Professional Documents
Culture Documents
- Làm nhỏ nguyên liệu, giải phóng tinh bột ra khỏi tế bào.
- Nhào với nước, lọc qua rây, lấy phần dưới rây.
3. Xác định sự có mặt trong dược liệu: Tác dụng với dd iod 🡪 Xanh tím (xđ tổ chức chứa tinh bột).
3.1. Lý tính:
- Đa số không màu, 1 số có màu (anthraglycosid: màu đỏ, flavonoid: màu vàng). Vị đắng.
- Độ tan:
+ Glycosid:
Tan trong nước, cồn, ít hoặc không tan trong dm hữu cơ.
Độ tan phụ thuộc vào mạch đường (dài, ngắn); vào nhóm ái nước của aglycon.
- Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực (thường là quay trái).
- Đa số glycosid không có tính khử (vì -OH bán acetal của đường đã tham gia vào dây nối).
+ Glycosid có đường đặc biệt (2,6-deoxy) 🡪 Cho phản ứng đặc hiệu.
+ Aglycon: Có thuốc thử đặc hiệu, phụ thuộc vào cấu trúc hóa học.
- Liên kết glycosid dễ bị thủy phân bởi acid, enzym. Sau khi thủy phân các -ose được giải phóng sẽ khử
thuốc thử Tollens hoặc Fehling.
- Sự thủy phân có tính chọn lọc (mỗi enzym chỉ cắt 1 loại dây nối; trừ emulsin và myrosin).
3 - Glycosid tim
3. Tính chất lý hóa.
3.1. Tính chất lý học:
- Chất kết tinh không màu, vị đắng.
- Tan trong nước, cồn, không tan trong benzene, ether.
- Có năng suất quay cực.
3.2. Tính chất hóa học:
- Đường 2,6 desoxy dễ bị thủy phân bởi:
+ Acid vô cơ 0.05N/MeOH, 30 phút.
+ Enzym, tạo glycosdi thứ cấp.
- Aglycon:
+ Nhân steroid
+ Vòng lacton dễ bị mở vòng trong mt kiềm tạo dẫn chất iso không có tác dụng.
4. Các phương pháp định tính – định lượng.
4.1. Thuốc thử tác dụng lên phần đường (2-desoxy): (3)
- TT Xanthydrol
+ Đường 2-desoxy: Phản ứng (+): Màu đỏ mận rõ, ổn định 🡪 Định lượng (λ = 550nm).
+ Đường 2-desoxy đã acetyl hóa: Phản ứng kém nhạy.
+ Đường 2-desoxy đã nối với glucose ở vị trí số 4, đường 6-desoxy: Phản ứng (-).
- TT H3PO4 đặc: Màu vàng 🡪 Định lượng (λ = 474nm)
- TT Keller-Kiliani: Tạo vòng màu đỏ, màu không ổn định 🡪 Không dùng định lượng.
4.2. Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon
a. Nhân steroid
- TT cho màu: Liebermann – Burchardt: Các dẫn chất có nhân steroid: Phản ứng (+): Tạo vòng màu
hồng – đỏ, trộn đều có màu xanh lá cây.
- TT cho huỳnh quang dưới ánh sáng UV: Các tác nhân dehydrat hóa làm mất nước 🡪 Tạo nối đôi ∆ 14-
15
và ∆16-17 (đối với cardenolid có -OH ở C16) => Phát huỳnh quang.
+ TT H3PO4: Huỳnh quang xanh lá cây.
+ TT Tatjie: Phản ứng với cardenolid có -OH ở C16 🡪 Màu đỏ đậm 🡪 Định lượng (λ = 272nm).
+ TT Svendsen – Jesen: Phản ứng với cardenolid có -OH ở C16 🡪 Hq xanh. Là TT hiện màu SKLM.
b. Vòng lacton
- Cardenolid tác dụng với dẫn chất nitro thơm/mt kiềm 🡪 Sản phẩm màu đỏ đến tím:
+ TT Baljet: Đỏ da cam.
+ TT Kedde: Đỏ tía 🡪 Định lượng (λ = 540nm).
+ TT Raymond – Marthoud: Màu tím không bền.
+ TT Legal : Màu đỏ
- Bufadienolid: Phản ứng trên âm tính => ĐT: SbCl3/CHCl3: Màu tím hoặc ĐT bằng phổ UV.
