GIỚI THIỆU MÔN HỌC

I. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Sản phẩm nguồn gốc tự nhiên (Natural Products - NPs) là các hợp chất hóa học tạo ra
bởi các tổ chức sống (động vật, thực vật, vi sinh vật, ...).
Phytochemicals là sản phẩm nguồn gốc tự nhiên được tạo ra bởi tổ chức sống là thực vật,
chiếm tỷ trọng lớn trong NPs.

II. MỤC TIÊU & ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

• Cổ điển: Phân lập, nhận dạng, xác nhận đặc điểm, cấu trúc và tổng hợp các hợp chất
phân tử thấp, đặc biệt là chất có hoạt tính sinh học, xuất hiện trong giới động vật, thực
vật hoặc do VSV tạo ra.
• Hiện nay:
- Tiếp tục hoàn thiện phương pháp phân tích hợp chất thiên nhiên
- Đẩy mạnh việc tìm các hợp chất có hoạt tính sinh học không chỉ từ đất liền mà còn
nguồn gốc từ biển
- Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có phân tử lượng lớn
- Sử dụng các hợp chất thiên nhiên mới, đặc biệt về mặt cấu trúc, hoạt tính sinh học
để tổng hợp các chất có cấu trúc tương tự, tính chất ưu việt hơn (về mặt sử dụng
hoặc thích nghi với môi trường)

III. ỨNG DỤNG

Hợp chất thiên nhiên là nguồn cung cấp lớn chất hoạt tính sinh học, sinh lý dược lý để
nghiên cứu các thuốc mới, điều trị bệnh, hỗ trợ chức năng cho sức khỏe con người.
Sử dụng để tổng hợp các sản phẩm ứng dụng cao: Thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, hương
liệu, may mặc, ...

IV. NỘI DUNG MÔN HỌC

2.1. Phần A: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Tìm hiểu về các nhóm hợp chất thiên nhiên phổ biến, trong đó chủ yếu đề cập đến:
- Đặc trưng cấu trúc
- Nhận định về tính chất hóa học, tính chất vật lý
- Sự phân bố trong các bộ phận của thực vật và trong giới thực vật

Trang 1
 - Vai trò với thực vật
- Vai trò với con người & một số ứng dụng hiện tại

2.2. Phần B: Các phương pháp phân lập tinh chế

Tìm hiểu về các phương pháp, kỹ thuật thông dụng dùng để trích ly, phân lập, tinh chế các
hợp chất thiên nhiên từ thực vật, trong đó chủ yếu đề cập đến:
- Nguyên tắc, cơ sở của phương pháp
- Kỹ thuật vận hành cơ bản
- Lựa chọn phương pháp, thông số vận hành phù hợp



Trang 2
 PHẦN A – HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

I. DANH PHÁP THỰC VẬT

Loài - Species: Đơn vị phân loại cơ bản của thực vật, là tập hợp các cá thể có đặc điểm
chung phân loại với các loài khác.
Chi: Các cá thể trong cùng một loài có đặc điểm chung gần giống nhau
Họ: Các chi tập hợp thành họ, bộ

Tên khoa học cơ bản = Chi + loài + Chữ đầu hoặc tên viết tắt
người phát hiện ra, (họ của thực vật)

Ví dụ: Annona squamosa L., (Annoaceae)

II. PHÂN LOẠI PHYTOCHEMICALS

2.1. Phân loại dựa trên đặc điểm phân bố trong giới thực vật
Có 2 nhóm chính: Sản phẩm chuyển hóa Bậc 1 & Bậc 2
Sản phẩm chuyển hóa bậc 1 Sản phẩm chuyển hóa bậc 2

Không liên quan trực tiếp trong sự sinh

Thiết yếu cho sự phát triển sinh
trưởng của cây. Là thành phần
Vai trò
xây dựng chất năng sinh lý, hỗ
trợ sự phát triển tế bào
trưởng phát triển của cây.
Liên quan đến chức năng sinh thái, cơ chế
tự vệ, sự tương tác của cây với tác động môi
trường để giúp cây thích ứng, chống chọi
nguy hiểm bên ngoài, hỗ trợ sinh tồn và duy
trì nòi giống của cây.

Đóng vai trò chức năng giống Vai trò đa dạng tùy thuộc từng nhóm chất
Đặc điểm
nhau trên hầu hết các loại cây. trên mỗi loài cây.
Có mặt phổ biến trong hầu hết Mỗi chất mang tính đặc hiệu riêng cho mỗi
Phân bố
thực vật. loài thực vật nhất định
Hàm lượng Lớn Nhỏ
Ứng dụng Thực phẩm Hoạt tính sinh học

Trang 3
 2.2. Phân loại dựa trên đặc điểm cấu trúc & con đường sinh tổng hợp
2.2.1 Sơ đồ chuyển hóa trong thực vật

Nhận xét: Các sản phẩm chuyển hóa của cây đều bắt đầu từ quá trình Quang hợp: Thực
vật sử dụng năng lượng mặt trời cùng CO2 và H2O để tạo ra carbohydrate để tham gia chuyển
hóa tạo thành các sản phẩm tiếp theo.
→ Đặc điểm chỉ có ở thực vật → Nguồn cung cấp hợp chất tự nhiên lớn nhất và quan trọng
nhất với con người.
2.2.2 Phân loại
Phytochemicals được phân thành nhiều nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm cấu trúc và con
đường sinh tổng hợp/chuyển hóa.
Trong một số nhóm phân loại, có thể có một số hợp chất tuy đặc điểm cấu trúc khác với
đặc điểm chung của nhóm nhưng được sinh ra từ cùng con đường chuyển hóa, do đó sẽ được xếp
vào chung một nhóm.

Trang 4
 Phaàn I
Caùc saûn phaåm
chuyeån hoùa baäc 1

Trang 5
 PHẦN 1.1 – CARBOHYDRATE (GLUCID)

I. KHÁI NIỆM

Cổ điển: Là các hợp chất hữu cơ gồm carbon, hydrogen và oxygen có công thức tổng quát
là Cn(H2O)m.
→ Không còn chính xác do có những carbohydrate có công thức tổng quát không tuân theo
công thức trên và chứa các nguyên tố khác như nitrogen, phosphor và lưu huỳnh
Hiện nay: Là những polyhydroxyl của aldehyde, ketone, alcohol hoặc acid cùng với các
dẫn xuất đơn giản của các hợp chất đó và các hợp chất có thể thủy phân ra chúng.

II. PHÂN LOẠI

Carbohydrate không thể bị thủy phân thành các glucid đơn

Monosaccharide
giản hơn.
Cấu trúc Carbohydrate khi thủy phân tạo thành 2 phân tử
Disaccharide
phân tử monosaccharide
Carbohydrate khi thủy phân tạo thành nhiều phân tử
Polysachharide
monosaccharide

Aldose Monosaccharide chứa nhóm chức aldehyde

Nhóm
chức
Ketose Monosaccharide chứa nhóm chức ketone

Số nguyên 3 4 5 6 7
tử carbon triose tetrose pentose hexose heptose
Aldohexose: monosaccharide có chứa nhóm
Tổng hợp Ghép các phân loại với nhau
chức aldehyde và có 6 nguyên tử carbon.

III. CARBOHYDRATE CƠ SỞ

2.1. Monosaccharide cơ bản mạch hở

15 monosaccharide từ aldotriose đến aldohexose là các carbohydrate cơ sở tạo nên cấu trúc
các carbohydrate lớn hơn (như disaccharide & polysaccharide) & được dùng làm cơ sở cho danh
pháp hệ thống.

Trang 6
 Tiếp đầu ngữ chỉ đồng phân quang học:
• Khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực:
(+): Sang phải
(-): Sang trái
• Cấu hình tương đối: Vị trí nhóm OH ở carbon bất đối được đánh số lớn nhất:
D: OH quay sang phải
L: OH quay sang trái

Triose D-glyceraldehyde

Tetrose

Pentose

Hexose

Trang 7
 Ketose

2.2. Monosaccharide mạch vòng

Các monosaccharide mạch hở trong môi trường có thể nằm cân bằng với dạng mạch vòng
do nhóm OH bị deproton hóa thành O- bởi chính phân tử H2O hoặc khi có base, trở thành tác
nhân ái nhân tấn công C = O để đóng vòng 5 hoặc 6 cạnh với dị tố oxygen.

Ở monosaccharide dạng vòng, nguyên tử carbon có chứa nhóm aldehyde hoặc ketone ở
mạch hở trở thành hemiacetal carbon (còn gọi là anomeric carbon) - nguyên tử carbon duy nhất
trong vòng liên kết với 2 nguyên tử oxygen nên có tính chất đặc biệt hơn các vị trí khác.

Trang 8
 Anomer: Đồng phân quang học mạch vòng của monosaccharide chỉ khác nhau về mặt cấu
hình ở vị trí C1.

Danh pháp chỉ đặc điểm mạch vòng:

• Kích thước vòng:
-pyranose: Dị vòng oxygen 6 cạnh
-furanose: Dị vòng oxy 5 cạnh
• Ký hiệu cấu hình: Biểu thị chiều của nhóm OH ở carbon hemiacetal so với nhóm OH
trước đó
𝛼: ngược chiều
𝛽: cùng chiều
Cấu hình 𝛼 và 𝛽 cùng tồn tại trong dung dịch với phần cấu hình chiếm nhiều hơn là cấu
hình ít cản trở về mặt không gian hơn.
Ví dụ: Với D-glucopyranose, cấu hình alpha chiếm ít hơn beta do nhóm OH nằm dưới vòng
bị án ngữ không gian của nhóm OH trên carbon liền kề.

2.3. Glycoside & Dẫn xuất của carbohydrate

Glycoside là các dẫn xuất của carbohydrate, trong đó, hydrogen liên kết với OH hemiacetal
bị thay thế bằng các nhóm chức khác, tạo nên một nhóm sản phẩm chuyển hóa riêng biệt sẽ đề
cập kỹ hơn ở các chương sau.

Trang 9
 Danh pháp chỉ đặc điểm mạch vòng:

• Nhóm chức thay thế:

- Tên dẫn xuất khi tạo thành acid hoặc alcohol bằng cách oxy hóa hay khử
monosaccharide được gọi bằng cách thay đuôi -ose bằng đuôi -onic, -airic hoặc -itol.
- Deoxy: Thể hiện việc loại bớt 1 nguyên tử oxygen từ nhóm C - O – H
• Kích thước vòng thay thế:
- Pyranoside: Acetal hóa vòng 6 cạnh tạo thành glycoside
- Furanoside: Acetal hóa vòng 5 cạnh tạo thành glycoside

IV. ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỐ Ở THỰC VẬT

Là thành phần thiết yếu của cây, hàm lượng lớn nhất trong các phytochemicals.
Carbohydrate phân bố ở thực vật thường phân bố dưới dạng polysaccharide, trong đó có
thể là các polysaccharide đồng thể (được tạo từ 1 loại monosaccharide) & dị thể (tạo từ nhiều
loại monosaccharide).

V. POLYSACCHARIDE ĐỒNG THỂ

5.1. Cellulose
Cellulose là một trong hai polysaccharide thông dụng và quan trọng nhất.
• Cấu trúc: Tạo thành từ các đơn vị 𝛽-D-glucose liên kết thông qua liên kết 1,4-𝛽-
glycoside.

Trang 10
• Dạng mạch: Mạch thẳng không phân nhánh, hình sợi gồm các polymer nằm song song
liên kết với nhau qua liên kết hydrogen
→ Có mạng lưới polymer chặt chẽ, có độ kết tinh và độ bền cơ học cao.
• Phân bố:
- Đa số thực vật, là thành phần chính trong vách tế bào thực vật.
- Hàm lượng cao ở các cây có sợi, lông (bông (95%), đay, gai, lanh), gỗ (40 – 50%)
• Vai trò:

- Là thành phần chính của vách tế bào thực vật, quyết định hình dạng và độ bền vững
của tế bào, bảo vệ nội chất bên trong.
- Là thành phần chính của lignocellulose cùng với hemicellulose và lignin có trong
gỗ, phụ phẩm nông nghiệp có khả năng tạo thành bioethanol thế hệ thứ 2
(bioethanol từ nguồn nguyên liệu phi thực phẩm, tránh sử dụng nguyên liệu là sản
phẩm nông nghiệp như ngô, ngũ cốc, ...).

Cấu trúc của màng sơ cấp của tế bào thực vật

5.2. Tinh bột

• Cấu trúc: Tạo thành từ các đơn vị 𝛼-D-glucose liên
kết
• Dạng mạch: Gồm 2 loại (tỷ lệ tương ứng 20:80 –
30:70)
Amylose: Mạch thẳng thông qua liên kết 1,4-𝛼-glycoside.
Amylopectin: Mạch nhánh, gồm liên kết 1,4-𝛼-glycoside
tạo mạch thẳng và 1,6-𝛼-glycoside tạo mạch nhánh.

Trang 11
 • Phân bố:
- Đa số thực vật, tập trung ở củ, rễ, quả, hạt, thân
• Vai trò: Là sản phẩm quiang hợp, cung cấp và dự trữ năng lượng cho cây & là nguyên
liệu chuyển hóa cơ bản cho các phytochemicals khác trong thực vật.

5.3. Fructan
• Cấu trúc: Tạo thành chủ yếu từ các đơn vị fructose

• Phân bố & Vai trò:

- Dự trữ năng lượng ở một số loại cỏ ôn đới như lúa mì, yến mạch, lúa mạch, …
- Fructan không thể bị tiêu hóa bởi cơ thể người, được xem là chất xơ hòa tan cho
cơ thể

VI. POLYSACCHARIDE DỊ THỂ

2.1. Gôm (Gum) & Chất nhầy (Mucilage)

• Cấu trúc & Tính chất chung:

- Polysaccharide dị thể, phân nhánh cao, tạo từ các đơn vị pentose (L-rhamnose, D-
xylose, L-arabinose) & hexose (D-galactose, D-manose), có thể chứa D-
glucouronic acid (Gum Arabic), chứa gốc sulfate (Thạch Agar).
- Tan trong nước, tạo dung dịch keo/gel có độ nhớt cao

Trang 12
 Cấu trúc của Arabic Gum

• Gôm:
- Nguồn gốc bệnh lý, được cây tiết ra như phản ứng với điều kiện không thuận lợi,
bảo vệ cây khi bị thương tổn.
- Tạo thành do sự biến đổi của màng tế bào, thường xảy ra ở những mô đã già, số ít
trường hợp xảy ra ở tế bào non.
- Ở cây thân gỗ, gôm tạo thành do tế bào phần tủy, tế bào gần vùng tầng sinh gỗ rồi
chảy ra ngoài theo các kẽ hở như lỗ sâu đục, vết chặt, … Cây ở nơi khô hanh tiết ra
gôm khi mùa mưa.

Ví dụ: Arabic Gum – Cây Acacia verek mọc ở Ai Cập ở vùng ven sa mạc, nửa năm không
mưa. Khi mưa xuống, cây tiết ra gôm ở tầng sinh gỗ. Khi vỏ cây khô nứt nẻ, gôm theo kẽ hở tiết
ra ngoài.

Gum tiết ra từ cây Arabic Gum

Trang 13
 • Chất nhầy (Mucilage)
- Là thành phần cấu tạo của tế bào bình thường.
- Tạo ra ở vỏ hạt đang nảy mầm, giúp giữ nước cần thiết cho quá trình nảy mầm,
thường gặp ở hạt lanh, một số cây họ Hoa môi.
- Dự trữ cho sự phát triển của bộ phận trên mặt đất, thường gặp ở một số cây họ Lan.

• Phân biệt Gôm & Chất nhầy

- Không có ranh giới rõ rệt giữa Gôm & Chất nhầy.
- Về cơ bản, Gôm có nguồn gốc bệnh lý, thu được dưới dạng rắn từ kẽ nứt tự nhiên
hoặc vết rạch của cây & Chất nhầy là sản phẩm có thể thu được từ quá trình chiết
nguyên liệu bằng nước.
• Phân biệt Gôm & Nhựa
Gôm Nhựa

Ngoại quan Đều chảy ra từ kẽ nứt, lỗ sâu đục, vết rạch trên cây

Không tan trong nước, dễ tan

Độ tan Trương nở trong nước và tan
trong dung môi hữu cơ

Cấu trúc hóa học Polysaccharide Nguồn gốc terpen

• Ứng dụng: Rộng rãi trong nhiều ngành như dệt, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, …
Trong dệt, mỹ phẩm: Làm chất nhũ hóa phân tán dầu trong nước
Trong dược phẩm:
Làm chất nhũ hóa trợ phân tán do đặc tính hoạt động bề mặt, không gây kích ứng,
tác động xấu lên cơ thể người
Làm tá dược – chất không có hoạt tính dược lý/sinh học, để pha loãng các thành
phần hoạt tính có hoạt lực mạnh, là môi trường quyết định khả năng phân tán đều
của thuốc, khả năng giải phóng, hấp thu dược chất trong cơ thể & hỗ trợ quá trình
sản xuất, pha chế như làm tăng độ hòa tan của thuốc, tăng tính chất trơn chảy của
hạt thuốc (dập viên, đóng nang, …) và tăng độ ổn định của thuốc.
Một số gum/chất nhầy có hoạt tính dùng làm dược liệu chữa ho, chóng lành các vết
thương, vết loét, … như thạch Agar-Agar để chữa táo bón, là môi trường nuôi cấy
vi sinh.

Trang 14
 Trong các gum, Alginat là một trong các gum có phổ ứng dụng rộng rãi.
Alginic acid (Algin) phân bố rộng rãi trong vách tế bào của tảo nâu, khi bị hydrate hóa tạo
nên gum nhớt. Alginate là dạng muối sodium hoặc calcium của alginic acid.

Cấu trúc của alginic acid

Algin & alginate chiếm phần lớn trong màng

sinh học của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và
được nuôi cấy, khai thác từ vi khuẩn này và tảo nâu.
Trong mỹ phẩm, thực phẩm vải sợi, sơn, giấy,
… được sử dụng nhờ tính nhũ hóa & giữ nước
Trong dược phẩm:

- Alginate: Chống béo phì do đặc tính trương nở

không hấp thu ở ruột gây cảm giác đầy bụng.
- Dung dịch keo alginate có tính dính bám và bao,
dùng để trị loét, bảo vệ niêm mạch đường tiêu hóa.
- Calcium alginate có tính cầm máu nhanh được
dùng khi chảy máu cam, chảy máu răng, thương
tích.
- Alginic acid & Alginat dùng làm tá dược để rã khi
sử dụng trong viên nén, chất ổn định nhũ dịch kem
và thuốc mỡ

Trang 15
2.2. Pectin

• Cấu trúc: Polysaccharide dị thể, phân nhánh với:

- Thành phần chính là pectic acid, polymer của acid 𝛼-D-galacturonic liên kết qua liên
kết 𝛼-1,4.

- Các nhóm COOH có thể bị methoxy hóa một phần hoặc nằm ở dạng muối K, Na,
Ca, …
- Mức độ phân nhánh tùy thuộc loại pectin

Pectin với cấu trúc các nhóm COOH nằm ở dạng muối Ca2+

Pectin với cấu trúc các nhóm COOH bị methoxy hóa 1 phần tạo COOCH3

Trang 16
 • Phân loại & Vai trò
- Pectin hòa tan: Trong dịch tế bào
- Protopectin: Không hòa tan, nằm trong thành tế bào & lớp gian bào, đóng vai trò
là chất cốt, xi măng liên kết các sợi cellulose & hemicellulose để tạo cấu trúc vững
chắc của thành tế bào.

Cấu trúc của màng sơ cấp của tế bào thực vật

- Protopectin chuyển hóa thành pectin dưới tác dụng của acid, enzyme
protopectinaza hoặc gia nhiệt, thường gặp ở quá trình chín trái cây.
Ví dụ: Ở các quả như cà chua, vỏ trái cây khi còn xanh chứa nhiều protopectin để tạo độ
cứng cho vỏ. Khi vỏ chín, protopectin bị thủy phân bởi enzyme, chuyển hóa thành pectin hòa tan
nên vỏ mềm.

