Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.

com

Công nghệ sinh học

DOI 10.1002 / biot.200600195 Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
Tạp chí

Kiểm tra lại

Phân lập DNA bộ gen thực vật: Nghệ thuật hay khoa học

Astha Varma1, Harish Padh2và Neeta Shrivastava1

1Trung
tâm Phát triển Nghiên cứu và Giáo dục Dược phẩm BV Patel (PERD) - Khoa Dược lý và Hóa thực vật,
Ahmedabad, Gujarat, Ấn Độ
2Trung tâm Phát triển Nghiên cứu và Giáo dục Dược phẩm BV Patel (PERD) - Khoa Công nghệ Sinh học, Ahmedabad, Gujarat,
Ấn Độ

Việc cô lập DNA chất lượng từ các mô / tế bào gây ra nhiều vấn đề đặc biệt khi thực vật Nhận ngày 27 tháng 9 năm 2006 Sửa
được sử dụng làm nguyên liệu nguồn. Các đặc điểm cụ thể của thực vật như sự hiện diện đổi ngày 11 tháng 12 năm 2006 Chấp
của thành tế bào polysaccharide cứng, các sắc tố, sự không đồng nhất về mặt hóa học của nhận ngày 20 tháng 12 năm 2006

các chất chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy ở các loài thực vật đa dạng, v.v., đòi hỏi sự cân
nhắc và kỹ năng đặc biệt trong quy trình phân lập. Cho đến nay, nhiều giao thức đã được
xuất bản cho mục đích này, nhưng không có giao thức nào được tìm thấy là có thể áp
dụng phổ biến. Các yếu tố khác nhau bắt đầu từ việc lựa chọn nguồn nguyên liệu đến
nồng độ của các chất chuyển hóa có trong cây quyết định quá trình phân lập. Bài tổng
quan hiện tại là bản cập nhật các phương pháp khác nhau được sử dụng để phân lập DNA
bộ gen thực vật,

Từ khóa: Tính không đồng nhất về mặt hóa học · DNA bộ gen · Polyphenolics · Polysaccharides · Chất
chuyển hóa thứ cấp

1. Giới thiệu
Lĩnh vực sinh học phân tử thực vật đã chứng kiến
những tiến bộ liên tục liên quan đến việc nghiên cứu
và sử dụng các nguồn gen thực vật ở cấp độ phân tử.
Biên giới mới đang được mở ra với mỗi khám phá mới,
thành tựu quan trọng mới nhất là việc hoàn thành giải
trình tự bộ gen lúa. Vật liệu di truyền đã được các nhà
nghiên cứu thao túng đến tận cốt lõi, bao gồm sản
xuất gen chuyển gen và dược phẩm sinh học, nhân
giống phân tử, lập bản đồ bộ gen, v.v. Tuy nhiên, vấn
đề với các mục tiêu ngoan cố, mà
Thư tín: Tiến sĩ Neeta Shrivastava, Trung tâm Phát triển Nghiên cứu và Giáo
dục Dược phẩm BV Patel (PERD), Đường cao tốc Sarkhej - Gandhinagar,
Thaltej, Ahmedabad 380054, Gujarat, Ấn Độ
E-mail: neetashrivastava_perd@yahoo.co.in Số
fax: + 91-79-27450449
Các từ viết tắt:CTAB, cetyltrimetylamoni bromua;DIECA, axit
diethyldithiocarbamic;PVP, polyvinyl pyrollidone;PVPP, polyvinyl
polypyrollidone
Các nhà sinh học phân tử thực vật đang phải đối mặt hàng
ngày, đó là khó khăn trong việc thu được DNA bộ gen chất
lượng cao, không bị ô nhiễm, mà không có bất kỳ phân tích
hoặc thao tác nào thêm là không khả thi. DNA càng tinh khiết
thì kết quả càng trở nên đáng tin cậy vì axit nucleic bị ô nhiễm
thường không cho kết quả chính xác, đáng tin cậy và có thể
tái tạo.
Trong hai đến ba thập kỷ trước, các nhà nghiên cứu đã phát
triển nhiều quy trình và quy trình để phân lập DNA chất lượng từ
nhiều loài thực vật khác nhau, có thể được sử dụng tùy thuộc vào
mục đích phân lập. Một số quy trình được tuân thủ rộng rãi là
những quy trình được đưa ra bởi Murray và Thompson [1], Doyle
và Doyle [2], Rogers và Bendich [3], Lodhiet al. [4]. Những phương
pháp này đã được chứng minh là thành công trong một số thử
nghiệm cho đến nay. Tuy nhiên, không có phương pháp nào
trong số này hoặc bất kỳ phương pháp nào khác đã được công bố
tự coi là có thể áp dụng phổ biến cho tất cả các giống cây trồng.
Nói chung, các nhà nghiên cứu cần phải sửa đổi một giao thức
hoặc pha trộn hai hoặc nhiều quy trình khác nhau để thu được
DNA có chất lượng mong muốn cho một yêu cầu cụ thể. Trong bài
tổng quan này, chúng tôi đã nhấn mạnh các yếu tố dẫn đến
những sửa đổi như vậy, và đó là yếu tố bắt buộc trong quá trình
phân lập DNA bộ gen từ thực vật.

386 © 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
2 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến phương
pháp phân lập
Về cơ bản, quy trình phân lập DNA bộ gen từ bất kỳ tế bào
nhân sơ hoặc sinh vật nhân chuẩn nào bao gồm ba bước
trung tâm, (1) loại bỏ vỏ bọc (thành / màng tế bào) xung
quanh DNA, (2) tách DNA khỏi tất cả các thành phần tế
bào khác (mảnh vỡ của thành tế bào và chất trao đổi
chất), và (3) duy trì tính toàn vẹn của DNA trong quá trình
tiến hành,I E., bảo vệ khỏi nucleaza và cắt cơ học [5]. Có
rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp phân lập,
làm cho việc phân lập DNA bộ gen từ thực vật, một nghệ
thuật hơn là một khoa học.
2.1 Nguồn nguyên liệu và chế biến
Sự hiện diện của thành tế bào polysaccharide cứng khiến
tế bào thực vật tương đối khó khăn để tách chiết DNA. Vì
vậy, trước khi quyết định quá trình khai thác từ nguồn
nguyên liệu thực vật, một số yếu tố chính cần được xem
xét.
