Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.

com

Xem các cuộc thảo luận, số liệu thống kê và hồ sơ tác giả cho ấn phẩm này tại:https://www.researchgate.net/publication/5931195

Phân lập và khuếch đại DNA bộ gen từ quả tiêu đen khô có tính hòa hợp (Piper
nigrum L.) - Một loại gia vị dược liệu

Bài báoTrongCông nghệ sinh học phân tử · Tháng 11 năm 2007

DOI: 10.1007 / s12033-007-0044-y · Nguồn: PubMed

CÔNG TÁC BÀI ĐỌC

26 1.626

4 tác giả:

Dhanya Kizhakayil Jaleel Kizhakkayil

Thuốc Sidra Đại học Các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống nhất

37CÔNG BỐ 553CÔNG TÁC 30CÔNG BỐ571CÔNG TÁC

XEM HỒ SƠ XEM HỒ SƠ

Syamkumar Siv Pillai Sasikumar Bhas

Đại học Idaho Viện Nghiên cứu Gia vị Ấn Độ
35CÔNG BỐ907CÔNG TÁC 76CÔNG BỐ1.626CÔNG TÁC

XEM HỒ SƠ XEM HỒ SƠ

Một số tác giả của ấn phẩm này cũng đang thực hiện các dự án liên quan:

Bảo tồn, mô tả đặc tính, đánh giá và cải thiện Zingiber và Curcuma SppXem Kế hoạch

Ý nghĩa tiên lượngXem Kế hoạch

Tất cả nội dung sau trang này đã được tải lên bởiDhanya Kizhakayilvào ngày 26 tháng 5 năm 2014.

Người dùng đã yêu cầu nâng cao tệp đã tải xuống.

