Chương 2

Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các
hợp chất thiên nhiên
Véronique Seidel

Tóm lược
Hiện nay, người ta ngày càng quan tâm đến việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là một phần của
các chương trình khám phá thuốc. Các chất chuyển hóa thứ cấp có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn tự nhiên
khác nhau, bao gồm thực vật, vi khuẩn, động vật biển, côn trùng và động vật lưỡng cư. Chương này tập trung
chủ yếu vào các quy trình quy mô phòng thí nghiệm chiết xuất ban đầu và số lượng lớn từ các nguồn thực vật
và vi sinh vật. Đối với các hợp chất thiên nhiên từ thực vật, các bước cần thiết để chuẩn bị nguyên liệu trước khi
chiết xuất, bao gồm các khía cạnh liên quan đến lựa chọn, thu hái, nhận dạng, sấy khô và nghiền thực vật, đều
được trình bày chi tiết. Các phương pháp chiết xuất khác nhau hiện có (ngấm kiệt, chiết dung môi hỗ trợ siêu
âm, thấm qua, chiết Soxhlet, chiết dung môi có áp suất, chiết trong điều kiện hồi lưu, chưng cất hơi nước và
chiết bằng axit/bazơ) được xem xét. Về các hợp chất thien nhiên của vi sinh vật, chương này đề cập đến các vấn
đề liên quan đến phân lập và nuôi cấy vi sinh vật và trình bày các phương pháp chiết xuất có sẵn để thu hồi các
chất chuyển hóa của vi sinh vật. Các phương pháp giảm thiểu sự xuống cấp của hợp chất, sự hình thành tạo tác,
nhiễm bẩn chiết xuất

Từ khóa: với tạp chất chiết xuất axit-bazơ bên ngoài, và làm giàu chiết xuất lượng lớn, chiết với dòng
mong muốn, các chất chuyển hóa chiết xuất ban đầu cũng được kiểm tra. Ngâm, thấm, chiết dung môi có
áp suất, chiết rắn-lỏng, chiết Soxhlet, chưng cất hơi nước, siêu âm

1. Giới thiệu

Hiện nay, người ta ngày càng quan tâm đến việc nghiên cứu các hợp
chất thiên nhiên, đặc biệt là một phần của các chương trình khám phá
thuốc, vì chúng đại diện cho một kho dự trữ đáng gờm các chất dẫn
tiềm năng hữu ích cho các loại thuốc mới. Các sản phẩm tự nhiên
được quan tâm ở đây là các phân tử hữu cơ nhỏ (mol. khối lượng
phân tử. < xấp xỉ 2.000 amu), thường được gọi là các chất chuyển hóa
thứ cấp và được tạo ra bởi các sinh vật sống khác nhau, ví dụ: thực
vật, vi khuẩn, sinh vật biển, côn trùng, và lưỡng cư (1) .

Satyajit D. Sarker and Lutfun Nahar (eds.), Natural Products Isolation, Methods in Molecular Biology, vol. 864,
DOI 10.1007/978-1-61779-624-1_2, © Springer Science+Business Media, LLC 2012

27
28 V. Seidel

Thực vật và vi sinh vật tạo ra các hỗn hợp phức tạp của các hợp
chất thiên nhiên và việc lựa chọn quy trình tốt nhất để chiết xuất hiệu
quả các chất này không phải là một nhiệm vụ đơn giản. Các quy trình
dựa trên dung môi “cổ điển”, ví dụ: ngâm, thấm, chiết xuất Soxhlet,
chiết xuất trong điều kiện hồi lưu, chưng cất hơi nước và chiết xuất
axit-bazơ, vẫn được áp dụng rộng rãi trong hóa thực vật mặc dù thực
tế là chúng thiếu khả năng tái tạo và cả thời gian và dung môi -tiêu
thụ. Điều này chủ yếu là do chúng chỉ yêu cầu dụng cụ thủy tinh cơ
bản và thuận tiện để sử dụng cho cả chiết ban đầu và chiết số lượng
lớn. Chiết dung môi tăng tốc là một kỹ thuật công cụ mới hơn. Mặc dù
nó mang lại một số lợi thế so với các phương pháp thông thường (chủ
yếu là hiệu quả và khả năng tái sản xuất), nhưng nó phù hợp nhất cho
việc chết ban ban đầu hơn là chiết lượng lớn. Cho đến nay, nó đã tìm
thấy một ứng dụng rộng rãi hơn trong công nghiệp (nơi mà số lượng
lớn các chất chiết xuất phải được sản xuất theo cách hiệu quả và có thể
tái sản xuất) hơn là trong học viện.

1.1. Khái niệm Trước bất kỳ công việc cô lập và tinh chế nào, các hợp chất thiên
về chết ban đầu nhiên phải được chiết xuất (hoặc giải phóng) khỏi nguyên liệu tự
và số lượng lớn nhiên. Quá trình trích xuất ban đầu thường được thực hiện trên một
lượng nhỏ vật liệu để thu được dịch chiết sơ cấp. Đây có thể là một
phần của nghiên cứu dược lý hoặc để đạt được kiến thức sơ bộ về hóa
học của các chất chuyển hóa có trong vật liệu. Khi các chất chuyển
hóa cụ thể đã được xác định trong dịch chiết ban đầu, thì có thể nên
thực hiện chiết xuất hàng loạt để cô lập số lượng lớn hơn các chất
chuyển hóa.

