in
humans. // Ageing Res Rev. — 2011. — Vol. 10, №3. — Р.336–345.
8. Moro-García M.A., Alonso-Arias R., López-Larrea C. Molecular
mechanisms involved in the aging of the T-cell immune response. // Curr
Genomics. — 2012. — Vol. 13, №8. — Р. 589-602.
9. Губрий Ігорь Борисович. Влияние гетерохронного парабиоза и
гетерохронной трансплантации селезенки на первичный иммунный ответ у
животных разного возраста: дис. … канд. биол. наук : — С.68. — 1982.
10. Бутенко Г.М., Андрианова Л.Ф., Губрий И.Б. и пр. Исследование
механизмов возрастных изменений иммунитета методом гетерохронных
химер. // Вестник МАН СССР. — 1984. — №3. — С. 24-30.
11. Бутенко Г.М., Губрий И.Б. Первичный иммунный ответ у парабионтов
разного возраста. // Бюл. эксперим. биол. мед. — 1980. — Т.89, №4. — С.
435-437.
133
12. Бутенко Г.М., Губрий И.Б. Изучение механизма угнетения иммунного
ответа при парабиозе животных разного возраста // Бюл. эксперим. биол. мед.
— 1981. — Т. 9, № 9. — С. 318-319.
13. Bilbo S.D., Schwarz J.M. The immune system and developmental
programming of brain and behavior. // Front Neuroendocrinol. — 2012. — Vol.
33, №3. — Р. 267-286.
14. Hos D., Cursiefen C. Lymphatic vessels in the development of tissue and
organ rejection. // Adv Anat Embryol Cell Biol. — 2014. — №214. — Р. 119-141.
15. Stappenbeck T.S., Miyoshi H. The role of stromal stem cells in tissue
regeneration and wound repair. // Science. — 2009. — Vol. 324, №5935. — Р.
1666-1669.
16. Grabowski P. Physiology of bone. // Endocr Dev. — 2009. — №16. — Р.
32-48.
17. Алибек К., Гречаный Л., Клименко Т. та ін. Пятая революция в
медицине: о роли инфекций в патогенезе старения и хронических болезней
человека. // ―Лікарська справа‖. — 2008. — № 1/2. — Ст. 3-30.
18. Global Health and Aging. // Washington DC: National Institute on Aging,
National Institutes of Health. — 2011. — № 11. — Р.7737.
19. Sadana R., Foebel A.D., Williams A.N. et al. Population aging, longevity
and the diverse contexts of the oldest old. // Public Policy and Aging Report. —
2013 — Vol. 23, №2. — Р. 18-25.
20. Semba R.D., Nicklett E.J., Ferrucci L. Does accumulation of advanced
glycation end products contribute to the aging phenotype? // J Gerontol A Biol Sci
Med Sci. — 2010. — Vol. 65, №9. — Р. 963-975.
21. Vlassara H., Uribarri J., Ferrucci L. et al. Identifying advanced glycation end
products as a major source of oxidants in aging: implications for the management
and/or prevention of reduced renal function in elderly persons. // Semin Nephrol.
— 2009. — Vol. 29, №6. — Р. 594-603.
134
22. Poggioli S., Bakala H., Friguet B. Age-related increase of protein glycation
in peripheral blood lymphocytes is restricted to preferential target proteins. // Exp
Gerontol. — 2002. — Vol. 37, №10-11. — Р. 1207-1215.
23. Aoki T., Abe T., Yamada E. et al. Increased LDL susceptibility to oxidation
accelerates future carotid artery atherosclerosis. // Lipids Health Dis. — 2012. —
Vol. 11, №4. — Р. 1-7.
24. Asai A., Nagao M., Kawahara M. et al. Effect of impaired glucose tolerance
on atherosclerotic lesion formation: an evaluation in selectively bred mice with
different susceptibilities to glucose intolerance. // Atherosclerosis. — 2013. —
Vol. 231, №2. — Р. 421-426.
25. van Greevenbroek M.M., Schalkwijk C.G., Stehouwer C.D. Obesity-
associated low-grade inflammation in type 2 diabetes mellitus: causes and
consequences. // Neth J Med. — 2013. — Vol. 71, №4. — Р. 174-87.
26. Melton L.J. Epidemiology worldwide. // Endocrinol. Metab. Clin. North
Am. — 2003. — Vol. 32, №1. — Р. 1-13.
27. Raisz L. Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and prospects. // J
Clin Invest. — 2005. — Vol. 115, №12. — Р. 3318–3325.
28. Waugh E.J., Lam M.A., Hawker G.A. et al. Risk factors for low bone mass
in healthy 40–60 year old women: a systematic review of the literature.
Osteoporosis international. — 2009. — Vol. 20, №1. — Р. 1–21.
29. Goronzy J.J., Weyand C.M. Immune aging and autoimmunity. // Cell Mol
Life Sci. — 2012. — Vol. 69, №10. — Р. 1615-1623.
30. Goc J., Fridman W.H., Sautes-Fridman C. et al. Characteristics of tertiary