• Ứng dụng: Trong thực phẩm, dược phẩm: Chất làm đặc, nhũ hóa, kết tinh



Trang 17
 PHẦN 1.2 – LIPID
Là các triester của g
lycerin và acid béo, là thành phần chính trong dầu béo của cây, giúp cây dự trữ năng lượng.



Trang 18
 Phaàn II
Caùc saûn phaåm
chuyeån hoùa baäc 2

Trang 19
 PHẦN 2.1 – TERPENNOID
Với hợp chất chuyển hóa bậc 2, terpenoid là nhóm chất lớn nhất, chiếm 1/3 NPs từ thực
vật. Terpenoid được sinh tổng hợp thông qua isoprenoid pathway.

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Terpen/Terpenoid có cấu trúc dựa trên cơ sở các phân tử isoprene liên kết lại với nhau, có
thể là các hydrocarbon hoặc có thêm các nhóm thế hydroxyl, acetyl, ether, carbonyl, …; dạng
mạch hở hoặc chứa vòng tùy theo số lượng mắt xích isoprene.
Theo quy ước, đầu mạch C gần nhánh gọi là đầu (head), đầu mạch C xa nhánh gọi là đuôi
(tail). Thông thường, cấu trúc terpenoid thường được nối với nhau theo kiểu đầu – đuôi.

Cần phân biệt giữa terpene và terpenoid. Cả hai đều có khung sườn từ isoprene nhưng
terpene là các hydrocarbon còn terpenoid xuất hiện nhiều nhóm chức chứa nguyên tố khác như
O, N, … Khung terpenoid có thể xuất các nhóm chức như: alcohol, ketone, aldehyde, indole
alkaloid, anthraquinone, naphthoquinone, furanocourmarine, …
Dựa trên số lượng mắt xích terpene, các terpenoid được phân loại như sau:
Sester Tetra
Hemi Mono Sequi Di Tri
(Hiếm) (Carotenoids)

Số C 5 10 15 20 25 30 40

Mắt xích
1 2 3 4 5 6 8
isoprene

Trang 20
II. PHÂN LOẠI

2.1. Monoterpene

Cấu trúc 10C, có thể mạch hở hoặc chứa từ 1 đến 3 vòng.

Là thành phần chủ yếu của tinh dầu, hiện diện trong khoảng 60 họ thực vật. Hàm lượng
tinh dầu thường thấp, chỉ khoảng 1%, trừ nụ cây Đinh hương cho hàm lượng đến 15 – 20%.
2.1.1. Acyclic
a. Hydrocarbon: Không chứa vòng, thường không được quan tâm do không có tính chất
dược lý đặc biệt hay mùi vị đặc trưng.

Myrcene: Thành phần có nhiều trong tinh dầu của rất nhiều loại cây, trong đó có lá nguyệt
quế, hoa bia. Có mùi hương dễ chịu nhưng không đặc trưng, kém bền và có thể tự polymer hóa
trong không khí nên thường được sử dụng làm chất trung gian để tổng hợp các mùi hương khác.

b. Oxygenated (chứa các dẫn xuất của oxy như hydroxyl (OH), aldehyde (CHO), ketone
(CO), …): Nhóm quan trọng, có mùi hương đặc biệt và một số hoạt tính sinh học như kháng
khuẩn, kháng viêm, …
• Dẫn xuất hydroxyl
Geraniol: Được tìm thấy trong cây sả hoa hồng (Palmarosa), có mùi của hoa hồng, được
dùng để thay thế mùi hoa hồng gốc trong hương liệu nước hoa & các sản phẩm chăm sóc cá
nhân.
Citronellol: Có nhiều trong sả Sri Lanka

Trang 21
 • Dẫn xuất aldehyde
Citral a (citral); Citral b (neral): Phổ biến trong nhóm này, là hai đồng phân hình học (E &
Z) của nhau. Có nhiều trong lá cây sả chanh.
Citronellal: Có nhiều trong cây bạch đàn chanh (Eucalyptus citrodora), mùi giống mùi lá
chanh nên thường được dùng làm hương liệu để thay thế mùi lá chanh.

2.1.2. Monocyclic
Phổ biến là limonene, thường được tìm thấy nhiều trong vỏ quả cây họ citrus có múi như
cam, chanh, quýt, bưởi, …

Terpinen-4-ol: Thành phần chính cây tràm trà (Malaleuca alternifolia), không có mùi
hương quyến rũ, có khả năng diệt khuẩn, kháng viêm tốt, dùng trong trị mụn, trị viêm họng, …

Menthol: Thành phần chính của cây bạc hà, cảm giác the mát và mùi hương đặc trưng
1,8-cineol: Thành phần chính của cây tràm gióm, tràn năm gân

Trang 22
 2.1.3. Tricyclic
Camphor: Long não được lấy từ cây long não (khác với long não trong tủ quần áo là băng
phiến – napthalene), được sử dụng cho khả năng trị liệu xoa bóp, giảm đau.
𝛼-pinene: Thành phần chính của nhựa thông

2.2. Sequiterpene

Cấu trúc 15C, có thể mạch hoặc chứa từ 1 đến 4 vòng. Là thành phần chính có trong tinh
dầu của thực vật, thường gặp trong các cây họ Cúc.
Được chia làm 2 nhóm chính: Hydrocarbon và Azulene.
2.2.1. Hydrocarbon
Zingiberene: Thành phần quan trọng trong tinh dầu gừng
Curcumene: Thành phần chính trong củ nghệ
Caryophyllene: Thành phần chính của dầu đinh hươn

2.2.2. Azulene
Các hợp chất có khung azulene có cấu trúc như hình dưới, xuất hiện hệ liên hợp vòng thơm
nên có màu, có thể được sử dụng cho làm phẩm nhuộm thiên nhiên.
Guajazulen có trong cây cúc la mã (charmomilla) cho màu xanh indigo.

Trang 23
 2.2.3. Sequiterpene lactone

Là nhóm hợp chất đặc trưng của cây thuộc họ Cúc (Asteraceae), một số cây khác cũng xuất
hiện nhưng ít hơn như họ Long não (Lauraceae), Hoa tán (Umbelliferae), Ngọc Lan
(Magnoliaceae). Phân bố chủ yếu ở bộ phận lá, đầu hoa. Thường có vị đắng, không màu, có tính
ái dầu. Một số phân tử có hoạt tính sinh học đáng kể

2.3. Diterpene

Cấu trúc 20C, có thể mạch hở hoặc chứa từ 1 đến 4 vòng. Do có nhiệt độ sôi cao nên thường
nằm ở lớp resin sau chưng cất tinh dầu.
Trong tự nhiên, hợp chất diterpene không vòng phổ biến có phytol; đơn vòng phổ biến là
vitamin A.

Taxol (paclitaxel) là thuốc điều trị ung thư nổi tiếng được điều chế trên nền của diterpene,
có thể điều trị ung thư buồng trứng, vú phổi, … Ngoài nguồn điều chế có thể chiết từ vỏ cây
thông đỏ Taxus brevifolia.

Trang 24
 2.4. SSesterterpene

Cấu trúc 25C, có thể mạch hở, chứa từ 1 đến 3 vòng. Hiếm gặp.

2.5. Triterpene

Cấu trúc lớn (30C), cấu trúc hóa học có thể mạch hở; chứa từ 3 đến 5 vòng.
Không màu, nhiệt độ nóng chảy cao; phân bố ở lớp resin, nằm ở lớp sáp, lớp bần.
Tiền chất trong sinh tổng hợp steroid, saponin, glycoside tim.
Được phân bố rộng rãi trong giới động vật, thực vật; hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside.

Azadirachtin: Chất gây chán ăn mạnh đối với côn trùng, tìm thấy trong hạt cây nêm
(Azadirachta indica), ứng dụng trong thuốc trừ sâu sinh học
𝛼 −amyrins, ursolic acid: Tạo lớp wax phủ trên bề mặt lá và một số vỏ quả

Limonin (trong cá cây họ citrus) và cucurbitacins (trong các loại bí ngô): Chất ức chế mạnh
đối với côn trùng dạng hormone steroid

Trang 25
 2.6. Tetraterpene (Carotenoids)

Cấu trúc 40C, thường được biết đến là nhóm carotenoids. Cấu trúc có thể mạch hở hoặc
chứa từ 1 đến 2 vòng, gồm hệ thống nối đôi liên hợp, tạo nên hợp chất có màu từ vàng, cam đến
đỏ (tùy vào số nối đôi), tạo nên màu sắc cho hoa và trái cây.
Đây là nhóm pigment, phân bố trong thực vật bậc cao, có vai trò:
- Tạo màu sắc vàng, cam, đỏ cho hoa quả giúp thu hút côn trùng thụ phấn, hấp dẫn động
vật ăn cỏ; hỗ trợ cho sự phân tán hạt
- Hỗ trợ cho sự quang tổng hợp, hấp thu ánh sáng và đưa đến trung tâm phản ứng cho
quang hợp
- Bảo vệ cây khỏi tổn thương do UV hoặc sự quang oxy hóa
Một số hợp chất là tiền chất của vitamin A.
Phổ biến có thể kể đến Lycopene (màu đỏ trong quả cà chua), 𝛽-carotene (màu cam trong
quả cà rốt), lutein (xanthophyll, màu đỏ vàng trong quả gấc).

2.7. Polyterpene

Cấu trúc mạch hở, thẳng. Polyterpene tự nhiên độ polymer hóa cao (từ 500 đến 5000 đơn
vị isoprene), là hợp chất trong nhựa cây
Nối đôi ở hợp chất tự nhiên của polyterpene đều ở cấu hình E hoặc Z.

Trang 26
III. TÍNH CHẤT

Hầu hết terpenoid đều là hydrocarbon mang một số nhóm chức như hydroxyl, acetyl, ether,
carbonyl, nối đôi, …
Là các hợp chất độ phân cực thấp, tính ái dầu, tan tốt trong ether dầu hỏa, hexane, diethyl
ether, chlorofom, … Ít tan trong nước, trừ khi kết hợp với các phân tử đường tạo glycoside.
Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách chiết riêng terpenoid ra khỏi bột cây. Sử
dụng các dung môi đã nêu ở trên chỉ có thể tách terpenoid ra khỏi cây cỏ, sau đó sử dụng kỹ thuật
sắc ký để tiếp tục phân riêng các hợp chất.

IV. VAI TRÒ

Trong thực vật: Các terpenoid dễ bay

hơi vai trò tạo mùi cho quá trình thụ phấn
của cây, tạo mùi để tự vệ, đuổi các động
vật ăn cỏ, các terpenoid khó bay hơi có vai
trò hỗ trợ chống lại sự xâm nhập của các
sâu bọ, vi sinh vật, … (Hình bên: Mũi tên
gạch chéo – Terpenoid không bay hơi; Mũi
tên thẳng không gạch chéo: Terpenoid bay
hơi).
Trong thảo dược truyền thống: Tạo
nên mùi hương (như trong cây tràm), vị
(trong quế, gừng), pigment (màu vàng
trong hoa hướng dương, màu đỏ trong cà
chua).
Một số terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm nên được ứng dụng trong các sản
phẩm chăm sóc cá nhân, trị liệu. Một số có hoạt tính sinh học được ứng dụng trong điều trị bệnh,
đặc biệt ung thư như Taxol.



Trang 27
 PHẦN 2.2 - STEROID

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là các hợp chất ở thể rắn, gồm 27 – 29C. Khung cơ bản là nhân steran gồm 17C và 4 nhân
(3 vòng 6, 1 vòng 5).

II. PHÂN LOẠI

Phân tử steroid có nhóm OH ở C-3 được gọi là sterol. được chia làm hai nhóm nhỏ là
zoosterol (nguồn gốc từ động vật) và phytosterol (nguồn gốc từ thực vật).

- Zoosterol: Các sterol phân bố trong động vật.

- Phytosterol: Các sterol phân bố trong thực vật, có cấu trúc phân tử gần giống cholesterol
Ngoài ra, steroid còn được phân thành các nhóm theo hoạt tính trong cơ thể: Acid mật và
hormone steroid.
1. Zoosterol & Phytosterol
Zoosterol phổ biến nhất là cholesterol, xuất hiện nhiều ở các động vật. Trong cơ thể người,
cholesterol được chuyển hóa để sinh tổng hợp các acid mật, hormone sinh dục, hormone vỏ tuyến
thượng thận.
Cholesterol cũng là thành phần thiết yếu của màng tế bào động vật, con người; giúp ổn định
tính lỏng của màng tế bào
Tập trung nhiều ở các bộ phận chứa màng (cấu trúc nhiều màng) như cơ quan nội tạng, não,
gan, … Cơ thể con người có thể tự tổng hợp qua gan và là nguồn cung cấp cho hoạt động sống.

Trang 28
 Tuy nhiên, nguồn động vật ngoại sinh cũng thường có nhiều cholesterol (trong mỡ, nội tạng
động vật khác). Do đó, hàm lượng có thể tăng vượt mức cần thiết, gây tắc nghẽn mạch máu, động
mạch, dẫn đến bệnh về tim, đột quỵ.

2. Phytosterol
Phân bố rộng, phổ biến trong các loại cây cỏ, nấm men, quả hạch, hạt đậu, dầu thực vật, …
thường có mặt song song với alkaloid hoặc saponin steroid. Có mặt trong tất cả các bộ phận của
cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc ester, một số ít ở dạng glycoside.
Vai trò thiết yếu trong hoạt động sinh lý con người: Nhờ cấu trúc gần giống cholesterol,
khi hấp thu trong cơ thể, phytosterol cạnh tranh với cholesterol làm giảm các hợp chất phytosterol
giúp giảm thành phần mỡ xấu.
Một số loại phổ biến: Stigmasterol (hạt đạu tương), ergosterol trong men bia, …

3. Acid mật
Túi mật chứa dịch mật là tác nhân giúp cơ thể hấp thu dinh dưỡng. Dịch mật chứa nhiều
acid mật có cấu tạo steroid như cholic acid trong mật gia cầm, ursodeoxycholic trong mật gấu,
mật chuột và mật người.

Trang 29
 Trong y học, cholic acid làm thuốc thông mật, lợi mật cho người viêm gan; ursodeoxycholic
acid làm thuốc tan sỏi mật, trị viêm gan, xơ gan

4. Hormone steroid sinh dục

Với nữ giới, có 2 nhóm:
- Estrogen: Là nhóm hợp chất steroid có 18 nguyên tử carbon, có 1 vòng là nhân thơm;
gồm các hormone như estradiol, estron, estriol, … Có vai trò hình thành, phát triển cơ
quan sinh học nữ, chu kỳ kinh nguyệt, mô sinh dục, các đặc tính đặc thù như da mịn
màng, mềm mại, giọng nói nhẹ nhàng, …
- Progesteron: Có 21 nguyên tử carbon trong phân tử. Chất quyết định chu kỳ kinh
nguyệt cho quá trình sinh sản, tiết sữa, nuôi con bú và sự phát triển hài hòa cơ thể của
nữ giới.

Với nam giới:

Testoteron là hormone steroid có trong động vật có vú, chim, bò sát,
… Được sinh tổng hợp ở tinh hoàn nam giới và một lượng nhỏ ở tuyến
thượng thận.
Ở nam giới, đóng vai trò hình thành và phát triển cơ quan sinh dục
như tinh hoàn, tuyến tiền liệt và các biểu hiện thứ cấp sinh dục đặc trưng
như phát triển cơ bắp, xương, mọc tóc, râu, … Ngoài ra, còn có tác dụng chống loãng xương.

5. Adrenocorticosteroid – Hormone tuyến thượng thận

Có tác dụng điều hòa các hoạt động cơ thể. Thiếu hormone làm các cơ yếu, giảm phản ứng
bảo vệ với insulin, rối loạn chuyển hóa muối, …

Trang 30
III. PHÂN BỐ TRONG THỰC VẬT

Phân bố rộng rãi trong giới động và thực vật.

Các phytosterol phân bố rộng, phổ biến trong các loại cây cỏ, nấm men, quả hạch, hạt đậu,
dầu thực vật, … thường có mặt song song với alkaloid hoặc saponin steroid. Có mặt trong tất cả
các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc ester, một số ít ở
dạng glycoside.

IV. TÍNH CHẤT

Hầu hết steroid đều là hydrocarbon mang một số nhóm chức như hydroxyl, acetyl, ether,
carbonyl, nối đôi, …
Là các hợp chất độ phân cực thấp, tính ái dầu, tan tốt trong ether dầu hỏa, hexane, diethyl
ether, chlorofom, … Ít tan trong nước, trừ khi kết hợp với các phân tử đường tạo glycoside.
Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách chiết riêng steroid ra khỏi bột cây. Sử
dụng các dung môi đã nêu ở trên chỉ có thể tách steroid ra khỏi cây cỏ, sau đó sử dụng kỹ thuật
sắc ký để tiếp tục phân riêng các hợp chất.



Trang 31
 PHẦN 2.3 – HỢP CHẤT GLYCOSIDE

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: Phần đường (glycon) và phần
không đường (aglycon) được liên kết với nhau qua O (của nhóm OH hemiacetal) gắn với
anomeric C. Liên kết giữa O và nhóm thế gọi là liên kết glycoside.

Phần đường của glycoside: Phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose,
L-rhamnose, D-xylose, glycuronic acid, galacturonic acid và các đường khác.
Phần aglycon của glycoside: Đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như:
terpenoid (monoterpene, sequiterpen, diterpen, triterpen, steroid, flavonoid, alkaloid,
polyphenol, … Với từng cấu trúc của nhân aglycon sẽ phân thành các nhóm khác nhau.

II. PHÂN BỐ

Glycoside hiện diện rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận: cây, lá, vỏ, hạt.

III. TÍNH CHẤT

Thường là chất kết tinh và có vị đắng. Dưới tác động của enzyme thực vật, dung dịch aicd
hoặc kiềm, glycoside bị thủy phân thành aglycon và phần đường.
Glycoside có tính phân cực khá mạnh, không tan trong ether dầu hỏa, hexane, benzene
nhưng tan được trong clorofom, diethyl ether (các monoglycoside), tan tốt trong alcohol, nước.
Glycoside thường được chiết bằng nước nóng, ethanol hoặc hỗn hợp alcohol – nước với
thành phần dao động từ 50 – 90%.



Trang 32
 PHẦN 2.2.1 – GLYCOSIDE TIM

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là những glycoside steroid có tác dụng đặc biệt lên tim. Ở liều điều trị có tác dụng cường
tim, làm chậm và điều hòa nhịp tim, khi quá liều gây loạn nhịp tim, giảm sức co bóp và cuối
cùng gây ngừng tim.
1. Phần aglycon
Chia làm hai phần: Nhân hydrocarbon và mạch nhánh là vòng lacton được gắn ở vị trí C17.
1.1 Nhân hydrocarbon
Cấu trúc trùng với nhân steroid (nhân steran):

Trong đó:
- Ở C-3 có nhóm OH, hầu hết đều ở hướng 𝛽 (hướng về phía trước trang giấy), vẫn có một
vài chất ở hướng 𝛼
- Ở C-14 hầu hết có nhóm OH hướng 𝛽, một vài chất không có nhóm OH này
- Các vị trí C-1, C-5, C-11, C-12, C-16 và C-19
đều có thể bị oxy hóa ở các mức độ khác nhau tạo
thành CH2OH, CHO hoặc COOH.
- Nhóm OH có thể bị acyl hóa
- Nhóm OH gần nhau có thể tương tác tạo thành
nhóm epoxy (hình bên trái)
- Nhóm OH ở C-11 có thể tác dụng với COOH ở
C-19 để tạo vòng lacton

1.2 Vòng lacton

Vòng lacton là các ester carboxylic đóng vòng nội phân tử, trên vòng có thể chứa liên kết
đôi hoặc dị nguyên tố khi thay thế một hoặc nhiều nguyên tố carbon trong vòng.