1.2. Chiết rắn- Ở đây, chúng tôi mô tả các phương pháp chiết xuất bằng dung môi,
lỏng chủ yếu dựa trên nguyên tắc chiết xuất chất lỏng rắn, có sẵn để chiết
xuất ban đầu và quy mô phòng thí nghiệm quy mô lớn các chất
chuyển hóa thứ cấp từ thực vật và vi sinh vật. Các khía cạnh lý thuyết
và thực tiễn liên quan đến chiết lỏng-lỏng được trình bày trong
Chương 9 . Nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất thiên nhiên khác
được thảo luận trong các Chương 3 – 5, 11 và 13 – 18.
Quá trình chiết rắn-lỏng có thể được đơn giản hóa bằng cách
chia nó thành các bước khác nhau. Một dung môi thích hợp (xem
Chú thích 1) được sử dụng để khuếch tán đầu tiên vào các tế bào, sau
đó hòa tan các chất chuyển hóa, và cuối cùng khuếch tán ra khỏi các
tế bào được làm giàu trong các chất chuyển hóa được chiết xuất.
Dung môi lý tưởng phải có độc tính thấp, khả năng bắt lửa thấp, nguy
cơ nổ thấp và khả năng hình thành tạp chất thấp. Nó cũng phải kinh
tế và thân thiện với môi trường (xem Chú thích 2). Những vấn đề này
đặc biệt quan trọng trong trường hợp chiết xuất lượng lớn, nơi sử
dụng một lượng lớn dung môi. Phương pháp chiết xuất lý tưởng phải
toàn diện, nghĩa là chiết xuất càng nhiều chất chuyển hóa mong
muốn hoặc càng nhiều hợp chất càng tốt. Nó phải nhanh chóng, đơn
giản, tiết kiệm, thân thiện với môi trường và có thể tái sử dụng nếu nó
được thực hiện lặp đi lặp lại.
 2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên
2. Nguyên vật liệu
2.1. Nguyên liệu thực vật Nguyên liệu thực vật có thể được lựa chọn theo nhiều cách khác
2.2. Nguyên liệu
có nguồn gốc vi
sinh vật
2.2.1. Vi sinh vật trong đất
2.2.2. Thực vật nội sinh rễ
29
nhau. Ví dụ, khi tìm kiếm các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính
sinh học hoặc một hoạt động dược lý cụ thể được nghiên cứu, một
cách tiếp cận phổ biến là thu thập nguyên liệu thực vật trên cơ sở sử
dụng dân tộc học truyền thống cụ thể. Việc sử dụng cơ sở dữ liệu tài
liệu (xem Chú thích 3 và xem Chương 1 và 13) có thể cung cấp một
số thông tin sơ bộ có giá trị.
1. Chỉ thu thập các mẫu thực vật khỏe mạnh, vì các dấu hiệu nhiễm
bẩn (nấm, vi khuẩn hoặc vi rút) có thể liên quan đến sự thay đổi cấu
hình của các chất chuyển hóa có mặt.
2. Thu thập toàn bộ cây hoặc một bộ phận cụ thể của cây tùy thuộc
vào nơi các chất chuyển hóa quan tâm (nếu biết) tích tụ.
3. Ghi lại tên loài thực vật, tên của (các) bộ phận được hái, địa điểm
và ngày thu hái (xem Chú thích 4).
4. Gửi một chứng từ (một mẫu vật khô được ép giữa các tờ giấy)
trong phòng tiêu bản để tham khảo trong tương lai. Thông tin chi
tiết về khía cạnh cụ thể này có thể được tìm thấy trong Chương 13.
Có thể khám phá nhiều loại môi trường khác nhau để phân lập vật
liệu có nguồn gốc vi sinh vật. Trong nhiều năm, các mẫu đất là nguồn
truyền thống của vi sinh vật. Các nguồn tự nhiên khác, chẳng hạn
như thực vật và môi trường sống ở biển, đã được nghiên cứu gần đây
hơn ( 2, 3 ) . Ở đây chúng tôi mô tả quá trình phân lập vi sinh vật từ
các mẫu đất và từ rễ cây, tức là vi sinh vật nội sinh.
1. Lấy một ít mẫu đất (xem Chú thích 5) và hòa tan trong nước cất.
2. Chuẩn bị các độ pha loãng thích hợp của phần nổi phía trên và
đặt trên môi trường đặc (thạch) (xem Chú thích 6).
3. Đặt các đĩa vào tủ ấm (xem Chú thích 7).
4. Cấy truyền từng khuẩn lạc thu được nhiều lần lên môi trường đặc
đã chọn cho đến khi khuẩn lạc thể hiện độ tinh khiết (về hình thái và
vi thể).
5. Bảo quản các chủng tinh khiết trong nitơ lỏng hoặc đông khô với
sự có mặt của chất bảo quản lạnh (xem Chú thích 8).
1. Thu thập phân lập rễ từ cây khỏe mạnh.
2. Làm sạch rễ bằng nước cất để loại bỏ đất và các mảnh vụn khác.
30 V. Seidel

3. Cắt rễ thành các mảnh nhỏ (5–10 mm) dưới kính hiển vi soi nổi,
rửa nhẹ các mảnh bằng nước cất, giữ lại trên dụng cụ lọc trà đã khử
trùng bằng lửa.
4. Các mảnh Sonicate (2 × 15 giây) và lắc nhẹ với 1% Tween 80 (1
phút), sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Lắc trong dung dịch
xấp xỉ 30% H2O2. 15 giây, sau đó thực hiện rửa lần cuối (ba lần)
trong nước cất vô trùng.
5. Thấm các mảnh rễ trên giấy lọc vô trùng trong đĩa Petri và cắt
chúng thành những mảnh nhỏ hơn (1 mm) một cách vô trùng.
6. Chuyển các mảnh nhỏ hơn này một cách vô trùng lên các đĩa
thạch (xem Chú thích 9).
7. Đặt các đĩa vào tủ ấm (xem Chú thích 10) và kiểm tra nhiễm bẩn
hàng ngày.
8. Khi đã lấy được dịch cấy, tiến hành cấy truyền trên môi trường
thạch nếu cần.
9. Bảo quản các chủng tinh khiết trong nitơ lỏng hoặc đông khô với
sự có mặt của chất bảo quản lạnh.

2.3. Dung môi Hydrocacbon aliphatic và clo hóa, este và ancol bậc thấp thường được
sử dụng để chiết xuất (Bảng 1). Chúng bao gồm n -hexan cấp độ phân
tích hoặc HPLC, ete dầu mỏ, diclometan (DCM), etyl axetat (EtOAc),
n -butanol, etanol (EtOH), metanol

Bảng 1
Tính chất hóa lý của một số dung môi thường dùng trong chiết
xuất các hợp chất thiên nhiên

Độ hòa tan trong

Dungmôi Chỉ số phân cực Điểm sôi (°C) Độ nhớt (cPoise) nước (% w/w )

n-Hexane 0.0 69 0.33 0.001

Dichloromethane 3.1 41 0.44 1.6
n-Butanol 3.9 118 2.98 7.81
iso-Propanol 3.9 82 2.30 100
n-Propanol 4.0 92 2.27 100
Chloroform 4.1 61 0.57 0.815
Ethyl acetate 4.4 77 0.45 8.7
Acetone 5.1 56 0.32 100
Methanol 5.1 65 0.60 100
Ethanol 5.2 78 1.20 100
Nước 9.0 100 1.00 100
 2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 31

(MeOH) và nước (Fisher Scientific UK, và VWR International). Bảo

quản tất cả các dung môi ở nhiệt độ phòng (trừ khi có chỉ định khác)
và giữ dung môi clo hóa trong chai thủy tinh màu hổ phách (xem Chú
thích 11).
2.4. Các vật liệu và
thiết bị cụ thể khác
2.4.1. Sấy khô và nghiền
nguồn gốc nguyên liệu 1. Máy Nghiền Cắt Pulverisette 15 (Fisher Scientific, UK).
thực vật 2. Máy nghiền phân tích cơ bản S2 (VWR International).
3. Lò sấy có hỗ trợ quạt.
4. Môi trường dinh dưỡng lỏng và rắn.
2.4.2. Phân lập và nuôi
5. Đĩa Petri.
cấy vật liệu có nguồn gốc
6. Bình nón.
vi sinh vật
7. Máy ấp lắc.
8. Máy lên men nhỏ.