Mol Biotechnol
DOI 10.1007 / s12033-007-0044-y
GỢI Ý VÀ LỜI KHUYÊN
Cô lập và khuếch đại DNA bộ gen từ quả tiêu đen sấy khô có
tính hòa hợp (Hồ tiêuL.) - Một Gia vị Thuốc
K. DhanyaÆJaleel KizhakkayilÆS. SyamkumarÆ
B. Sasikumar
- Humana Press Inc. 2007
trừu tượngHạt tiêu đen là một loại gia vị dược liệu
quan trọng được giao dịch quốc tế. Việc tách chiết
DNA bộ gen chất lượng cao để khuếch đại PCR từ hạt
tiêu đen khô là một thách thức vì sự hiện diện của
một lượng lớn các hợp chất polyphenol bị oxy hóa,
polysaccharid và các chất chuyển hóa thứ cấp khác. Ở
đây chúng tôi báo cáo một quy trình hexadecyl
trimethyl amoni bromide (CTAB) đã được sửa đổi
bằng cách kết hợp kali axetat và bước kết tủa PEG
cuối cùng để cô lập DNA bộ gen có thể khuếch đại
PCR từ quả hạt tiêu đen khô và bột. Giao thức này có
ý nghĩa thương mại vì nó sẽ giúp xác định đặc tính
PCR của ớt đen buôn bán từ các quốc gia khác nhau.
Từ khóaHạt tiêu đen - Phân lập DNA - PEG - Chỉ
dẫn địa lý - Đánh dấu phân tử
Tiêu đen (Hồ tiêuL.), 'Vua của các loại gia vị' hay 'vàng đen'
được coi là một loại gia vị chữa bệnh trên khắp thế giới. Hạt
tiêu đen thương mại là quả chín khô của hạt tiêu đen và các
sản phẩm giá trị gia tăng của nó như hạt tiêu trắng, hạt tiêu
xanh khử nước, hạt tiêu xanh khô đông lạnh, nhựa dầu, dầu
và bột hạt tiêu đen. Ấn Độ, Brazil, Malaysia, Indonesia, Việt
Nam, Sri Lanka, Trung Quốc, Thái Lan và các nước
Micronesian là những nước sản xuất hạt tiêu đen lớn trên
thế giới. Tự do hóa thương mại được quy định trong WTO
mang lại phạm vi Quyền sở hữu trí tuệ (IPR) cho hàng hóa
có uy tín. Tên gọi Chỉ dẫn Địa lý (GI) là một trong những IPR
như vậy. Tính đủ điều kiện của Địa lý
K. Dhanya - J. Kizhakkayil - S. Syamkumar -
B. Sasikumar (&)
Phòng Cải tiến cây trồng và Công nghệ sinh học, Viện
Nghiên cứu Gia vị Ấn Độ, Calicut, Kerala 673012, Ấn Độ e-
mail: bhaskaransasikumar@yahoo.com
Việc bảo hộ chỉ định cho một hàng hóa dựa trên một
số chất lượng, danh tiếng cụ thể hoặc các đặc tính
hữu hình và vô hình khác, bao gồm cả hình thức bên
ngoài của hàng hóa, những đặc tính này chỉ được quy
định về cơ bản và độc quyền theo giới hạn địa lý.
Ngoài việc mô tả vật lý và chất lượng chính xác của
hàng hóa, việc phát triển các kỹ thuật phân tử dựa
trên DNA sẽ giúp bảo vệ hàng hóa thông qua GI bằng
cách hạn chế các hành vi thương mại không công
bằng. Việc phân lập và khuếch đại DNA từ các sản
phẩm được mua bán như vậy là bước đầu tiên và
quan trọng nhất trong việc xác định đặc tính phân tử
của hàng hóa. Quả tiêu đen khô là các mô bảo quản
ngoan cường có chứa hàm lượng cao các hợp chất
polyphenol ở dạng oxy hóa của chúng cùng với
polysaccharid, gây ra vấn đề ô nhiễm nghiêm trọng
trong quá trình tinh chế DNA thực vật.
Nguyên liệu và phương pháp
Quả mọng khô xuất khẩu của Ấn Độ (Malabar), Indonesia và tiêu đen
Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu đã được thu mua thông qua
Spices Board, Cochin, India. Các quả mọng được nghiền thành bột bằng
cách sử dụng máy nghiền mẫu Cyclotech 1093 và được sử dụng để tách
chiết DNA theo quy trình đưa ra dưới đây:
1. Nghiền một gam mẫu bột thành dạng mịn hơn
bằng cối và chày.
2. Hòa bột kỹ lưỡng trong 6 ml dung dịch đệm chiết
(3% CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM EDTA (pH
8), 1,5 M NaCl và 1% PVP) được lấy trong 30 ml
Oakridge ống.
3. Ủ ống ở 65-C trong nồi cách thủy trong 30 phút và
lắc liên tục.
 Mol Biotechnol

4. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm một phần ba
thể tích kali axetat 5 M, trộn nhẹ lượng chứa và ủ
trên đá trong 1 h.
5. Thêm thể tích bằng nhau của cloroform — isoamylalcohol (24: 1) và
trộn bằng cách đảo ngược trong 5 phút.
6. Ly tâm ở 10.000gtrong 15 phút ở 4-C bằng máy ly
tâm Eppendorf, 5804R.
7. Chuyển pha nước vào một ống Oakridge mới và
thêm 30% polyetylen glycol 6000 thể tích bằng
nhau, trộn nhẹ và ủ các ống trên đá từ 30 phút
đến 1 h.
8. Máy ly tâm ở 12.000gtrong 20 phút ở 4-C và loại bỏ
phần nổi phía trên.
9. Rửa viên bằng etanol 70%.
10. Làm khô và hòa tan viên DNA trong nước không có
nuclease.
11. Bảo quản đông lạnh mẫu DNA ở –20-C.
Nồng độ và chất lượng của DNA được xác định bằng
phương pháp đo quang phổ bằng cách tính tỷ lệ 260/280 và
cũng được định lượng bằng phương pháp điện di trên gel
agarose.
Để kiểm tra chất lượng và tính phù hợp của DNA đối với
phân tích thông lượng cao, quá trình phân tích giới hạn được
thực hiện bằng cách sử dụng ba enzyme giới hạn (Eco RV, Mse I
và Hae III) cùng với DNA chuẩn (DNA bộ gen người, Bangalore
Genei, Ấn Độ) làm đối chứng. Các sản phẩm tiêu hóa được phân
giải trong gel agarose 1%.
Phân tích PCR:Bốn mồi decamer ngẫu nhiên
(Operon Technologies, Almada, USA) được sử dụng
để khuếch đại PCR theo quy trình của Williams et al. [
1] với một số sửa đổi. Khuếch đại được thực hiện
trong 25ll thể tích phản ứng với 35 ng DNA bộ gen,
0,2 mM dNTP, 10 picomole mồi, 2 mM MgCl2và 1UTaq
DNA polymerase sử dụng Bộ điều khiển nhiệt có thể
lập trình PTC-100 (MJ Research, Inc., USA). Sau bước
biến tính trước 3 phút ở 94-C, khuếch đại
các phản ứng được thực hiện theo chu kỳ 35 lần ở 94-C
trong 1 phút, 37-C trong 1 phút và 72-C trong 1 phút. Cho
phép khuếch đại cuối cùng trong 10 phút ở 72-C. Hai mồi
ISSR từ IDT, Hoa Kỳ (IDT-01 (GACA)4và IDT-12 (CA)số 8T đã
được thử nghiệm. Đối với phản ứng ISSR, nồng độ mồi được
sử dụng là phản ứng 60 picomol–1và nhiệt độ ủ trong điều
kiện PCR được nâng lên 55-C và số lần lặp lại chu kỳ là 32.
Các sản phẩm khuếch đại được tải và hiển thị bằng
cách chạy trong gel agarose 2% chứa 0,5lg ml–1của
ethidium bromide và được ghi lại bằng hệ thống tài liệu
gel (Alpha Imager 2220, Hoa Kỳ).
Kết quả và thảo luận
Phương pháp chiết xuất DNA được ưu tiên cho một mô
ngoan cố nhất định chỉ có thể được xác định thông qua
các phương pháp thử và sai [2,3]. Mặc dù chúng tôi đã
thử một số phương pháp phân lập DNA [4-12] để phân
lập DNA chất lượng cao thích hợp cho việc khuếch đại
PCR từ quả tiêu đen khô và bột, hầu hết chúng đều
không thu được DNA. Tuy nhiên, hai phương pháp được
đề xuất bởi Aras et al. [11] và Syamkumar et al. [12] tạo
ra DNA bị cắt hoàn toàn, có màu nâu sẫm hoặc gần như
đen và không thể khuếch đại (Hình.1một). Do đó, quy
trình tách chiết DNA CTAB cơ bản của Doyle và Doyle [10
] đã được sửa đổi bằng cách tăng nồng độ CTAB lên 3%,
nồng độ NaCl lên 2 M, thêm PVP vào đệm chiết, bổ sung
kali axetat (Bước 4) và kết tủa DNA bằng PEG 6000 (Bước
7) thay vì isopropanol. Polyphenol có trong các mô
ngoan cố, ở dạng oxy hóa của chúng liên kết cộng hóa
trị với DNA tạo ra màu nâu khiến nó không thể sử dụng
được cho PCR [13]. Vì chúng tôi đã sử dụng quả mọng
khô và bột, điều này sẽ gây ra các vấn đề khác như đã
được báo cáo bởi Do và Adams [14].

Hình 1DNA được phân lập từ quả

khô và bột của hạt tiêu đen từ các
nguồn khác nhau. (một)DNA được
phân lập bằng phương pháp Doyle
& Doyle.
M-DNA bộ gen người,
Lane 1-ớt Ấn Độ
(Malabar), Ngõ 2-Hồ tiêu
Indonesia, Ngõ 3-Việt Nam
hạt tiêu. (b)DNA được phân lập
bằng phương pháp sửa đổi.
Lane 1-DNA bộ gen người, Lane
2-Hạt tiêu Ấn Độ
(Malabar), Lane
3-Hạt tiêu Indonesia,
Hồ tiêu Lane 4-Việt Nam, thang
DNA M-1Kb (Biogene, Mỹ)
Mol Biotechnol