lymphoid structures in primary cancers. // Oncoimmunology. — 2013. — Vol. 2,
№12. — e26836.
31. Choi S.R., Howell O.W., Carassiti D. et al. Meningeal inflammation plays a
role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. // Brain. — 2012.
— Vol. 135, № 10. — Р. 2925-2937.
32. Ройт А. Імунологія. / Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. — М. : Мир, 2000.
— 593 с.
135
33. Heath W.R., Carbone F.R. The skin-resident and migratory immune system
in steady state and memory: innate lymphocytes, dendritic cells and T cells. // Nat
Immunol. — 2013. — Vol. 14, №10. — Р. 978-985.
34. Gowans J.L., McGregor D.D., Cowen D.M. Initiation of immune responses
by small lymphocytes. // Nature. — 1962. — № 196. — Р. 651-655.
35. Boehm T. Thymus development and function. // Curr Opin Immunol. —
2008. — Vol. 20, №2. — Р. 178-184.
36. Bhati M., Cole D.K., McCluskey J. et al. The versatility of the αβ T-cell
antigen receptor. // Protein Sci. — 2014. — Vol. 23, №3. — Р. 260-272.
37. Zoete V., Irving M., Ferber M., Cuendet M.A., Michielin O. Structure-
Based, Rational Design of T Cell Receptors. // Front Immunol. — 2013. — №4.
— Р. 268.
38. Woodsworth D.J., Castellarin M, Holt R.A. Sequence analysis of T-cell
repertoires in health and disease. // Genome Med. — 2013. — Vol. 5, №10. — Р.
98.
39. Yates A.J. Theories and Quantification of Thymic Selection. // Front
Immunol. — 2014. — №5. — Р. 1-15.
40. Nakayamada S., Takahashi H., Kanno Y. et al. Helper T cell diversity and
plasticity. // Current Opinion in Immunology. — 2012. — Vol. 24, №3. — Р. 297–
302.
41. Constant S.L., Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell
responses: the alternative approaches. // Annu Rev Immunol. — 1997. — № 15. —
Р. 297-322.
42. Hirota K., Duarte J.H., Veldhoen M. et al. Fate mapping of IL-17-producing
T cells in inflammatory responses. // Nature Immunology. — 2011. — Vol. 12,
№3. — Р. 255–263.
43. Vignali D.A.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work.
// Nature Reviews Immunology. — 2012. — № 8. — Р. 523-532.
136
44. Opata M., Stephens R. Early Decision: Effector and Effector Memory T Cell
Differentiation in Chronic Infection. // Curr Immunol Rev. — 2013. — Vol. 9,
№3. — Р. 190-206.
45. Boyman O., Letourneau S., Krieg C. et al. Homeostatic proliferation and
survival of naive and memory T cells. // Eur J Immunol. — 2009. — 39, №8. — Р.
2088-2094.
46. Makoto G. Inflammaging (inflammation + aging): A driving force for
human aging based on an evolutionarily antagonistic pleiotropy theory? //
BioScience Trends. — 2008. — Vol. 2, №6. — Р. 218-230.
47. Sansoni P., Vescovini R., Fagnoni F. et al. The immune system in extreme
longevity // Exp Gerontol. — 2008. — Vol. 43, №2. — Р. 61-65.
48. Brelinska R., Malendowicz L.K., Malinska A. et al. Characteristics of age-
related changes in rat thymus: morphometric analysis and epithelial cell network in
various thymic compartments. // Biogerontology. — 2008. — № 9. — Р. 93-108.
49. Holland A. M., van den Brink V.R.M. Rejuvenation of the aging T cell
compartment // Curr. Opin. Immunol. — 2009. — Vol. 21, № 4. — Р. 454–459.
50. Fayad R., Sennello J.A., Kim S.H. et al. Induction of thymocyte apoptosis
by systemic administration of concanavalin A in mice: role of TNF-alpha, IFN-
gamma and glucocorticoids. // Eur J Immunol. — 2005. — Vol. 35, № 8. — Р.
2304-2312.
51. Savino W. The Thymus Is a Common Target Organ in Infectious Diseases.
// PLoS Pathog. — 2006. — Vol. 2, №6. — e62.
52. George A.J., Ritter M.A. Thymic involution with ageing: obsolescence or
good housekeeping? // Immunol Today. — 1996. — Vol. 17, №6. — Р. 267–272.
53. Whisler R.L., Williams J.W., Newhouse Y.G. Human B cell proliferative
responses during aging. Reduced RNA synthesis and DNA replication after signal
transduction by surface immunoglobulins compared to B cell antigenic
determinants CD20 and CD40 // Mech Ageing Dev. — 1991. — Vol. 61, №2. —
Р. 209–222.
137
54. Birjandi S.Z., Ippolito J.A., Ramadorai A.K. et al. Alterations in marginal