2.4.3. Chiết xuất nguyên 1. Bể siêu âm.

liệu thực vật và vi sinh 2. Bộ chiết dung môi cấp tốc; hộp chiết; bộ lọc cellulose cho hộp
vật mực ASE (Dionex, Vương quốc Anh); cát biển (50–70 mesh)(Sigma-
Aldrich, UK), cung cấp khí nitơ (không có oxy).
3. Bình lọc màu (bình hình trụ hoặc hình nón có vòi ở đáy).
4. Bộ chiết Soxhlet nối với bình cầu đáy tròn và bộ sinh hàn hồi lưu;
ống chiết cellulose để chiết Soxhlet (VWR International); bông gòn;
và các hạt chống va đập.
5. Máy cô quay.
6. Thiết bị chưng cất hơi nước.
7. Máy sấy lạnh.
8. Vải BioPrepNylon ® (VWR International).

3. Phương pháp

3.1. Sấy khô và 1. Rửa nguyên liệu thực vật dưới vòi nước lạnh đang chảy và chải nhẹ
nghiền nguyên để loại bỏ đất và các mảnh vụn khác.
liệu thực vật 2. Đối với thực vật có chứa các hợp chất dễ bay hơi hoặc không bền
nhiệt, hãy làm đông lạnh nhanh vật liệu trong nitơ lỏng càng sớm
càng tốt sau khi thu hái và bảo quản ở -20°C hoặc đông khô (xem
Chú thích 12). Khi sẵn sàng chiết xuất, nghiền mẫu trong cối có nitơ
lỏng và chiết xuất phần cặn đã nghiền thành bột ngay lập tức hoặc
bảo quản ở -20°C để ngăn bất kỳ thay đổi nào về cấu hình của các
chất chuyển hóa ( 4, 5 ) .
32 V. Seidel

3. Đối với các loại cây khác, cắt vật liệu thu được thành từng miếng
nhỏ và rải đều vật liệu trên các khay ở nhiệt độ môi trường trong
phòng có đủ thông gió để tạo điều kiện sấy khô đồng nhất (xem Chú
thích 13).
4. Bảo quản nguyên liệu thực vật đã sấy khô trong hộp kín ở nơi khô
ráo và thoáng mát. Tránh lưu trữ trong thời gian dài, vì một số thành
phần có thể bị phân hủy.
5. Nghiền nguyên liệu thực vật đã sấy khô bằng cách sử dụng máy
nghiền phân tích (đối với chiết xuất ban đầu) hoặc nghiền cắt (đối
với chiết xuất lượng lớn) để cải thiện quá trình chiết xuất tiếp theo
bằng cách làm cho mẫu đồng nhất hơn, tăng diện tích bề mặt và tạo
điều kiện cho dung môi xâm nhập vào các tế bào (xem Chú thích 14).

3.2. Chiết xuất Thực vật là những chất nền phức tạp, tạo ra một loạt các chất chuyển
Nguyên liệu Thực vật hóa thứ cấp với các nhóm chức và phân cực khác nhau. Mặc dù nước
được sử dụng làm chất chiết xuất trong nhiều quy trình truyền thống
(xem Chú thích 15), các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau
thường được chọn trong các phương pháp chiết xuất hiện đại để tận
dụng các khả năng hòa tan khác nhau của các thành phần thực vật
(xem Chú thích 16). Các quy trình chiết xuất bằng dung môi được áp
dụng cho các chất chuyển hóa của thực vật bao gồm ngâm, chiết xuất
bằng dung môi có hỗ trợ siêu âm, thấm qua, chiết xuất Soxhlet, chiết
xuất bằng dung môi có áp suất, chiết xuất trong điều kiện hồi lưu,
chưng cất hơi nước và chiết xuất bằng axit-bazơ. Việc lựa chọn một
phương pháp được điều chỉnh bởi bản chất và lượng vật liệu được
chiết xuất. Nếu lượng lớn được chiết xuất, nên xem xét việc dễ dàng
chuyển từ quy mô ban đầu sang quy mô lớn. Trong mọi trường hợp,
dịch chiết thô khô thu được sau khi làm bay hơi dung môi hữu cơ
hoặc làm đông khô (dung dịch nước) (xem Chú thích 17).
3.2.1.Ngâm 1. Trong hộp thủy tinh đậy kín, ngâm nguyên liệu thực vật đã nghiền
thành bột trong dung môi thích hợp (xem Chú thích 18).
2. Sau một thời gian tiếp xúc, tách phần nguyên liệu thực vật còn
sót lại (marc) ra khỏi dung môi. Điều này liên quan đến việc phân
loại sơ bộ bằng cách gạn, thường được theo sau bởi bước lọc bằng
giấy lọc Whatman #1 (VWR International) (xem Chú thích 19).
3. Thêm một ít dung môi mới vào marc để đảm bảo chiết được hết
(xem Chú thích 20).
4. Gộp tất cả các dịch lọc lại với nhau.
Quá trình ngâm thích hợp cho cả chiết ban đầu và lượng lớn
nguyên liệu thực vật. Tuy nhiên, chiết toàn bộ số lượng lớn có thể
khá tốn thời gian, mất từ vài giờ đến vài tuần và tiêu thụ một lượng
lớn dung môi ( 6 ) .
3.2.2. Chiết bằng dung 1. Cho nguyên liệu dạng bột vào hộp thủy tinh để tiếp xúc với dung
môi có hỗ trợ siêu âm môi chiết.
2. Đặt nguyên vật chứa vào bể siêu âm (xung tần số cao, 20 kHz)
(xem Chú thích 21).
 2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 33

Chiết dung môi hỗ trợ siêu âm hiếm khi được áp dụng để chiết
quy mô lớn; nó được sử dụng chủ yếu để chiết xuất ban đầu một
lượng nhỏ vật liệu. Nó thường được áp dụng để tạo thuận lợi cho việc
chiết các chất chuyển hóa nội bào từ nuôi cấy tế bào thực vật ( 7 ) .