Trang 33
 Hầu hết các chất có hoạt tính sinh học đều có vòng lacton ở hướng 𝛽. Có hai loại vòng
lacton, chia glycoside tim thành 2 nhóm chính:
- Nhóm cardenolid: Vòng lacton có 4 carbon và một nối đổi ở vị trí 𝛼 − 𝛽
- Nhóm bufadienolid: Vòng lacton có 5 carbon và hai nối đôi (vòng 𝛼-pyron & coumalin)

2. Phần đường: Phần đường nối vào OH ở C-3 của aglycon.

II. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CẤU TRÚC LÊN HOẠT TÍNH

Phần quyết định lên tim là phần alycon: Cả nhân steroid và vòng lacton chưa bão hòa
đều quan trọng:
- Nếu giữ vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzene, napthalene: Mất tấc dụng
- Nếu giữ nguyên steroid mà thay đổi vào lacton: Bão hòa nối đôi, mở vòng lacton, thay
vòng lacton bằng vòng lactam: Mất hoặc giảm đáng kể tác dụng
Cụ thể:
- Nhóm OH ở C-14 quan trọng, không có nhóm tác dụng giảm đi đáng kể.
- Nhóm OH ở C3 hướng 𝛼 cũng làm giảm tác dụng đáng kể.
- Vòng lacton hướn 𝛼 cũng bị giảm tác dụng
- Hoạt tính của bufadienolid mạnh hơn dẫn xuất cardenolid tương ứng
- Phần tương ảnh hưởng đến tác dụng ít, chủ yếu là độ tan.

Sự hấp thu trong cơ thể qua dạ dày, ruột non, tá tràng phụ thuộc vào số lượng nhóm OH
(i.e, tính ái dầu của phân tử). Phân tử càng ái dầu (càng ít nhóm OH) càng dễ hấp thu qua đường
tiêu hóa.

Trang 34
 Ví dụ: Digitoxin có 1 nhóm OH tự do nên có thể hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa, tái
hấp thu bởi thận, gan. Ouabain có 5 nhóm OH tự do trong phần aglycon nên khó hấp thu qua
đường tiêu hóa, phải tiêm tĩnh mạch và bị loại thải khỏi cơ thể nhanh.

III. TÍNH CHẤT

Là những chất kết tinh, không màu, vị đắng, có năng suất quay cực.
Tan trong nước, cồn, không tan trong benzene/ether.
Glycoside tim dễ bị thủy phân bởi các enzyme có sẵn trong cây để chuyển thành các
glycoside thứ cấp.
Vòng lacton 5/6 cạnh dễ bị mở vòng bởi tác dụng của kiềm tạo dẫn chất iso không có hoạt
tính.

IV. PHÂN BỐ

Phổ biến trong nhiều loại thực vật, có thể kể đến họ Trúc đào – Apocynaceae, họ Thiên lý
– Asclepiadaceae, Liliaceae – họ Hành, Meliaceae – họ Xoan, Euphorbiaceae – họ Thầu dầu,
Moraceae – họ Dâu tằm, Ranunculaceae – họ Hoàng liên…
Có mặt trong mọi bộ phận của cây: Lá, hoa, vỏ, thân, rễ, thân rễ, dò, nhựa mủ.



Trang 35
 PHẦN 2.2.2 – SAPONIN
Là glycoside lớn trong thực vật, có tính tạo bọt giống xà phòng (sapo) Gồm 2 nhóm:
Saponin triterpenoid (trung tính/acid) và saponin steroid (trung tính/kiềm), phần aglycon của
sapnonin còn được gọi là sapogenin

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là các hợp chất glycoside có nhân triterpenoid hoặc steroid, có đặc tính tạo bọt giống xà
phòng. Phần aglycon của saponin còn được gọi la sapogenin.
Theo nhân glycon, saponin được chia thành 2 loại: Saponin triterpenoid và Saponin steroid.
1. Saponin triterpenoid

Phần aglycol gồm 30C, cấu tạo từ 4 – 5 vòng. Phân thành 2 nhóm: pentacyclic và
hexacyclic.
1.1 Saponin triterpenoid pentacyclic

Có 4 dạng vòng thường gặp: 5 vòng 6C (olean, ursan) và 4 vòng 6C & 1 vòng 5C (lupan
và hopan).
a. Olean

Phần lớn các saponin

triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc
nhóm này, aglycon có 5 vòng và là
dẫn xuất của 𝛽-amyrin. Mạch đường
có thể nối vào C-3 theo liên kết
acetal hoặc nối vào C-28 theo liên
kết ester.
b. Ursan: Phần aglycon gồm 30C, có xuất phát từ dẫn xuất của 𝛼-amyrin.

Trang 36
 Loại này thường có: Cinchona Glycoside B trong cây canh-ki-na; asiaticosid trong rau má.
Tương tự, gốc đường có thể liên kết với O ở C-3 theo liên kết acetal và ở C-28 theo liên kết
ester.

c. Lupan

Cấu trúc cũng có 4 vòng nhưng vòng E là vòng 5 cạnh, thường có nối đôi ở vị trí C-20 –
29.
Ví dụ saponin có trong rễ cây Acanthus iliciformis.

Trang 37
d. Hopan:

Cấu trúc gần giống với lupan. Nhóm đường liên kết qua O ở C-3
Saponin đầu tiên được biết là mollugocin A trong cỏ thảm Mollugo hirta L.

1.2 Saponin triterpenoid tetracyclic

Có 3 nhóm chính: Dammaran; lanostan và cucurbitan

a. Dammaran: Aglycon gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh. Phần đường nối vào OH ở C số 3
hoặc thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh.

Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran.

Đại diện là saponin của nhân sâm, hạt táo, rau đắng biển.

Trang 38
b. Lanostan: Saponin có trong loài hải sâm (Holothurin A)

c. Cucurbitan: Gặp ở họ Cucurbitaceae

2. Saponin Steroid
Saponin steroid: Phần aglycol gồm 27C, trong đó có khung steroid thường gắn dị vòng O
hoặc N.
2.1 Nhóm spirostan

Ở dạng glycoside phần đường thường được nối vào C-3; số ít trường hợp gắn ở C-1. Mạch
đường thường phân nhánh, phức tạp

Nhóm spirotan được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các
thuốc steroid.
Trang 39
 2.2 Nhóm furostan: Vòng F bị biến đổi

Trường hợp 1: Vòng F mở, nhóm alcohol bậc 1 ở C-26 được nối với đường glucose. Nếu
glucose ở C-26 bị cắt thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn
chất nhóm spirostan.

Trường hợp 2: Vòng F 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy. Ví dụ như Avenacosid trong
yến mạch. Cũng có 2 mạch đường, thủy phân cắt đường glucose ở C-26 chuyển thành dẫn chất
nhóm spirostan.

2.3 Aminofuran: Vòng F mở, ở vị trí C-3 đính nhóm NH2

Trang 40
 2.4 Spirosolan: Khác spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F thay bằng NH

2.5 Solanidan:

3 nhóm: Aminofuran, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alkaloid vừa
mang tính glycoside nên gọi là glycoalkaloid. Ngoài ra còn 1 số cấu trúc mạch nhánh khác.

II. TÍNH CHẤT

Thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, trừ glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid
trong cam thảo dây, osladin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt. Khó tinh chế, điểm nóng
chảy cao, từ 200oC đến có thể hơn 300oC.
Trong trong nước, alcohol; ít tan trong acetone, ether, hexane. Do đó dùng 3 dung môi này
để tủa saponin
Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa
Có thể tạo phức với cholesterol và các 3-𝛽-hydroxylsteroid (sterol) khác và bị tủa bởi chì
acetate, barium hydroxide, ammonium sulfate, … và tính chất này thường được lợi dụng để cô
lập saponin.
Khó bị thẩm tích → Lợi dụng trong quá trình chiết xuất

Trang 41
 III. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

Làm vỡ hồng cầu ngay ở nồng độ rất loãng, độc với cá (làm tăng tính thấm của biểu mô
đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, có tác dụng diệt loài thân mềm như giun,
sán, ốc sên.
Kích ứng niêm mạch, gây hắt hơi,đỏ mắt; có tác dụng long đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn
mửa, đi lỏng.
Long đờm, chữa ho. Là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh,
cam thảo, thiên môn, mạch môn.
Có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn.
Có trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác.
Làm tăng sự thấm của tế bào, sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa
tan và hấp thu.
Một số kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus.

IV. PHÂN BỐ

Saponin Steroid thường gặp trong những cây 1 lá mầm. Các họ hay gặp là:
Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae. Đáng chú ý nhất la một số loài thuộc
chi Dioscorea L.; Agave L.; Yucca L.
Saponin Titerpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như:
Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyll-aceae, Fabaceae,
Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae.

Trong cây saponin thường tích lũy ở những bô phận khác nhau: tích lũy ở quả như bồ kết,
bồ hon; rễ rihư cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ, ...

Trang 42
V. CHIẾT XUẤT

Thẩm tích.
Dùng bột MgO hoặc bột polyamide để tách saponin (hòa với nước, trộn với nột rồi đun trên
nồi cách thủy 10 phút, thu được khối nhão rồi chiết bằng ethanol 80% nóng).
Sắc ký lọc gel bằng cột Sephadex.



Trang 43
 PHẦN 2.4 – HỢP CHẤT PHENOLIC

Chứa nhân thơm gắn với 1 hay nhiều nhóm OH, được chia thành 2 nhóm:
a. Flavonoid
b. Non-flavonoid: Lignin, Tannin, Quinone và Courmarin



Trang 44
 PHẦN 2.4.1 - FLAVONOID
Là pigment phenol thực vật, tạo màu cho rất nhiều rau, quả, hoa, … Phần lớn có màu vàng,
một số khác có màu xanh, tím, đỏ

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Khung cơ bản của flavonoid là 1,3-diphenylpropane, C6 – C3 – C6, gồm 2 vòng benzene

nối với nhau qua vòng 3C (thường nằm ở dạng dị vòng O).

Có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc dạng glycoside với các phân tử D-glucose, D-galactose,
L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và uronic acid.

II. PHÂN LOẠI

1. Các nhóm phân bố rộng rãi

Flavone (vàng chanh), flavonol và anthocyanidin (anthocyanin) phân bố rộng rãi trong tự
nhiên.

Flavonol: Thường xuất hiện ở dạng glycoside flavonol như rutin, quercitrin.

Trang 45
 Rutin: Có tác dụng tăng sức bền mao mạch, ngăn ngừa nguy cơ vỡ mạch máu, đột quỵ, xuất
huyết, có trong hoa hòe (Sophora japonica)
Quercitrin xuất hiện nhiều trong các loại quả họ citrus

Anthocyanin: Pigment thực vật quan trọng, tìm thấy nhiều nhất trong các tổ chức sinh sản,
tạo màu cho hoa, quả và có vai trò nhất định trong quá trình thụ phấn và phân tán.
Trong cây hầu hết nằm ở dạng glycoside, nằm trong dịch tế bào.
Nhân anthocyanidine được chia thành 3 loại, với từng gam màu khác nhau: Cyanidin từ đỏ
đến hồng; pelargonidin từ cam đến đỏ, delphinidin từ hồng đến tím

Malvidin 3-glucoside: Pigment đỏ trong quả nho tím và trong rượu vang
Cyanidin 3-glycoside: Pigment trong Hibiscus sabdariffa

Trang 46
 2. Các nhóm ít phổ biến

III. PHÂN BỐ

Nhóm chất phổ biến trong thực vật, hơn 1 nửa loại rau quả thường dùng và các loại dược
liệu chứa flavonoid.
Ít gặp trong thực vật bậc thấp. Ngành rêu chỉ phát hiện được ít chất; dương xỉ số lượng ít
nhưng có mặt đều các phân nhóm nhỏ. Ngành hạt trần cũng phát hiện không nhiều hợp chất
flavonoid.
Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín 2 lá mầm, lớp 1 lá mầm tìm thấy với tỉ lệ
thấp hơn (10/53 họ).
Hàm lượng và thành phần flavonoid phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc vùng nhiệt đới và
núi cao thì hàm lượng cây cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng.

IV. TÍNH CHẤT

- Flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu.

- Có khả năng tan trong dung dịch kiềm.
- Dễ bị biến tính bởi nhiệt.

V. VAI TRÒ

Vai trò đa dạng trong thực vật: sắc tố, chất kháng oxy hóa, bảo vệ cây chống tia UV, sự tấn
công tác nhân gây bệnh, động vật, côn trùng, điều hòa sinh trưởng, …

Trang 47
Có hoạt tính lớn, là dược liệu với vai trò:

• Dập tắt gốc tự do như HO*, ROO*, tác nhân gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, lão
hóa, ...
• Tạo phức với ion kim loại và xúc tác ngăn cản phản ứng oxy hóa
• Bảo vệ màng tế bào, ngăn ngừa nguy cơ xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn
thương do bức xạ…
• Ức chế hoạt động của enzyme hyaluronidase, làm giảm tính thấm của mao mạch, bảo vệ
thành mạch duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức
năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch.
• Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan.
• Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu
trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu hiện lão suy,
rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt, …



Trang 48
 PHẦN 2.4.1 – NON-FLAVONOID: TANNIN

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC & PHÂN LOẠI

Obligomer polyphenol tan trong nước, có vị chát, có tính thuộc da (MW ~ 500 – 3000, có
khi lên đến 20000).
(Obligomer là phân tử được hình thành từ một số ít mắt xích liên kết với nhau, khác với
polymer được hình thành từ hàng nghìn mắt xích.)
Gồm 2 loại: True Tannins (Tannins có khối lượng phân tử lớn, gồm tannin ngưng tụ &
tannin thủy phân) & Pseudotanin (Tannins có khối lượng phân tử nhỏ).

1. Tannin ngưng tụ (Tannin không thủy phân)

Là tannin được ngưng tụ từ các đơn vị flavanol, flavan-3,4-diols hoặc catechin.

Flavanol Flavan-3,4-diol Catechin

Trang 49
 Tính chất:
- Tannin ngưng tụ khi tác dụng với enzyme hoặc acid vô cơ không bị thủy
phân mà sẽ tự polymer hóa hoặc phân hủy thành hợp chất có màu đỏ là
phlobaphenes, không tan trong nước, có màu đỏ nâu, được tìm thấy ở rất nhiều
dược liệu & cây cỏ.
- Khi chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp tannin ngưng tụ thu được catechol.
- Khi tác dụng với FeCl3 cho phức màu nâu lục.

Phân bố: Ở nhiều bộ phận của cây, thường gặp ở lá trà xanh, lá Hamamelis, cây canh-ki-
na, quế, vỏ cây anh đào dại, cây catechu đen, catechu nhạt, …

Lá Hamamelis Cây catechu đen

Trang 50
 2. Tannin thủy phân
Là ester của đường (thường là glucose) với một/nhiều nhóm gallic acid hoặc ellagic acid.

Gallic acid Ellagic acid Pyrogallol

Tính chất:

- Khi tác dụng với acids hoặc enzymes, tannins bị thủy phân, tạo thành các mắt xích ban
đầu (gallic acid, ellagic acid).
- Khi chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp, gallic acids và các cấu tử khác bị chuyển
thành pyrogallol.
- Khi tác dụng với dung dịch FeCl3, tannins thủy phân cho dung dịch màu xanh lam.
Phân bố: Có thể gặp ở một số thực vật như cây đại hoàng, đinh hương, hạt dẻ, cây sồi, vỏ
quả lựu, …

Trang 51
 3. Psedotannin
Nhóm các chất có cùng con đường chuyển hóa và cấu trúc tương tự tannin nhưng có khối
lượng phân tử nhỏ, khả năng thuộc da kém (được đề cập đến ở phần sau).
Có thể gặp một số chất như chlorogenic acid trong café, catechin trong ca cao, …

Catechin Chlorogenic acid

II. TÍNH CHẤT CHUNG

Có màu vàng nhạt đến đỏ nâu, không kết tinh, tồn tại ở trạng thái vô định hình vô định
hình phân bố rộng rãi ở thực vật.
Phân tán trong nước tạo hệ nhũ, có tính acid nhẹ, có vị chát. Tannin có mặt trong trà tạo
nên vị chát, màu và hương vị đặc trưng của trà.
Tan trong kiềm loãng, alcohol, glycerol và acetone nhưng tan rất ít trong các dung môi hữu
cơ khác.
Bị kết tủa bởi các ion kim loại nặng, alkaloids, glycosides và proteins (như gelatin).

III. ỨNG DỤNG

Đặc tính kết tủa với protein → Ứng dụng để làm thuốc cầm máu vết thương, bảo vệ bề mặt
bị viêm như viêm miệng và cổ họng.
Xử lý các vết bỏng, tạo một lớp mỏng kháng khuẩn bảo vệ lớn da bị thương bên dưới lớp
da mới đang hình thành.
Thuốc giải độc cho ngộ độc kim loại nặng, alkaloids, một số glycoside.
Có hoạt tính chống oxy hóa.
Ứng dụng đặc trưng của tannin là ứng dụng thuộc da (xử lý bề mặt da sống động vật làm
thay đổi vĩnh viễn cấu trúc protein của da, giúp da không bị thối rữa, bền, từ đó sản xuất các sản

Trang 52
phẩm từ da). Khả năng này của tannin đến từ khả năng phản ứng tạo kết tủa với các loại da sống,
protein đi từ da sống của động vật, từ đó khóa các nhóm hoạt tính trên bề mặt của protein.
Các nhóm OH của tannin liên kết với nhóm NH của protein bằng liên kết hydrogen hoặc
giữa các nhóm hydrocarbon bằng tương tác không phân cực tạo nên cấu trúc chất phức tạp. Do
tannin bền nên việc liên kết này làm giảm khả năng phân hủy của protein, từ đó giúp da bền hơn.
Vì vậy, tannin càng có nhiều nhóm OH, khả năng thuộc da càng tốt (thường MW > 500).
Pseudotannin có có khối lượng phân tử quá nhỏ, tạo thành từ ít mắt xích polyphenol nên có ít
nhóm OH, do đó không đủ khả năng thuộc da.

Trong công nghiệp: Nhuộm, sợi, hồ dán, dầu, tác nhân tạo hương, thuốc, nước hoa, …



Trang 53
 PHẦN 2.4.2 – NON-FLAVONOID: LIGNIN
Là polymer phong phú thứ 2 thế giới sau cellulose.

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là polymer dị thể có cấu trúc phức tạp, tạo từ 3 monomer chính (phenyl propanoid alcohol,
p-Courmaryl alcohol và các dẫn xuất methoxy hóa), độ phân nhánh cao, thường xảy ra ở các liên kết
giữa các monomer.

Trang 54
II. PHÂN BỐ & VAI TRÒ

Xuất hiện ở lớp thành thứ cấp của tế bào. (Tế bào thực vật đều chứa lớp màng sơ cấp, nhưng
không phải tế bào nào cũng có thành thứ cấp, thành thứ cấp thường gặp ở các tế bào không nhân
lên phát triển nữa, chủ yếu xuất hiện ở mô ống, mô gỗ của thực vật.)

a Màng sơ cấp d Lignin

b Màng thứ cấp e Hemicellulose
c Màng plasma f Cellulose

Hàm lượng có thể chiếm tới 35 wt.% vật liệu khô, có vai trò:

- Ngăn sự hấp thu nước của polysaccharide trong thành tế bào, cho phép vận chuyển
nước tốt hơn
- Cấu trúc vô định hình tạo mạng lưới 3 chiều kết nối với polysaccharide ở thành thứ cấp
→ Tăng độ cứng và độ bền của thành tế bào
- Tạo hàng ràng chống lại côn trùng và nấm

Tuy nhiên, trong công nghiệp sử dụng bột gỗ sản xuất giấy → Công đoạn tách lignin ra
khỏi cellulose là khó nhất vì đây là cấu trúc rất phức tạp, không hòa tan bằng dung môi thông
thường.