Hình 2Hạn chế tiêu hóa DNA bộ gen được phân lập từ quả hạt tiêu
đen khô và bột. Lane 1 — DNA chuẩn, Lane 2 — DNA tiêu chuẩn
được ủ không có enzym giới hạn, Lane 3 — DNA tiêu chuẩn được
tiêu hóa bằng Eco RV, Lane 4 — DNA tiêu chuẩn được tiêu hóa bằng
Mse I, Lane 5 — DNA tiêu chuẩn được tiêu hóa bằng Hae III,
Ngõ 6—1 KB thang, Ngõ 7 — DNA hạt tiêu đen, ngõ 8 — DNA hạt
tiêu đen được ủ với enzyme cắt giới hạn, ngõ 9 — DNA tiêu đen
được tiêu hoá bằng Eco RV, Lane 10 — DNA tiêu đen được tiêu hoá
với Mse I, ngõ 11 — DNA hạt tiêu đen được tiêu hóa với thang Hae
III, Lane 12—1 KB

Trong quy trình mới, người ta quan sát thấy rằng 1 g mô
mẫu trên 6 ml dung dịch đệm chiết CTAB đã sửa đổi là cần
thiết để chiết xuất DNA bộ gen có thể khuếch đại PCR thay
vì 4 ml trên một gam mô như thường lệ. Người ta báo cáo
rằng sự gia tăng nồng độ CTAB và NaCl làm tăng sản lượng
DNA của tế bào [15]. CTAB thường được sử dụng làm chất
tẩy rửa để tách polysaccharid ra. Tương tự, nồng độ NaCl
lớn hơn 1,5 M loại bỏ các polysaccharid [16]. Mặc dù nó
cũng được báo cáo rằng sự gia tăng nồng độ của chất
chelat hóa thứ cấp hoặc chất chống oxy hóa như PVP, PVPP,
b-mercaptoethanol cũng rất hữu ích để tăng sản lượng và
chất lượng của DNA [9], chúng tôi không thấy nó hữu ích
trong nghiên cứu hiện tại. Nhưng
bổ sung kali axetat (Bước 4) trong quy trình của chúng tôi đã
cho thấy hiệu quả trong việc loại bỏ hầu hết các chất chuyển
hóa thứ cấp và polysaccharid khỏi DNA, dẫn đến sản lượng
DNA cao phân tử tốt hơn ở một mức độ nào đó. DNA nhớt và
phân huỷ có màu sẫm với năng suất kém cũng có thể do các
polyphenol được đồng chiết xuất trong quá trình tách chiết
DNA và đồng kết tủa với DNA trong quá trình kết tủa etanol
hoặc isopropanol [2,15]. Mặc dù chúng tôi đã thử chiết xuất
cloroform lặp đi lặp lại hoặc kết tủa bằng etanol hoặc
isopropanol, chúng tôi không thể loại bỏ các chất gây ô nhiễm
này và nó ảnh hưởng xấu đến sản lượng và chất lượng của
DNA. Do đó, trong giao thức mới của chúng tôi, chúng tôi đã sử
dụng PEG để kết tủa DNA thay vì isopropanol. Sự kết tủa-

Hình 3 (a)Cấu hình RAPD của

DNA được phân lập từ quả khô
và bột của hạt tiêu đen được
khuếch đại với các mồi OPC-05
(I), OPC-11 (II), OPC-16 (III) và
OPA-18 (IV)
tương ứng. (b)Hồ sơ ISSR của
DNA được phân lập từ quả
hạt tiêu đen khô và bột được
khuếch đại với mồi IDT-01 (V)
và IDT-12 (VI). M-Marker
(thang DNA 1Kb), Lane 1-tiêu
Ấn Độ
(Malabar), Ngõ 2-Hồ tiêu Indonesia,
Ngõ 3-Hồ tiêu Việt Nam