3.2.3. Thẩm thấu 1. Trong bình lọc màu, đặt nguyên liệu thực vật dạng bột để ngâm
tiếp xúc với dung môi chiết (xem Chú thích 22).
2. Đổ một ít dung môi bổ sung lên trên nguyên liệu thực vật và để
dịch chiết thấm từ từ (nhỏ từng giọt) ra khỏi đáy của thiết bị lọc màu
(xem Chú thích 23).
3. Thực hiện các quá trình thẩm thấu liên tiếp để chiết xuất triệt để
nguyên liệu thực vật bằng cách nạp lại dung môi mới vào bộ thẩm
thấu.
4. Gộp tất cả các chất chiết xuất lại với nhau.
Sự thẩm thấu là đủ cho cả quá trình chiết ban đầu và quy mô lớn
( 8 ) . Tuy nhiên, nhược điểm chính của quá trình thẩm thấu sốlượng
lớn là cần một lượng lớn dung môi và quá trình này có thể tốn nhiều
thời gian. Để đảm bảo rằng quá trình chiết hoàn tất, có thể kiểm tra
chất thấm qua để tìm sự hiện diện của các chất chuyển hóa bằng
thuốc thử cụ thể (xem Chương 6).

3.2.4. Chiết Soxhlet 1. Cho nguyên liệu thực vật dạng bột vào ống đựng xen-lu-lô và bọc
bằng bông gòn.
2. Đặt ống chiết vào bên trong buồng chiết Soxhlet.
3. Lắp buồng chiết Soxhlet lên trên bình hứng đáy tròn có chứa một
số hạt chống va đập.
4. Thêm dung môi thích hợp vào buồng Soxhlet (xem Chú thích
24). Khi một mức dung môi nhất định đã tích tụ trong ống lót, nó sẽ
được hút vào bình bên dưới.
5. Kết nối sinh hàn hồi lưu với buồng Soxhlet.
6. Đặt bình thu thập vào một lớp phủ gia nhiệt và làm nóng thiết lập
dưới dòng chảy ngược.
Chiết xuất Soxhlet được sử dụng rộng rãi cho cả chiết ban đầu và
chiết số lượng lớn (xem Chú thích 25) ( 9, 10 ) . Ưu điểm chính của
nó là vật liệu được chiết xuất liên tục, nghĩa là dung môi bão hòa
trong các chất chuyển hóa hòa tan được đổ vào bình, dung môi mới
được ngưng tụ lại sau đó chiết xuất lại vật liệu trong ống. Phương
pháp này ít tốn thời gian và dung môi hơn so với ngâm hoặc thấm.
Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là chất chiết xuất được đun
nóng liên tục ở điểm sôi của dung môi được sử dụng, điều này có thể
làm hỏng các hợp chất không bền nhiệt và/hoặc bắt đầu hình thành
các giả chất.

3.2.5. Chiết dung môi Còn được gọi là chiết dung môi tăng tốc (xem Chương 4), phương
điều áp pháp này sử dụng áp suất cao để duy trì dung môi ở trạng thái lỏng ở
34 V. Seidel

nhiệt độ cao (xem Chú thích 26). Chúng tôi đã sử dụng chiết xuất
dung môi có áp suất để chiết xuất nguyên liệu thực vật ban đầu như
sau ( 11 ) .

1. Trộn vật liệu dạng bột với một ít cát biển theo tỷ lệ 4:1.
2. Nạp hỗn hợp cát-thực vật (khoảng 40 g) vào hộp chiết 100 mL
ASE ®.
3. Đặt hộp chiết vào máy chiết ASE ® 100.
4. Đổ dung môi chiết phù hợp vào các chai chứa.
5. Lập trình hệ ASE ® 100 để chiết ở áp suất 1.500 psi và nhiệt độ
100°C trong bốn chu kỳ tĩnh (thời gian tĩnh 8 phút/chu kỳ) với thể
tích xả là 60% và thời gian thanh lọc bằng khí nitơ là 150 giây.
6. Thu dịch chiết, được lọc tự động, vào bình nhận.
Với yêu cầu về dung môi thấp, chiết xuất bằng dung môi có áp suất
cung cấp một giải pháp thay thế kinh tế và thân thiện với môi trường
hơn so với các phương pháp thông thường ( 12 ) . Các ưu điểm khác
là nhiệt độ và áp suất cao cải thiện quá trình hòa tan chất chuyển
hóa, do đó nâng cao tốc độ và hiệu suất chiết xuất ( 13 ) ; quy trình
hoàn toàn có thể lập trình được và mang lại khả năng tái sử dụng tốt.
Phương pháp này phù hợp nhất để chiết xuất ban đầu nhanh chóng
và có thể lặp lại một số lượng lớn mẫu.

3.2.6. Chiết xuất theo 1. Trong bình cầu đáy tròn, nhúng nguyên liệu thực vật vào dung
phương pháp hồi lưu môi thích hợp và nối bình trực tiếp với sinh hàn hồi lưu (xem Chú
và chưng cất hơi
thích 27).
nước
2. Đặt thiết bị vào một lớp phủ sưởi ấm. Khi dung môi đạt đến điểm
sôi, hơi nước được ngưng tụ và dung môi được đưa trở lại bình cầu
(xem Chú thích 28).
Nhược điểm chính của chiết xuất theo phương pháp hồi lưu và
chưng cất hơi nước là các thành phần không bền nhiệt có nguy cơ bị
phân hủy. Chưng cất hơi nước thường được áp dụng để chiết xuất
tinh dầu thực vật.

