Nghiên cứu &

Sản xuất vaccine

Giới thiệu
• Đơn vị nghiên cứu vs Đơn vị sản xuất
Giới thiệu
• Một số cơ quan quản lý dược phẩm
 Medicines Control Agency, UK
 European Medicines Evaluation Agency
 US Food and Drug Administration
Giới thiệu
• Yêu cầu của GMP
Giới thiệu
• Chi phí liên quan đến sản xuất vaccine
Giới thiệu
• Phương pháp sản xuất phải đơn giản
• Quy trình nghiên cứu thường phải được hoàn
thiện trước khi đưa vào sản xuất
• Các bước thực hiện cần được đơn giản hóa
và giữ ở mức tối thiểu
Giới thiệu
Giới thiệu
Giới thiệu
• Xác định mục đích của dự án sản xuất
vaccine ngay từ đầu
Giới thiệu
• Khi sản xuất các sản phẩm sinh học cần đặc
biệt lưu ý đến
 Kiểm soát quy trình sản xuất
 Thử nghiệm bằng phương pháp sinh học
thay vì hóa lý
do tính dễ biến đổi của sản phẩm
Nguyên liệu thô
• Tất cả các nguyên liệu dùng trong sản xuất
dược phẩm phải được
 Mua từ những nhà cung cấp được thừa
nhận
 Kiểm tra chất lượng trừ khi nguyên liệu đạt
mức dược điển (EP, USP. BP)
 Cần phải có CoA của nhà sản xuất
Nguyên liệu thô
• Khi sử dụng các sản phẩm từ động vật cần
quan tâm đến việc nhiễm các tác nhân gây
bệnh
Chọn lọc chủng
• Chủng hay dòng tế bào thích hợp
Chọn lọc chủng
• Các vi sinh vật tái tổ hợp cần có thông tin về
trình tự, bản đồ của vector với các vị trí cắt
giới hạn và các gene được tạo dòng
Chọn lọc chủng
• Chủng gốc phải được tồn trữ trong các điều
kiện được kiểm soát chặt chẽ
• Khi cấy chuyền hay chuyển giao chủng gốc
phải ghi rõ trong hồ sơ
• Nếu sử dụng các chủng có ích, không gây
bệnh hay được làm yếu để sản xuất vaccine
bao giờ cũng làm tăng giá thành sản xuất
vaccine
Chọn lọc chủng
• Tránh sử dụng các chủng tạo bào tử
Chọn lọc chủng
Chủng tái tổ hợp
• Sản phẩm có thể được tạo thành trong hay
ngoài tế bào tùy thuộc vào vector sử dụng
• Các protein tái tổ hợp được biểu hiện nội bào
ở dạng không tan hoặc tan
Chọn lọc chủng
Chủng tái tổ hợp
• Vi sinh vật sản xuất protease ngoại bào:
protease có thể phân hủy sản phẩm tạo thành
Nuôi cấy
• Chuẩn bị đủ lượng giống của chủng vi sinh vật
dự định sử dụng cho cả quá trình nghiên cứu
• Giống cần được chuẩn bị trong môi trường
dùng cho sản xuất vaccine
Nuôi cấy
Nuôi cấy
Chọn môi trường
• Giai đoạn nghiên cứu: quan trọng, giúp giảm
thời gian và chi phí trong giai đoạn hoàn thiện
• Yêu cầu: môi trường đơn giản, không có
thành phần từ động vật, cho sinh khối và hàm
lượng cao
Nuôi cấy
Chọn môi trường
Nuôi cấy
Chọn môi trường
Nuôi cấy
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
• Các yếu tố cần tối ưu hóa
 Nhiệt độ  Chất chống bọt
 pH  Thời gian cho vi sinh vật vào
 Tốc độ lắc  Thời gian thu hoạch
 Nguồn C
Nuôi cấy
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
• Ngoài quy trình nuôi cấy chuẩn, nồi lên men
có thể vận hành liên tục hay quy mô fed-batch
→ nên dùng nồi lên men từ khi nghiên cứu
vaccine thay vì đợi đến lúc hoàn thiện
• Trong phase pilot cần kiểm tra độ ổn định của
vector tái tổ hợp đặc biệt khi đã loại bỏ các tác
động chọn lọc (ví dụ kháng sinh)
Xử lý sản phẩm
• Chọn các phương pháp để tách kháng nguyên
ra khỏi vi sinh vật sản xuất ra nó và môi
trường nuôi cấy
Xử lý sản phẩm
• Những chất sử dụng trong quá trình sản xuất
bắt buộc phải được loại bỏ ở bước sau
Xử lý sản phẩm
• Khi xây dựng quy trình tinh sạch cần lưu ý đến
các hạn chế có thể có khi sản xuất ở quy mô
lớn
Xử lý sản phẩm
Xử lý bước đầu
• Dùng sắc ký để loại tạp chất
• Xử lý ban đầu cần phải loại bỏ được phần lớn
các thành phần tạp chất không mong muốn