2.1.1 Loại mô và tuổi
Tuổi và loại mô nguồn ảnh hưởng lớn đến chất lượng và
sản lượng của DNA phân lập. Các mô non, khỏe mạnh và
mềm, đặc biệt là các lá nở ra một phần là lựa chọn lý
tưởng vì chúng có thể mang lại chất lượng và số lượng
DNA tốt do số lượng tế bào lớn hơn và ít lắng đọng tinh
bột và các chất chuyển hóa thứ cấp [1, 2, 6, 7]. Các lá non
được phân tách cũng được báo cáo là nguồn nguyên liệu
tốt để phân lập DNA. Trồng cây nguồn trong 3–4 ngày
trong bóng tối trước khi thu hoạch để phân lập mô lá làm
cho quy trình phân lập dễ dàng hơn, vì nó kích thích lá ([8,
9] và www.qiagen.com). Ngược lại, DNA chiết xuất từ lá
trưởng thành được báo cáo là có chất lượng kém và năng
suất thấp do sự hiện diện của nồng độ cao của
polyphenol, tannin, polysaccharid và các chất chuyển hóa
thứ cấp khác, dẫn đến việc nhúng DNA vào một chất nền
sền sệt dính hoặc tạo thành các sản phẩm có màu nâu
không mong muốn, không thích hợp cho bất kỳ ứng dụng
nào [10–13]. Ngoài lá, các bộ phận khác của cây như thân,
rễ, hạt, phôi, thân rễ,vân vân., cũng có thể được sử dụng
tùy thuộc vào nhà máy nguồn và sự sẵn có của mô.
2.1.2 Thu thập và lưu trữ
Xử lý và bảo quản đúng cách mô thực vật sau khi thu hoạch là
một yếu tố cần thiết được xem xét trong quá trình này. Để
tách chiết DNA, nguyên liệu thực vật thường được thu thập
tươi và trực tiếp qua quá trình xử lý [14], hoặc được bảo quản
ở –18ºC, –80ºC hoặc trong nitơ lỏng dưới dạng mẫu đông lạnh
trước khi sử dụng. Việc đông lạnh ngăn cản hoạt động của
nuclease mà nếu không sẽ làm phân hủy DNA trong mô đã rã
đông [15]. Trong trường hợp không thể làm lạnh ngay các
mẫu đã thu thập, như ở các mẫu thực địa hoặc các vị trí xa,
mô có thể được bảo quản trong các dung dịch như
cetyltrimethylammonium bromide bão hòa (CTAB) -
© 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
www.biotechnology-journal.com
NaCl-NaN3[16], hoặc làm khô bằng vật liệu như silica gel và
sau đó được bảo quản để tránh nhiễm bẩn do ẩm [17]. Các
mẫu được lưu trữ ở dạng mô đông khô là lựa chọn tốt hơn
nhiều vì chúng có thể được lưu trữ trong vài năm mà chất
lượng DNA ít bị giảm sút [18]. Tuy nhiên, nhiều phương pháp
phân lập sử dụng các mô khô, mẫu cây cỏ hoặc thậm chí
nhiều vật liệu đã bị phân huỷ cũng đã được công bố [19–23].
2.1.3 Đồng nhất hóa
Trong tế bào thực vật, sự hiện diện của thành tế bào
polysaccharide cứng làm cho sự phá vỡ các mô hơi
phức tạp, chiếm khoảng 30-70% tổng thời gian cần
thiết để xử lý mẫu. Các quy trình ly giải vật lý tiêu
chuẩn để giải phóng DNA trở nên kém hiệu quả hơn
trong trường hợp này, vì các lực vật lý tương tự cần
thiết để phá vỡ thành tế bào là đủ để cắt đứt DNA có
trọng lượng phân tử cao [1]. Việc này trở nên khó khăn
hơn với những cây lâu năm hoặc những loài cây có lá
cứng, có thể yêu cầu các quy trình nghiền đặc biệt [16,
24, 25] để đạt được sự phá vỡ hoàn toàn của mô để lấy
DNA. Đồng nhất thích hợp là cần thiết vì nó cũng làm
giảm độ nhớt do các hợp chất có trọng lượng phân tử
cao như cacbohydrat phức tạp gây ra [26]. Nhiều
phương pháp làm gián đoạn vật lý được sử dụng,vân
vân. Nghiền mô trong nitơ lỏng bằng quy trình đông
lạnh nhanh được ưa thích hơn, phần lớn là nhanh
chóng, áp dụng được cho cả mô mềm và mô cứng và
cũng ngăn ngừa nhiễm bẩn chéo khi nhiều mẫu đang
được xử lý [4, 27–30]. Hạn chế cơ bản của nitơ lỏng là
điều kiện bảo quản đặc biệt và giá thành cao nên
không phù hợp với các phòng thí nghiệm ít được trang
bị [31, 32].
Bên cạnh các phương pháp phá vỡ vật lý để đồng nhất
mô, các phương pháp phá vỡ hóa học thuận tiện cũng có sẵn.
Cách tiếp cận này mặc dù tốn kém nhưng tránh được khả
năng DNA bị cắt do tác dụng của lực cơ học. Các chất gây rối
loạn hóa học chủ yếu bao gồm các enzym thủy phân như
xenluloza, pectinaza hoặc macerase thành tế bào để hòa tan
thành tế bào. Một loại cocktail chứa nhiều carbohydrase khác
nhau cũng được phát hiện là thích hợp cho quá trình tiêu hóa
hóa học ở các loài khác nhau bao gồmIlex aquifolium,Vitis
vinifera, Humulus lupulus, Phong lữsp., vân vân. [33]. Một
cách tiếp cận hơi khác khi sử dụng các hợp chất
xanthateforming, chẳng hạn như natri / kali ethyl
xanthogenate, cũng đã được báo cáo về vấn đề này [34].