4.3. Sắc kí
- Sắc kí giấy: Dung môi: n-BuOH bão hòa nước.
- Sắc kí lớp mỏng:
+ Chất hấp phụ: Sillicagen G.
+ Dung môi: EtOAc : MeOH : H2O (80:5:5)
+ TT hiện màu: TT Kedde (màu đỏ), TT Raymond – Marthoud (màu tím), TT Xanthydrol…
4.4. Quang phổ
a. Phổ tử ngoại (UV)
- Cardenolid có đỉnh hấp thụ cực đại λ 215-218 nm. Nếu có nhóm carbonyl (C=O) thì có đỉnh hoặc vai ở
λ 272-305 nm.
- Bufadienolid có đỉnh hấp thụ cực đại λ 300 nm.
b. Phổ hồng ngoại (IR).
4.5. Định lượng
- Phản ứng tạo màu/huỳnh quang.
- Định lượng glycosid tim toàn phần hay glycosid tim tinh khiết (tách):
+ Bằng máy đo mật độ quang trên SK đồ.
+ Làm phản ứng màu, đo mật độ quang.
- Định lượng aglycon (genin) sau khi thủy phân bằng HCl 0,2N.
4.6. Đánh giá bằng phương pháp sinh vật.
- Dược điển quy định đánh giá hiệu lực glycosid tim bằng phương pháp sinh vật.
- Súc vật: Mèo, ếch.
- Phương pháp:
+ Mèo: Tiêm tĩnh mạch đùi, dựa vào liều gây ngừng tim ở thời kì tâm trương 🡪 Đơn vị mèo.
+ Ếch: Tiêm dưới da vào túi bạch huyết, dựa vào liều gây ngừng tim ở thời kì tâm thu 🡪 Đơn vị ếch.
*Đơn vị mèo: Là liều tối thiểu cửa dược liệu hay của glycosid tim là cho tim mèo ngừng đập tính theo 1kg thể
trọng.
*Đơn vị ếch: Là liều tối thiểu của dược liệu hay của glycosid tim làm cho đa số ếch trong 1 lô thí nghiệm bị ngừng
tim (TN được tiến hành trong điều kiện quy định).
4 – Saponin
CSPH=2C x X
C: Nồng độ dd bồ kết.
X: Số ml dd bồ kết đã cho vào ống nghiệm mà ở đó có sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.
c. Các phản ứng màu:
- Phản ứng Salkowski (H2SO4 đặc): Cho màu thay đổi.
- Phản ứng Rosenthaler (vanillin 1%/HCl, to): Saponin triterpenoid cho màu hoa cà.
- Phản ứng phân biệt saponin triterpenoid và steroid:
Phản ứng Tác nhân Saponin Saponin steroid
triterpenoid
Liebermann – (CH3CO)2O + H2SO4 đặc Màu hồng - tía Màu lơ – xanh lá
Burchardt
SbCl3/CHCl3 + UV365 nm Huỳnh quang xanh Huỳnh quang vàng
b. Phản ứng với thuốc thử diazo/mt kiềm yếu 🡪 Màu cam – đỏ.
c. Tác dụng với Brom/nhiệt độ lạnh 🡪 Dibromid (làm mất màu nước brom).
d. Tác dụng với kalicyanid 🡪 4-cyanohydrocoumarin.
e. Mở vòng furan (furocoumarin): Tác dụng với Benzen/AlCl 3.
- Thử nghiệm vi thăng hoa 🡪 Cho t/d với 1 giọt dd Iod/KI 🡪 Soi thấy tinh thể màu nâu tím.
- Thử nghiệm huỳnh quang (trên giấy lọc): Nhỏ 1 giọt dịch cồn lên giấy thấm, nhỏ tiếp 1 giọt NaOH 🡪
Sấy khô 🡪 Che nửa vết bằng miếng nhôm, chiếu UV 365 vài phút 🡪 Cất miếng nhôm thấy: nửa vòng tròn
không che sáng hơn nửa bị che. Tiếp tục chiếu UV, 2 nửa sáng như nhau.