zone macrophages and marginal zone B cells in old mice. // J Immunol. — 2011.
— Vol. 186, №6. — Р. 3441-3451.
55. Tsukamoto H., Clise-Dwyer K., Huston G.E. et al. Age-associated increase
in lifespan of naіve CD4 T cells contributes to T-cell homeostasis but facilitates
development of functional defects. // Proc Natl Acad Sci. — 2009. — Vol. 106,
№43. — Р. 18333–18338.
56. Cusi M.G., Martorelli B., Genova G.D. et al. Age related changes in T cell
mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus
(RSV) in healthy subjects. // Immunity & Ageing. — 2010. — № 7. — Р. 1-8.
57. Bannard O., Kraman M., Fearon D. Pathways of memory CD8+ T-cell
development. // Eur J Immunol. — 2009. — Vol. 39, №8. — Р. 2083-2087.
58. Weng N.P., Akbar A.N., Goronzy J. CD28- T cells: their role in the age-
associated decline of immune function. // Trends Immunol. — 2009. — Vol. 30,
№7. — Р. 306–312.
59. Larbi A., Franceschi C., Mazzatti D. et al. Aging of the Immune System as a
Prognostic Factor for Human Longevity // PHYSIOLOGY. — 2008. — Vol. 23,
№2. — Р. 64–74.
60. Saurwein-Teissl M., Lung T.L., Marx F. et al. Lack of antibody production
following immunization in old age: association with CD8(+)CD28(?) T cell clonal
expansions and an imbalance in the production of Th1 and Th2 cytokines. // J
Immunol. — 2002. — 168. — Р. 5893–5899.
61. Mebius R.E., Kraal G. Structure and function of the spleen. // Nat Rev
Immunol. — 2005. — Vol. 5, №8. — Р. 606-616.
62. Koning J.J., Mebius R.E. Interdependence of stromal and immune cells for
lymph node function. // Trends Immunol. — 2012. — Vol. 33, №6. — Р. 264-270.
63. Swirski F.K., Nahrendorf M., Etzrodt M. et al. Identification of splenic
reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. // Science. —
2009. — Vol. 325, №5940. — Р. 612-616.
138
64. Brodsky I., Dennis L.H., Kahn S.B. et al. Normal Mouse Erythropoiesis. I.
The Role of the Spleen in Mouse Erythropoiesis. // Cancer Res. — 1966. — №26.
— Р. 198-201.
65. Cesta M.F. Normal Structure, Function, and Histology of the Spleen. //
Toxicol Pathol. — 2006. — №34. — Р. 455-465.
66. Willard-Mack C.L. Normal Structure, Function, and Histology of Lymph
Nodes. // Toxicol Pathol. — 2006. — №34. — Р. 409-424.
67. Roozendaal R., Mebius R.E., Kraal G. The conduit system of the lymph
node. // International Immunology. — 2008. — Vol. 20, №12. — Р. 1483–1487.
68. Satpathy A.T., Wu X., Albring J.C. et al. Re(de)fining the dendritic cell
lineage. // Nat Immunol. — 2012. — Vol. 13, №12. — Р. 1145-1154.
69. Zalkind S. Ilya Mechnikov: His Life and Work. / Zalkind S. — Honolulu,
Hawaii: University Press of the Pacific, 2011. — 210 р.
70. Stefater J.A., Ren S., Lang R.A. et al. Metchnikoff's policemen:
macrophages in development, homeostasis and regeneration. // Trends Mol Med.
— 2011. — Vol. 17, №12. — Р. 743-752.
71. Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage
activation. // Nat Rev Immunol. — 2008. — Vol. 8, №12. — Р. 958-969.
72. Zhang X., Goncalves R., Mosser D.M. The Isolation and Characterization of
Murine Macrophages. // Curr Protoc Immunol. — 2008. — CHAPTER 14. —
Unit–14.1.
73. Steinman R.M., Cohn Z.A. Identification of a novel cell type in peripheral
lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. // J. Exp.
Med. — 1973. — № 137. — Р. 1142-1162.
74. Geissmann F., Manz M.G., Jung S. et al. Development of monocytes,
macrophages, and dendritic cells. // Science. — 2010. — Vol. 327, №5966. — P.
656-661.
75. Saunders D., Lucas K., Ismaili J. et al. Dendritic cell development in culture
from thymic precursor cells in the absence of granulocytemacrophage colony-
stimulating factor. // J. Exp. Med. — 1996. — № 184. — Р. 2185-2196.
139
76. Zhang Y., Harada A., Wang J.B. et al. Bifurcated dendritic cell
differentiation in vitro from murine lineage phenotype-negative c-kit+ bone
marrow hematopoietic progenitor cells. // Blood. — 1998. — № 92. — Р. 118-128.
77. Thomson A.W. Tolerogenic dendritic cells: all present and correct? // Am J
Transplant. — 2010. — Vol. 10, №2. — Р. 214-219.