Những hợp chất này tạo thành polysaccharide xanthates hòa
tan trong nước với các nhóm hydroxyl của polysaccharide
thành tế bào và hòa tan nó. Nếu không có thành tế bào, tế
bào thực vật cũng giống như bất kỳ tế bào nào khác có màng
có thể bị tách ra bằng cách sử dụng chất tẩy rửa. Phương
pháp này đặc biệt hữu ích đối với các loại lá cứng như lá lúa,
có chứa một lượng lớn xenlulo, pectin, tế bào silica, sáp,vân
vân. [6]. Tuy nhiên, phương pháp này được báo cáo là mang
lại số lượng DNA rất thấp [33, 35].
387
Công nghệ sinh học
Tạp chí
2.2 Sự hiện diện của chất gây ô nhiễm
Các vấn đề thường gặp nhất với hầu hết các quy trình là
sự hiện diện của các hợp chất gây ô nhiễm trong các mẫu
DNA, đặc biệt là RNA, protein, polysaccharid, polyphenol
và DNA không nhân. Các chất chuyển hóa thứ cấp khuếch
đại những khó khăn đối với tế bào thực vật, đặc biệt khi
cây thuốc được sử dụng làm nguồn gốc. Các hợp chất
mang lại hiệu quả điều trị cho cây có thể là trở ngại lớn
trong quy trình phân lập bằng cách liên kết với DNA và
được kết tủa cùng với nó [36]. Do đó, tùy theo sự đa dạng
của các chất hiện diện cùng với DNA, các giao thức cần
được điều chỉnh theo từng loài thực vật (và đôi khi thậm
chí cả mô), làm cho quá trình phân lập trở thành một kỹ
năng hoặc một nghệ thuật phải được phát triển bằng
cách thực hành lặp đi lặp lại. Một số chất gây ô nhiễm
chính được mô tả dưới đây.
2.2.1 Polysaccharid
Polysaccharid là những chất cản trở chính trong quy trình
phân lập DNA vì chúng không thể bị phát hiện và khó loại
bỏ. Sự hiện diện của một lượng lớn polysaccharid, như
trong trường hợp thực vật có chất nhầy nhưSedum tele[
27], làm cho mô đồng nhất rất nhớt và cho dấu hiệu sai về
sự hiện diện của một lượng lớn DNA. Polysaccharide
thường đồng kết tủa với DNA và tạo ra một đặc tính dính,
nhớt cho DNA. Ở dạng này, chúng cũng can thiệp vào
hoạt động của một số enzym sinh học như polymerase,
ligases và endonuclease giới hạn [10, 21]. Các chất gây ô
nhiễm giống polysaccharide cũng có thể gây ra động học
tái liên kết bất thường [1] và làm cho DNA không thích
hợp cho quá trình xử lý xuôi dòng. DNA bị ô nhiễm có xu
hướng dính vào giếng trong quá trình điện di trên gel [37,
38].
Sử dụng NaCl nồng độ cao (hơn 0,5 M) thích hợp để
loại bỏ polysaccharid khỏi dung dịch DNA bằng cách
tăng khả năng hòa tan của chúng trong etanol. Nồng
độ NaCl thay đổi tùy theo loài thực vật nguồn [4, 14,
39, 40],ví dụ., Zidaniet al[40] đã sử dụng 1,4 M NaCl
trong hạt kê ngọc trai (Pennisetum glaucum) và
Aljanabi và Martinez [14] đã áp dụng NaCl cao tới 6 M
cho lúa mì giàu polysaccharide (Triticum aestivum) và
lúa mạch (Hordium vulgaris). NaCl kết hợp với chất tẩy
cation CTAB cũng đã được chứng minh là có lợi trong
việc phân lập DNA từ thực vật giàu polysaccharide [1,
41]. CTAB giúp kết tủa DNA bằng cách tạo phức với nó
trong môi trường có cường độ ion thấp, và ở nồng độ
muối cao, nó tạo phức không hòa tan với protein và
hầu hết các polysaccharide có tính axit, để lại axit
nucleic trong dung dịch, sau đó có thể dễ dàng phân
lập . Trong các bộ phận của thực vật có quá nhiều
polysaccharide, như trong trường hợp củ và hạt, có thể
sử dụng nhựa liên kết polysaccharide để loại bỏ sự ô
nhiễm. Rogstadet al.[42] sử dụng các enzym thủy phân
như pectinase để tiêu hóa chất xúc tác giống pectin
388 © 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
nant trong thực vật chẳng hạn nhưQuercus rubra,Castanea
nha khoa, vân vân. Một cách đơn giản và hiệu quả có thể là
pha loãng dịch chiết DNA hoặc rửa chất đồng nhất hai hoặc
ba lần bằng dung dịch đệm chiết để giảm sự ô nhiễm
polysaccharide [11, 21].
2.2.2 Polyphenol
Có lẽ vấn đề thường gặp nhất trong các quy trình phân lập DNA thực vật là
sự suy thoái DNA bộ gen do sự hiện diện của polyphenol. Polyphenol rất
khác nhau về sự xuất hiện và loại của chúng. Trong quá trình ly giải tế bào,
polyphenol đi ra khỏi không bào và dễ dàng bị oxy hóa bởi các oxy hóa tế
bào. Các polyphenol bị oxy hóa trải qua các tương tác không thể đảo ngược
với axit nucleic và gây ra hiện tượng hóa nâu do enzym của viên DNA, do đó
khiến nó trở nên vô dụng đối với hầu hết các quá trình sau [4, 7, 9, 13, 29,
43–45]. Các polyphenol như flavonoid, tecpenoit và tanin, tất cả đều xuất
hiện rất rộng rãi trong giới thực vật, khi liên kết với axit nucleic không thể
loại bỏ bằng các quy trình chiết xuất thông thường. Để đối phó với vấn đề ô
nhiễm polyphenolic, chất chống oxy hóa được thêm vào đệm chiết xuất để
ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol trong quá trình ly giải tế bào. Polyvinyl
pyrollidone (PVP) và polyvinyl polypyrollidone (PVPP) là những hóa chất
được sử dụng phổ biến nhất để loại bỏ polyphenol vì chúng hoạt động như
chất hấp phụ polyphenol, đặc biệt là ở pH thấp. Chúng tạo phức với các hợp
chất polyphenol thông qua liên kết hydro, cho phép các polyphenol được
tách ra khỏi DNA, do đó làm giảm mức độ của chúng trong sản phẩm [4, 43,
45–47]. Một trong hai hoặc cả hai hợp chất có thể được sử dụng với tỷ lệ
thích hợp, như Basak đã chứng minh Chúng tạo phức với các hợp chất
polyphenol thông qua liên kết hydro, cho phép các polyphenol được tách ra
khỏi DNA, do đó làm giảm mức độ của chúng trong sản phẩm [4, 43, 45–47].