Trang 55
 PHẦN 2.4.3 – NON-FLAVONOID: QUINONE

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là nhóm hợp chất chứa nhân quinone. Gồm 3 loại: Benzoquinone, Napthoquinone,
Anthraquinone.

Benzoquinone Napthoquinone Anthraquinone

Trong đó: Anthraquinone là nhóm phổ biến và có nhiều ứng dụng quan trọng với con
người.

II. VAI TRÒ CHUNG VỚI THỰC VẬT

Nhóm có màu trong thực vật, gam màu rộng nhưng chủ yếu phân bố bên phần trong của
thực vật, không tạo thấy màu sắc thường thấy ở ngoài.
Vai trò trong quá trình hô hấp của thực vật, vận chuyển điện tử tạo ra cặp oxy hóa khử
quinone và hydroquinone.

III. ANTHRAQUINONE

Anthraquinone chia làm 2 nhóm: Nhóm phẩm nhuộm và nhóm nhuận tẩy

1. Nhóm phẩm nhuộm

Có gam màu đỏ, cam, … được sử dụng trong công nghiệp phẩm nhuộm, tạo màu cho thực
phẩm, nước, …
Ví dụ: Carminic Acid & Karmesic acid là chất màu được sử dụng rộng rãi trong thực
phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, … nhưng không xuất phát từ thực vật mà trích từ rệp son ký sinh
trên các cây xương rồng (Carminic acid), từ loài Laccifer lacca Kerr (Karmesic acid).

Trang 56
 Ví dụ: Một số hợp chất như alzarin được trích từ rễ cây Rubia tinctorum được dùng làm
thuốc nhuộm màu đỏ cho da, len, cotton và tơ tằm. Một số hợp chất khác như purpurin,
quinizarin, … cũng được trích từ rễ cây.

2. Nhóm nhuận tẩy

Là nhóm anthraquinone có tác dụng tẩy xổ, nhuận tràng. Cấu trúc của nhóm nhuận tẩy có
gắn OH ở vị trí C1, C8, có gắn ở C3 các nhóm như CH2OH, CHO, COOH, ...

Aloe emodin

Trang 57
 PHẦN 2.4.4 – NON-FLAVONOID: COURMARINE

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là nhóm chất chứa cấu trúc benzo-𝛼-pyrone.

benzo-𝛼-pyrone

II. PHÂN BỐ & VAI TRÒ

Khoảng hơn 1300 courmarin đã được xác định

Hầu hết có tác dạng chống cho thắt, giãn nở động mạch vành, chống đông máu
Một số có tác động kháng khuẩn, kháng viêm, như calophylloid từ dầu mù u có tác dụng
chống viêm, chống đông máu.
Lưu ý: Tuy courmarine không có nhóm phenol nhưng vẫn được xếp vào hợp chất phenolic
vì đi chung con đường sinh tổng hợp với các phenolic khác.



Trang 58
 PHẦN 2.5 – GLUCOSINOLATE

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là nhóm hợp chất trong cấu trúc chứa nitrogen và sulfur, một số glucosinate có chứa nhóm
thioglucoside.

II. PHÂN BỐ & VAI TRÒ

- Phân bố tương đối giới hạn trong thực vật, chủ yếu là các loại cây họ cải, có hơn 100
cấu trúc đã được xác định.
- Xuất hiện chủ yếu trong bộ Capparales (Bạch hoa), họ Cruciferae (cải), Resedaceae,
Capparaceae (như mù tạc trắng), cải bẹ xanh, radish (củ cải), cress (cải xoong),
cabbages (bắp cải) brussel sprouts, cauliflower (súp lơ), broccoli (bông cải xanh), kale
(cải xoăn).
- Tạo vị cay nồng, tham gia vào chức năng phòng vệ cho cây
- Thường được sử dụng trong thực phẩm để tạo vị như mù tạt, một số glucosinolate có
tác dụng với sức khỏe con người.



Trang 59
 PHẦN 2.6 – ALKALOID

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là hợp chất hữu cơ chứa N, đa số ở dạng dị vòng, có phản ứng kiềm (alkaline), có phản
ứng đặc trưng với một số thuốc thử alkaloid. Tên gọi thường có đuôi “ine”.

Colchicine Morphine Chloroquine

Lưu ý: Cấu trúc alkaloid rất đa dạng, không có đặc điểm chung. Để xác định một hợp chất
chứa N là alkaloid, trước hết cần loại trừ xem hợp chất đã thuộc về nhóm sản phẩm chuyển hóa
chứa N nào hay chưa (như chlorophyll, betalain, …). Nếu chưa, sử dụng thuốc thử alkaloid, nếu
cho phản ứng dương tính với thuốc thử thì hợp chất đó mới là alkaloid.

II. THUỐC THỬ ALKALOID

1. Thuốc thử kết tủa

Có 2 nhóm: Nhóm 1 (tạo tủa ít tan trong nước) & Nhóm 2 (Tạo tủa tinh thể)
Nhóm 1: Do sự kết hợp giữa cation alkaloid và anion lớn phức hợp nhiều thuốc thử
- Thuốc thử Mayer (K2HgI4): Tủa trắng, vàng nhạt
- Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu
Nhóm 2: Cho tủa dạng tinh thể như thuốc thử chloride vàng, nước bão hòa picric acid, …

Trang 60
 2. Thuốc thử tạo màu
Nguyên tắc: Cho màu đặc biệt khác nhau, mỗi màu tương ứng với một loại alkaloid.
Thuốc thử tạo màu thường là hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ trong acid H2SO4 đậm đặc.

III. PHÂN BỐ

Phổ biến trong thực vật, hầu hết ở thực vật bậc cao tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ
Trúc đào), Papaveraceae (họ Thuốc phiện), Fabaceae (họ Đậu), Rutaceae (họ Cam), Liliaceae
(họ Hành), Solanaceae (họ Cà), Amaryllideceae (họ Thủy tiên), Rubiaceae (họ Cà phê),
Loganiaceae (họ M. tiền). Số ít phân bố trong động vật như Samandaridin, Bufotenin, ...
Tập trung ở một số bộ phận nhất định như: hạt (m. tiền, cà phê, tỏi độc, ...), quả (ớt, hồ tiêu,
...) lá (thuốc lá, chè, coca, ...), hoa (cà độc dược, ...), thân (ma hoàng, ...), vỏ, rễ , củ (bình vôi,
...), …
Thường là hỗn hợp nhiều alkaloid, akaloid trong cùng một cây có cấu tạo tương tự nhau
(chung nhân cơ bản).
Hàm lượng trong cây thường rất thấp, trừ cây canhkina (6 – 10%), nhựa thuốc phiện (20 –
30%). Dược liệu chứa 1 – 3% alkaloid được coi là khá cao
Hàm lượng phụ thuộc nhiều yếu tố: khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón,giống cây, bộ
phận và thời kỳ thu hái.
Ít khi ở trạng thái tự do (akaloid base mà ở dạng muối của acid hữu cơ như citral, tactat,
oxalat, acetate (đôi khi ở dạng muối vô cơ) tan trong dịch tế bào
Một số cây kết hợp với tannin hoặc acid đặc biệt chính cây đó như meconic acid trong cây
thuốc phiện, acid tropic trong cây họ cà; một số ít kết hợp với đường tạo ra glycoalkaloid như
solasonin.

IV. TÍNH CHẤT

1. Tính chất vật lý

Ở nhiệt phòng, alkaloid có chứa oxygen thường là thể rắn, không có oxy thường ở thể lỏng.
Vẫn có số ít trường hợp ngoại lệ.
Alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được, có điểm nóng chảy xác định; một số bị phá hủy
trước điểm nóng chảy.
Alkaloid ở thể lỏng bay hơi được, thường bền không bị phá hủy ở nhiệt độ sôi nên có thể
dùng hơi nước để lôi kéo.

Trang 61
 Mùi vị: Đa số không mùi, có vị đắng, một số vị cay như capsicine, piperin
Màu sắc: Hầu hết không màu, trừ 1 số màu vàng như becberin, palmatin, chelidonin, …

2. Tính chất hóa học

Độ tan:

- Alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol,
ethanol, ether, chlorofom, benzene, …
- Các muối dễ tan trong nước, hầu như không tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực.
- Một số alkaloid có nhóm phenol tan được trong dung dịch kiềm.
Tính base yếu, một số không có phản ứng kiềm và có thể có phản ứng acid yếu
Có thể giải phóng khỏi muối bằng kiềm trung tính và mạnh như NH4OH, MgO, kiềm
carbonate, NaOH, …
Kết hợp với kim loại nặng tạo muối phức (Hg, Bi, Pt).

3. Dược tính
Thường có dược tính mạnh, phần lớn có độc tính (tác động lên hệ thần kinh như ma túy,
gây nghiện, giảm đau, …).

V. CHIẾT XUẤT

- Base yếu, tồn tại dạng muối acid hữu cơ, hoặc vô cơ, tannin: Phân tán nhỏ nguyên liệu
thô, giải phóng ra khỏi muối bằng kiềm trung tính hoặc kiềm mạnh.
- Akaloide bay hơi: Chưng cất lôi cuốn hơi nước sau khi lấy alkaloid ra khỏi dạng muối.
- Alkaloid không bay hơi: Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm, dung
dịch acid loãng trong cồn/nước hoặc chiết bằng cồn.



Trang 62
 PHẦN 2.6 – CHLOROPHYLL
Pigment phổ biến nhất trong tự nhiên

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Tạo bởi vòng Porphyrinogens có nhân Magnesium.

II. PHÂN BỐ & VAI TRÒ

- Có mặt trong các tổ chức quang hợp: thực vật, tảo, dương xỉ, rêu, một số vi khuẩn có
chức năng quang hợp.
- Đóng vai trò chính yếu và trung tâm của quá trình quang tổng hợp, chức năng chính là
hấp thu ánh sáng, chuyển năng lượng ánh sáng tới trung tâm phản ứng để thực hiện sự
chuyển hóa CO2 và nước thành carbohydrate, giải phóng oxygen.



Trang 63
 PHẦN 2.6 – BETALAIN
Pigment phổ biến nhất trong tự nhiên

I. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC

Là pigment dị vòng nitrogen, dẫn xuất immonium của betalamic acid, ở dạng glycoside.
Có 2 nhóm chính betacyanin (đỏ – tím) và betaxanthin (vàng – cam).

II. PHÂN BỐ & VAI TRÒ

Betalain là pigment phân bố giới hạn ở những thực vật bậc cao thuộc bộ Cẩm chướng
(Caryophyllales), phân bố trong các “không bào” (vacuole).
Betalain và Anthocyanin thay thế lẫn nhau ở chức năng trong mô thực vật như thu hút côn
trùng thụ phấn, chất kháng oxy hóa, màng chắn tia UV, …



Trang 64
 PHẦN B – CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỰ NHIÊN

I. MỤC TIÊU

• Phân lập hợp chất chưa biết → Nhận danh, xác định cấu trúc → Sử dụng kết quả làm cơ
sở dữ liệu, cung cấp thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học, độc tính của loại
thực vật đó
• Phân lập hợp chất đã biết cấu trúc → Đánh giá hàm lượng, thành phần, sự phân bố trong
thực vật cùng họ, cùng loài, đánh giá hoạt tính sinh học
• Phân lập 1 nhóm chất từ thực vật → Phục vụ nghiên cứu hoạt tính, ứng dụng (phối chế
trong thực phẩm, dược phẩm)

II. ẢNH HƯỞNG CỦA MỤC TIÊU LÊN YÊU CẦU CỦA QUY TRÌNH PHÂN LẬP

2.1 Hàm lượng sản phẩm

Nhận danh, xác định cấu trúc → Chạy phổ NMR 1 chiều, 2 chiều, … → Độ tinh khiết từ
95% trở lên, khối lượng hợp chất tinh khiết cần khoảng 20 mg → Khó, đặc biệt với các chất có
hàm lượng ít trong thực vật, quy trình phân lập cực kỳ phức tạp để đạt độ tinh khiết cao.
Phân lập 1 nhóm chất → Không cần phân lập từng chất riêng biệt, yêu cầu độ tinh khiết
thấp và dễ phân lập hơn.
Đánh giá hoạt tính → Yêu cầu về hàm lượng khác nhau, tùy theo hoạt tính đánh giá.

2.2 Độ phức tạp

Hợp chất đã biết → Có hiểu biết sơ bộ về tính chất vật lý, hóa học và một số phương pháp
phân lập có thể sử dụng → Đơn giản hơn
Hợp chất chưa biết cấu trúc → Quy trình phân lập phức tạp do không có định hướng, cần
phải thực hiện các thuốc thử trước để định tính nhóm hợp chất rồi từ đó thử từng phương pháp
khác nhau

Trang 65
 III. QUY TRÌNH CHUNG

Bước 1: Trích ly với dung môi hữu cơ để lấy hợp chất ra khỏi nguyên liệu ban đầu
Bước 2: Sàng lọc về nhóm chất (Sơ bộ hóa thực vật): Dùng phương pháp định tính (so màu,
kết tủa, phản ứng đặc trưng) để xác định hợp chất đó thuộc nhóm sản phẩm bậc 2 nào
Bước 3: Dựa trên các kiến thức về sơ bộ hóa thực vật, sử dụng phương pháp tiền phân lập
(chiết lỏng – lỏng, hấp phụ, chiết pha rắn) để loại bỏ cấu tử nhiễu, lấy ra phân đoạn có chất cần
tách và một số tạp chất có tính chất gần tương tự để đưa vào bước sắc ký
Bước 4: Phân lập bằng sắc ký để tách chất cần tách ra khỏi các chất đi kèm, tăng độ tinh
khiết của chất để đạt đủ yêu cầu
Bước 5: Từ sản phẩm phân lập xác định cấu trúc, định danh, đánh giá hoạt tính sinh học.



Trang 66
 Phaàn I
Trích ly

Trang 67
 PHẦN 1.1 – ĐẠI CƯƠNG VỀ TRÍCH LY

I. VỊ TRÍ & VAI TRÒ TRONG QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT TỪ SPTN

Là bước đầu tiên trong quy trình phân lập, dùng để tách hợp chất cần thiết cùng với các
chất khác (tạp chất) khỏi matrix (mạng lưới chất rắn) của nguyên liệu thô.
Sản phẩm là cao chiết có thành phần chính chỉ gồm hỗn hợp các chất có trong nguyên
liệu, dùng để tiếp tục tách ra trong các bước tiếp theo.
Vai trò: Do trong thực vật có chứa rất nhiều các cấu tử có tính chất trải rộng từ kém phân
cực đến phân cực, ở mỗi độ phân cực lại có nhiều nhóm chất có tính chất hóa lý rất gần nhau nên
rất khó để lấy ngay được hợp chất cần thiết. Vì vậy ở bước đầu tiên chỉ cần tách tất cả các hợp
chất này ra khỏi matrix nguyên liệu, thu được hỗn hợp các chất để tiếp tục tách trong các bước
tiếp theo.

II. ĐẠI CƯƠNG VỀ QUÁ TRÌNH TRÍCH LY

1. Khái niệm
Trích ly (chiết) nói chung là quá trình chuyển khối pha này sang pha kia dựa trên sự khác
biệt về khả năng phân bố của chất trong 2 pha.
Trong quy trình phân lập, trích ly là quá trình chuyển các hoạt chất cần thiết từ matrix
nguyên liệu vào dung môi.

2. Cơ chế trích ly: 5 giai đoạn

Trang 68
 - Giai đoạn 1: Dung môi tiếp xúc đến bề mặt vật liệu
- Giai đoạn 2: Dung môi khuếch tán vào trong mạng vật liệu dựa trên khuếch tán phân
tử, xâm nhập vào các mao quản rồi thẩm thấu vào bên trong màng tế bào thực vật để
vào bên trong cấu trúc tế bào
- Giai đoạn 3: Khi tiếp cận được vị trí của hoạt chất, lúc này xảy ra sự cắt đứt liên kết
giữa hoạt chất và mạng nguyên liệu bằng các liên kết mạnh hơn (liên kết vật lý, phân
tử, hấp phụ) giữa phân tử dung môi và hoạt chất. Sau khi cắt đứt khỏi mạng nguyên
liệu, hoạt chất hòa tan vào pha dung môi.
- Giai đoạn 4: Dung môi chứa chất tan khuếch tán ngược trở lại bề mặt vật liệu, cũng
dựa vào khuếch tán phân tử và thẩm thấu ngược trở lại bề mặt.
- Giai đoạn 5: Dung môi chứa chất tan chuyển từ bề mặt → Môi trường
Trong các giai đoạn trên: Giai đoạn 2, 3, 4 là giai đoạn xảy ra chậm, ảnh hưởng chính đến
thời gian và hiệu quả trích ly → Để tối ưu hóa quá trình trích ly cần tối ưu hóa các giai đoạn này.

III. LỰA CHỌN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY

• Chất cần tách: Dựa vào tài liệu tham khảo để xác định chất đó thuộc nhóm sản phẩm
chuyển hóa nào (độ phân cực, tính chất hóa lý, ...)
• Mạng nguyên liệu: Chất nằm ở vị trí nào (ở ngoài, trên các mao quản, trong mao quản
hoặc trong tế bào) hoặc nằm trong túi tinh dầu ở vỏ quả, hoa, cành, lá, ... (tinh dầu cam
chanh quýt ở vỏ; chất béo trong các loại hạt có vỏ rất cứng, ...). Mạng nguyên liệu đó có
thể có chất nào xung quanh ảnh hưởng đến quá trình trích ly.

IV. MỘT SỐ DUNG MÔI TRUYỀN THỐNG TRONG TRÍCH LY

Trang 69
 • Lưu ý: Petroleum ether (ether dầu hỏa, xăng dung môi) không phải là ether (không có
nhóm ROR’ trong phân tử), là hỗn hợp các hydrocarbon no từ 5 → 7C, từ pentane tới
heptane, xuất phát từ các phân đoạn chưng cất dầu mỏ

• Phân loại giới hạn sử dụng dung môi theo độc tính (FDA):
Nhóm 1: Dung môi có độ độc cao, chỉ dùng trong mục đích phân tích, không được sử dụng
trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm
Gồm: Benzene, Carbon Tetrachloride, 1,2-dicloroethane, 1,1,1-trichloroethane

Nhóm 2: Dung môi có độ độc tương đối, giới hạn sử dụng trong dược phẩm, thực phẩm;
hàm lượng vết cho phép từ 50 – 3880 ppm tùy dung môi
Gồm: Acetonitrile, chlorofom, hexane, methanol, toluene, methyl ethyl ketone,
dichloromethane, cyclohexane

Nhóm 3: Dung môi có độc tính thấp, có thể sử dụng trong công nghiệp dược phẩm
Gồm: Acetone, ethanol, ethyl acetate, propyl acetate, acetic acid, 1-propanol, 2-propanol

• Lưu ý: Với ethanol

Có 4 loại cồn cơ bản trong ngành Hóa, chất lượng và giá tăng dần theo các loại
1. Cồn công nghiệp: Chứa từ 15 - 20% methanol, rất độc hại và rất hôi → Tuyệt đối không
sử dụng để trích ly mùi hương dược liệu, pha mùi hương, pha sản phẩm nước xịt phòng,
nước rửa tay
2. Cồn mỹ phẩm: Chỉ dùng ngoài da, không có mùi hôi (cồn Denatured Alcohol: Không
có mùi hôi thông thường hay dùng, dùng trong nước hoa)
3. Cồn chất lượng thực phẩm
4. Cồn chất lượng dược phẩm



Trang 70
 PHẦN 1.2 – KỸ THUẬT TRÍCH LY RẮN – LỎNG TRUYỀN THỐNG

I. NGÂM VỚI DUNG MÔI

1. Nguyên tắc chung: Nguyên liệu ngâm trong dung môi chiết trong nhiều giờ, ngày; có
thể kết hợp gia nhiệt và khuấy trộn. Kết thúc khi đạt cân bằng nồng độ hoạt chất trong
dịch chiết và trong nguyên liệu.

2. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá

Ưu điểm: Dễ thực hiện, dễ áp dụng linh hoạt ở nhiều nơi khác nhau
Nhược điểm: Nhiều thời gian, tốn dung môi (do không khuấy trộn, tất cả vật liệu và chất
lỏng thường đứng yên) → Tốn công tách dung môi → Ảnh hưởng độ bền sản phẩm
⇒ Hiệu quả không cao khi triển khai hiệu quả công nghiệp
Phạm vi ứng dụng: Ít sử dụng ở quy mô công nghiệp, chủ yếu ở quy mô nhỏ.

3. Kỹ thuật thực hiện: 4 kỹ thuật chính

a) Infusion: Trích ly bằng nước nóng hoặc EtOH & nước. Nguyên liệu thô được ngâm
trong trong nước sôi hoặc đun sôi nhẹ với nước ấm trong 1 thời gian.
Ví dụ: Hãm trà, pha trà túi lọc
b) Decoction: Nguyên liệu thô được cắt nhỏ rồi ngâm trong nước sôi. Sau đó đun nóng
nhẹ với lửa nhỏ liền nhiều giờ đồng hồ. Kỹ thuật bao gồm cả 2 quá trình cùng lúc: Trích
ly và cô đặc. Sau khi kết thúc quá trình, bã được lọc ra để lấy phần nước lọc.
Ví dụ: Sắc thuốc
c) Maceration: Nguyên liệu thô được nghiền nát rồi cho vào hũ. Dung môi cần trích
(rượu, hexane) được cho vào cùng nguyên liệu. Đậy nắp giữ hệ kín rồi để 1 thời gian
(từ 1 đến 3 ngày), có thể kết hợp khuấy nhẹ. Cuối cùng lọc nguyên liệu lấy dịch lọc rồi
làm bay hơi dung môi để thu được hoạt chất.
• Lưu ý:
- Thời gian ngâm càng lâu, các hoạt chất được trích ra môi trường lỏng càng dễ
bị biến tính.
- Trong các quá trình ngâm rượu trên thực tế, nguyên liệu thô được giữ nguyên,
không nghiền hoặc cát lát (như ngâm rượu nhân sâm) chủ yếu là do lý do thẩm
mỹ, không có ý nghĩa trong hiệu suất trích ly.

Trang 71
 d) Percolation

Sử dụng phễu bằng thủy tinh. Lớp nguyên liệu thô được nghiền và nằm giữa 1 lớp bông
thủy tinh (glass wool) hoặc bông gòn (cotton) ở đáy và 1 lớp bông gòn/giấy lọc và lớp cát ở trên.
Dung môi sẽ được đổ ngập ở trên lớp cát này và được châm vào liên tục.
Dung môi sẽ chảy từ từ xuống dưới theo tác dụng của trọng lực, thấm ướt vật liệu và lôi
kéo các hoạt chất ra khỏi pha dung môi. Sau đó, mở van hứng dịch, không cần qua bước lọc và
đem bay hơi dung môi
• Lưu ý
- Mục đích của lớp giấy lọc ở trên: Nguyên liệu khô được nghiền thành bột nên
mịn, nếu đổ dung môi lên, do khối lượng riêng thấp nên bột sẽ nổi lên bề mặt
dung môi. Do vậy, cần 1 lớp phủ lên trên để đè lớp bột này.

II. TRÍCH SOXHLET

1. Nguyên tắc chung

Bình cầu chứa dung môi được đun nóng liên tục. Hơi dung môi đi lên gặp ống sinh hàn và
ngưng tụ lại và chảy xuống buồng chiết. Tại buồng chiết, nguyên liệu thô được gói trong túi lọc.
Dung môi trong buồng chiết trích hoạt chất từ dung môi này.
Khi dung môi chiết đạt đủ độ cao, dung môi sẽ chảy qua ống syphon và chảy xuống bình
cầu chứa dung môi trở lại. Quá trình lặp lại tuần hoàn đến khi dung môi trích kiệt dung môi trong
nguyên liệu thô.

Trang 72
 2. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá
Ưu điểm:
• Dung môi làm mới thường xuyên trong quá trình trích ly → Tăng tốc độ truyền khối →
Tiết kiệm dung môi, có thể trích kiệt hoạt chất
• Không cần lọc sau chiết
Nhược điểm:
• Thời gian chiết dài (thường 8h trở lên) → Tốn kém năng lượng và thời gian
• Không thể khuấy trộn
• Không thích hợp với những hợp chất kém bền nhiệt (do Soxhlet luôn cần gia nhiệt ở nhiệt
độ sôi dung môi)
• Cơ cấu phức tạp khi triển khai trên quy mô lớn
Phạm vi ứng dụng:
Là phương pháp tham chiếu, dựa trên hiệu quả trích kiệt (lấy tối đa hoạt chất của trích
Soxhlet), đánh giá khả năng trích ly của 1 phương pháp trích ly mới.
Được sử dụng phương pháp tham chiếu do thiết bị dụng cụ đơn giản, rẻ tiền, mọi PTN có
thể trang bị được, linh độ, dễ sử dụng
Thông thường kết hợp với vi sóng & siêu âm để tăng tốc độ quá trình chuyển khối

Trang 73
 III. CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC

1. Nguyên tắc chung

Hơi nước đi xuyên qua lớp vật liệu và lôi theo các cấu tử dễ bay hơi đi vào bộ phận ngưng
tụ và thu được hỗn hợp tách lớp tinh dầu trong nước hoặc hệ phân tán nhũ dầu trong nước.
Lưu ý: Giai đoạn thu tinh dầu
• 1 số tinh dầu độ tan tốt trong nước → Dễ bị nhũ hóa và khó tách tinh dầu ra khỏi nước
• Khối lượng riêng tinh dầu gần khối lượng riêng của nước
→ Thêm muối tăng tỷ trọng của nước giúp quá trình phân lớp tốt hơn hoặc sử dụng dung
môi chiết.

2. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá

Phạm vi ứng dụng: Trích tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi; phù hợp với các chất
không tan lẫn vào nước và không phản ứng với nước.
Ưu điểm:
- Xanh: Không sử dụng dung môi hữu cơ
- Thiết bị rẻ tiền, dễ tìm, dễ triển khai quy mô lớn
- Trích được tinh dầu ở nhiệt độ dưới 100oC → Hạn chế sự phân hủy của tinh dầu
Nhược điểm

- Không phù hợp các chất dễ bị thủy phân (như ester)

- Thời gian trích dài (thường 1 – 5h) → Tốn kém năng lượng và thời gian
- Nếu tạo thành hệ phân tán dầu trong nước thì cần thêm bước chiết và cô quay đuổi dung
môi, tốn thêm dung môi và năng lượng
3. Kỹ thuật thực hiện
Có 3 kỹ thuật chính thực hiện phương pháp:
Trực tiếp (Hydrodistillation): Nước và nguyên liệu được cho vào chung 1 buồng và tiếp
xúc trực tiếp với nhau
Cách thủy (Direct Steam Distillation): Nước và nguyên liệu được cho vào 2 buồng khác
nhau, nguyên liệu phía trên, nước phía dưới
Gián tiếp (Dry Steam Distillation): Nguyên liệu và nước ở hai thiết bị khác nhau

Trang 74
 PHƯƠNG PHÁP TRỰC TIẾP
- Ưu điểm:
• Tốn ít thiết bị hơi → Tiết kiệm diện tích và chi phí
• Nước tiếp xúc trực tiếp với nguyên liệu nên dễ dàng lôi kéo các cấu tử và đi qua lớp
nguyên liệu, không cần hơi nước áp suất cao
• Có thể lắp đặt các hệ thống phân tích trên đầu ra của quá trình do áp suất hơi đi lên
vẫn còn đủ cao, dễ di chuyển sang các thiết bị tiếp theo
- Nhược điểm:
• Khó kiểm soát lưu lượng hơn
• Nguồn nhiệt tiếp xúc với gần nguyên liệu nên ảnh hưởng lên các hợp chất kém bền
nhiệt và dễ bị cháy khét (đặc biệt ở đáy thiết bị và hai bên thành thiết bị)

PHƯƠNG PHÁP CÁCH THỦY

- Ưu điểm:
• Tốn ít thiết bị hơn → Tiết kiệm diện tích và chi phí.
- Nhược điểm:
• Khó kiểm soát lưu lượng hơn
• Nguồn nhiệt tiếp xúc với gần nguyên liệu nên ảnh hưởng lên các hợp chất kém bền
nhiệt và dễ bị cháy khét (đặc biệt ở đáy thiết bị và hai bên thành thiết bị).
• Hơi nước đi qua lớp vật liệu bị cản trở áp suất mạnh nên cần nhiều thời gian, hơi nước
ra áp suất thấp nên không sử dụng chung với các thiết bị phân tích trên đầu ra của quá
trình do không đủ động lực di chuyển tiếp.
Trang 75
 PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP
- Ưu điểm:
• Dễ kiểm soát lưu lượng hơi
• Các chất không tiếp xúc trực tiếp với nguồn nhiệt nên ít bị phân hủy hơn
- Nhược điểm:
• Hơi nước đi qua lớp vật liệu bị cản trở áp suất mạnh nên cần nhiều thời gian, hơi nước
ra áp suất thấp nên không sử dụng chung với các thiết bị phân tích trên đầu ra của quá
trình do không đủ động lực di chuyển tiếp.

IV. YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG KỸ THUẬT TRÍCH LY RẮN & LỎNG TRUYỀN THỐNG
1. Nguyên liệu
a) Độ trưởng thành
Mỗi thực vật trong mỗi giai đoạn sinh trưởng khác nhau có hàm lượng hoạt chất khác nhau.
Ví dụ: Khi trích ly tinh dầu bạc hà, nếu bạc hà ra hoa rộ, tinh dầu chứa nhiều menthol, chất
lượng cao; nếu trích ly từ lá thu hoạch lúc bạc hà chưa ra hoa, tinh dầu ngoài menthol với hàm
lượng ít hơn, còn có một phần đáng kể menthone gây mùi khó chịu, giảm chất lượng tinh dầu.
b) Kích thước nguyên liệu
Tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, giảm quãng đường dung môi khuếch tán nên tăng hiệu suất
trích ly, giảm thời gian trích ly nhưng không phải lúc nào cũng nên nghiền nguyên liệu.
Ưu điểm:
- Hiệu quả tốt hơn (thời gian ngắn hơn) do rút ngắn quãng đường dung môi phải đi
- Tăng bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi
Nhược điểm:
- Khi xay quá nhuyễn:
• Hỗn hợp rắn được lèn chặt, độ xốp thấp, trở lực cao → Dung môi khó xâm nhập, tăng thời
gian trích ly, tăng năng lượng tiêu tốn
• Quá trình lọc khó khăn do kích thước hạt nhỏ → Cần có dụng cụ lọc chuyên dụng nếu
không trong dịch lọc sẽ còn cặn
• Gây phá vỡ tế bào, giải phóng luôn cả những thành phần không có lợi như: Enzyme (phân
hủy hoạt chất), Tinh bột (trong dung môi trương nở tạo thành hỗn hợp nhão, bọc luôn cả
vật liệu làm hoạt chất không phải đi ra ngoài, dung môi không thể tiếp xúc, không thể lọc
được)

Trang 76
 c) Độ ẩm
Trích tươi (ẩm 60 – 80% tùy nguyên liệu) và trích khô khác nhau ở hàm lượng nước → Độ
phân cực dung môi ảnh hưởng bởi lượng nước trong nguyên liệu do nước sẽ hòa tan làm thay
đổi độ phân cực dung môi.

d) Độ đồng nhất, độ xốp

Độ xốp: Càng xốp dung môi càng dễ đi qua vật liệu và xâm
nhập vào cấu trúc
Độ đồng nhất: Nếu hệ nguyên liệu không đồng nhất, chỗ
lèn chặt, chỗ độ xốp cao, do chất lỏng có xu hướng chảy theo
đường gặp ít trở lực nhất → Dung môi đi qua không đều khối vật
liệu, các vị trí được lèn chặt sẽ không tiếp xúc với dung môi →
Lượng hoạt chất trích giảm, lượng dung môi sử dụng không được
sử dụng hiệu quả

2. Chất cần tách

Hợp chất Độ phân cực Dung môi

Ether dầu hỏa, hexane,

Terpenoid, Steroid Thấp
diethyl ether, chlorofom

Glycoside
Nước, ethanol, methanol
(Cardiac Glycoside, Saponin)

Nước, ethanol, alcohol,

Flavonoid, Tannin,
glycerol, dung dịch kiềm loãng
Cao
Lignin Dung môi hữu cơ đặc biệt

Methanol, ethanol, ether,

Alkaloid
chlorofom, benzene

Muối của alkaloid Nước

Trang 77
 • Tính Acid/Base: Sử dụng hỗ trợ cho quá trình trích ly
Ví dụ: Acid hóa alkaloid để chuyển thành dạng muối tan trong nước → Chiết lỏng lỏng,
hợp chất phenolic có nhóm OH phenol, sử dụng dung dịch kiềm loãng để chuyển thành dạng
muối phenolat, tăng độ tan trong nước.

• Độ bền nhiệt: Các chất kém bền nhiệt hạn chế trích ly ở điều kiện nhiệt độ cao
• Ánh sáng: Các hợp chất nhạy ánh sáng khi phơi khô phơi trong mát, tránh ánh sáng
trực tiếp vào quá trình trích ly
• Thể rắn/Lỏng: Các chất có trạng thái kết tinh có thể sử dụng phương pháp kết tinh
lại để tăng độ tinh khiết
• Đặc tính đặc biệt của hoạt chất: Tạo tủa với các ion kim loại nặng, các nhóm chất khác
→ Sử dụng để tách riêng nhóm chất đó ra khỏi các nhóm chất chung rồi giải phóng ra sau
hoặc cẩn thận khi trích ly vì có thể biến tính nhóm chất.
Ví dụ: Nhóm phenolic thường tạo phức tím với Fe3+ nên hạn chế trích ly trong các thiết bị
bằng sắt vì tạo phức tím, phải có bước dừng tạo phức.

3. Yếu tố liên quan đến quy trình

Nhiệt độ: Nhiệt càng cao hiệu quả trích càng tốt do:
- Tăng động năng hệ, tăng sự chuyển động của hệ → Tạo dòng đối lưu giúp hệ khuấy
trộn tiếp xúc tốt hơn, tăng tốc độ khuếch tán dung môi
- Giảm độ nhớt, giảm sức căng bề mặt → Dung môi dễ di chuyển hơn, thẩm thấu vào
mạng nguyên liệu tốt hơn
Thời gian: Thời gian càng dài khả năng trích kiệt càng cao nhưng chi phí năng lượng, khả
năng phân hủy chất cũng tăng lên
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: Càng cao, khả năng trích kiệt càng tốt nhưng thời gian trích
ly càng dài, tốn nhiều năng lượng và dung môi hơn
Khuấy trộn: Tăng sự đồng đều, tránh sự gia nhiệt cục bộ



Trang 78
 PHẦN 1.3 – KỸ THUẬT TRÍCH LY RẮN – LỎNG HIỆN ĐẠI

I. TRÍCH LY SỰ HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM

(UAE – Ultrasound-assisted extraction)

1. Giới thiệu về siêu âm

Siêu âm là sóng âm, có tần số cao hơn 20 kHz trở lên, cao hơn so với ngưỡng nghe của con
người (16 – 18 kHz), có thể truyền qua 3 môi trường: rắn, lỏng, khí.
Siêu âm được chia thành 3 loại chính:
- Siêu âm chẩn đoán/Siêu âm tần số cao (Diagnostic/High frequency Ultrasound): Từ 2
MHz – 10 Mhz, thường được sử dụng trong chụp ảnh y tế, xác định khuyết tật trong
vật liệu nhựa, …
- Siêu âm tần số thấp (Low frequency Ultrasound): 20 kHz – 100 kHz, thường được sử
dụng để tạo các tác động vật lý và hóa học để gia tăng tốc độ phản ứng

2. Nguyên tắc
Khi truyền qua môi trường đàn hồi như môi trường lỏng, sóng siêu âm tạo các pha nén, dãn
liên tục (đẩy hai phân tử dung môi ra xa rồi kéo 2 phân tử xích lại gần, va chạm lẫn nhau)
Khi cường độ đủ mạnh, hai phân tử được kéo dài đến mức độ nào đó và cắt đứt phân tử
dung môi, lúc này bên trong lòng dung môi tạo ra áp suất âm → Không khí tràn vào, tạo bong
bóng khí.
Khi nén dãn dung môi, bong bóng khí cũng nén dãn liên tục, khi đạt kích thước tới hạn,
bong bóng khí vỡ ra, áp suất và nhiệt độ cục bộ có thể đạt 1000 atm, 5000K cao. Áp suất và nhiệt
độ cục độ cao hình thành các vi vòi phun (microjet) làm các phân tử xung quanh bắn đi với tốc

Trang 79
độ lớn, cùng với shockwave (sóng do quá trình vỡ bong bóng khí) tác động làm vỡ màng tế bào
giúp giải phóng hoạt chất.

3. Thiết bị

Transducer: Thiết bị chuyển năng lượng điện thành năng lượng sóng siêu âm bằng cách
sử dụng vật liệu tinh thể nhận năng lượng điện và dao động theo tần số mong muốn
Emitter (Reactor): Thiết bị tiếp nhận sóng siêu âm từ transducer, phát xạ và khuếch đại
sóng siêu âm theo nhu cầu.
Theo quy mô phòng thí nghiệm, emitter được chia làm 2 loại chính
- Bể siêu âm (Bath): Emitter ở thành bể và truyền theo bể đi vào trong cốc.
Phạm vi ứng dụng: Phân tán các hạt rắn vào dung dịch (khả năng phân tán càng tốt khi kích
thước càng nhỏ), loại bỏ các khí hòa tan trong dung dịch.
Ưu điểm: Thiết bị đơn giản, chi phí lắp đặt không cao, nhiệt độ dung dịch dễ kiểm soát hơn,
có thể sử dụng ở các thể tích lớn.

Trang 80
 Nhược điểm: Sóng bị giảm cường độ do phân tán từ thành qua môi trường và vật liệu làm
thành cốc nên khi đến dung dịch tác động đã giảm đi đáng kể.

- Thanh siêu âm (Probe): Nhúng trực tiếp vào hệ, emitter thường được đặt ở đầu thanh
siêu âm và phát sóng siêu âm thẳng vào dung dịch xung quanh

Ưu điểm: Sử dụng năng lượng hiệu quả hơn do không bị mất qua môi trường xung quanh.
Cường độ mạnh, tập trung hơn, thường được sử dụng trong trích ly.
Nhược điểm: Áp dụng cho thể tích nhỏ (thể tích lớn để đều cần lắp đặt nhiều thanh ở các
vị trí khác nhau), vùng thể tích nhỏ nên nhiệt độ tăng rất nhanh, phải có giải pháp kiểm soát nhiệt
độ → Thiết bị phức tạp hơn.

Trang 81
 4. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá
• Ưu điểm
Giảm thời gian thực hiện trích ly, giảm lượng dung môi cần trích, tăng hiệu quả trích ly do
làm vỡ thành tế bào, hoạt chất được giải phóng ra triệt để hơn và dung môi cũng xâm nhập dễ
dàng hơn.
• Nhược điểm
Âm thanh của máy tạo siêu âm rất ồn, khó chịu dù kích thước nhỏ → Khi chạy công suất
lớn, vấn đề ô nhiễm âm thanh là vấn đề cần giải quyết
Sóng siêu âm phân hủy nước thành gốc tự do H* và OH*, có khả năng làm hư hoạt chất
(các hợp chất có nhiều nối đôi, nhóm phenol, các hoạt chất nhạy cảm với gốc tự do) → Không
phát liên tục mà phát gián đoạn xen kẽ (1 – 2 phút nghỉ rồi chạy)
Đầu phát sóng siêu âm sau 1 thời gian bị rỗ mặt làm các đầu kim loại bị hư → Nhiễm kim
loại vào dịch trích.