78. Alvarez D., Vollmann E.H., von Andrian U.H. Mechanisms and
consequences of dendritic cell migration. // Immunity. — 2008. — Vol. 29, №3.
— Р. 325-342.
79. Tan J.K., O'Neill H.C. Concise review: Dendritic cell development in the
context of the spleen microenvironment. // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25, №9.
— Р. 2139-2145.
80. Bruunsgaard H., Pedersen B.K. Age-related inflammatory cytokines and
disease // Immunol Allergy Clin North Am. — 2003. — Vol. 23, №1. — Р. 15-39.
81. Mooradian A.D., Reed R.L., Osterweil D., Scuderi P. Detectable serum
levels of tumor necrosis factor alpha may predict early mortality in elderly
institutionalized patients. // Journal of the American Geriatrics Society. - 1991. -
Vol. 39, №9. – Р. 891-894.
82. Stout R.D., Suttles J. Immunosenescence and macrophage functional
plasticity: dysregulation of macrophage function by age-associated
microenvironmental changes. // Immunol Rev. — 2005. — № 205. — Р. 60-71.
83. Cecilio C.A., Costa E.H., Simioni P.U. et al. Aging alters the production of
iNOS, arginase and cytokines in murine macrophages. // Braz J Med Biol Res. —
2011. — Vol. 44, №7. — Р. 671-681.
84. Kleemann R., Zadelaar S., Kooistra T.. Cytokines and atherosclerosis: a
comprehensive review of studies in mice. // Cardiovascular Research. — 2008. —
№ 79. — Р. 360–376.
85. Biscaro B., Lindvall O., Tesco G. et al. Inhibition of microglial activation
protects hippocampal neurogenesis and improves cognitive deficits in a transgenic
mouse model for Alzheimer's disease. // Neurodegener Dis. — 2012. — Vol. 9,
№4. — Р. 187-198.
140
86. Yuan A., Chen J.J., Yang P.C. Pathophysiology of tumor-associated
macrophages. // Adv Clin Chem. — 2008. — № 45. — Р. 199-223.
87. Gu S.Q., Sakuma M., Naito S. et al. Surface densities of murine Ia+
dendritic epidermal cells (Ia+DECs) and Thy-1+ dendritic epidermal cells (Thy-
1+DECs) in relationship to aging and ultraviolet B (UVB) radiation. // J Dermatol.
— 1986. — №13. — Р. 433–439.
88. Komatsubara S., Cinader B., Muramatsu S. Polymorphism of age-related
changes in stimulatory capacity of murine dendritic cells. // Mech Ageing Dev. —
1986. — №37. — Р. 163–173.
89. Linton P.J., Li S.P., Zhang Y. et al. Intrinsic versus environmental influences
on T-cell responses in aging. // Immunol Rev. — 2005. — №205. — Р. 207–219.
90. Grolleau-Julius A., Garg M.R., Mo R. et al. Effect of aging on bone marrow-
derived murine CD11c+ CD4-CD8alpha-dendritic cell function. // J Gerontol A
Biol Sci Med Sci. — 2006. — № 61. — Р. 1039–1047.
91. Steger M.M., Maczek C., Grubeck-Loebenstein B. Morphologically and
functionally intact dendritic cells can be derived from the peripheral blood of aged
individuals. Clin Exp Immunol. — 1996. — № 105. — Р. 544–550.
92. Rittman B.R., Hill M.W., Rittman G.A. et al. Age-associated changes in
Langerhans cells of murine oral epithelium and epidermis. // Arch Oral Biol. —
1987. — № 32. — Р. 885–889.
93. Parameswaran N., Suresh R., Bal V. et al. Lack of ICAM-1 on APCs during
T cell priming leads to poor generation of central memory cells. // J Immunol. —
2005. — Vol. 175, №4. — Р. 2201-2211.
94. Geijtenbeek T.B., Torensma R., van Vliet S.J. et al. Identification of DC-
SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary
immune responses. // Cell. — 2000. — № 100. — Р. 575–585.
95. Grolleau-Julius A., Abernathy L., Harning E. et al. Mechanisms of murine
dendritic cell antitumor dysfunction in aging. // Cancer Immunol Immunother. —
2009. — Vol. 58, №12. — Р. 1935–1939.
141
96. Teig N., Moses D., Gieseler S. et al. Age-related changes in human blood
dendritic cell subpopulations. // Scand J Immunol. — 2002. — № 55. — Р. 453–
457.
97. Lung T.L., Saurwein-Teissl M., Parson W. et al. Unimpaired dendritic cells
can be derived from monocytes in old age and can mobilize residual function in
senescent T cells. // Vaccine. — 2000. — № 18. — Р. 1606–1612.
98. Agrawal A., Agrawal S., Gupta S. Dendritic Cells in Human Aging. // Exp
Gerontol. — 2007. — Vol. 42, №5. — Р. 421–426.