3.2.7. Chiết Axit-Bazơ Trong phương pháp này, độ pH của pha nước chiết xuất được thay
đổi để hòa tan có chọn lọc các nhóm chất chuyển hóa (chẳng hạn như
axit hoặc bazơ), sau đó được chiết xuất vào dung môi hữu cơ không
thể trộn lẫn với nước, tức là chiết xuất chất lỏng-lỏng. Chiết xuất axit-
bazơ thường được sử dụng trong chiết xuất các ancaloit ( 14, 15 ) và
anthocyanin ( 16 ) . Một nhược điểm của phương pháp xử lý axit-
bazơ là nó có thể tạo ra một số tạp chất và/hoặc dẫn đến sự phân hủy
của các hợp chất ( 17 ) .
 2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 35

3.3. Nuôi cấy vi Việc nuôi cấy vi sinh vật được thực hiện trong môi trường dinh
sinh vật dưỡng ban đầu được chia trong bình. Điều này cho phép thiết lập
tương đối tốt để theo dõi cả tốc độ tăng trưởng của sinh khối và sản
xuất các chất chuyển hóa. Nó cũng cung cấp một phương tiện để thực
hiện các nghiên cứu ban đầu nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy
và tăng sản xuất chất chuyển hóa. Quy trình có thể được mở rộng quy
mô sau khi ảnh hưởng của các thông số quan trọng đã được tối ưu
hóa, ví dụ: sục khí, nhiệt độ, pH và xác định chắc chắn không có
nhiễm bẩn bên ngoài.
1. Bắt đầu nuôi cấy trong bình lỏng bằng cách cấy một vài khối thạch
2–3 mm 2 chất cấy từ mép đang phát triển của khuẩn lạc vào dung
dịch dinh dưỡng (100 mL) trong các lọ hình nón vô trùng được bịt
kín bằng nút bông (xem Lưu ý 29).
2. Ủ các bình ở nhiệt độ yêu cầu (xem Chú thích 30) và kiểm tra
thường xuyên để phát hiện các chất gây ô nhiễm.
3. Để chiết xuất lượng lớn, chuyển chủng sang các thiết bị lên men
nhỏ (bình kín bằng thép không gỉ) (xem Chú thích 31).

3.4. Chiết xuất Một loạt các phương pháp được sử dụng trong việc thu hồi các chất
vật liệu có nguồn chuyển hóa của vi sinh vật tùy thuộc vào việc các hợp chất quan tâm
gốc vi sinh vật được các tế bào bài tiết hoàn toàn hay một phần vào môi trường hay
có mặt trong các tế bào. Các chất chuyển hóa của vi sinh vật thường
được sản xuất với hiệu suất thấp và một chủng có thể tạo ra một hỗn
hợp các hợp chất phức tạp. Đối với nguyên liệu thực vật, các dung
môi hữu cơ không thể trộn lẫn với nước, ví dụ: EtOAc, DCM, n -
butanol, MeOH, v.v., được sử dụng để chiết xuất các chất chuyển hóa
của vi sinh vật (Bảng 1 ). Làm bay hơi dung môi hữu cơ hoặc làm
đông khô (của dung dịch nước) thu được dịch chiết thô khô (xem
Chú thích 17). Chi tiết khác về tinh chế và đặc tính của các chất
chuyển hóa vi sinh vật được cung cấp trong Chương 15 .

3.4.1. Chiết xuất toàn
bộ vi sinh vật nuôi cấy
3.4.2. Khai thác
sinh khối vi sinh
vật
1. Làm đông khô toàn bộ môi trường nuôi cấy.
2. Chiết xuất các chất chuyển hóa của vi sinh vật trong và ngoài tế
bào bằng cách ngâm hoặc siêu âm sử dụng dung môi thích hợp
( 18 ) .
1. Tách sinh khối vi sinh vật khỏi các thành phần môi trường và các
chất gây ô nhiễm khác (xem Chú thích 32).
2. Chiết xuất các chất chuyển hóa của vi sinh vật nội bào bằng cách
ngâm hoặc siêu âm sử dụng dung môi thích hợp ( 11 ) .

3.4.3. Chiết xuất chất
lỏng trung bình
1. Loại bỏ bất kỳ “tạp chất” vật lý nào, ví dụ: mảnh vụn tế bào, thành
phần môi trường không hòa tan (xem Chú thích 32).
2. Phân chia môi trường lỏng (pha nước) giữa một dung môi hữu cơ
không thể trộn lẫn với nước bằng cách thay đổi độ pH của pha nước
và/hoặc chọn một dung môi để phân chia các chất chuyển hóa mong
muốn để chiết xuất các chất chuyển hóa một cách chọn lọc tùy thuộc
vào pKa của chúng và/ hoặc hệ số phân vùng (tách lớp) ( 11, 19 ) .
36 V. Seidel

4. Ghi chú

1 . Một dung môi có độ phân cực thích hợp được sử dụng để chiết
xuất các chất chuyển hóa theo nguyên tắc “giống nhau tan vào
nhau”. Vật liệu có thể được chiết xuất tuần tự bằng các dung môi
có độ phân cực tăng dần (chiết xuất chọn lọc) hoặc có thể thực
hiện chiết xuất toàn bộ bằng cách sử dụng dung môi cồn có khả
năng tăng tính thấm của thành tế bào, do đó tạo điều kiện thuận
lợi cho việc chiết xuất hiệu quả một lượng lớn chất phân cực và
các thành phần phân cực trung bình đến thấp. Khi cần hỗn hợp
dung môi, hỗn hợp nhị phân (hai dung môi có thể trộn được)
thường được sử dụng.
2 . Không được sử dụng các dung môi độc hại và những chất có hại
cho môi trường, ví dụ như benzen, toluene và carbon
tetrachloride. Nên tránh dietyl ete vì nó rất dễ cháy và có thể dẫn
đến sự hình thành peroxit dễ nổ. Hydrocacbon aliphatic rất dễ
cháy. DCM được ưu tiên hơn chloroform (CHCl3 ), loại sau độc
hơn. Acetone có thể làm phát sinh giả chất trong điều kiện axit.
MeOH, DCM, và CHCl3 cũng có thể tạo ra các giả chất (xem
Chương 13 ).
3 . Một số cơ sở dữ liệu và tạp chí (chẳng hạn như Journal of
Ethnopharmacology ) có thể được tham khảo trên Internet.
Chúng bao gồm các liên kết sau:
http://ukcrop.net/perl/ace/search/PhytochemDB .
http://ukcrop.net/perl/ace/search/MPNADB .
http://ukcrop.net/perl/ace/search/EthnobotDB .
http://www.ars-grin.gov/duke/ .
http://www.leffi ngwell.com/plants.htm .
4 . Các cân nhắc về địa lý nên được tính đến cho các mục đích tái thu
thập để đảm bảo hồ sơ tái sản xuất của các chất chuyển hóa.
5 . Để phân lập chọn lọc xạ khuẩn, ví dụ Streptomyces , các mẫu đất
được làm khô trong không khí trong vài ngày để giảm nhiễm vi
khuẩn không sinh bào tử (đặc biệt là vi khuẩn Gram âm) và sau
đó đun nóng ở 100–120°C trong 1 giờ. Để phân lập chọn lọc các
chủng Bacillus Gram dương, các mẫu đất được đun nóng ở 70°C
hoặc treo trong 1 giờ trong EtOH 50%.
6 . Đặt màng lọc trên đĩa thạch và cấy huyền phù đất lên bề mặt của nó
sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của sợi nấm xạ khuẩn.
Môi trường phân lập chọn lọc với peptone và các axit amin khác sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử Bacillus. Môi
trường phân lập chọn lọc với chất kháng nấm sẽ ức chế sự phát
triển của nấm và nấm mốc.
Nhiệt độ ủ tối ưu để phân lập ưu tiên vi khuẩn và nấm lần lượt là
37 và 25°C.
2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 37

Các chủng ưa nhiệt sẽ yêu cầu nhiệt độ ủ ở ≥ 50°C.