Một trong hai hoặc cả hai hợp chất có thể được sử dụng với tỷ lệ thích hợp,
như Basak đã chứng minh Chúng tạo phức với các hợp chất polyphenol
thông qua liên kết hydro, cho phép các polyphenol được tách ra khỏi DNA,
do đó làm giảm mức độ của chúng trong sản phẩm [4, 43, 45–47]. Một
trong hai hoặc cả hai hợp chất có thể được sử dụng với tỷ lệ thích hợp, như
Basak đã chứng minhet al. [48] trongVigna mungovàBambusa balcoa,vân
vân., với kết quả tốt. PVP 10 được ưu tiên hơn PVP 40, vì sau này đôi khi có
thể kết tủa với axit nucleic, do đó hoạt động như một chất gây ô nhiễm [37].
Chất chống oxy hóa như β-mercaptoethanol, BSA, natri azit, axit ascorbic,
DTT, natri sulfit, natri iso-ascorbate,vân vân., cùng với PVP thường được sử
dụng để giải quyết các vấn đề liên quan đến phenol [8, 17, 28, 35, 37, 39,
49]. β-Mercaptoethanol nói riêng được sử dụng rộng rãi, và ngăn chặn sự
trùng hợp của tannin cản trở quá trình phân lập theo cách tương tự như
polysaccharid. Ở thực vật có hàm lượng polyphenol cao, chẳng hạn như cà
chua, nho,Arabidopsis, canola, ca cao,vân vân., việc sử dụng chất ức chế
polyphenol oxidase cụ thể, chẳng hạn như DIECA cũng được báo cáo [19,
35, 46, 50]. Permingeatet al. [46] đã sử dụng glucose làm chất khử trong
bông (Gossypium hirs đờm) để tránh nhiễm bẩn và hóa nâu bởi polyphenol.
2.2.3 Protein và RNA
Một lượng đáng kể protein và RNA có thể kết tủa với DNA.
RNA thường được thanh lọc bằng cách sử dụng DNasefree
tụy RNase; nếu điều này không có sẵn, liti clorua có thể được
sử dụng hiệu quả cho mục đích [27, 31]. Protein thường bị
loại bỏ bằng cách sử dụng các hóa chất như SDS,
Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
DTT và β-mercaptoethanol, phá hủy tổ chức cấu trúc của
protein. Các enzym thủy phân protein như proteinase K cũng
thích hợp cho mục đích này vì chúng phá vỡ nhiều loại liên kết
peptit và nhanh chóng vô hiệu hóa DNase và RNase trong
dịch ly giải của tế bào, tạo điều kiện cho việc phân lập DNA có
trọng lượng phân tử cao. Có thể cần nghiền nguyên liệu thực
vật trong dung dịch đệm chiết SDS có chứa proteinase K
trong trường hợp mô giàu protein,
ví dụ., hạt [14, 51]. Các protein thông thường được loại bỏ
bằng cách chiết xuất với các dung môi hữu cơ như phenol và
chloroform. Hạn chế chính của quy trình này là các đặc tính
ăn da và độc hại của phenol và cloroform, ngoài ra làm mất đi
đáng kể lượng mẫu được thấy sau khi chiết phenol. Thomaset
al.[52] đề xuất sử dụng ống rào gel để chiết xuất phenol-
chloroform an toàn hơn. Một số lượng lớn các quy trình
không khuyến nghị sử dụng phenol [6, 14, 53], hoặc khuyến
cáo nên tránh sử dụng khi chiết xuất DNA từ các loài thực vật
giàu phenol. Trong trường hợp nguyên liệu nguồn có hàm
lượng lipid cao, như hạt dầu, việc khử chất béo nguyên liệu
trước khi phân lập DNA tỏ ra có lợi, vì lipid tạo thành một lớp
có thể nhìn thấy trên chất đồng nhất và gây khó khăn trong
quá trình xử lý tiếp theo [54].
2.2.4 DNA ngoài nhân
Ngoài các chất gây ô nhiễm được mô tả ở trên, DNA của
lục lạp và ty thể cũng được coi là chất gây ô nhiễm trong
một số ứng dụng sinh học phân tử quan trọng, như xây
dựng và sàng lọc thư viện bộ gen, nghiên cứu lai DNA và
nghiên cứu về biến tính DNA, vân vân., nơi chỉ có thể sử
dụng DNA hạt nhân thuần khiết. Đặc biệt lục lạp được coi
là chất gây ô nhiễm chính trong các quá trình liên quan
đến thực vật. Để giải quyết vấn đề này, hạt nhân có thể
được phân lập trước khi chiết xuất. Ở các loài thực vật
ngoan cố như bông, nho,vân vân., Phân lập DNA thông
qua phân lập nhân giảm thiểu các vấn đề ô nhiễm do mức
polysaccharide và polyphenolic cao trong tế bào.
Hạt nhân có thể được phân lập từ tế bào thực vật
bằng cách đồng nhất mô thực vật trong một đệm cách ly
thích hợp có chứa chất bảo vệ thẩm thấu, chất ổn định
màng nhân, và đôi khi là chất tẩy rửa không ion Triton
X-100 [5, 7, 12, 15, 29]. Sự hiện diện của các chất bảo vệ
thẩm thấu như glucose, và sucrose, và các chất ổn định
màng như tinh trùng, tinh trùng, và polylysine trong đệm
đồng nhất làm ổn định màng nhân, do đó tạo điều kiện
phân lập các hạt nhân nguyên vẹn bằng cách ly tâm. Việc
bổ sung Triton X-100 đặc biệt ly giải lục lạp và ti thể, để lại
các hạt nhân nguyên vẹn [7, 12, 15, 50], sau đó có thể
được phân lập bằng cách ly tâm. Viên hạt nhân thu được
sau khi ly tâm sau đó được ly giải bằng cách sử dụng đệm
ly giải hạt nhân và DNA thu được bằng phương pháp siêu
ly tâm gradient cesium clorua [15, 50]. Kỹ thuật này tạo ra
DNA chất lượng cao, nhưng có nhược điểm nổi bật là tốn
kém, mất thời gian và bất tiện. Hầu hết các quy trình phân
lập hạt nhân gần đây không liên quan đến ly tâm clorua
xêzi, mà sử dụng clo-
© 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
www.biotechnology-journal.com
tách chiết roform và kết tủa bằng etanol sau khi ly giải nhân
để thu được ADN nhân tinh khiết.