- Phản ứng với thuốc thử diazo (Ar-N=N-Cl): Đun cách thủy dịch cồn + Na 2CO3 🡪 Để nguội, thêm
thuốc thử diazo 🡪 Màu đỏ cam.
- Phổ UV, phổ IR:
- SKLM:
+ Bản mỏng silicagel GF254.
+ Dịch chiết: DL/EtOH, đun nóng 🡪 Lọc nóng 🡪 Dịch chiết.
+ Dung môi khai triển:
Hệ 1: Toluen – ethylformat – acid formic (50:40:1)
Hệ 2: Benzen – aceton (9:1)
Hệ 3: Benzen – ethylacetat (95:5).
+ Phát hiện: UV 365nm hoặc phun thuốc thử Iod/KI.
2. Định lượng
- Phương pháp oxy hóa – khử (kém chính xác): Chuẩn độ bằng KMnO4:
Coumarin + dd KMnO4/H2SO4 🡪 Mất màu.
Khi thừa dd KMnO4 🡪 Tím hồng.
- Phương pháp đo phổ UV (cần mẫu tinh khiết): Đo song song với mẫu chuẩn tại λ max 🡪 Ghi Abs. So
sánh với nồng độ chuẩn => Nồng độ coumarin trong mẫu thử.
- Phương pháp HPLC (thông dụng).
8 – Tanin
3. Chiết xuất Tanin: Dược liệu + nước, đun sôi 2 phút 🡪 Để nguội, lọc 🡪 Dịch chiết.
- Tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton. Không tan trong dung môi hữu cơ.
- Phản ứng tủa với các alkaloid hoặc 1 số d/c chứa nitơ khác như hexamethylen teramin, dibazol…
+ Cho tủa với các kim loại nặng như Pb2+, Hg2+, Zn2+, Fe2+,…
+ Với muối sắt, các tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với độ đậm khác nhau.
5.2. SKLM
- Dung dịch thử: DL/MeOH 🡪 Ngâm 15ph 🡪 Lọc 🡪 Dịch lọc = Dịch thử.
6. Định lượng
- Nguyên tắc: Dựa vào hấp phụ của tanin lên bột da chuẩn
P1: Lấy chính xác Vml, bốc hơi sấy khô, cân: m1.
P2: Cho dư bột da khuấy đều, lọc lấy dịch lọc, lấy chính xác Vml, bốc hơi sấy khô, cân m 2
+ Dựa vào sự chênh lệch giữa m1, m2 tính được hàm lượng tanin.
- Nguyên tắc: Dựa vào tính chất dễ bị oxy hóa của tanin bởi KMnO 4. Dùng phương chuẩn độ tanin bằng
KMnO4 0,1 N; chỉ thị màu Sulfo-indigo
9 – Lipid
- Nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào cấu tạo của dầu, mỡ: T onc: Acid béo no > acid béo không no. (càng
nhiều dây nối đôi thì to càng thấp).
- Độ tan: không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ, ít tan trong cồn.
- Tỷ trọng: <1
- Độ nhớt: cao
- Dễ bị thủy phân bởi enzym (lipase) hay mt acid hoặc t o và áp suất cao.
- Dễ bị xà phòng hóa cho glycerol và muối kiềm của acid béo tan/H 2O.
- Cho phản ứng cộng halogen (gắn iod vào đầu thuốc phiện tạo lipiodol làm chất cản quang).
3.3. Xác định các chỉ số hóa học của chất béo
- Để đánh giá chất lượng của một loại chất béo, người ta thường xác định các chỉ số hóa học của mẫu chất
béo đó. Các chỉ số hóa học thường dùng là: chỉ số iod, chỉ số acid, chỉ số xà phòng và chỉ số este.
- Các chỉ số này của mỗi loại dầu mỡ được quy định nằm trong một giới hạn nhất định.
- Định nghĩa:
+ Chỉ số iod của một chế phẩm là số gam iod bị hấp phụ bởi 100g chế phẩm được xác định trong những
điều kiện nhất định.
+ Chỉ số iod của dầu mỡ là số gam iod có thể kết hợp với các acid béo không no có trong 100g dầu mỡ
trong những điều kiện nhất định.
- Nguyên tắc:
+ Acid béo không no trong dầu mỡ kết hợp với iod để bão hòa dây nối đôi. Tác nhân kết hợp: iod clorid
(hay dùng) hoặc iod bromid trong môi trường acid.