8 . Một dung dịch gốc thường được chuẩn bị bằng cách bảo quản các
phần dịch, ví dụ: 1 mL, của dịch cấy ở -80°C. Glycerol (20%) được
sử dụng làm tác nhân bảo quản lạnh.
9 . Chúng tôi đã sử dụng môi trường rắn, chẳng hạn như Melin
Norkrans biến tính (MNN) (mỗi lít): KH2 PO4 (0,5 g), MgSO4
·7H2O (0,15 g), CaCl2 (50 mg), NaCl (25 mg) ), thiamine (100 μ g),
(NH4)2HPO4 (0,25 g), FeCl3 (dung dịch 1%) (1,2 mL), agar (10 g),
bổ sung glucose (10 g/L) hoặc mạch nha dịch chiết (3 g/L); Potato
Dextrose và Malt Extract agar (Oxoid, UK) ở công thức nồng độ
đầy đủ hoặc 1/2, bổ sung streptomycin và penicillin G (cả 30 mg/
L) (Sigma-Aldrich, UK), có hoặc không có chất diệt nấm benomyl
(2 mg/L)(Sigma-Aldrich, UK), để phân lập chọn lọc nấm nội sinh
từ các mẫu rễ.
1 0 . Ủ ở 15–20°C đã được sử dụng để phân lập nấm nội sinh ở rễ.
1 1 . Các dung môi dùng cho m ục đích chung (có sẵn trên thị
trường trong hộp nhựa hoặc trong Winchesters có nút nh ựa)
thường chứa chất làm dẻo (chất phụ gia được sử dụng trong
sản xuất nhựa). Giảm thiểu ô nhiễm với chất hóa dẻo là đặc
biệt quan trọng khi thực hiện chiết xuất lượng lớn và sử dụng
lượng lớn dung môi. Dioctyl phthalate ester là ch ất gây ô
nhiễm phổ biến nhất. Nó có thể được phát hiện bằng sự hiện
diện của một đốm màu hồng tím đậm trên tấm TLC silicagel
(giá trị Rf = 0,4 trong ete d ầu hỏa-EtOAc, 95:5) sau khi phát
hiện bằng thuốc thử anisaldehyd-axit sunfuric và ủ trong 5
phút ở 110 °C. Dữ liệu quang phổ: UV λ max 275 nm (log ε
3,17), 282 nm (sh); 1 H NMR ( δ , CDCl 3 ) 7,70 (2H, dd,
H-3 và H-6 proton th ơm),7,52 (2H, dd, H-4 và H-5 proton
thơm), 4,20 (4H, dd, H -1' và H-1 ″ gốc 2-etylhexyl), 1,2–
1,8 (14H, m, CH và CH 2 của gốc 2-etylhexyl), 0,90 (nhóm
12H, CH3); EIMS ( m/z ) 279, 167 và 149 (100%). Ch ưng
cất dung môi loại thông dụng trước khi chiết và sử dụng hộp
thủy tinh để bảo quản có thể loại bỏ sự nhiễm bẩn với chất
làm dẻo. Một chất gây ô nhiễm khác có thể xảy ra là mỡ chân
không cao (chất bôi trơn gốc silicon) được sử dụng làm chất
bịt kín và để ngăn chặn các mối nối của đồ thủy tinh bị kẹt.
Khối phổ có thể được sử dụng để phát hiện ô nhiễm; mỡ
silicon thể hiện mô hình phân m ảnh khối lượng điển hình
( m/z 429, 355, 281, 207 và 133) khác với mỡ hydrocacbon
béo (phân mảnh cứ sau 14 đơn vị khối lượng).
12. Nếu sử dụng nguyên liệu thực vật tươi, enzyme có thể bị biến tính (hoặc vô
hiệu hóa) bằng cách ngâm nguyên liệu trong dung môi hữu cơ, ví dụ: MeOH
hoặc EtOH.
38 V. Seidel

13. Điều kiện khô ráo là điều cần thiết để ngăn chặn quá trình lên
men của vi sinh vật và sự phân hủy tiếp theo của các chất chuyển
hóa. Ngoài ra, nên bảo vệ khỏi ánh sáng mặt trời trực tiếp để
giảm thiểu các phản ứng hóa học (và sự hình thành hiện vật) do
tia cực tím gây ra. Để đẩy nhanh quá trình sấy khô (đặc biệt là ở
những nước có độ ẩm tương đối cao), vật liệu có thể được sấy
khô trong tủ sấy. Điều này cũng có thể giảm thiểu các phản ứng
enzyme (ví dụ: thủy phân glycoside) có thể xảy ra miễn là còn
một phần độ ẩm còn sót lại trong nguyên liệu thực vật. Nhiệt độ
dưới 30°C được khuyến nghị để tránh làm mất mát/phân hủy các
hợp chất không bền nhiệt, ví dụ: các thành phần dễ bay hơi của
tinh dầu.
14. Tuy nhiên, một số nguyên liệu, chẳng hạn như hạt và trái cây giàu
chất béo và dầu dễ bay hơi, có thể làm tắc nghẽn các lưới lọc và
nhiệt sinh ra có thể làm giảm chất chuyển hóa không bền nhiệt.
15. Các phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào việc sử dụng
hỗn hợp nước lạnh/nóng, đôi khi có cồn và/hoặc dung dịch cồn
để thu được các chế phẩm dùng ngoài hoặc uống trong cơ thể như
trà.
16. Dung môi không phân cực hòa tan hầu hết các hợp chất ưa béo, ví
dụ: ankan, axit béo, sắc tố, sáp, sterol, một số terpenoit, ancaloit
và coumarin. Các dung môi phân cực trung bình có thể chiết xuất
các hợp chất có độ phân cực trung bình, ví dụ: một số alkaloid,
flavonoid, trong khi các dung môi phân cực hơn được sử dụng
cho các hợp chất phân cực hơn, ví dụ, glycoside flavonoid, tanin
và một số alkaloid. Nước thường không được sử dụng làm chất
chiết ban đầu, ngay cả khi mục đích là chiết xuất các thành phần
thực vật hòa tan trong nước, ví dụ: glycoside, alkaloid bậc bốn và
tanin.
Việc loại bỏ dung môi nên được thực hiện ngay sau khi chiết để
giảm thiểu sự thất thoát các hợp chất không bền trong dung dịch.
Cũng nên tránh tiếp xúc lâu với ánh sáng mặt trời vì khả năng
xuống cấp. Đối với dung môi hữu cơ, dịch chiết được cô đặc bằng
cách làm bay hơi dưới áp suất giảm (sử dụng thiết bị cô quay) ở
nhiệt độ dưới 40°C để giảm thiểu sự phân hủy của các hợp chất
không bền với nhiệt. Cần có các biện pháp phòng ngừa nếu chất
chiết xuất có chứa một số chất chuyển hóa tạo bọt vì chúng có thể
tràn vào dung môi thu thập chất lỏng. Một lượng nhỏ dung môi
(<5 mL) có thể được làm bay hơi dưới dòng khí nitơ thổi nhẹ.
Nếu hỗn hợp hữu cơ/nước được sử dụng làm chất chiết, thì mẫu
được làm bay hơi dưới áp suất giảm và sau đó được đông khô.
Dịch chiết đông khô được bảo quản tốt nhất trong hộp đậy kín
trong tủ đông (-20°C) cho đến khi được yêu cầu để giảm thiểu sự
giáng hóa ở nhiệt độ phòng.
Quá trình ngâm thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Thỉnh
thoảng hoặc liên tục khuấy chế phẩm (sử dụng máy lắc cơ học
hoặc máy trộn để đảm bảo trộn đồng nhất) có thể làm tăng tốc độ
chiết xuất.
2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 39