3 bộ dụng cụ phân lập DNA
Các quy trình liên quan đến việc phân lập hạt nhân hoặc ly
tâm gradient clorua xêzi có thể thu được DNA chất lượng cao
nhưng rất tốn thời gian. Do đó, một phương pháp nhanh
chóng và ít tốn kém mà cho ra DNA chất lượng được đa số
các nhà sinh học phân tử ngày nay ưa thích [55]. Một tiến bộ
đáng chú ý trong phương pháp này là sự sẵn có của các bộ
phân lập DNA thương mại, dễ sử dụng và mang lại kết quả
nhanh chóng và tốt hơn. Chúng được trang bị các thiết bị phá
vỡ tế bào cơ học (để tạo nền tốt cho mô), bộ đệm ly giải,
RNase,vân vân. Protein và polysaccharid được loại bỏ bằng
cách kết tủa muối và ly tâm ([16, 25] và www.qiagen.com).
Phần lớn các bộ dụng cụ này sử dụng nhựa chất lượng cao
hoặc cột sắc ký dùng một lần, có các quy trình rửa giải khác
nhau ([56] và www.qiagen.com). Các loại nhựa dựa trên
tương tác trao đổi ion / hấp phụ hỗn hợp để tinh chế, sử dụng
silica gel mà DNA liên kết theo cách thuận nghịch khi có mặt
các muối chaotropic và rửa giải trong nước thải đầu ra của cột
khi được bù nước bằng cách rửa bằng dung dịch đệm nước
[57]. Các bộ công cụ chuẩn bị nhỏ DNA có thể tự động hóa
quy mô lớn được cung cấp bởi một số công ty: Qiagen,
Promega, Epibio, Cartagen, Roche, công nghệ sinh học
Epicenter,vân vân. Do đó, có thể thu được DNA tinh khiết
trong vòng khoảng 1 giờ bằng cách sử dụng các bộ dụng cụ
sẵn sàng sử dụng này, nhưng hầu hết các bộ này không đủ
hiệu quả về chi phí để sử dụng trên quy mô phòng thí nghiệm
thông thường. Là một giải pháp thay thế rẻ hơn, nhựa có thể
được mua với số lượng lớn và đóng gói trong cột thủy tinh
thông thường hoặc ống tiêm để sử dụng ngay trong các
phòng thí nghiệm [10, 11, 58]. Tuy nhiên, kết quả sử dụng bộ
dụng cụ đôi khi cũng không hiệu quả khi xử lý các loại thực
vật có hàm lượng polysaccharide cao hoặc polyphenolic cao
như đậu phộng (Arachis hypogea) và các loài thuộc họ Cúc
(Cichorioideae),ví dụ.,Cichorium intybus, Taraxacum officinale
vàLactuca sativa[8, 11].
4 Đánh giá chất lượng và sản lượng DNA
Một loạt các phương pháp có sẵn để đánh giá chất lượng
của DNA được phân lập, bao gồm điện di trên gel, phân
tích quang phổ, phân hủy giới hạn, khuếch đại PCR và kỹ
thuật sắc ký. Tuy nhiên, đánh giá chủ yếu dựa trên độ
nhớt và độ trong của dung dịch DNA. Kỹ thuật được sử
dụng thường xuyên nhất để đánh giá chất lượng là phân
tích quang phổ của axit nucleic. Nhanh chóng, dễ dàng và
tương đối rẻ, nó thường là phương pháp được lựa chọn.
Tỷ lệ độ hấp thụ ở bước sóng 260/280 nm là 1,8 đối với
một mẫu DNA tinh khiết và sự giảm xuống cho thấy sự
nhiễm bẩn bởi (phần lớn) protein, trong khi sự hiện diện
của RNA làm tăng tỷ lệ (trên 2,0) [9, 57].
389
Công nghệ sinh học
Tạp chí
Các chế phẩm DNA thực vật có khả năng có tạp chất polysaccharid và
polyphenol, có thể được phát hiện bằng cách đọc các phép đọc ở bước
sóng 230 nm và 270 nm. Tỷ lệ A260/MỘT230phải lớn hơn 1,8 và tỷ lệ A260/
MỘT270nên nằm trong khoảng từ 1,2 đến 1,3 trong các chế phẩm DNA
không bị nhiễm polysaccharid và polyphenol tương ứng [7, 20, 31, 35].
Gel agarose cũng có thể cho biết các tạp chất như muối, RNA và
carbohydrate. DNA có thể chịu sự phân hủy của enzyme giới hạn vì
DNA giới hạn được coi là DNA tinh khiết đáng kể. Ngoài ra, sắc ký
HPLC cũng có thể được sử dụng để phân tích các dung dịch DNA [9],
trong đó không có đỉnh nổi bật ở 230, 270 và 280 nm và đỉnh nổi bật ở
260 nm trong quang phổ sẽ chỉ ra DNA không bị nhiễm bẩn. Sản
lượng DNA có thể được xác định bằng phân tích quang phổ, sử dụng
giả thiết rằng độ hấp thụ 1 ở bước sóng 260 nm tương ứng với 50 μg
DNA sợi kép trong 1 mL. Tuy nhiên, vì DNA và RNA đều hấp thụ mạnh
ở bước sóng 260 nm và độ hấp thụ tăng lên khi có sự hiện diện của
DNA đơn độc, điều này có thể giải thích sai về số lượng. Do đó, kỹ
thuật đo quang phổ không được coi là rất chính xác để định lượng
DNA. Ước tính bằng phương pháp đo lưu lượng DNA bằng thuốc
nhuộm Hoechst 33258 được coi là một lựa chọn tốt hơn. Ngoài ra, ước
tính có thể thu được bằng cách sử dụng gel agarose với các nồng độ
khác nhau của chất chuẩn được nạp trong các giếng riêng biệt; ở đây
giả định là cường độ dải tần của chúng tỷ lệ với lượng mẫu được tải.
