Modern fénymikroszkópos eljárások

1. Fluoreszcencia mikroszkópia
- a minták fluoreszcenciáját képezzük le, amelyet a megvilágító fény vált ki
- élő sejteket felépítő anyagok egy része fluoreszkál
o NADH
o A,B,C-vitamin
- natív/intrinsic fluoreszcencia
- de általában fluorflórokat használnak
- gerjesztést megfelelő hullámhosszú fénnyel kell végezni
- gerjesztő és emittált fényt el kell választani
o optimális, ha csak az emittált fény jut a szemünkbe
- optimális gerjesztési hullámhossztartomány:
o lámpa elé helyezett színes szűrővel
o megfelelő lézer alkalmazása
o használt festék abszorpciós spektrumának megfelelő
o λ általában: kék, zöld, UV-tartomány
o ha UV kell: kvarcból készült lencsék a megvilágító oldalra
- emittált fény elválasztása: dikroikus tükör
o okulár és objektív közé
o gerjesztő fényt a mintára vetíti
o de az emittált fotonokat eltérítés nélkül
átengedi a megfigyelő irányába
o emissziós szűrőn is áthaladnak a fotonok a
jobb jel/zaj arány elérése miatt
- fényforrás lehet:
o lámpa
o lézer (argon-ion, argon-kripton-ion, He-Ne lézer)
 ebben az esetben nem kell emissziós szűrő

2. Konfokális lézer-mikroszkóp
- = konfokális pásztázó mikroszkóp (CLSM)
- speciális lézermikroszkóp
- a tárgy mozgatásával pontról pontra történik a leképezése (=konfokális leképezés)
- a tárgyat megvilágító fényforrás (=lézer) egy lyukon (lyukdiafragma) keresztül belép a
mikroszkópba
- fókuszálva érkezik a minta egy síkban kiválasztott pontjára
o az objektíven áthaladva
- a tárgypontról keletkező lumineszcencia fényt az objektív egy részben áteresztő tükör
közvetítésével a detektorba vezeti egy másik lyukdiafragmán keresztül: leképezi a
tárgypontot
o csak a tárgypont képe lesz éles a diafragmán, mivel főleg az ebből érkező sugarak
jutnak át a detektorba
- a kiválasztott tárgysík (a tárgy egy vékony szelete) pontról pontra alakul ki
 o számítógép: vezérli a pásztázást és összegyűjti a fényességadatokat a
koordináták szerint
- 3D-s képet is elő tudunk hívni vele (tárolt adatokból összeállítható)
- a pásztázás alapvetően az XY tengelyen történik
- alkalmazás:
o 3D-s lehetősége miatt főleg
o fluoreszcens molekulával való festés, konfokális leképezése
↘fluoreszcens technikában alkalmazzák főképp
o sejtmagi struktúrák vizsgálata, adhéziós organellumok, élő sejtek vizsgálata

 emittált fotonok
 megvilágító fény

3. Kétfotonos gerjesztés
- jobb, mint az 1 fotonos gerjesztés, mert:
o jobb felbontás (mivel a gerjesztés hatása az intenzitás négyzetével arányos)
o kevésbé szóródik a hosszabb hullámhosszú gerjesztés (szövetbe is bejut)
o 3D rekonstrukció, beépített szelekció, optikai szeletelés
o csak a fókuszpontban gerjeszt
o a szórt fluoreszcencia fényt is össze lehet gyűjteni (ami csak a fókuszpontból
származhat)
o kevésbé ég ki a minta
o autofluoreszcencia: festék nélkül is látszik
o UV helyett a láthatóban gerjeszt
o szimultán gerjesztés
o gerjesztés: femtoszekundumos időskálán mozog (10 -15 sec)
 enzimreakciók mechanizmusa
 biokémiai reakciók lépései vizsgálhatók

- példa: Ti-zafír lézer
o 100 fs körüli időtartamú impulzusok sorozatával sugároz
o impulzusokban nagy a teljesítmény
 elég egy kis teljesítményű (1 W) lézert használni
o ha a gerjesztő fotonok elég gyorsan követik egymást, a két foton energiája
összeadódhat, kétszeres energiájú átmenetet gerjesztve
o különleges tulajdonságok:
 fókuszált sugár esetében a gerjesztés egy igen kis térrészre korlátozható