• Phạm vi ứng dụng

Ứng dụng: Flavonoid, Polyphenol, chất kháng oxy hóa, hương liệu, tạo mùi, dầu thực vật
Ví dụ: Trích dầu béo từ các loại hạt chứa dầu
- Truyền thống: Sử dụng phương pháp ép (không lấy triệt để hoạt chất) hoặc soxhlet
(nhiệt độ cao làm biến tính acid béo không no), hiệu quả không cao do lớp vỏ cứng,
khó xâm nhập
- Hỗ trợ siêu âm: Khi vỡ bong bóng khí tác động lên màng tế bào, làm vỏ xốp hơn, dung
môi đi vào tế bào tốt hơn
4. Các yếu tố ảnh hưởng
Tần số sóng: Tần số cao, khả năng tạo bong bóng khí càng khó vì thời gian pha dãn lớn →
Tần số cao thời gian pha dãn ngắn hơn
Cường độ sóng: Cường độ càng cao, bong bóng khí vỡ ra càng mạnh
Nhiệt độ: Nhiệt độ cao làm tăng hiệu suất chiết. Tuy nhiên gần đến nhiệt độ sôi, áp suất hơi
trong hỗn hợp tăng lên, lượng khí đi vào bong bóng tăng nhưng chênh lệch áp suất giữa bên trong
và bên ngoài bong bóng giảm xuống dẫn đến vỡ bong bóng khí không mạnh, khả năng bắn phá
của microjet và shockwave giảm xuống.

Trang 82
II. TRÍCH LY SỰ HỖ TRỢ CỦA VI SÓNG

(MAE – Microwave-Assisted Extraction)

1. Giới thiệu về vi sóng

Vi sóng (microwave) là sóng điện từ với dải tần 0,3 – 300 GHz (bước sóng 1 mm – 1m), dải tần
gia dụng và công nghiệp là 2450 MHz để không bị chồng với các sóng radio.

2. Nguyên tắc
Dựa trên sự tác dụng trực tiếp trên phân tử vật liệu lưỡng cực, ion thông qua 2 cơ chế:
Truyền dẫn ion và quay lưỡng cực.
• Sự quay lưỡng cực: Lưỡng cực quay theo chiều dao động của điện trường. Điện trường
của sóng điện từ quay và đảo chiều liên tục nên kéo lưỡng cực quay vào đảo chiều liên tục theo.
Trong khi quay, các lưỡng cực ma sát với nhau sản sinh nhiệt rất nhanh.

• Truyền dẫn ion: Sự di chuyển do lực điện trường tác dụng lên hạt mang điện (ion) khi
có điện trường áp vào. Lực điện trường đổi chiều liên tục làm ion đổi chiều di chuyển liên tục.
Lực cản của dung dịch và sự ma sát giữa các phân tử do quá trình này sản sinh nhiệt
→ Vi sóng có tính chọn lọc, chỉ tác dụng lên phân tử phân cực.
Dung môi không phân cực như hexane được gọi là dung môi “microwave-transparent”.

3. Thiết bị

Trang 83
 Magnetron: Bộ phận phát vi sóng, dựa trên cách hoạt động của magnetron mà chia làm 2
loại thiết bị chính:
- Monomode: Phát vi sóng tập trung vào 1 vị trí nhất định trong lò → Đặt thiết bị cần hỗ
trợ vi sóng ngay vị trí đó. Dùng trong nghiên cứu, PTN để thực hiện phản ứng để lấy
toàn bộ năng lượng vi sóng
- Multimode: Vi sóng đi từ bộ phận này và phản xạ trên thành lo, hình thành nhiều mode
cộng hưởng xung quanh lò, trường điện từ phân bố đều hơn trong khoang chứa → Năng
lượng vi sóng phân bố đều đều khoang chứa. Dùng chủ yếu trong dụng cụ đời sống
nhưng cũng có thể dùng trong trích ly.
VMAE – Vaccum microwave extraction: Thiết bị trích ly vi sóng chân không

Trang 84
 • Ưu điểm:
- Giảm nhiệt độ sôi của hoạt chất nên hệ hoạt động ở nhiệt độ thấp
- Tạo môi trường không có oxygen, giảm khả năng bị oxy hóa ở nhiệt độ cao của các
hoạt chất trong sản phẩm tự nhiên
- Chênh lệch áp suất giữa bên trong và bên ngoài tế bào tạo thêm động lực để làm vỡ
tế bào, thúc đẩy khả năng khuếch tán của hoạt chất ra khỏi tế bào
• Phạm vi áp dụng: Các hoạt chất dễ bị oxy hóa và kém bền nhiệt như phytosterol, …

FMASE – Focused Microwave-assisted Soxhlet Extraction

Thiết bị trích Soxhlet có sự hỗ trợ của vi sóng, khắc phục nhược điểm của Soxhlet là thời
gian dài và không trích được các hợp chất bị giữ sâu trong matrix nhờ vi sóng.

Trang 85
UMAE – Ultrasound & Microwave-assisted Extraction
Mô hình thiết bị trích ly kết hợp giữa vi sóng và siêu âm.

MWHD (MAHD) – Microwave Hydro-distillation

Mô hình thiết bị trích ly có sự hỗ trợ vi sóng kết hợp với chưng cất lôi cuốn hơi nước.

Trang 86
 5. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá
• Ưu điểm
- Do gia nhiệt từ bên trong và đồng thời trên toàn hệ → Tăng thời gian và hiệu quả gia
nhiệt.
- Nước bên trong cấu trúc nguyên liệu cũng bị gia nhiệt, hóa hơi và gây vỡ cấu trúc tế
bào từ bên trong & Chuyển động quay liên tục gây phá vỡ liên kết hydro yếu và liên
kết giữa chất phân tích với matrix nguyên liệu
→ Hiệu quả trích cao, giảm thời gian trích (từ vài s đến khoảng 30 phút), giảm lượng dung
môi (thường 5 – 10 lần so với phương pháp trích truyền thống)

- Độ chọn lọc cao với một số nhóm chất, chi phí đầu tư thấp.
• Nhược điểm
- Gia nhiệt nhanh có thể gây phân hủy các hợp chất kém bền nhiệt.
- Vi sóng không hiệu quả trong một số trường hợp dung môi hoặc hoạt chất cần trích kém
phân cực.
- Bức xạ do vi sóng có thể thúc đẩy các phản ứng hóa học làm thay đổi cấu trúc hợp chất.

• Phạm vi ứng dụng

Rộng rãi trong trích ly hợp chất tự nhiên ở trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên ứng dụng vi
sóng trong công nghiệp vẫn hạn chế.

6. Yếu tố ảnh hưởng

a) Dung môi
Hằng số điện môi dung môi ảnh hưởng lớn lên hiệu quả và độ chọn lọc của quá trình trích.

Trang 87
 b) Nguyên liệu
Dựa trên đặc điểm nguyên liệu để chọn độ phân cực dung môi phù hợp sao cho tốc độ gia
nhiệt không quá chậm hoặc không quá nhanh:

- Thường chọn dung môi phân cực (methanol, ethanol, ...) hoặc hỗn hợp dung môi phân
cực và kém phân cực (H2O & dung môi hữu cơ) để giữ nhiệt độ hỗn hợp không quá cao.
- Nguyên liệu hấp thu mạnh vi sóng (có hàm ẩm lớn, …), có thể sử dụng dung môi kém
phân cực.
- Nguyên liệu kém bền nhiệt → Nguyên liệu được gia nhiệt tách hoạt chất trong dung môi
ở nhiệt độ thấp.

III. TRÍCH LY Ở ÁP SUẤT CAO

ASE Accelerated solvent extraction HPSE high pressure solvent extraction

PLE/PFE pressurised liquid/fluid extraction SHLE superheated liquid extraction
PHSE pressurized hot solvent extraction SSE subcritical solvent extraction
1. Nguyên tắc
Trích ly thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, cao hơn điểm sôi, dưới điểm tới hạn với áp suất cao
để dung môi duy trì trạng thái lỏng ở nhiệt độ cao.
2. Thiết bị

Trang 88
 Mẫu dạng rắn, được nghiền nhỏ, qua rây để kích thước hạt đồng nhất
Trộn mẫu với các chất nền trơ:
- Đá silic nghiền mịn, muối sodium sulfate, cát có tỉ trọng lớn: Tránh thể tích chết trong
cell, giúp dung môi tiếp xúc mẫu tốt hơn, tiết kiệm dung môi sử dụng
- Thêm các chất hấp phụ tại chỗ: Làm sạch tại chỗ, hấp phụ các chất không mong muốn

Đưa dung môi vào cell, đóng van tĩnh lại, tăng áp, tăng nhiệt để trích tĩnh, dung môi dãn
nở, tăng áp suất hệ, áp suất hệ tăng quá áp suất cài đặt → Van tĩnh mở cho hoạt chất đi ra, đóng
van tĩnh lại, tiếp tục cho dung môi vào
Kết thúc chu trình: Sử dụng N2 loại dung môi còn lại trong hệ, hạn chế việc pha loãng dịch
trích.

3. Phạm vi áp dụng & Đánh giá

• Ưu điểm
Trích ly thực hiện với dung môi ở áp suất cao hoặc/và nhiệt độ cao nằm dưới điểm tới hạn
→ Giữ dm ở pha lỏng ở nhiệt độ cao → Khả năng hòa tan và tốc độ khuếch tán của chất tan trong
dung môi, áp suất cao, khả năng thẩm thấu của dung môi vào mẫu cũng cao → Hiệu quả trích ly
cao với lượng dm ít hơn và thời gian trích ngắn hơn.

- Hiệu quả trích ly cao, ít tiêu tốn dung môi, thời gian trích ly ngắn.
- Hệ kín, thích hợp các hợp chất kém bền với oxy hóa, ánh sáng
- Thích hợp với phương pháp trích ly “xanh”
- Tính tự động hóa cao
- Khả năng scale up lên quy mô lớn
- Khoảng trích ly rộng

Trang 89
 • Nhược điểm
Thiết bị phức tạp, tiêu tốn nhiều năng lượng
Không phù hợp hoạt chất kém bền ở nhiệt độ cao

4. Thông số ảnh hưởng

a) Nhiệt độ
Yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng tính chất vật lý của dung môi.

Nhiệt độ tăng:
- Giảm độ phân cực, độ nhớt & sức căng bề mặt → Tăng tốc độ khuếch tán, giảm lực
tương tác hoạt chất & mạng nguyên liệu nên dễ giải hấp hơn
- Thúc đẩy phân hủy chất, gây phản ứng không mong muốn
→ Thường hoạt động trong vùng 100 – 200oC
b) Áp suất
Thường duy trì áp suất cao tối thiểu để dung môi giữ ở pha lỏng do áp suất chỉ có vai trò
giữ dung môi ở pha lỏng chứ ít ảnh hưởng đến hiệu suất chiết nên chọn tối thiểu để tiết kiệm
năng lượng.
ASE quy mô phòng thí nghiệm thường duy trì dưới 1 MPa.

c) Dung môi
Thường tránh dm có nhiệt độ tự bắt cháy trong khoảng 40 – 200oC (CS2, diethyl ether, ...)
Tránh acid, base gây ăn mòn
Thường chọn nước hoặc hỗn hợp nước/dung môi thường được chọn để phân lập hợp chất
phân cực trung bình – cao.
Trang 90
IV. TRÍCH LY BẰNG CHẤT LỎNG SIÊU TỚI HẠN

(SFE – Supercritical Fluid Extraction)

1. Chất lỏng siêu tới hạn

Tính chất giữa pha lỏng và pha khí:
- Tỷ trọng giống pha lỏng.
- Độ nhớt, sức căng bề mặt giống pha khí.
- Độ dẫn nhiệt cao và thường đạt max ở gần điểm tới hạn.
- Khả năng khuếch tán cao hơn pha lỏng .
→ Năng lực dung môi của pha lỏng, nhưng khả năng xuyên thấm, khuếch tán của pha khí.

2. Nguyên tắc
Trích ly với dung môi ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn.

Trang 91
3. Thiết bị

Trang 92
 4. Phạm vi ứng dụng & Đánh giá
• Ưu điểm
Dễ tìm, trơ, không độc hại và không cháy nổ.
Có khả năng hòa tan hoàn toàn các chất khí.
Tỷ trọng cùng các tính chất vật lý liên quan như hằng số điện môi, năng lực solvate hóa, …
có thể điều chỉnh thông qua nhiệt độ và áp suất.
Khả năng truyền khối tốt do độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán cao, không có sức căng
bề mặt, nó được xem là dung môi hoàn hảo cho quá trình trích ly.
Khả năng truyền nhiệt tốt.
Dễ dàng đuổi dung môi khỏi sản phẩm bằng cách hạ áp suất, hạ nhiệt độ.

• Nhược điểm
Thực hiện ở áp suất tương đối cao nên thiết bị phức tạp.
Khả năng hoà tan các chất phân cực khá kém, do chỉ thay đổi độ phân cực trong giới hạn,
nếu muốn tăng độ phân cực phải sử dụng chung với các dung môi phân cực khác (hỗn hợp
dung môi).
Chất hoạt động bề mặt ái CO2 hỗ trợ giảm sức căng CO2 để phân tán vào mao quản các
matrix nguyên liệu đang được phát triển nên giá còn đắt.

• Phạm vi ứng dụng:

Hiệu quả trích hợp chất phân cực không cao

5. Yếu tố ảnh hưởng

• Áp suất, nhiệt độ

Trang 93
 Gần điểm tới hạn, một sự thay đổi nhỏ của nhiệt độ hoặc áp suất cũng có thể tạo ra sự thay
đổi lớn về tỷ trọng.
Tại vùng siêu tới hạn:
- Khi đẳng nhiệt: Áp suất tăng làm tỷ trọng tăng
- Khi đẳng áp:
• Nhiệt độ tăng làm tỷ trọng giảm, độ phân cực giảm → Độ tan giảm
• Tăng áp suất hơi chất tan → Tăng độ tan
- Càng gần điểm tới hạn càng biến thiên mạnh

• Dung môi
Sử dụng đồng dung môi để tăng độ phân cực của CO2, tăng khả năng hòa tan
Thông dụng MeOH, EtOH, H2O, dầu, … hàm lượng không quá 15%

• Chất tan
Chất khối lượng phân tử càng lớn, độ phân cực càng lớn, độ tan trong ScCO2 càng giảm
Áp suất hơi càng lớn, tỷ trọng dung môi càng lớn, độ tan vào ScCO2 càng tăng



Trang 94
 Phaàn II
Tieàn phaân laäp

Trang 95
 PHẦN 2.1 – ĐẠI CƯƠNG VỀ TIỀN PHÂN LẬP

I. VỊ TRÍ TRONG QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT TỪ SPTN

Thực hiện sau khi thu được dịch chiết từ vật liệu qua các quá trình chiết xuất (chưng cất
lôi cuốn hơi nước, chưng cất phân đoạn, trích ly, ...)
Sản phẩm thu được từ bước này sẽ được đưa vào bước tinh chế tiếp theo như Sắc ký.

Hình 1. Quy trình tách, phân lập tinh chế hợp chất thiên nhiên từ nguyên liệu thô

II. VAI TRÒ CỦA QUÁ TRÌNH TIỀN PHÂN LẬP

(?) Vì sao không tiến hành phân lập cao thô bằng Sắc ký luôn mà phải qua bước tiền phân
lập ?

2.1 Tính chất sản phẩm thu được từ bước chiết xuất
Cao thô: Chứa cấu tử mong muốn, tuy nhiên hàm lượng cấu tử thấp và tồn tại chung với
nhiều chất khác có tính chất và cấu trúc gần tương tự nhau.

Trang 96
 2.2 Sự ảnh hưởng của tác nhân nhiễu
Cặn/Bã còn phân tán trong dung dịch: Bám lên và che phủ các tâm hoạt tính của pha tĩnh,
làm giảm độ phân tách và tuổi thọ của cột.
Dịch thu được ngoài cấu tử mong muốn còn chứa hỗn hợp nhiều chất khác. Do đó:

a) Các chất có tính chất cần với cấu tử mong muốn rửa giải cùng lúc làm peak không
sạch, giảm độ tin cậy và tinh khiết của chất.

Hình 2. Hiệu quả bước tiền phân lập với độ tinh khiết của hợp chất

b) Các chất khác cấu tử cần mong muốn làm xuất hiện nhiều peak, gây phức tạp cho việc
phân tích và kéo dài thời gian phân tích.

Hình 3. Hiệu quả bước tiền phân lập với việc giảm độ phức tạp peak sắc ký

Trang 97
 c) Sự ảnh hưởng của nồng độ: Nồng độ cấu tử mong muốn trong dịch chiết thô thường
rất thấp. Do đó, nếu sử dụng thiết bị cần có độ nhạy cao mới nhận biết được peak.
Peak quá thấp gây khó khăn cho việc tính toán chính xác.

Hình 4. Hiệu quả bước tiền phân lập với việc giảm độ phức tạp peak sắc ký

III. MỤC TIÊU & SẢN PHẨM QUÁ TRÌNH TIỀN PHÂN LẬP

• Mục tiêu:
- Phân đoạn cao chiết thành các đoạn nhỏ hơn
- Loại bỏ 1 phần tạp chất đi theo
→ Thu được cao có hàm lượng chất cần cao hơn, giúp bước phân tách tinh chế có độ tin
cậy cao, giảm bớt nhiễu và thu hẹp phạm vi tính chất cần phân tách.

• Sản phẩm:
Cao tinh (cao sạch): Tương đối loại khá nhiều tạp chất, thành phần gồm các nhóm chất có
tính chất gần tương tự nhau.

IV.NHÓM PHƯƠNG PHÁP CHÍNH

• Chiết lỏng lỏng

• Hấp phụ
• Chiết pha rắn

V. SƠ BỘ HÓA THỰC VẬT

Các thuốc thử đặc trưng để kiểm tra nhanh, đơn giản, ít tốn kém sự có mặt của một số
nhóm chất phytochemicals trong thực vật.

Trang 98
Nhóm sản Tên thuốc
Chất phản ứng Hiện tượng khi dương tính
phẩm thử

Dragendorff Dd KBiI4 Kết tủa đỏ

Wagner I2 trong KI Kết tủa nâu đỏ

Alkaloid
Mayers Dd K2HgI4 Kết tủa vàng

Hager Dung dịch acid picric bão hòa Kết tủa vàng

Froth Nước Lớp bọt cao 1 cm

Saponins
Foam Nước Lớp bọt bền 10 phút

Salkowski CHCl3, H2SO4 đặc Dung dịch màu vàng gold

Phytosterols
Libermann CHCl3, (CH3CO)2O, H2SO4 Có vòng tròn nâu tại mặt
Burchard đậm đặc phân pha
Ferric Dung dịch màu đen hơi xanh
Phenols Dd FeCl3
Chloride (bluish black)

Tannins Gelatin Dung dịch 1% gelatin, NaCl Kết tủa trắng



Trang 99
 CHƯƠNG 2.2 – CHIẾT LỎNG – LỎNG

I. NGUYÊN TẮC

Sự khác nhau về độ hòa tan, khác nhau hệ số phân bố chất tan giữa 2 pha lỏng – lỏng không
tan lẫn vào nhau.