ước tính có thể thu được bằng cách sử dụng gel agarose với các nồng
độ khác nhau của chất chuẩn được nạp trong các giếng riêng biệt; ở
đây giả định là cường độ dải tần của chúng tỷ lệ với lượng mẫu được
tải. ước tính có thể thu được bằng cách sử dụng gel agarose với các
nồng độ khác nhau của chất chuẩn được nạp trong các giếng riêng
biệt; ở đây giả định là cường độ dải tần của chúng tỷ lệ với lượng mẫu
được tải.
5. Kết Luận
Xem xét các yếu tố khác nhau liên quan, quy tắc ngón tay cái vẫn
sử dụng 'những gì hiệu quả' cho cây trồng quan tâm. Bất kỳ quy
trình nào, dù liên quan đến ly tâm cesium clorua kéo dài, phân lập
hạt nhân, thuốc thử đắt tiền, dung môi hữu cơ hoặc bộ dụng cụ
phân lập DNA, chỉ được chứng minh là xứng đáng khi nó tạo ra
DNA không bị nhiễm độc, tốt nhất là trong thời gian ngắn. Các
nhà nghiên cứu nói chung theo đuổi các giao thức cơ bản [1–3] và
kết hợp các sửa đổi theo yêu cầu của họ. Khi vật lộn với các chất
chuyển hóa thứ cấp, những thay đổi quan trọng thường liên quan
đến việc thay đổi nồng độ của thuốc thử như CTAB, NaCl, PVP và
các chất chống oxy hóa khác, enzym thủy phân, thanh lọc cột, v.v.,
có thể thay đổi theo cây trồng và thậm chí cả các mô trong cây.
Mặc dù có những ví dụ về quy trình đã được áp dụng cho nhiều
loài thực vật khác nhau [14, 19, 31, 33], sự không đồng nhất về
mặt hóa học và tính đa dạng của các hệ thống thực vật khiến cho
một phương pháp duy nhất được sử dụng phổ biến để phân lập
DNA bộ gen thực vật có thể hạn chế là rất khó. Do đó, có nghĩa vụ
phát triển một phương pháp phổ rộng tiềm năng có hiệu quả về
chi phí, tránh sử dụng thuốc thử nguy hiểm, ít tốn thời gian hơn
và quan trọng nhất là có thể phù hợp với nhiều nguồn thực vật.
Thiết kế của như vậy có thể liên quan đến nhiều nguồn thực vật.
Thiết kế của như vậy có thể liên quan đến nhiều nguồn thực vật.
Thiết kế của như vậy
390 © 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
một phương pháp sẽ đòi hỏi một thái độ nghệ thuật với một cách tiếp
cận khoa học, điều này sẽ giúp tạo ra các mục tiêu khá thuận tiện cho
những người làm công việc sinh học phân tử thực vật.
Một trong các tác giả (AV) muốn cảm ơn Hội đồng Nghiên
cứu Khoa học và Công nghiệp, New Delhi, Ấn Độ đã hỗ trợ
tài chính.
6 Tài liệu tham khảo
[1] Murray, MG, Thompson, WF, Phân lập nhanh DNA thực vật cao
phân tử.Axit nucleic Res. 1980,số 8, 4321–4325.
[2] Doyle, JJ, Doyle, JL, Quy trình phân lập nhanh chóng đối với số
lượng nhỏ mô lá tươi.Phytochem. Bò đực. 1987,1911–15.
[3] Rogers, SO, Bendich, AJ, Chiết xuất DNA từ các mô thực vật, trong:
Gelvin, SB, Schilperoort, RA (Ed.),Sổ tay hướng dẫn sinh học phân tử
thực vật, A6, Nhà xuất bản Học thuật Kluwer, Boston 1988, trang 1–10.
[4] Lodhi, MA, Ye, GN, Weeden, NF, Reisch, BI, Một phương pháp đơn
giản và hiệu quả để tách chiết DNA từ cây nho,Vitis loài và
Ampelopsis.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1994,12,6–13.
[5] Gilmartin, PM, Bowler, C. (Eds.),Sinh học thực vật phân tử, tập 1, Nhà
xuất bản Đại học Oxford, Oxford 2002.
[6] Williams, CE, Ronald, PC, PCR khuôn mẫu-DNA được phân lập nhanh
chóng từ lá một lá mầm và lá hai lá mầm mà không đồng nhất mô.Axit
nucleic Res.1994,22,Năm 1917–1918.
[7] Peterson, DG, Boehm, KS, Stack, SM, Phân lập số lượng miligam DNA
hạt nhân từ cà chua (Lycopersicon esculentum), một loại cây có chứa
hàm lượng cao các hợp chất polyphenolic.Mol thực vật. Biol. Trả lời.
1997,15,148–153.
[8] Michiels, A., Van den Ende, W., Tucker, M., Van Riet, L.et al.,Tách
chiết DNA bộ gen chất lượng cao từ thực vật chứa mủ. Hậu môn.
Hóa sinh. 2002,315,85–89.
[9] Puchooa, D., Khoyratty, SS, tách chiết DNA bộ gen từVictoria
amazonica.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 2004,22,195a – 195j.
[10] Sangwan, NS, Sangwan, RS, Kumar, S., Phân lập DNA bộ gen từ
cây sốt rétArtemisia annua.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1998,16,1–8.
[11] Sharma, KK, Lavanya, M., Anjaiah, V., Một phương pháp phân lập và tinh sạch
DNA đậu phộng thích hợp cho các ứng dụng phân tích.Mol thực vật. Biol. Trả
lời.2000,18,393a – 393h.
[12] Hanania, U., Velcheva, M., Sahar, N., Perl, A., Một phương pháp cải tiến để
phân lập DNA chất lượng cao từVitis viniferacác hạt nhân.Mol thực vật. Biol.
Trả lời.2004,22,173–177.