Xử lý bước đầu
• Tách sản phẩm ra khỏi vi sinh vật
• Ly giải tế bào giải phóng protein
Xử lý bước đầu
• Tạp chất ảnh hưởng lớn nhất: DNA nhiễm sắc
thể
• Loại mảnh vỡ tế bào
• Loại nước: “tạp chất” chiếm lượng lớn nhất
Xử lý bước đầu
• Tủa protein
• Tủa tạp chất hay/và sản phẩm bằng cách
dùng pH
Sắc ký
• Trong nghiên cứu: dùng các phức hợp
gradient để cải thiện các điều kiện rửa giải sản
phẩm (elution condition) từ chất nền sắc ký
• Trong sản xuất: các dụng cụ để cung cấp
những gradient như thế rất mắc và không cho
ra những gì thu được như trong nghiên cứu
→ Chỉ sử dụng gradient dùng rửa giải sơ bộ
Sắc ký
• Khi dùng sắc ký để tinh chế sản phẩm GMP
cần lưu ý đến độ ổn định của chất nền khi rửa
và làm vệ sinh
• Các nhà sản xuất cột sắc ký cung cấp các chi
tiết về độ ổn định hóa lý của các sản phẩm
sắc ký chuyên dùng cho GMP nhưng các nhà
sản xuất vaccine phải chịu trách nhiệm chuẩn
hóa các phương pháp vệ sinh làm sạch
Sắc ký
 Để tránh chi phí làm vệ sinh nên sử dụng
chất nền mới cho mỗi đợt sản xuất
 Nên sử dụng chất nền sắc ký chuyên dùng
cho sản phẩm GMP nếu có thể
Sắc ký
• Nếu sản phẩm khó tinh chế, nên sử dụng các
hệ thống thương mại dùng 1 đuôi ái lực gắn
vào protein để tách nhanh ra khỏi cột sắc ký;
phần đuôi thường dùng: hex-histidine, protein
gắn maltose, glutathione S-transferase
(Novagen)
 Đuôi ái lực phải dễ dàng tách ra khỏi protein
và loại khỏi sản phẩm qua bước sắc ký
Xây dựng công thức
• Cần thử nghiệm trước trên động vật để xác
định có cần chất hỗ trợ hay không
• Dựa vào các dữ liệu có được khi nghiên cứu
về độ ổn định của sản phẩm để xây dựng
công thức sản phẩm (dung dịch tiệt trùng hay
sản phẩm đông khô) và bổ sung các tá dược
ổn định nếu cần
• Cần kiểm tra đến các yếu tố ảnh hưởng đến
công thức của vaccine
Các phương pháp phân tích
• Ngoài việc tạo ra một protocol để sản xuất
vaccine, khi nghiên cứu cần xác định các tính
chất vật lý và sinh hóa của sản phẩm
→ Các tính chất này quyết định các phương
pháp nào sẽ được sử dụng để sản xuất cũng
như làm nền tảng cho các thử nghiệm kiểm
tra chất lượng
Các phương pháp phân tích
• Có 2 loại thử nghiệm kiểm tra chất lượng
 Các thử nghiệm trong quá trình sản xuất để
kiểm tra sản phẩm, các tạp chất, các thông
số thực hiện (pH, nhiệt độ hay độ truyền
dẫn…)
 Kiểm tra sản phẩm cuối cùng
Các phương pháp phân tích
• Trong giai đoạn phát triển sản phẩm cần xây
dựng phương pháp đánh giá hiệu quả của các
hoạt chất → cần có mô hình động vật để kiểm
tra xem vaccine có khả năng bảo vệ chống lại
bệnh nhiễm hay độc tố hay không → quyết
định lựa chọn “ứng viên” nào
• Khi lựa chọn động vật thử nghiệm, cần xem
xét tới chi phí để thử nghiệm thường xuyên
trên từng lô vaccine cũng như các thử nghiệm
về chuẩn hóa và độ ổn định
Các phương pháp phân tích
• Các phương pháp thử nghiệm (định tính, định
lượng, xác định độ tinh khiết…) cần phải được
chuẩn hóa nếu dùng cho giai đoạn thử nghiệm
lâm sàng pha 1
• Khi chọn 1 phương pháp thử nghiệm cần xem
xét các thông số sau đây có đáp ứng hay
không: tính lặp lại, độ chính xác, tính đặc hiệu,
tính thực tế và tính thích ứng
Các phương pháp phân tích
Một số phương pháp được sử dụng để kiểm
tra protein vaccine thành phẩm
• Hiệu quả Động vật
• Định lượng Xác định hàm lượng protein
Các thử nghiệm miễn dịch
(ELISA)
• Định tính Western-blot với Ab đơn dòng,
Xác định trình tự protein
Khối phổ, phân tích amino acid
• Độ an toàn Độc tính trên động vật
Các phương pháp phân tích