99. Fooksman D.R., Vardhana S., Vasiliver-Shamis G. et al. Functional
Anatomy of T Cell Activation and Synapse Formation // Annu Rev Immunol. —
2010. — № 28. — Р. 79-105.
100. Kuhns M.S., Badgandi H.B. Piecing together the family portrait of TCR-
CD3 complexes. // Immunol Rev. — 2012. — Vol. 250, №1. — Р. 120-143.
101. Smith-Garvin J.E., Koretzky G.A., Jordan J.E. et al. T Cell Activation. //
Annu Rev Immunol. — 2009. — Vol. 27. — P. 591–619.
102. Beemiller P., Krummel M.F. Mediation of T-cell activation by actin
meshworks. // Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2010. — Vol. 2, №9. —
a002444.
103. Brakebusch С., Fassler R. The integrin-actin connection, an eternal love
affair. // The EMBO Journal. — 2003. — Vol. 22, №10. — Р. 2324-2333.
104. Diaz-Meco M.T., Moscat J. The atypical PKCs in inflammation: NF-?B and
beyond. // Immunol Rev. — 2012. — Vol. 246, №1. — Р. 154-167.
105. Corbalan-Garcia S., Gomez-Fernandez J.C. Protein kinase C regulatory
domains: the art of decoding many different signals in membranes. // Biochim
Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1761, №7. — Р. 633-654.
106. Zanin-Zhorov A., Dustin M.L., Blazar B.R. PKC-θ function at the
immunological synapse: prospects for therapeutic targeting. // Trends Immunol. —
2011. — Vol. 32, №8. — Р. 358-363.
107. Hemmings B.A., Restuccia D.F. PI3K-PKB/Akt pathway. // Cold Spring
Harb Perspect Biol. — 2012. — Vol. 4, №9. — a011189.
142
108. Luik R.M., Lewis R.S. New insights into the molecular mechanisms of
store-operated Ca2+ signaling in T cells. // Trends Mol Med. — 2007. — Vol. 13,
№3. — P. 103-107.
109. Gwack Y., Feske S., Srikanth S. et al. Signalling to transcription: store-
operated Ca2+ entry and NFAT activation in lymphocytes. // Cell Calcium. —
2007. — Vol. 42, №2. — Р. 145-156.
110. O'Dea E., Hoffmann A. The regulatory logic of the NF-kappaB signaling
system. // Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2010. — Vol. 2, №1. — a000216.
111. Rothwarf D.M., Karin M. The NF-kappa B activation pathway: a paradigm
in information transfer from membrane to nucleus. // Sci STKE. — 1999. — Vol.
1999, №5. — RE1.
112. Huxford T., Ghosh G. A structural guide to proteins of the NF-kappaB
signaling module. // Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2009. — Vol. 1, №3. —
a000075.
113. Attar R.M., Macdonald-Bravo H., Raventos-Suarez C. et al. Expression of
constitutively active IkappaB beta in T cells of transgenic mice: persistent NF-
kappaB activity is required for T-cell immune responses. // Mol Cell Biol. — 1998.
— Vol. B8718, №1. — Р. 477-487.
114. Klement J.F., Rice N.R., Car B.D. et al. IkappaBalpha deficiency results in a
sustained NF-kappaB response and severe widespread dermatitis in mice. // Mol
Cell Biol. — 1996. — Vol. 16, №5. — Р. 2341-2349.
115. Prosch S., Wuttke R., Kruger D.H. et al. NF-kappaB--a potential therapeutic
target for inhibition of human cytomegalovirus (re)activation? // Biol Chem. —
2002. — Vol. 383, №10. — Р. 1601-1609.
116. Kim H.J., Park J.K., Kim Y.G. Suppression of NF-kappaB activation in
normal T cells by supernatant fluid from human renal cell carcinomas. // J Korean
Med Sci. — 1999. — Vol. 14, №3. — Р. 299-303.
117. Lee N.S., Barber L., Kanchwala A. et al. Low levels of NF-κB/p65 mark
anergic CD4+ T cells and correlate with disease severity in sarcoidosis. // Clin
Vaccine Immunol. — 2011. — Vol. 18, №2. — Р. 223-234.
143
118. Sundstedt A., Sigvardsson M., Leanderson T. et al. In vivo anergized CD4+
T cells express perturbed AP-1 and NF-kappa B transcription factors. // Proc Natl
Acad Sci U S A. — 1996. — Vol. 93, №3. — Р. 979-984.
119. Schmitz M.L., Bacher S., Dienz O. NF-kappaB activation pathways induced
by T cell costimulation. // FASEB J. — 2003. — Vol. 17, №15. — Р. 2187-2193.
120. Riha P., Rudd C.E. CD28 co-signaling in the adaptive immune response. //
Self Nonself. — 2010. — Vol. 1, №3. — Р. 231-240.
121. Wang S., Chen L. T lymphocyte co-signaling pathways of the B7-CD28
family. // Cell Mol Immunol. — 2004. — Vol. 1, №1. — Р. 37-42.