[13] Sarwat, M., Negi, MS, Lakshmikumaran, M., Tyagi, AKet al., Một
giao thức chuẩn hóa để phân lập DNA bộ gen từTerminalia arjuna
để phân tích đa dạng di truyền.Êlectron. J. Biotech. 2006,9, 86–91.
[14] Aljanabi, SM, Martinez, I., Khai thác muối phổ quát và nhanh chóng của DNA
bộ gen chất lượng cao cho các kỹ thuật dựa trên PCR.Axit nucleic Res. 1997,
25, 4692–4693.
[15] Jofuku, KD, Goldberg, RB, Phân tích cấu trúc gen thực vật, trong: Shaw,
CH (Ed.),Sinh học phân tử thực vật, một cách tiếp cận thực tế, IRL
Press, Oxford 1988, trang 37–41.
[16] Bhattacharjee, R., Kolesnikova-Allen, M., Aikpokpodion, P., Taiwo, S. et al., Một
phương pháp nhanh chóng bán tự động được cải tiến để chiết xuất DNA bộ
gen để phân tích chỉ thị phân tử trong Ca cao,Theobroma cacaoL.Mol thực
vật. Biol. Trả lời.2004,22,435a – 435h.
[17] Wang, XD, Wang, ZP, Zou, YP, Một quy trình cải tiến để phân lập
DNA hạt nhân từ lá của cây nho dại được làm khô bằng silica gel.
Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1996,14,369–373.
Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
Shrivastavacó bằng tiến sĩ sau
đại học về khoa học thực vật
Các lĩnh vực nghiên cứu của cô là
khoa học thực vật, sinh học phân
tử và hóa học và dược lý học.
sở thích tìm kiếm cũng bao gồm
ngành dược học. Hiện tại, cô làm việc như
một nhà khoa học thực vật tại Trung tâm
PERD BV Patel, Ahmedabad. Cô có 37 ấn
phẩm, bao gồm các bài báo nghiên cứu,
được mời đánh giá, các chương trong cuốn sách và chuyên khảo. Cô đã
hướng dẫn nhiều sinh viên làm luận văn tốt nghiệp. Cô ấy có ba sinh viên
làm việc với cô ấy cho chương trình tiến sĩ.
[18] Sharma, AD, Gill, PK, Singh, P., phân lập DNA từ các mẫu khô và tươi
của thực vật giàu polysaccharide.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 2002,20,
415a – 415f.
[19] Stewart, CN, Jr., Chiết xuất nhanh DNA từ thực vật, trong: Micheli, M.
R., Bova, R. (Ed.),Phương pháp lấy dấu vân tay dựa trên PCR được sơn
lót tùy ý, Springer, Heidelberg 1997, trang 25–28.
[20] Singh, M., Bandana, Ahuja, PS, Phân lập và khuếch đại PCR của DNA bộ
gen từ các mẫu trà khô trên thị trường.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1999,
17,171–178.
[21] Tel-Zur, N., Abbo, S., Myslabodski, D., Mizrahi, Y., Quy trình CTAB sửa
đổi để phân lập DNA từ xương rồng Epiphytic của chiHylocereusvà
Selenicereus(Họ Xương rồng).Mol thực vật. Biol. Trả lời.1999,
17,249–254.
[22] Warude, D., Chavan, P., Joshi, K., Patwardhan, B., phân lập DNA từ các
mẫu tươi và khô với dịch chiết mô có tính axit cao.Mol thực vật. Biol.
Trả lời. 2003,21, 467a – 467f.
[23] Cheng, YJ, Guo, WW, Yi, HL, Pang, XMet al., Một quy trình hiệu quả để
tách chiết DNA bộ gen từ các loài cam quýt.Mol thực vật. Biol. Trả lời.
200321, 177a – 177 gam.
[24] Mace, ES, Buhariwalla, HK, Crouch, JH, Một quy trình tách chiết DNA thông
lượng cao cho các chương trình nhân giống phân tử nhiệt đới. Mol thực vật.
Biol. Trả lời.2003,21,459a – 459 giờ.
[25] Karakousis, A., Langridge, P., Một phương pháp chiết xuất DNA thực vật thông lượng
cao để phân tích điểm đánh dấu.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 2003,21, 95a – 95f.
[26] Wilson, K., Walker, J. (Biên tập):Các nguyên tắc và kỹ thuật của Hóa sinh
thực hành,Nhà xuất bản Đại học Cambridge, New York 1994, trang 17–
18.
[27] Barnwell, P., Blanchard, AN, Bryant, JA, Smirnoff, N.et al.,Phân lập
DNA từ cây mọng nước có nhiều chất nhầySedum tele.Mol thực
vật. Biol. Trả lời. 1998,16,133–138.
[28] Dixit, A., một quy trình đơn giản và nhanh chóng để phân lậpRau dền DNA
thích hợp để phân tích dấu vân tay.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1998,16, 1–8.
[29] Chaudhry, B., Yasmeen, A., Husnain, T., Riazuddin, S., Tách chiết DNA bộ
gen quy mô nhỏ từ bông.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1999,17, 1–7.
[30] Kuta, DD, Kwon-Ndung, E., Dachi, S., Bakare, O.et al.,Tối ưu hóa
các giao thức để tách chiết DNA và phân tích RAPD ở Tây Phi fonio
(Digitaria exilisvàDigitaria iburua) mô tả đặc tính của tế bào mầm.
Afr. J.Biotechnol. 2005,4, 1368–1371.
[31] Ahmad, SM, Ganaie, MM, Qazi, PH, Verma, V.et al.,Quy trình phân
lập DNA nhanh chóng cho cây hạt kín.Bulgari. J. Plant Physiol.
2004,30,25–33.
© 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
www.biotechnology-journal.com
[32] Kang, TJ, Yang, MS, Trích xuất nhanh chóng và đáng tin cậy DNA bộ gen
từ các loại cây dại và cây chuyển gen khác nhau.BMC Biotechnol. 2004,
4, 20.
[33] Manen, JF, Sinitsyna O., Aeschbach, L., Marlov, AV,et al., Một phương pháp
enzym hoàn toàn có thể tự động hóa để tách chiết DNA từ các mô thực vật.
BMC Plant Biol. 2005,5, 23.
[34] Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 5352777, phân lập DNA từ tế bào động vật.