Một số phương pháp được sử dụng để kiểm
tra protein vaccine thành phẩm
• Chất hỗ trợ Tùy vào bản chất hóa học của
chất sử dụng
• Độ ổn định Kiểm tra các tính chất trên ở
những điều kiện và thời gian
bảo quản khác nhau
• Protein chính Điện di trên gel, 2 chiều, mao
quản, HPLC pha đảo
Các thử nghiệm miễn dịch
Các phương pháp phân tích
Một số phương pháp được sử dụng để kiểm
tra protein vaccine thành phẩm
• DNA chính Lai hóa DNA
• Endotoxin LAL (Limulus Amoebocyte
Lysate), chí nhiệt tố trên thỏ
• Vi khuẩn, vi nấm Độ vô trùng

• Virus Các thử nghiệm sinh học

Các thử nghiệm miễn dịch
• Chất phụ gia Tùy vào các chất sử dụng
Lưu trữ tài liệu
• Cần lưu tất cả các tài liệu liên quan trong suốt
quá trình nghiên cứu
• Hồ sơ chuyển giao kỹ thuật đòi hỏi phải cung
cấp chi tiết về quá trình nghiên cứu, phương
pháp phân tích với tất cả các số liệu trong
trường hợp
Lưu trữ tài liệu
 Chuyển giao công nghệ cho các nhà sản
xuất theo GMP
• Trong GMP các hồ sơ về toàn bộ quy trình
giúp
 Ngăn các sai sót có thể xảy ra do truyền
miệng thông tin
 Bảo đảm độ lặp lại
 Thuận tiện cho việc truy xét từng lô sản
phẩm
Lưu trữ tài liệu
• Nếu vaccine được tung ra thị trường, các nhà
chức trách sẽ yêu cầu một báo cáo chi tiết về
quá trình phát triển sản phẩm từ ý tưởng thực
hiện ban đầu cho tới khi sản xuất ra thành
phẩm bao gồm các dữ liệu trong quá trình
nghiên cứu cũng như phát triển và sản xuất
Tóm tắt
Các yếu tố chính cần lưu tâm trong một dự án
nghiên cứu về vaccine để bảo đảm chuyển giao
công nghệ, sản xuất trôi chảy, không thiếu sót
• Quy trình trong nghiên cứu phải có thể chuyển
sang sản xuất, nếu không thể nâng cấp hoặc
không thích hợp với các nguyên tắc của GMP:
tìm giải pháp khác thay vì mất thời gian
• Thiết kế quy trình càng đơn giản càng tốt để
giảm chi phí nhân công và phương tiện, tăng
quy mô cũng như tăng tối đa lợi nhuận thu
được
Tóm tắt
• Bảo đảm quy trình có thể lặp lại ở quy mô nhỏ
trước khi chuyển giao công nghệ để tránh chi
phí tái phát triển sản phẩm
• Giữ lại các hồ sơ của cả quá trình nghiên cứu
để giảm thiểu việc chuẩn bị giấy tờ chuyển
giao công nghệ, đăng ký bảo hộ sản phẩm,
đăng ký bằng sáng chế
Tóm tắt
• Tham vấn thường xuyên với các nhân viên
phát triển sản phẩm, an toàn lao động, quản lý
chất lượng và sản xuất để đánh giá khả năng
thích ứng của quy trình nghiên cứu so với sản
xuất ở quy mô lớn đáp ứng GMP
→ nhanh chóng khắc phục sai sót ngay bước
đầu ở mức chi phí thấp
Tóm tắt
• Tập trung các thông tin về sản phẩm càng
nhiều càng tốt để thuận tiện cho việc xác định
phương pháp phân tích và định hướng các
quy trình tách chiết
• Phát triển càng nhiều càng tốt các phương
pháp phân tích dùng trong nghiên cứu, sản
xuất cũng như cho thành phẩm → tránh việc
đình trệ khi phải tìm kiếm các phương pháp
thích hợp ở giai đoạn cuối
Tóm tắt
Các phương pháp thay thế dùng cho quy mô
lớn hoặc sản xuất GMP
• Kích thích biểu hiện protein: kích thích quá
trình sinh lý / dùng chất hóa học
• Nuôi cấy tế bào thu sinh khối: lên men liên tục
/ lắc
• Phá vỡ tế bào: Máy đồng hóa áp suất cao,
nghiền bi, chất hóa học / Siêu âm
• Giảm hoạt tính protease: Sử dụng chủng
không sinh protease / dùng chất ức chế
protease
Tóm tắt
Các phương pháp thay thế dùng cho quy mô
lớn hoặc sản xuất GMP
• Loại bỏ DNA: Sắc ký trao đổi ion, lọc bằng
màng đặc biệt / nuclease
• Loại tạp chất: Lọc, ly tâm liên tục/ ly tâm
• Loại nội độc tố: sắc ký trao đổi ion, lọc qua
màng đặc biệt / Polymyxin
• Tinh chế: Lọc gel / thẩm phân