II. QUY TRÌNH

Bước 0 (Từ quá trình trích ly): Từ vật liệu ban đầu, trích ly với dung môi thích hợp
(MeOH, EtOH, ...). Sau khi thu được dịch chiết, cô quay để tạo cao khô rồi hòa tan với nước tạo
dung dịch 95%.
Bước 1: Bắt đầu từ cao chiết, thực hiện lần lượt với từng dung môi có độ phân cực tăng
dần. Bắt đầu từ dung môi độ phân cực thấp nhất là Hexane/Ether dầu/Diethyl Ether.
Giai đoạn chiết với hexane còn gọi là giai đoạn loại béo.
Bước 2: Với mỗi dung môi có độ phân cực xác định, cho lượng nhỏ dung môi, lắc nhiều
lần rồi để cân bằng, sau đó gạn pha hữu cơ. Tiếp tục lấy pha nước thêm lượng nhỏ dung môi vào
và lặp lại quá trình chiết đến khi không còn chất hòa tan.
Bước 3: Dịch chiết được gom chung lại, làm khan với Na2SO4, MgSO4, CaSO4, ...
Bước 4: Đuổi dung môi thu được cao chiết ứng với dung môi đó.
Bước 5: Lấy pha nước tiếp thu chiết với dung môi khác có độ phân cực cao hơn.

Trang 100
 III. DUNG MÔI SỬ DỤNG

Độ phân cực tăng dần

Hexane/Ether dầu hỏa (Petroleum Ether) < Chlorofom <
Ethyl Acetate < n-Butanol

IV.THÀNH PHẦN SẢN PHẨM

Cao ether dầu, hexane, diethyl ether: Kém phân cực như lipids, hydrocarbon béo, sáp, tinh
dầu, sterol thực vật, chất màu (chlorophyll, carotenoid, ...)
Cao chlorofom: Sesquiterpene, diterpene, courmarin, quinone, aglycon từ các glycosid bị
thủy phân, alkaloid
Cao ethyl acetate: Phân cực trung bình như monolglycoside, phenolics, terpenoid phân cực
Cao n-BuOH/Nước: Phân cực cao, chủ yếu các glucoside

V. ƯU & NHƯỢC ĐIỂM

• Ưu điểm
- Đơn giản
- Thiết bị đơn giản, dễ tìm
→ Các PTN về HCTN thường dùng phương pháp này

• Nhược điểm
- Một số trường hợp xảy ra sự tạo nhũ tương, khó phân lớp.
- Giữa các cao chiết sự phân tách không rạch ròi, có thể có các chất nằm ở cả 2 pha.
- Lượng dung môi độc hại sử dụng lớn.
• Lưu ý
EtOAc: Có thể gặp hợp chất "giả" (chất được tạo ra trong quá trình chiết chứ không chiết
từ cây. Quá trình chiết gặp các hợp chất chứa OH phản ứng ester hóa với acetic acid lẫn còn dư
trong EtOAc) ⇒ Khi gặp hợp chất acetate, cần xác định hợp chất này có trong nguyên liệu ngay
từ đầu hay “giả” từ phản ứng với AcOH còn dư.
CHCl3: Thường được dùng để trích alkaloids vì dung môi có tính acid nhẹ, tăng khả năng
hòa tan alkaloids mang tính base
n-BuOH: Nên được bão hòa với nước trước khi dùng để trích pha nước. Do n-BuOH vẫn
có khả năng hòa tan một phần trong nước (9,1 mL n-BuOH/100 mL H2O ở 25oC) để tránh hiện
tượng nước trong pha nước đi vào pha n-BuOH, làm thay đổi sự phân bố của hợp chất
Trang 101
 Trích Saponin: Phân đoạn Glycoside (cao n-BuOH) nên được trích ly với dung dịch 1%
KOH để loại bớt phần lớn các hợp chất phenolic như flavonoids và các glycosides liên quan.
Sau đó, acid hóa pha nước và tiến hành trích ly lại thu được phân đoạn giàu các hợp chất
phenolic.
Tách lớp nước: Phải xác định lớp nước để tách ra. Lớp nước thường nằm dưới nhưng
không phải lúc nào cũng vậy.
Ví dụ: Khi chiết với chlorofom, pha nước nằm trên pha chlorofom

Xác định pha nước & pha dầu

Không phải lúc nào tỷ trọng cũng đúng: Vì chất hòa tan vào làm thay đổi tỷ trọng, hòa tan
càng nhiều tỷ trọng càng thay đổi.
Kiểm tra: Nhỏ giọt nước lên bề mặt trên của phễu chiết, nếu nước tan trong lớp đó thì là
pha nước.



Trang 102
 CHƯƠNG 2.3 – HẤP PHỤ

I. ỨNG DỤNG

Macroporous Resin thường được sử dụng để làm giàu sản phẩm tự nhiên bậc 2.

II. NGUYÊN TẮC

Hấp phụ chọn lọc cấu tử dựa trên lực tĩnh điện, liên kết hydro, sự tạo phức, sự rây phân tử,
... giữa resin và cấu tử cần hấp phụ
→ Làm giàu các hợp chất dựa trên khối lượng phân tử, độ phân cực và hình dạng kích
thước hạt.

III. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG

Macroporous Resin: Nhựa có kích thước lỗ xốp bên trong lớn (từ khoảng 20 - 100 nm)

Sự phân cực của resin được thay đổi nhờ sự biến tính bề mặt:
• Không phân cực: Polystyrene
• Phân cực trung bình: Đính nhóm ester
• Phân cực: Đính các nhóm amide, amidocyanogen, acylamino
Chọn loại resin dựa vào cấu tử làm giàu và tính chất của cấu tử (độ phân cực, khối lượng
phân tử, kích thước hạt).

IV.ƯU ĐIỂM

Việc sử dụng Macroporous resin có ưu điểm so với các chất hấp phụ truyền thống:
• Dung lượng hấp phụ lớn (gấp khoảng hơn 10 lần so với các chất hấp phụ truyền thống)
• Độ chọn lọc hấp phụ cao, dễ hấp phụ
• Độ bền cơ học tốt, dễ tái sử dụng
• Có thể giải hấp bằng dung dịch ethanol là dung môi ít độc hại → Thân thiện môi trường

Trang 103


Trang 104
 CHƯƠNG 2.4 – CHIẾT PHA RẮN
(SPE – Solid Phase Extraction)

I. NGUYÊN TẮC

Tương tự như sắc ký. Phân tách các hợp chất dựa trên sự khác biệt về ái lực của cấu tử với
hai pha tĩnh và pha động.

II. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG

Thiết bị dùng trong SPE như hình dưới, là một ống nhỏ hình dạng gần giống kim tiêm, gồm
3 phần:
• Phần đầu nhỏ dưới cùng: Phần để dung môi chảy ra ngoài
• Phần chất rắn pha tĩnh được lót ở giữa
• Phần không gian trống ở trên để load mẫu và dung môi giải ly vào

Trang 105
 Có 2 cơ chế chính: Bind and Elute và Removal/Trapping

a) Bind & Elute

Cấu tử cần tách bị giữ lại trong pha tĩnh, sau đó được giải ly dần ra, còn phần dung môi còn
lại và các cấu tử không cần thiết theo pha động đi ra ngoài.

b) Removal/Trapping
Cấu tử cần tách theo pha động đi ra ngoài, không bị giữ lại bởi pha tĩnh. Dung môi và các
chất không cần thiết bị giữ lại trong cột.

Trang 106
 III. QUY TRÌNH CHUNG

BƯỚC 1: CONDITIONING - CÂN BẰNG CỘT

• Thực hiện
Cho cùng loại dung môi sử dụng để hòa tan mẫu chạy qua cột 6 - 10 lần trước khi thực hiện
SPE.
• Mục đích
Các tâm hoạt tính trên bề mặt pha rắn đều khô. Cân bằng cột để dung môi đi qua làm ướt
các tâm hoạt tính này, giúp pha động có thể dễ dàng tiếp xúc và thẩm thấu vào bên trong để các
cấu tử có thể tiếp xúc với pha tĩnh.

BƯỚC 2: LOAD MẪU

• Thực hiện
Load mẫu lên phần không gian trống phía trên để mẫu chảy xuống dưới tác dụng của trọng
lực.
• Mục đích
Khi pha động chứa mẫu chảy xuống, các cấu tử cùng tính chất với pha động bị giữ lại, các
cấu tử khác tính chất pha động sẽ chảy ra ngoài. Từ đó phân tách được các cấu tử.

BƯỚC 3: RỬA CỘT

• Thực hiện
Load dung môi cùng loại với dung môi sử dụng để hòa tan mẫu chạt qua cột nhiều lần để
lôi cuốn các cấu tử nhiễu không mong muốn bị giữ lại trong cột nhưng không phải do tương tác
với pha rắn.
• Mục đích
Loại các cấu tử nhiễu bị giữ lại do các lý do khác (như bị giữ lại do va chạm, ...) để giúp
tăng độ tinh khiết của cấu tử bị giữ lại.

BƯỚC 4: GIẢI LY
• Thực hiện
Sử dụng dung môi có độ phân cực phù hợp với cấu tử bị giữ lại trong pha rắn để lôi kéo
từng cấu tử trong pha rắn ra.

Trang 107
 Khi pha rắn có nhiều cấu tử, có thể phân đoạn các cấu tử bằng cách dùng dung môi có độ
phân cực tăng dần hoặc giảm dần (tùy theo loại SPE pha thuận hay pha đảo).
• Mục đích
Phân đoạn các cấu tử để thu được cấu tử mong muốn tinh khiết hơn với hàm lượng cao hơn.

IV.PHÂN LOẠI

Gồm 3 loại:
• SPE pha thuận: Pha rắn phân cực
• SPE pha đảo: Pha rắn không phân cực
• SPE trao đổi ion: Pha rắn là các chất có khả năng trao đổi ion

SPE PHA THUẬN

• Pha rắn: Phân cực
• Hấp phụ dựa trên lực tương tác ái nước: Polar - Polar; liên kết hydro, tương tác pi - pi,
tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực cảm ứng
• Để phân đoạn, sử dụng cho chất mong muốn kém phân cực đến phân cực trung bình (do
pha động trong SPE pha thuận phân cực kém).
• Giải ly với dung môi độ phân cực tăng dần. Do cấu tử mong muốn phân cực kém nên sử
dụng dung môi có độ phân cực thấp sẽ giúp giải ly các cấu tử này ra trước. Nếu sử dụng
dung môi độ phân cực lớn hơn trước có khả năng các chất không mong muốn có độ phân
cực cao hơn sẽ rửa giải chung và làm giảm độ tinh khiết.

SPE PHA ĐẢO

• Pha rắn: Không phân cực
• Hấp phụ dựa trên lực tương tác kỵ nước, nonpolar - nonpolar, Van der Waals
• Để phân đoạn, sử dụng cho chất mong muốn phân cực trung bình đến mạnh (do pha động
trong SPE pha đảo phân cực)
• Giải ly với dung môi độ phân cực giảm dần. Lý do tương tự SPE pha thuận
• Với trường hợp SPE Pha đảo: Pha rắn silica phải được solvate hóa với methanol hoặc
acetonitrile 6 - 10 lần với nước hoặc dung dịch đệm trước khi conditioning cột.

Trang 108
NGUYÊN NHÂN

Pha rắn silica được hình thành từ các nhóm silanol với bề mặt (SiO2)x được biến tính, gắn
các nhánh R bằng các phản ứng thích hợp để thay đổi độ phân cực bề mặt. Với trường hợp pha
rắn không phân cực trong SPE pha đảo, gốc R thường là C18.
Nếu không solvate hóa pha rắn trước, khi cho pha động trong dung môi nước chảy trong
thiết bị, khu vực ở xung quanh các nhánh C18 (bản chất không phân cực) là nước (phân cực rất
mạnh). Do sự khác nhau về bản chất này:
• Nước không thể tương tác, liên kết và thẩm thấu vào bề mặt vật liệu để các cấu tử có
thể hấp phụ vào pha rắn
• Khu vực xung quanh nhánh C18 pha rắn có sức căng bề mặt rất lớn nên các nhánh gần
nhau có xu hướng liên kết và tụ lại thành một khối, cản pha động tiếp xúc với vật liệu,
làm bề mặt tiếp xúc giảm đi đáng kể (Hình A)

Do đó, việc solvate hóa pha rắn bằng dung môi có độ phân cực thấp hơn nước như methanol
giúp cho sự chênh lệch về độ phân cực giữa C18 và môi trường xung quanh giảm xuống, xu
hướng liên kết giữa các nhánh C18 giảm xuống (Hình B) từ đó tạo điều kiện để pha động tiếp
cận, thẩm thấu trên bề mặt pha rắn dễ dàng hơn.

Trang 109
 Quá trình solvate hóa pha rắn lý tưởng có thể giúp các nhánh C18 được sắp xếp như hình
C nếu pha dung môi solvate hóacó độ phân cực đủ nhỏ như acetonitrile hoặc tetrahydrofuran.
Tuy nhiên khi sử dụng các dung môi độ phân cực nhỏ, các dung môi phủ lên này lại có khả năng
không tan trong pha nước, đóng vai trò lớp phủ bên ngoài cản trở pha nước thẩm thấu vào. Do
đó, việc sử dụng pha để solvate phải hết sức cân nhắc về độ tan của chúng trong nước.
Dựa trên khả năng solvate pha rắn và độ tan trong nước, hai dung môi thường sử dụng là
methanol và acetonitrile.

SPE TRAO ĐỔI ION

• Nguyên tắc
Cấu tử mong muốn được liên kết với pha rắn với cột bằng cách tích điện và thay thế ion có
điện tích tương ứng đang đính trên pha rắn của cột.

Sau đó cấu tử mong muốn được giải ly khỏi pha rắn bằng dung dịch có pH thích hợp hoặc
dung dịch chứa chất điện ly có lực ion đủ cao để thay thế ion cấu tử mong muốn.

• Phân loại
Có 2 loại:

- Anion Exchanger: Trao đổi ion âm trên bề mặt vật liệu tích điện dương như amine
béo bậc 4 (SAX, pKa > 14) hoặc silica rắn nhánh aminopropyl béo (WAX, pKa ~ 9.8).
- Cation Exchanger: Trao đổi ion dương trên bề mặt vật liệu tích điện âm như silica
gắn RSO3H (SCX, pKa < 1), gắn COOH (WCX, pKa ~ 4.8).

• Nguyên tắc thực hiện:

Trang 110
BƯỚC 1: CONDITIONING - CÂN BẰNG CỘT
• Thực hiện:
Làm ướt cột bằng dung dịch đệm pH ở điều kiện phân tách ở các bước sau nhiều lần.
• Mục đích:
Cung cấp môi trường pH phù hợp để các cấu tử ở bước 2 sẽ chuyển về dạng ion và bị giữ
lại bởi pha rắn.
Chọn pH môi trường dựa vào pH đẳng điện (pHi) của từng cấu tử trong hỗn hợp.
pH đẳng điện là giá trị pH mà tại đó, phân tử tồn tại dưới dạng trung hòa về điện. Khi pH
< pHi, phân tử bị proton hóa và tích điện dương. Ngược lại khi pH > pHi, phân tử bị kiềm hóa
và tích điện âm.

Ví dụ để phân tách 3 hợp chất A, B, C có pHi lần lượt là 3, 7, 9. Khi sử dụng pH môi trường
là 5. A sẽ nằm dưới dạng anion do pH > pHi (A), B và C nằm dưới dạng cation.
Cung cấp các ion đối đầy đủ cho các đầu ion của pha rắn để pha rắn có thể trao đổi ion

Trang 111
BƯỚC 2: LOAD MẪU
• Thực hiện:
Load mẫu lên phần không gian trống phía trên để mẫu chảy xuống dưới tác dụng của trọng lực.
• Mục đích:
Khi pha động chứa mẫu chảy xuống, các chất tích điện cùng dấu với ion đối sẽ bị giữ lại trên cột.
Các chất tích điện ngược dấu với ion đối sẽ đi theo pha động ra ngoài.

BƯỚC 3: RỬA CỘT

• Thực hiện
Load dung môi cùng loại với dung môi sử dụng để hòa tan mẫu chạy qua cột nhiều lần để
lôi cuốn các cấu tử nhiễu không mong muốn bị giữ lại trong cột nhưng không phải do tương tác
với pha rắn.
• Mục đích
Loại các cấu tử nhiễu bị giữ lại do các lý do khác (như bị giữ lại do va chạm, ...) để giúp
tăng độ tinh khiết của cấu tử bị giữ lại.

BƯỚC 4: GIẢI LY
• Thực hiện
Có 2 cách:
• Điều chỉnh pH của dung dịch đệm
Dùng dung dịch đệm có pH môi trường đủ để chọn lọc 1 cấu tử trở về dạng trung hòa hoặc
đảo dấu ion, từ đó giải ly cấu tử này ra.
Ví dụ: Có hai cấu tử B và C với pHi lần lượt là 7 và 9. Khi sử dụng pH trong khoảng từ 7
đến 9, B trở về dạng anion cùng dấu với pha rắn nên sẽ tách ra và bị giải ly. Trong khi đó C vẫn
còn ở dạng cation nên bị giữ lại trong cột. Sau khi giải ly B, sử dụng dung dịch đệm pH > 9 để
giải ly C.

Trang 112
 • Sử dụng dung dịch chất điện li nồng độ tăng dần
Dùng dung dịch chất điện ly (như NaCl) với nồng độ tăng dần để ion đối có lực ion đủ để
đẩy 1 trong 2 cấu tử ra ngoài và thay thế vào vị trí cấu tử này.
Ví dụ: Sử dụng dung dịch NaCL với nồng độ tăng dần. Khi nồng độ tăng đến CB, lực ion
của Cl- đủ để thay thế anion B nên Cl- đẩy anion B ra khỏi liên kết với pha rắn và giúp rửa giải
B. Sau khi rửa giải B xong, tiếp tục tăng nồng độ để Cl- đủ sức đẩy C ra ngoài.



Trang 113
Trang 114
 Phaàn III
Phaân laäp

Trang 115
 CHƯƠNG 3.1 – ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN LẬP
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY)

- Mục đích: Tách một hỗn hợp phức tạp gồm nhiều loại hợp chất riêng thành từng đơn chất
- Cơ sở: Dựa vào sự khác nhau về phân bố (ái lực) của các chất với hai pha: Pha động &
Pha tĩnh
- Phân loại:

Theo pha động Theo pha tĩnh

Sắc ký hấp phụ

- Bản mỏng (TLC – thin layer chromatography)
Sắc ký lỏng - Khí (GC – Gas chromatography)
(Liquid Chromatography) - Cột (CC – Column Chromatography)
- Lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance
Chromatography)

Sắc ký phân bố
- Lỏng – khí

Sắc ký khí - Lỏng – lỏng

(Gas Chromatography)
Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử (lọc gel)

- Pha thuận & Pha đảo:

• Pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, phân tích chất phân cực trung
bình đến cao
• Pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, phân tích chất phân cực thấp
- Chọn phương pháp sắc ký:
• Pha động:
- Sắc ký khí: Chất dễ bay hơi, M < 500, ts < 350oC, khả năng tách cao hơn sắc ký lỏng
- Sắc ký lỏng: Chất khó bay hơi, chiếm phổ biến 80%
Trang 116
• Pha tĩnh



Trang 117
 CHƯƠNG 3.2 – ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ HẤP PHỤ

I. ĐẠI CƯƠNG
- Pha tĩnh là rắn vô cơ phân cực, pha động có thể là lỏng/khí
- Cơ chế: Hấp phụ vật lý và hóa học
- Trường hợp sử dụng:
• Chất cần tách độ phân cực thấp đến trung bình
• Có M < 1000
II. PHA TĨNH
I.1 Silica gel
a) Ký hiệu: Silicagel 60G F254: 60 = Đường kính lỗ 60 Angstrong, G = Có chất kết dính
Gypsum, F254 = Phát huỳnh quang khi bị chiếu xạ UV bước sóng 254 nm.

b) Đặc tính cấu trúc: Là cấu trúc gồm các phân tử SiO2 liên kết với nhau, bề măt biến
tính gắn các nhóm OH tạo thành các nhóm silanol tạo độ phân cực cao.

Single Silanol

Geminal Silanol

Bề mặt silica gel có thể biến tính với các gốc R khác nhau để tạo silicagel liên kết (bonded
phase silicagel) sử dụng chọn lọc cho các hợp chất tự nhiên khác nhau.