tion DNA với PEG dẫn đến các chế phẩm DNA đồng nhất
tương đối tinh khiết không có protein và polysaccharide
như đã báo cáo [17,18]. PEG đã là một chất hấp phụ poly
phenol và nó loại bỏ sắc tố màu trong các mẫu trong
quá trình tách chiết DNA [12].
Các phép đo quang phổ của DNA ở bước sóng 260 và
280 nm cho tỷ lệ độ hấp thụ (A260 / A280) là 1,75–1,82
cho thấy độ tinh khiết của DNA. Sản lượng DNA được
phân lập từ các mẫu dao động từ 10lgg–1đến 15lgg–1của
khăn giấy khô. Chất lượng DNA phân lập từ quả tiêu đen
khô cũng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
(0,7%). Chúng tôi đã quan sát thấy một dải DNA trọng
lượng phân tử cao dễ thấy với một số vết cắt (Hình.1b).
Chất lượng của DNA phân lập cũng được kiểm tra bằng
cách phân hủy hạn chế. DNA mẫu được tiêu hóa hoàn
toàn bằng ba enzyme giới hạn (máy cắt thường xuyên),
cho thấy chất lượng DNA tốt nên cũng là DNA chuẩn
(Hình.2).
DNA được phân lập bằng giao thức sửa đổi này cũng
được khuếch đại một cách nhất quán với các cặp mồi
decamer ngẫu nhiên và các cặp mồi lặp lại trình tự đơn giản
được sử dụng để khuếch đại PCR. Mô hình dải RAPD và ISSR
của DNA được phân lập từ quả bột khô của ớt đen Ấn Độ,
Indonesia và Việt Nam bằng cách sử dụng các mồi RAPD
OPC-05, OPC-11, OPC-16 và OPA-18 và các mồi ISSR IDT-01
và IDT-12 được hiển thị trong Hình.3A và B.
Tỷ lệ độ hấp thụ của DNA được phân lập ở 260/280
(1,7–1,8) và mô hình phân tách giới hạn của DNA so
với DNA chuẩn cùng với kiểu khuếch đại phù hợp
trong PCR sử dụng các dấu hiệu RAPD và ISSR tiết lộ
rằng DNA bộ gen được phân lập bằng cách sử dụng
quy trình từ quả hạt tiêu đen ngoan cố có chất lượng
tốt. Quy trình này cũng có thể áp dụng cho các mô
thực vật khô khác giàu polysaccharid và các hợp chất
polyphenol.
Sự nhìn nhậnCác tác giả ghi nhận ông S. Kannan, Giám đốc (Tiếp
thị), Ban Gia vị, Cochin; Dr.YR Sarma, Rtd. Giám đốc, Viện Nghiên
cứu Gia vị Ấn Độ, Calicut, Kerala và ông KK Santhosh cho các mẫu ớt
đen Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Chúng tôi cũng ghi nhận sự
đánh giá cao của chúng tôi tới Tiến sĩ VA Parthasarathy, Giám đốc,
Viện Nghiên cứu Gia vị Ấn Độ, Calicut, Kerala về sự khích lệ và cơ sở
vật chất cho công việc nghiên cứu. Công việc này được hỗ trợ bởi
một khoản tài trợ nghiên cứu của Sở Công nghệ Sinh học, Chính
phủ. của Ấn Độ.
Người giới thiệu
1. Williams, JGK, Kubelik, AR, Livak, KJ, Rafalski, JA, & Tingey, SV
(1990). Các đa hình DNA được khuếch đại tùy ý
Xem số liệu thống kê về xuất bản
Mol Biotechnol
mồi hữu ích như là dấu hiệu di truyền.Nghiên cứu axit nucleic,
18,6531–6535.
2. Remya, R., Syamkumar, S., & Sasikumar, B. (2004). Phân lập
và khuếch đại DNA từ bột nghệ.Tạp chí Thực phẩm Anh,
106,673–678.
3. Syamkumar, S., Lawarence, B., & Sasikumar, B. (2003). Phân