122. Ueno S., Sudo T., Oka N. et al. Absence of Human Papillomavirus Infection
and Activation of PI3K-AKT Pathway in Cervical Clear Cell Carcinoma. // Int J
Gynecol Cancer. — 2013. — Vol. 23, №6. — Р. 1084-1091.
123. Stankiewicz E., Prowse D.M., Ng M. et al. Alternative HER/PTEN/Akt
pathway activation in HPV positive and negative penile carcinomas. // PLoS One.
— 2011. — Vol. 6, №3. — e17517.
124. Wu T., Mohan C. The AKT axis as a therapeutic target in autoimmune
diseases. // Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. — 2009. — Vol. 9, №2.
— Р. 145-150.
125. Negro R., Gobessi S., Longo P.G. et al. Overexpression of the
autoimmunity-associated phosphatase PTPN22 promotes survival of antigen-
stimulated CLL cells by selectively activating AKT. // Blood. — 2012. — Vol.
119, №26. — Р. 6278-6287.
126. Rudd C.E., Taylor A., Schneider H. CD28 and CTLA-4 coreceptor
expression and signal transduction. // Immunol Rev. — 2009. — Vol. 229, №1. —
Р. 12-26.
127. Song J., Lei F.T., Xiong X. et al. Intracellular signals of T cell costimulation.
// Cell Mol Immunol. — 2008. — Vol. 5, №4. — Р. 239-247.
128. Fulop T., Larbi A., Dupuis G. et al. Perturbations of TCR signal transduction
pathways with ageing – a biochemical paradigm for the ageing immune system //
Arthritis Res Ther. — 2003. — №5. — Р. 290-302.
144
129. Pahlavani M.A., Harris M.D., Richardson A. Activation of p21ras/MAPK
signal transduction molecules decreases with age in mitogen-stimulated T cells
from rats. // Cell Immunol. — 1998. — Vol. 185, №1. — Р. 39-48.
130. Mattoo H., Faulkner M., Kandpal U. et al. Naive CD4 T cells from aged
mice show enhanced death upon primary activation. // International Immunology.
— 2009. — Vol. 21, №11. — Р. 1277–1289.
131. Kirk C.J., Miller R.A. Analysis of Raf-1 activation in response to TCR
activation and costimulation in murine T-lymphocytes: effect of age. // Cell
Immunol. — 1998. — Vol. 190, №1. — Р. 33-42.
132. Pahlavani M.A., Vargas D.M. Influence of aging and caloric restriction on
activation of Ras/MAPK, calcineurin, and CaMK-IV activities in rat T cells. //
Proc Soc Exp Biol Med. — 2000. — Vol. 223, №2. — Р. 163-169.
133. Garcia G.G., Sadighi Akha A.A., Miller R.A. Age-related defects in
moesin/ezrin cytoskeletal signals in mouse CD4 T cells. // J Immunol. — 2007. —
Vol. 179, №10. — P. 6403-6409.
134. Garcia G.G., Miller R.A. Age-related defects in the cytoskeleton signaling
pathways of CD4 T cells. // Ageing Res Rev. — 2011. — Vol. 10, №1. — Р. 26-
34.
135. Kirk C.J., Freilich A.M., Miller R.A. Age-related decline in activation of
JNK by TCR- and CD28-mediated signals in murine T-lymphocytes. // Cell
Immunol. — 1999. — Vol. 197, №2. — Р. 75-82.
136. Bunster E., Meyer R.K. An improved method of parabiosis // Anat. Res. —
1933. — Vol. 57, №4. — P. 339-343.
137. Сидоренко Е.В. Методы математической обработки в психологии. —
СПб: ООО «Речь», 2000. – 350 с., ил.
138. Sidorenko A. V., Gubrii I. B., Andrianova L. F. et al. Functional
rearrangement of lymphohemopoietic system in heterochronically parabiosed mice
// Mech Ageing Develop. — 1986. — Vol. 36, № 1. — Р.41-56.
139. Surh C. D., Sprent J. Homeostasis of naive and memory T cells // Immunity.
— 2008. — Vol. 29, № 9. — Р. 848-862.
145
140. Schmitz M.L., Krappmann D. Controlling NF-kappaB activation in T cells
by costimulatory receptors. // Cell Death Differ. — 2006. — Vol. 13, №5. —
Р.834-842.
141. Kennedy N.J., Kataokа T., Tschopp J. et al. Caspase Activation Is Required
for T Cell Proliferation. // J Exp Med. — 1999. — Vol. 190, №12. — Р. 1891–
1896.
142. Wagers A.J., Sherwood R.I., Christensen J.L. et al. Little evidence for
developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells // Science. — 2002. —
Vol. 297, № 5590. — Р. 2256-2259.
143. Tauchi H., Hasegawa K. Change of the hepatic cellsin parabiosis between
old and young rats. // Mechanisms of Ageing and Development. — 1977. — № 6.
— Р. 333 - 339.
144. Deyl Z., Butenko G.M., Hausmann J. et al. Increased glycation and
pigmentation of collagen in aged and young parabiotic rats and mice. // Mech