19. Thực vật có thể được ngâm trong túi muslin để tạo điều kiện lọc
thêm và bổ sung dung môi mới. Có thể cần ly tâm nếu vật liệu dạng
bột quá mịn để lọc.
20. Quá trình chiết xuất cuối cùng sẽ dừng lại khi đạt được trạng thái
cân bằng giữa nồng độ của các chất chuyển hóa trong dịch chiết và
nồng độ trong nguyên liệu.
21. Siêu âm được sử dụng để tạo ra ứng suất cơ học lên các tế bào
thông qua việc tạo ra các lỗ hổng trong mẫu. Sự phá vỡ tế bào làm tăng
khả năng hòa tan của các chất chuyển hóa trong dung môi và cải thiện
hiệu suất chiết xuất. Hiệu quả của việc khai thác phụ thuộc vào tần số
của thiết bị, độ dài và nhiệt độ của sonication.
22. Nên sử dụng bình chứa bằng kim loại nếu sử dụng dung môi
nóng. Thông tin chi tiết về thiết bị có thể được tìm thấy trong nhiều
chuyên khảo dược điển. Mức độ mà vật liệu được nghiền có thể ảnh
hưởng đến sản lượng chiết xuất. Do đó, bột mịn và vật liệu, chẳng hạn
như nhựa và thực vật trương nở quá mức, ví dụ: những loại có chứa
chất nhầy, có thể làm tắc bộ lọc màu. Ngoài ra, nếu vật liệu không
được chia đồng nhất trong vật chứa, ví dụ: nếu vật liệu được đóng gói
quá dày đặc, thì dung môi có thể không đến được tất cả các khu vực và
quá trình chiết sẽ không hoàn thành. Chỉ những vật liệu được phân
mảnh thô lọt qua sàng 3 mm là đủ để thấm. Cả thời gian tiếp xúc giữa
dung môi và thực vật, tức là tốc độ thẩm thấu và nhiệt độ của dung
môi sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất. Ban đầu, thực vật thường
được ngâm trong thiết bị lọc màu tối đa 24 giờ. Nhiệt độ cao cải thiện
hiệu suất chiết xuất, nhưng có thể dẫn đến sự phân hủy các chất
chuyển hóa không bền nhiệt.
23. Không cần lọc bổ sung dịch chiết vì đã có bộ lọc ở đầu ra của thiết
bị lọc màu.
24. Nên sử dụng một dung môi duy nhất đơn giản vì một trong các
dung môi trong hỗn hợp có thể chưng cất nhanh hơn dung môi khác.
Điều này có thể dẫn đến thay đổi tỷ lệ dung môi trong buồng chiết
Soxhlet.
25. Có thể thực hiện chiết Soxhlet lượng lớn và ban đầu trong tối đa
72 giờ. Một lần chiết ban đầu sử dụng trung bình 200–500 mL trong
khi chiết xuất số lượng lớn sử dụng 2,5–5 L dung môi. Vì mục đích an
toàn, nên đặt thiết bị Soxhlet trong loại tủ hút không cửa ngăn.
26. Chiết xuất dung môi tăng tốc là một quy trình đã đăng ký (ASE ® )
do Dionex (Sunnyvale, CA, USA) phát triển. Quá trình chiết xuất được
thực hiện dưới áp suất cao (100–200 bar) trong vòng 12–20 phút, sử
dụng 15–45 mL dung môi và ở nhiệt độ từ môi trường xung quanh
đến 200°C. Hai hệ hiện đang có sẵn. ASE ® 150 có một cell đơn (1–100
mL)
40 V. Seidel