lập và khuếch đại DNA từ thân rễ tươi của nghệ và gừng.
Phóng viên Sinh học Phân tử Thực vật, 23,171a – 171e.
4. Dellaporta, SL, Wood, J., & Hicks, JB (1983). Một sự chuẩn bị mini DNA
thực vật: Phiên bản II.Báo cáo Sinh học Phân tử Thực vật, 1,Ngày
19–21.
5. Singh, M., Bandana, & Ahuja, PS (1999). Phân lập và khuếch đại
PCR DNA bộ gen từ các mẫu chè khô trên thị trường. Phóng
viên Sinh học Phân tử Thực vật, 17,171–178.
6. Cheng, KT, Chang, HC, Su, CH, & Hsu, FL (1997). Xác định thân rễ
khô của các loài Coptis bằng cách sử dụng DNA đa hình được
khuếch đại ngẫu nhiên.Botanical Bulletin of Academia Sinica,
38,241–244.
7. Schneerman, MC, Mwangi, J., Hobart, B., Arbuckle, J., Vaske,
DA, Đăng ký III JC, & Weber, DF (2002). Bắp ngô khô làm
nguồn DNA để phân tích PCR.Phóng viên Sinh học Phân tử
Thực vật, 20,59–65.
8. Sangwan, RS, Yadar, U., & Sangwan, NS (2000). Phân lập DNA bộ
gen từ bã hạt dầu đã khử chất béo của cây thuốc phiện
(Papaver sominiferum). Phóng viên Sinh học Phân tử Thực vật,
18, 265–270.
9. Pirtilla, AM, Hirsicorpi, M., Kamarainen, T., Jaakola, L., &
Hohtola, A. (2001). Phương pháp phân lập ADN cây thuốc và
cây thơm.Phóng viên Sinh học Phân tử Thực vật, 19,273a –
273f.
10. Doyle, JJ, & Doyle, JL (1987). Quy trình phân lập DNA nhanh
chóng từ một lượng nhỏ mô lá tươi.Bản tin hóa thực vật,
19,11–15.
11. Aras, S., Duran, A., & Yenilmez, G. (2003). Phân lập DNA để phân
tích RAPD từ vật liệu lá khô của một sốHesperis L.mẫu vật.
Phóng viên Sinh học Phân tử Thực vật, 21,461a – 461f.
12. Syamkumar, S., Mridula, J., & Sasikumar, B. (2005). Phân lập và
khuếch đại PCR của DNA bộ gen từ viên nang khô của cây bạch
đậu khấu (Cây bạch đậu khấuM.).Phóng viên Sinh học Phân tử
Thực vật, 23,1a – 1e.
13. Katterman, FRH, & Shattuck, VL (1983). Một phương pháp
hiệu quả để phân lập DNA từ các lá trưởng thành của
Gossypium các loài có chứa một lượng lớn các tecpenoit và
tannin phenolic.Hóa sinh chuẩn bị, 13,347–359.
14. Do, N., & Adams, RP (1991). Một kỹ thuật đơn giản để loại bỏ các chất gây ô
nhiễm polysaccharide thực vật khỏi DNA thực vật.Công nghệ sinh học, 10,
162–166.
15. Smith, JF, Sytsma, KJ, Shoemaker, JS, & Smith, RL (1991). So
sánh định tính tổng số các quy trình tách chiết DNA tế bào.
Bản tin hóa thực vật, 23,2–9.
16. Fang, G., Hammer, S., & Grumet, R. (1992). Một phương pháp nhanh
chóng và rẻ tiền để loại bỏ polysaccharid khỏi DNA thực vật. Công
nghệ sinh học, 13,52–56.
17. Dixit, A. (1998). Quy trình phân lập ADN Dền gai đơn giản và
nhanh chóng phù hợp cho phân tích dấu vân tay.Phóng viên
Sinh học Phân tử Thực vật, 16,1–8.
18. Agudo, LC, Gavida, P., Perez-Bermudez, P., & Segura, J.
(1995). Kết tủa PEG, một bước cần thiết để PCR khuếch đại
DNA từ cây dại củaDigitalis obscuraL.Công nghệ sinh học,
18,766–768.