Ageing Dev. — 1990. — Vol. 55, №1. — Р. 39-47.
145. Villeda S.A., Luo J., Mosher K.I. et al. The ageing systemic milieu
negatively regulates neurogenesis and cognitive function. // Nature. — 2011. —
Vol. 477, №7362. — Р. 90-94.
146. Губрий И.Б., Резников А.Г., Демченко В.Н. и пр. Прекращение
овариальной цикличности у молодой мыши при парабиозе ее со старой. //
Бюл. эксперим. биол. мед. — 1987. — Т.103, № 2. — С. 205-208.
147. Conboy I.M., Conboy M.J., Wagers A.J., Girma E.R., et al. Rejuvenation of
aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. // Nature. —
2005. — Vol. 433, №7027. — Р. 760-764.
148. Villeda S.A., Plambeck K.E., Middeldorp J., et al. Young blood reverses
age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. //
Nat Med. — 2014. — Vol. 20, №6. — Р. 659-663.
149. Лабунец И.Ф., Родниченко А.Е., Магдич Л.В. и пр. Тимус и адаптивные
изменения клеточного состава костного мозга у животных разного возраста.
// Успехи геронтологии. — 2011. — №2. — С. 207-215.
146
150. Papiernik M. The thymus micro-environment and T lymphocyte
differentiation. // Reprod Nutr Dev. — 1984. — Vol. 24, №2. — Р. 179-187.
151. Ferrando-Martínez S., de la Fuente M., Guerrero J.M. et al. Impact of thymic
function in age-related immune deterioration. // Rev Esp Geriatr Gerontol. —
2013. — Vol. 48, №5. — Р. 232-237.
152. Qi Q., Zhang D.W., Weyand C.M. et al. Mechanisms shaping the naïve T
cell repertoire in the elderly – Thymic involution or peripheral homeostatic
proliferation? // Exp Gerontol. — 2014. — №54. — Р. 71-74.
153. Cools N., Ponsaerts P., Van Tendeloo V. F. et al. Balancing between
immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells,
and effector T cells. // J. Leukoc. Biol. — 2007. — Vol. 82, № 6. — Р. 1365-1374.
154. Murali-Krishna K., Lau E. L., Sambhara S. et al. Persistence of memory
CD8 T-cells in MHC I-defficient mice // Science. — 1999. — Vol.B127 286, №
5443. — Р. 1377-1381.
155. Nolte M.A., Hoen E.N., van Stijn A. et al. Isolation of the intact white pulp.
Quantitative and qualitative analysis of the cellular composition of the splenic
compartments. // Eur J Immunol. — 2000. — Vol. 30, №2. — Р. 626-634.
156. Gerondakis S., Siebenlist U. Roles of the NF-kappaB pathway in
lymphocyte development and function. // Cold Spring Harb Perspect Biol. —
2010. — Vol. 2, №5. — a000182.
157. Bukowski R.M., Rayman P., Uzzo R. et al. Signal transduction
abnormalities in T lymphocytes from patients with advanced renal carcinoma:
clinical relevance and effects of cytokine therapy. // Clin Cancer Res. — 1998. —
Vol. 4, №10. — р.2337-2347.
158. Фильченков А. А. Реактиваторы апоптоза как препараты целевой
противоопухолевой терапии // Биомедицинская химия. — 2013. — т. 59, № 2.
— Ст. 119-143.
159. Lleo A., Selmi C., Invernizzi P. et al. The consequences of apoptosis in
autoimmunity. // J Autoimmun. — 2008. — Vol. 31, №3. — P. 257-262.
147
160. Matés J.M., Segura J.A., Alonso F.J. et al. Oxidative stress in apoptosis and
cancer: an update. // Arch Toxicol. — 2012. — Vol. 86, №11. — Р. 1649-1665.
161. MacKenzie S.H., Clark A.C. Death by caspase dimerization. // Adv Exp
Med Biol. — 2012. — Vol. 747. — Р. 55-73.
162. Parrish A.B., Freel C.D., Kornbluth S. Cellular mechanisms controlling
caspase activation and function. // Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2013. —
Vol. 5, №6. — pii: a008672.
163. McComb S., Mulligan R., Sad S. Caspase-3 Is Transiently Activated without
Cell Death during Early Antigen Driven Expansion of CD8+ T Cells In Vivo. //
PLoS ONE. — 2010. — Vol. 5, №12. — e15328.
164. Coiras M., López-Huertas M.R., Mateos E. et al. Caspase-3-mediated
cleavage of p65/RelA results in a carboxy-terminal fragment that inhibits IκBα and
enhances HIV-1 replication in human T lymphocytes. // Retrovirology. — 2008.
— Vol. 5. — Р. 1-20.
165. Alam A., Cohen L.Y., Aouad S., et al. Early activation of caspases during T
lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic
cells. // J Exp Med. — 1999. — Vol. 190, №12. — Р. 1879-1890.