và phù hợp nhất cho quá trình trích xuất ban đầu với thông
lượng thấp. Có thể đạt được quá trình chiết xuất thông lượng cao
với ASE ® 350, có một băng chứa tới 24 cell (1–100 mL). Cả hai
hệ có thể chứa 1–100 g mẫu.
27. Trong phương pháp chưng cất hơi nước, nguyên liệu thực vật được
ngâm trong nước cất. Cần cẩn thận để không nghiền nguyên liệu quá
mịn. Tốt hơn là vật liệu bị vỡ vụn hoặc nghiền nát. Một số glycerol có
thể được thêm vào nước để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất
vật liệu cứng, ví dụ: vỏ cây, hạt và rễ.
28. Trong phương pháp chưng cất hơi nước, hơi nước ngưng tụ khi
đun nóng và phần chưng cất được thu vào ống chia độ nối với bình
ngưng. Xylene có thể được thêm vào bình thu chia độ để giữ sản phẩm
chưng cất được tạo ra. Cả mô tả về thiết bị chưng cất và quy trình
chưng cất hơi nước đều được tìm thấy trong nhiều chuyên khảo về
dược điển. Các điều kiện chiết xuất tối ưu, ví dụ, tốc độ chưng cất,
phải được xác định tùy thuộc vào bản chất của vật liệu được chiết xuất.
29. Thông thường, 50–100 mL môi trường lỏng được chia vào các
bình (dung tích 500 mL). Thể tích môi trường nhỏ so với kích thước
của bình là cần thiết để tăng sục khí. Nút bông vô trùng được sử dụng
để tránh ô nhiễm bên ngoài và cho phép trao đổi khí. Chúng tôi đã sử
dụng môi trường lỏng, chẳng hạn như MNN bổ sung glucose (10 g/L),
glu-cose/chiết xuất mạch nha (tương ứng là 5 và 3 g/L) hoặc chiết xuất
glucose/mạch nha/nấm men (5, 2 và 1 g/L tương ứng), Hagems chứa
(mỗi lít): MgSO4 7H2O (0,5 g), KH2PO4 (0,5 g), NH4Cl (0,5 g), FeCl3
(dung dịch 1%) (0,5 mL), thiamine (50 μ g), được bổ sung với chiết
xuất glucose/mạch nha/nấm men ở nồng độ tương ứng là 5, 2 và 1 g/L;
Chiết xuất mạch nha và canh thang Dextrose khoai tây (Oxoid, Vương
quốc Anh) để nuôi cấy vi nấm nội sinh từ các mẫu rễ.
30. Có thể đặt các bình (tối đa 50–100) trong tủ ấm lắc có kiểm soát
nhiệt độ. Chúng tôi đã nuôi cấy endophytes của nấm rễ bằng cách ủ
các bình ở nhiệt độ 15–20°C trong 3–5 tháng.
31. Tủ lên men nhỏ có dung tích 5–10 L. Thiết bị lên men nhỏ (tối đa
2 L) có thể cung cấp một giai đoạn trung gian trong quá trình tăng quy
mô.
32. Quá trình phân tách được thực hiện bằng cách lọc hoặc ly tâm tùy
thuộc vào tính chất vật lý của dung dịch cũng như hình thái và kích
thước của tế bào. Các tế bào vi sinh vật bao gồm vi khuẩn (1 × 2 μ m),
nấm men (7 × 10 μ m) và sợi nấm (1 × 10 μ m). Loại thứ hai có thể
phát triển dưới dạng sợi nấm. Chúng tôi đã sử dụng vải BioPrepNylon
® (VWR International, UK) để tách sợi nấm của endophyte nấm khỏi
dung dịch.
 2. Chiết ban đầu và chiết lượng lớn trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên 41
Tài liệu tham khảo
1. Newman DJ, Cragg GM (2007) Natural prod-
ucts as sources of new drugs over the last
25 years. J Nat Prod 70:461–477
2. Verma VC, Kharwar RN, Strobel GA (2009)
Chemical and functional diversity of natural
products from plant associated endophytic
fungi. Nat Prod Commun 4:1511–1532
3. Bhatnagar I, Kim SK (2010) Immense essence
of excellence: marine microbial bioactive com-
pounds. Mar Drugs 8:2673–2701
4. Schliemann W, Yizhong Cai Y, Degenkolb T,
Schmidt J, Corke H (2001) Betalains of Celosia
argentea. Phytochemistry 58:159–165
5. Brown GD, Liang G-Y, Sy L-K (2003)
Terpenoids from the seeds of Artemisia annua.
Phytochemistry 64:303–323
6. Regasini LO, Vellosa JC, Silva DH, Furlan M,
de Oliveira OM, Khalil NM, Brunetti IL,
Young MC, Barreiro EJ, Bolzani VS (2008)
Flavonols from Pterogyne nitens and their eval-
uation as myeloperoxidase inhibitors.
Phytochemistry 69:1739–1744
7. Conceição LF, Ferreres F, Tavares RM, Dias
AC (2006) Induction of phenolic compounds
in Hypericum perforatum L. cells by
Colletotrichum gloeosporioides elicitation.
Phytochemistry 67:149–155
8. Sun J, Lou H, Dai S, Xu H, Zhao F, Liu K
(2008) Indole alkoloids from Nauclea officina-
lis with weak antimalarial activity. Phytochemistry
69:1405–1410
9. Pfundstein B, El Desouky SK, Hull WE,
Haubner R, Erben G, Owen RW (2010)
Polyphenolic compounds in the fruits of
Egyptian medicinal plants (Terminalia beller-
ica, Terminalia chebula and Terminalia horr-
ida): characterization, quantitation and
determination of antioxidant capacities.
Phytochemistry 71:1132–1148
10. Mulholland DA, Langat MK, Crouch NR,
Coley HM, Mutambi EM, Nuzillard JM (2010)
Cembranolides from the stem bark of the
southern African medicinal plant, Croton grat-
issimus (Euphorbiaceae). Phytochemistry
71:1381–1386
11. Gordien AY, Gray AI, Ingleby K, Franzblau
SG, Seidel V (2010) Activity of Scottish plant,
lichen and fungal endophyte extracts against
Mycobacterium aurum and Mycobacterium
tuberculosis. Phytother Res 24:692–698
12. Benthin B, Danz H, Hamburger M (1999)
Pressurized liquid extraction of medicinal
plants. J Chromatogr A 837:211–219
13. Waksmundzka-Hajnos M, Petruczynik A,
Dragan A, Wianwska D, Dawidowicz A, Sowa
I (2004) Influence of the extraction mode on
the yield of some furanocoumarins from
Pastinaca sativa fruits. J Chromatogr B
800:181–187
14. Zanolari B, Guilet D, Marston A, Queiroz EF,
Paulo MQ, Hostettmann K (2003) Tropane
alkaloids from the bark of Erythroxylum vac-
ciniifolium. J Nat Prod 66:497–502
15. Zhang X, Yea W, Zhaoa S, Che C-T (2004)
Isoquinoline and isoindole alkaloids from
Menispermum dauricum. Phytochemistry
65:929–932
16. Toki K, Saito N, Shigihara A, Honda T (2001)
Anthocyanins from the scarlet flowers of
Anemone coronaria. Phytochemistry
56:711–715
17. Salim AA, Garson MJ, Craik DJ (2004) New
alkaloids from Pandanus amaryllifolius. J Nat
Prod 67:54–57
18. Cao S, Lee ASY, Huang Y, Flotow H, Ng S,
Butler MS, Buss AD (2002) Agonodepsides A
and B: two new depsides from a filamentous
fungus F7524. J Nat Prod 65:1037–1038
19. Liu Z, Jensen PR, Fenical W (2003) A cyclic
carbonate and related polyketides from a
marine-derived fungus of the genus Phoma.
Phytochemistry 64:571–574