[35] Chen, DH, Ronald, PC, Một phương pháp phân tích ngắn DNA nhanh chóng
thích hợp cho AFLP và các ứng dụng PCR khác.Mol thực vật. Biol. Trả lời.
1999,17,53–57.
[36] Pirttila, AM, Hirsikorpi, M., Kamarainen, T., Jaakola, L.et al.,Phương pháp
phân lập ADN cây thuốc và cây thơm.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 2001,
19,273a – 273f.
[37] Puchooa, D., Một phương pháp đơn giản nhanh chóng và hiệu quả để
tách chiết DNA bộ gen từ vải thiều (Vải chinensisCon trai.).Afr. J.
Biotechnol. 2004,3,253–255.
[38] Chakraborty, D., Sarkar, A., Gupta, S., Das, S., Quy trình phân lập
DNA bộ gen quy mô nhỏ và lớn cho đậu xanh (Cicer arietinumL.),
thích hợp cho phân tích chỉ thị phân tử và chuyển gen.Afr. J.
Biotechnol.2006,5,585–589.
[39] Fang, G., Hammer, S., Grumet, R., Một phương pháp nhanh chóng và rẻ
tiền để loại bỏ polysaccharide khỏi DNA bộ gen thực vật.Công nghệ
sinh học1992,13, 52–54.
[40] Zidani, S., Ferchichi, A., Chaieb, M., Phương pháp tách chiết DNA
bộ gen từ cây kê ngọc trai (Pennisetum glaucum) lá.Afr. J.
Biotechnol. 2005,4,862–866.
[41] Syamkumar, S., Lowarence, B., Sasikumar, B., Phân lập và khuếch
đại DNA từ thân rễ của nghệ và gừng.Mol thực vật. Biol. Trả lời.
2003,21,171a – 171e.
[42] Rogstad, SH, Keane, B., Keiffer, CH, Hebard, F.,et al.,Tách chiết DNA từ
thực vật: Việc sử dụng pectinase.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 2001,
19,353–359.
[43] John, ME, Một phương pháp hiệu quả để phân lập RNA và DNA từ
thực vật có chứa polyphenol.Axit nucleic Res. 1992,20, 2381.
[44] Kim, CS, Lee, CH, Shin, JS, Chung, YSet al., Một phương pháp đơn giản
và nhanh chóng để phân lập DNA bộ gen chất lượng cao từ cây ăn quả
và cây lá kim bằng cách sử dụng PVP.Axit nucleic Res. 1997,25, 1085–
1086.
[45] Porebski, S., Bailey, LG, Baum, BR, Sửa đổi quy trình tách chiết
DNA CTAB cho thực vật có chứa thành phần polysaccharide và
polyphenol cao.Mol thực vật. Biol. Trả lời. 1997,15,8–15.
[46] Permingeat, HR, Romagnoli, MV, Vallejos, RH, Một phương pháp đơn giản để
phân lập DNA chất lượng và năng suất cao từ bông (Gossypium hirs đờmL.)
rời đi.Mol thực vật. Biol. Trả lời.1998,16,1–6.
[47] Pich, U., Schubert, I., Phương pháp Midiprep để phân lập DNA từ
thực vật có hàm lượng polyphenol cao.Axit nucleic Res. 1993,21,
3328.
[48] Basak, J., Das, M., Ghose, TK, Pal, A., Một phương pháp phân lập DNA
tương thích PCR hiệu quả và năng suất cao để điều tra công nghệ sinh
học từ các cây quan trọng về kinh tế, tại: D'Souza, L., Anuradha, M.,
Nivas, S., Hegde, S., Rajendra, K. (Eds.),Công nghệ sinh học cho tương
lai tốt đẹp hơn, Nhà xuất bản SAC, Mangalore 2004, trang 99–105.
[49] Suzuki, Y., Hibino, T., Kawazu, T., Wada, T.et al.,Tách chiết RNA tổng số
từ lá của cây Bạch đàn và một số cây thân gỗ và thân thảo khác bằng
cách sử dụng natri iso ascorbate.Công nghệ sinh học2003,34, 988–993.
[50] Bryant, JA, chiết xuất DNA, trong: Dey, PM, Harbourne, JB (Eds.), Các phương
pháp trong Hóa sinh thực vật, Tập 10b, Academic Press, San Diego 1997,
trang 1–12.
[51] Thangjam, R., Maibam, D., Sharma, JG, Một phương pháp đơn giản và nhanh chóng
để phân lập DNA từ phôi được ngâm trong môi trườngParkia timoriana(DC.) Merr.
để phân tích PCR.Thực phẩm, Agric. Môi trường. 2003,1, 36–38.
391
Công nghệ sinh học
Tạp chí
[52] Thomas, SM, Moreno, RF, Tilzer, LL, chiết xuất DNA bằng dung
môi hữu cơ trong ống rào gel.Axit nucleic Res. 1989,17,5411.
[53] Richards, EJ, Chuẩn bị DNA bộ gen từ các mô thực vật, trong:
Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, More, DD, (Eds.),Các giao
thức ngắn trong sinh học phân tử, John Wiley và Sons Inc., New
York 1990, tr. 60.
[54] Sangwan, RS, Yadav, U., Sangwan, NS, Phân lập DNA bộ gen từ bã hạt
dầu đã khử chất béo của cây thuốc phiện (Papaver sominiferum).Mol
thực vật. Biol. Trả lời. 2000,18, 265–270.
392 © 2007 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Biotechnol. J. 2007, 2, 386–392
[55] Hosaka K., Một phương pháp chiết xuất DNA dễ dàng, nhanh chóng và rẻ
tiền, chiết xuất DNA trong một phút cho PCR ở khoai tây.Là. J. Potato Res.
2004,81,17–19.
[56] Đơn xin PCT số. WO 00/63362 Bộ tách chiết DNA từ tính cho thực
vật.
[57] Sambrook, J., Russell, DW (Eds.),Nhân bản phân tử, Tập 1. Nhà xuất bản
Phòng thí nghiệm Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor 2001.
[58] Rogstad, SH, Tách chiết DNA thực vật bằng silica.Mol thực vật. Biol. Trả lời.
2003,21,463a – 463 gam.