Київ - 2015

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Київ - 2015

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Національна академія медичних наук України

Державна установа «Інститут геронтології ім. Д.Ф. Чеботарьова НАМН»

УДК 612.017.112.94 + 577.7

ШИТІКОВ ДМИТРО В’ЯЧЕСЛАВОВИЧ

МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ВІКОВИХ ЗМІН Т-КЛІТИННОЇ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Пішель Ірина Миколаївна,

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ,

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ …………………………………………. 12

1.1. Роль Т-лімфоцитів в імунній системі та їх вікові зміни …………… 12

1.2. Мікрооточення Т-лімфоцитів у вторинних лімфоїдних органах ….. 20

1.3. Молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів ……………………. 27

Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ .……………………. 35

2.1. Дослідження стану імунної системи in vivo в експерименті на

2.1.1. Схеми експериментів та експериментальні моделі ………………. 35

2.1.2. Методи експериментальних досліджень стану імунної системи… 37

2.2. Дослідження стану імунної системи in vitro………………………… 40

2.2.1. Схеми експериментів та експериментальні моделі ………………. 40

2.2.2. Дослідження змін у функціональному стані Т-лімфоцитів ……… 41

2.2.3. Методи експериментальних досліджень впливу клітин

2.3. Дослідження впливу макрофагів селезінки на молекулярні

2.3.1 Схеми експерименту та експериментальні моделі ……………….. 47

2.3.2 Методи експериментальних досліджень впливу макрофагів

2.4. Статистичний аналіз результатів ……………………………………. 50

Розділ 3. ОСНОВНІ ПОРУШЕННЯ Т-КЛІТИННОЇ ЛАНКИ ІМУННОЇ

3.1 Зміни маси та клітинності тимусу молодих партнерів по

ВИСНОВКИ ……………………………………………………………….. 130

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………………………….……… 132

АПК Антигенпрезентуючі клітини

Актуальність теми. З віком імунна система підлягає значним

1.1. Роль Т-лімфоцитів в імунній системі та їх вікові зміни

1.3. Молекулярні механізми активації Т-лімфоцитів

Найдослідженішими серед численних костимуляторних молекул, що

Для реалізації поставлених завдань використовувались сучасні методи

2.1 Дослідження стану імунної системи in vivo в експерименті на

Рис. 2.1. Опис експериментальної моделі.

Тварин було розподілено на наступні експериментальні групи:

Молоді ізохронні парабіонти (n = 20).

До експерименту тварин брали через 6 або 12 тижнів після операції.

2.1.2 Методи експериментальних досліджень стану імунної системи

Параметри фагоцитозу МФ селезінки визначали з використанням

де ВФ – відсоток фагоцитозу, NФ – кількість МФ, які поглинули

де ФЧ – фагоцитарне число, nФ – кількість часток латексу у

2.2 Дослідження стану імунної системи in vitro

Молоді ізохронні парабіонти (n = 10).

Для другого блоку тварин було розподілено на такі експериментальні

Молоді ізохронні парабіонти (n = 12).

В експеримент тварин брали зі строком співіснування протягом 6

2.2.2 Дослідження змін у функціональному стані Т-лімфоцитів

2.2.3 Методи експериментальних досліджень впливу клітин

Визначення проліферативної активності Т-лімфоцитів іn vіtro

3. Т-клітини селезінки парабіонтів та аутологічні МФ селезінки.

Визначення проліферативної активності Т-лімфоцитів іn vіtro

Молоді ізохронні парабіонти (n = 12).

В експеримент тварин брали зі строком співіснування у парабіотичних

2.3.2 Методи експериментальних досліджень впливу макрофагів

5. Т-клітини селезінки парабіонтів та аутологічні МФ селезінки з часом

Аналіз змін вмісту сигнальних білків проводився за використанням АТ

nDx • 100% (2.5)

де nDx – нормалізована оптична густина бенду досліджуваного білку,

де Ex – відносна експресія досліджуваного білку у зразку, nDx –

2.4. Статистичний аналіз результатів.

3.1. Зміни маси та клітинності тимусу молодих партнерів по