Gắn iod clorid vào các mạch nối đôi của acid béo không no (cho thừa lượng iod clorid).
Lượng iod clorid thừa sẽ kết hợp với kali iodid để giải phóng iod tự do.
ĐL iod giải phóng bằng dd natri thiosulfat 0,1N, chỉ thị là hồ tinh bột.
Song song tiến hành với mẫu trắng.
- Tiến hành:
+ Cân chính xác w (g) dầu trong một cốc cân nhỏ, đáy bằng 🡪 Thả vào bình nón 🡪 Thêm 3ml cloroform,
lắc đều để hòa tan dầu 🡪 Thêm iod clorid dư, lắc mạnh 1 phút 🡪 Thêm dd kali iodid, nước cất, lắc đều 🡪
Chuẩn độ bằng dd natri thiosulfat 0,1N, khi ĐL gần kết thúc thêm 2 - 3ml cloroform và 2ml dd hồ tinh
bột.
b. Xác định chỉ số acid, chỉ số xà phòng và chỉ số este của chất béo
- Định nghĩa:
+ Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1g dầu mỡ.
+ Chỉ số este là số mg KOH cần thiết để xà phòng hóa este có trong 1g dầu mỡ.
+ Chỉ số xà phòng là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do và xà phòng hóa este có trong 1g
dầu mỡ.
- Tiến hành:
Cân chính xác b (g) dầu thực vật, cho vào bình nón 🡪Thêm hh cồn tuyệt đối - ether ethylic (1:1) (đã được
trung hòa bằng KOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein), lắc đều 🡪 Thêm phenolphtalein, chuẩn độ bằng dd
KOH 0,1N tới khi xuất hiện màu hồng. Các chất béo có chỉ số acid dưới 1 được định lượng bằng
microburet. Chỉ số acid được xác định theo công thức:
Cân chính xác c (g) dầu thực vật, cho vào bình nón 🡪 Thêm 25ml KOH 0,5N trong cồn. Lắp sinh hàn hồi
lưu, đun cách thủy 60 - 90 phút cho đến khi chất béo thủy phân hoàn toàn. Song song tiến hành mẫu
trắng. Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình 25ml nước mới đun sôi để nguội. Thêm 5 giọt
phenolphtalein. Chuẩn độ bằng dd HCl 0,5N cho đến khi dd mất màu. Chỉ số xà phòng được xác định
theo công thức:
+ Chỉ số este của chất béo: Chỉ số este = chỉ số xà phòng - chỉ số acid.
- Xác định các hằng số vật lý: độ tan, độ nhớt, độ sôi, tỷ trọng…
- Xác định chỉ số hóa học: chỉ số acid, chỉ số ester, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số acetyl, chỉ số iod
a. Nguyên tắc: Chiết dầu mỡ trong dược liệu bằng dmhc 🡪 Cất thu hồi dmhc và sấy cặn đến trọng lượng
không đổi. Cân cặn còn lại (a gam). Hàm lượng dầu mỡ trong DL được tính theo CT:
D%= aw x 100
b. Dụng cụ soxhlet.
- Làm túi giấy lọc đựng dược liệu: Túi hình trụ, đường kính nhỏ hơn đường kính trong của thân Soxhlet,
chiều cao của túi thấp hơn đỉnh của ống dẫn dung môi.
- Cân chính xác 5g dược liệu, nghiền trong cối sứ với 2g Natri sulfat khan 🡪 Cho túi đã chuẩn bị sẵn 🡪
Gập miệng túi rồi đặt vào dụng cụ chiết.
- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi cách thủy. Đặt phễu lên miệng ống sinh hàn, rót dung môi qua phễu, dung môi
thường dùng là ether ethylic hoặc ether dầu hỏa.
- Chiết hồi lưu nhiều lần đến khi dầu mỡ được chiết kiệt. Cách thử: nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc,
hơ nóng 🡪 không để lại vết là đạt yêu cầu.
- Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dm, chuyển sang cốc sạch, khô đã được cân bì 🡪 Đun cách thủy đến
khô 🡪 Sấy cắn đến khối lượng không đổi 🡪 Cân cắn và tính hàm lượng dầu mỡ trong dược liệu.