Trang 118
 Bên trái: Modified gốc R thành các hydrocarbon phân cực
Bên phải: Modified gốc R thành các nhóm phân cực, PG = Polar group (amide, cyanide, carbonyl, …)

c) Khả năng hấp phụ

- Hấp phụ vật lý
- Hấp phụ hóa học: Nhóm silanol có tính acid → Hấp phụ mạnh chất có tính base (như
nhóm amino -NH2)
- Hấp phụ chọn lọc: Chọn lọc cao với các đồng phân vị trí
Ví dụ: Hydroquinone bị giữa trên silicagel mạnh hơn catechol do hydroquinon tạo liên
kết bền với 2 tâm silanol còn catechol chỉ tạo được liên kết đơn

- Giảm khả năng hấp phụ khi nung ở nhiệt độ cao 300oC do tạo nhóm siloxane Si-O-Si
- Giảm khả năng hấp phụ khi hấp phụ nước do nước tạo liên kết hydrogen với các nhóm
silanol, phá hủy liên kết hydro của các nhóm silanol kết hợp.

Trang 119
 d) Phổ ứng dụng

Tên vật liệu Gốc R liên kết Sắc ký Ứng dụng

Silica Pha thuận Đa số nhóm chất hữu cơ

Steroids, Phenols, Vitamin, Đường,

Sil NH2 Xanthines, Nuclotides, Thuốc trừ sâu

Không tương thích với carbonyl
Pha thuận Steroid, Hormone, Thuốc trừ sâu, hợp chất
Sil Diol & đảo trong thực vật

Steroid, Phenols, Thuốc trừ sâu, Chất bảo

Sil CN
quản

Pha đảo

PR-18 với ít dung

Steroid, Phenols, Flavonoids, Alkaloids,
môi
Amino Acids, Peptides, Aromatics
RP-18 W Thuốc bảo quản, Chất làm trắng quang
Pha thuận
học, Dược phẩm
C18-50 & đảo

I.2 Các chất hấp phụ khác

Chất hấp phụ Đặc điểm cấu trúc Ứng dụng

3 loại: Acid (pH ~ 4 – 5), neutral & basic
(pH ~ 9 – 10)
Phân cực, hoạt tính phụ thuộc H2O hấp
phụ bề mặt (che lấp tâm hoạt tính), tâm Terpene, Akaloid, Steroid,
Aluminum Oxide
acid (Al3+), base (O2-) và số lượng nhóm Aliphatic, Aromatic
OH bề mặt
Hấp phụ rất mạnh → Có thể phản ứng phụ,
không công dụng bằng silica

Trang 120
 Xơ cellulose ngắn, số lượng mắt xích Sắc ký phân chia, các chất ái
Cellulose
khoảng 400 – 500. Trương trong nước nước: amino acid, carbohydrate
DEAE (diethylaminoethyl) cellulose Sắc ký trao đổi ion (anionic
R – O – (CH2)2N(CH2CH3)2 exchanger)
Dẫn xuất Cellulose
PEI (polyethyleneimine) impregnated Hóa sinh: Amino acid, enzymes,
cellulose phosphate, nucleotide, hormone
Polyamide 6 & 11 Sắc ký phân chia, hấp phụ:
Nhóm hoạt tính amide (-NHCO-) → phenol, polyphenol như
Polyamide
Tương tác hydro, lưỡng cực, electron anthocyanin, anthoxanthine, dẫn
donor, receptor xuất anthraquinone, flavone, …

III. DUNG MÔI

1. Yêu cầu cơ bản
Độ tinh khiết cao, tương thích và “transparent” với detector (không gây tín hiệu với
detector)
Tương thích với mẫu: Hòa tan và trơ với mẫu, pha tĩnh
Độ nhớt thấp
Giá thành thấp
An toàn (ít chảy nổ, ít độc, ít ăn mòn)

2. Ảnh hưởng dung môi pha động

 o : Năng lực rửa giải dung môi, năng lực càng cao, rửa giải càng nhanh (M hấp phụ càng
mạnh, X càng khó thế chỗ nên khó bị giữ lại → Ra nhanh hơn)

M – Dung môi pha động, X – Chất phân tích

Năng lực rửa giải phụ thuộc:

- Ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh

- Lực lôi kéo chất phân tích của pha động
Dung môi rửa giải mà chỉ làm thay đổi thời gian rửa giải

Trang 121
 Không dùng dung môi độ phân cực quá cao (như methanol, nước) vì các phân tử này sẽ
liên kết chặt vào tất cả phân tử trên bề mặt gây bất hoạt không làm thay đổi thứ tự bề mặt, làm
các cấu tử độ phân cực tuy cao nhưng vẫn không bị pha tĩnh giữ lại.
Khi khảo sát pha thuận, sử dụng dung môi ít phân cực trước, sau đó nếu chất tan bị giữ
lại quá mạnh mới trộn dung môi độ phân cực mạnh hơn, tăng dần độ phân cực dung môi.
Giải thích: Do với cùng một cột sắc ký, nếu sử dụng dung môi phân cực cao trước trong
sắc ký pha thuận, dung môi độ phân cực cao gắn rất chặt với pha tĩnh. Lúc này khi giảm độ phân
cực, dung môi mới không thể đẩy được dung môi cũ ra khỏi vị trí trên tâm hấp phụ → Phải xử lý
cột hoặc sử dụng cột mới.

Một số đơn dung môi phổ biến: Theo chiều tăng dần năng lực giải ly

Petroleum Ether/Hexane < CCl4 < Toluene < Benzene < CHCl3 <
CH2Cl2 < EtOAc < CH3CN (acetonitrile) < Isopropanol < MeOH < H2O

Petroleum ether (ether dầu hỏa, xăng dung môi): Không phải là ether (không có nhóm ROR
trong phân tử), là hỗn hợp các hydrocarbon no từ 5 → 7C, từ pentane tới hexane)
CHCl3 có thể tạo liên kết hydro với chất phân tích, H2O không sử dụng đơn dung môi trong
sắc ký hấp phụ

Trang 122
 Một số hệ dung môi phổ biến:
Hệ dung môi Chất hấp phụ Ứng dụng
Hexane : EtOAc
Universal
Petroleum Ether : EtOAc

Universal cho sản phẩm chuyển hóa không

Petroleum Ether : Et2O
phân cực (terpenes, acid béo)

Đặc thù: Tách cinnamic acid và dẫn xuất

Petrol : Chlorofom (CHCl3)
trong một số courmarin

Toluene : EtOAc : AcOH Universal cho

(TEA) Silica gel sản phẩm chuyển hóa có tính acid

Universal cho sản phẩm chuyển hóa độ

CHCl3 : Acetone
phân cực trung bình

Benzene : Acetone
Đặc thù: Hợp chất vòng thơm
Toluene : Acetone
BuOH : AcOH : Nước Đặc thù: Flavonoids, Glycosides
BuOH : H2O : Pyridine :
Đặc thù: Carbohydrate
Toluene

Bắt đầu với 100% MeOH, thêm 1 lượng

MeOH : H2O C18
nhỏ acid, base để cải thiện hiệu năng
Acetontrile : H2O C18/C2 Universal cho pha đảo
Polyamide Universal
MeOH : H2O Đặc thù: Độ phân cực mạnh như
Cellulose
Đường, Glycosides

Trang 123
 CHƯƠNG 3.3 – SẮC KÝ BẢN MỎNG
(TLC – THIN LAYER CHROMATOGRAPHY)
PTLC – Preparative Thin Layer Chromatography (ít sử dụng)

I. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ BẢN MỎNG

1.1 Nguyên tắc

- Pha tĩnh là bản mỏng (kiếng, nhôm, plastic) tráng lớp hấp phụ mỏng phân cực (silica gel,
aluminum oxide).
- Mẫu chấm trên bản mỏng, đặt trong bình chứa lượng nhỏ dung môi
- Dung môi di chuyển lên do lực mao quản, kéo các thành phần trong mẫu phân tách thành
các vết riêng biệt
- Các vết có thể nhìn trực tiếp hoặc soi dưới đèn tử ngoại, phun thuốc thử, … để hiện các vết
1.2 Mục đích sử dụng
- Phân tích thành phần hỗn hợp
- Theo dõi tiến trình phản ứng, sắc ký cột
- Đánh giá sơ bộ đặc điểm sản phẩm mới
- TLC Phân tích: Xác định độ tinh khiết, nhận biết sự có mặt một số nhóm chất trước khi
phân tích NMR
- TLC Chuẩn bị: Hỗ trợ sắc ký cột, tìm các điều kiện, hệ dung môi thích hợp để tách hỗn hợp
1.3 Ưu điểm
- Nhanh, nhạy, lượng mẫu nhỏ
- Có thể phân tích đồng thời mẫu & chuẩn
- Kỹ thuật & dụng cụ đơn giản, rẻ

Trang 124
II. CẤU TẠO CỦA BẢN MỎNG
Bản mỏng là một tấm thủy tinh, nhựa hay nhôm.
Lớp pha tĩnh (100 – 200 m) được tráng trên bản mỏng, thành phần thường là silica gel,
alumina (Al2O3).
Lớp pha tĩnh được giữ dính trên bản mỏng bởi một chất kết dính hữu cơ hay vô cơ thêm
vào trong quá trình chế tạo:
- Chất kết dính hữu cơ: tinh bột, polymer hữu cơ, …
- Chất kết dính vô cơ: CaSO4.2H2O (gypsum), v.v.
Chất chỉ thị phát huỳnh quang (fluorescent) được thêm vào pha tĩnh để hiển thị các chất
hấp thu trong vùng UV. Có thể dùng Kẽm orthosilicate ZnSiO4, Mn hoạt hóa, …

III. CẤU TẠO CỦA BÌNH GIẢI LY

Thường bằng thủy tinh trong suốt, kích thước chỉ nên lớn hơn kích thước bản mỏng một
chút, và có nắp đậy kín.

IV. TRÌNH TỰ THỰC HIỆN

1. Lắp đặt hệ sắc ký
• Chuẩn bị vi mao quản từ các ống thủy tinh để lấy mẫu
• Chuẩn bị bản mỏng dài khoảng 25 cm (cắt ra từ bản 2020 cm).
• Dùng bút chì vạch nhẹ mức xuất phát và mức
tiền tuyến dung môi (có thể được vạch sau khi
kết thúc giải ly).
• Chuẩn bị dung dịch mẫu: Hòa tan mẫu trong
dung môi hữu cơ thích hợp (không nhất thiết
là dung môi giải ly) với nồng độ 2 – 5%.

Trang 125
 2. Chấm mẫu
Cho dung dịch mẫu lên bản mỏng bằng vi quản, để sau một thời gian để dung môi hòa tan
bay hơi hết, để lại mẫu trên bản.
Vết chấm không nên quá đậm đặc và quá rộng, làm giảm hiệu quả tách → Muốn cho nhiều
chất không cho cùng lúc mà lặp lại quy trình chấm 1 lượng nhỏ, đợi khô nhiều lần.

- Nếu nồng độ quá thấp: Vết mờ, khó quan sát

- Nếu nồng độ cao, vết rộng: Khả năng hòa tan của dung môi có giới hạn. Nếu dung
môi đi qua kéo hết toàn bộ chất thì vết gọn. Nếu nồng độ quá lớn, 1 lần đi qua dung
môi không tải hết được mà phải đợi thêm lần dung môi sau → Xảy ra hiện tượng kéo
đoạn (tailing) do các chất không đi cùng lúc mà có chất đi trước, có chất đi sau. (vết
bên trái ngoài cùng ở hình dưới), làm khó xác định khoảng cách tới vạch chuẩn.

Có thể chấm nhiều mẫu lên bản mỏng, các vết cách nhau 1 cm, cách bìa 1,5 cm.
Có thể chấm nhiều mẫu vào cùng một điểm (nội chuẩn).

Trang 126
 3. Giải ly
Cho khoảng 10 mL dung dịch giải ly vào bình.

- Mực dung môi giải ly phải thấp hơn mức xuất phát của bản mỏng, tránh hòa tan các
vết chấm.
- Lượng dung môi giải ly phải đủ lớn để bão hòa bầu khí quyển của bình & phải đợi 1
thời gian để dung môi bão hòa hết bên trong bình: Nếu dung môi không bão hòa, phía
ngoài dễ bay hơi tránh hiện tượng mức tiền tuyến dung môi có hình lõm (do dung
môi 2 bên cạnh dễ bay hơi hơn phía trong do tiếp xúc với môi trường nhiều hơn, do
đó phần ngoài rìa đi lên nhanh hơn phần bên trong).

- Giấy lót (Paper Wick) có thể không cần nếu bình không quá cao. Giấy lót có tác động tạo
điểm neo để dung môi có thể bay hơi lên phần phía trên bình nhanh hơn bằng cách thấm
ướt phần dung môi dần lên mép lên. Lượng dung môi này tiếp tục bay hơi, giúp bão hòa
toàn bộ không gian bình.

Trang 127
 Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của tấm ngập vào dung dịch giải ly khoảng
0.5 cm, có thể bắt đầu tính thời gian giải ly.
Dung môi giải ly bắt đầu đi lên bản mỏng nhờ lực mao dẫn và đẩy các vết mẫu với tốc độ
khác nhau tùy thuộc vào mức độ tương tác của mẫu với pha tĩnh và độ tan của mẫu trong pha
động.
Lấy bản mỏng ra khỏi bình khi dung môi lên đến cách cạnh trên  0,5 cm. Dùng viết chì
vạch nhẹ ngay mức tiền tuyến, tránh để dung môi lên quá cạnh trên của bản do có khả năng đẩy
tràn cấu tử ra khỏi rìa bản.
Để dung môi bay hơi hoàn toàn.

4. Hiện hình vết sau giải ly

Một số hợp chất có màu có thể thấy được bằng mắt thường, nhưng đa phần các hợp chất
hữu cơ là không màu. Có thể sử dụng phương pháp vật lý hoặc hóa học để hiện các vết.

a) Phương pháp vật lý

• Nguyên tắc:
Đèn chiếu UV bị hấp thụ bởi các chất chỉ thị phát huỳnh quang và phát huỳnh quang.
Các hợp chất hữu cơ hấp thu tia UV, ở các vị trí đó, chất phân tích hấp thu UV thay cho
bản mỏng và tạo thành vệt đen → Định được vị trí của chất

(a) – Sử dụng đèn chiếu tia UV, (b) – Sử dụng đèn UV trong hộp tối
Trang 128
 Thông thường sử dụng đèn UV có thể chiếu 2 loại tia 254 nm (vết có màu tối sẫm trên nền
màu bản mỏng xanh lục) và 366 nm (vết có màu sáng trên nền màu sẫm).

Đèn chiếu tia UV 254 nm Đèn chiết tia UV 366 nm

• Phạm vi áp dụng:
Các chất có khả năng hấp thu tia UV ở các bước sóng đó. Các chất có ít liên kết đôi thường
hấp thu ở 254 nm, có một vài liên kết đôi có khả năng hấp thu ở 366 nm.
Không áp dụng với các chất có liên kết bão hòa (hợp chất no) do không hấp thụ ở vùng
bước sóng này.

b) Phương pháp hóa học

• Nguyên tắc:
- Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng.
- Thuốc thử được hòa tan trong dung môi thích hợp → Đa số phá hủy mẫu
- Thuốc thử + Hợp chất → dẫn xuất có màu.
• Phân loại thuốc thử:
Thuốc thử không đặc trưng (universal) và thuốc thử đặc trưng.

Trang 129
 • Một số thuốc thử phổ biến

Thuốc thử Đặc trưng Hợp chất Màu của vết Ghi chú

Không
Hơi I2 Vàng/Nâu
phá hủy mẫu
Xanh đen trên
CAM Cần gia nhiệt
nền sáng
Hiệu quả nhất với Đen trên nền
Ce(SO4)2 Cần gia nhiệt
alkaloids vàng-trắng
Không
Chromic acid Đen
Morin hydrate Huỳnh quang
Phosphomolybdic
Blue-dark green
acid PMA
Sulfuric Acid Vệt than Cần gia nhiệt
Vanilin Nhiều Cần gia nhiệt
p-anisaldehyde Carbohydrate Khác nhau Cần gia nhiệt
Yellow-Green
Bromocresol Green Carboxylic Acid
trên nền xanh
2,4-DNP Aldehydes & Ketones Cam
Amines trơ (amine có gắn
Dragendorff Cam
nhóm bảo vệ), alkaloids

Amines, Dẫn xuất

Gia nhiệt nhẹ,
Ehrlich Indoles, Steroids, Thuốc
thời gia ngắn
Có kháng sinh
Ferric Chloride Phenols
Iodoplatinate (PIP) Alkaloids
Amines, Amino acids &
Ninhydrin
đường amino
Hydrocarbon
Hợp chất không phân cực Vàng trên nền không cần đun
KMnO4
& alcohols tím nóng, còn lại
cần

Trang 130
V. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Dung môi sẽ thẩm thấu từ từ qua bản và đi lên vạch đích. Khi đi lên, dung môi sẽ lôi cuốn
các cấu tử cần khảo sát đi lên nhưng với tốc độ khác nhau (do độ phân cực khác nhau nên tương
tác phân cực khác nhau). Sau khi hiện hình các vết giải ly, ta thu được vị trí của các vết giải ly.

Đặc trưng vị trí vết giải ly thể hiện bởi Hệ số lưu Rf:

a
R f ( A) =
d
Trong đó: d là quãng đường dung môi đi được.
a, b,c là các quãng đường các cấu tử A, B, C đi được.

1. Đại lượng ảnh hưởng Rf

• Bản chất của pha tĩnh (vật liệu trên bản mỏng).
• Bản chất của pha động (dung môi giải ly).
• Bề dày bản mỏng

Trang 131
 • Lượng mẫu và bản chất của chất chấm lên bản.
• Nhiệt độ.
• Điều kiện bão hòa khí quyển
Do đó, cần có chất chuẩn cho mỗi bản.

2. Ý nghĩa giá trị Rf

Đặc trưng cho độ phân cực của chất phân tích. Rf càng cao, chất phân tích độ phân cực càng
thấp do càng ít bị giữ bởi bản mỏng.
Thứ tự Rf chỉ phụ thuộc bản chất chất phân tích. Việc thay đổi các điều kiện khác chỉ
làm thay đổi độ lớn chứ không làm thay đổi thứ tự rửa giải.

VI. ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ BẢN MỎNG

6.1. Theo dõi diễn tiến phản ứng tổng hợp hữu cơ
Nguyên tắc: So sánh độ đậm nhạt với các chất chuẩn của chất tham gia phản ứng và sản
phẩm, so sánh độ đậm, nhạt của vết.

6.2. Sơ bộ số hợp chất trong mẫu

Chuẩn bị nhiều bản và giải ly với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi tách được
tối đa các hợp chất trên bản.
N vết chưa chắc là N chất vì có khả năng độ phân giải thấp nên 2 vết của 2 chất trùng nhau.

6.3. Sơ bộ thành phần các chất trong mẫu

Dựa vào độ đậm nhạt của vết để xác định sản phẩm chính, tạp chất để đề xuất phương pháp
cô lập và tinh chế.

6.4. Xác định độ phân cực của hợp chất

Giải ly với nhiều loại hệ dung môi với độ phân cực tăng dần và quan sát kết quả
Chất có giá trị Rf nhỏ ngay cả với hệ dung môi phân cực mạnh là các chất phân cực mạnh
Chất có giá trị Rf lớn ngay cả với hệ dung môi phân cực trung bình là các chất phân cực yếu

Trang 132
 6.5. Tìm hệ dung môi cho sắc ký cột
Mẫu là sản phẩm của phản ứng tổng hợp hữu cơ (hỗn hợp chứa 2 – 3 chất): Chọn hệ dung
môi sao cho chất quan tâm có Rf từ 0,2 đến 0,7 (tối ưu từ 0,3 đến 0,6) và đủ sức để tách rời chất
quan tâm khỏi các vệt khác gần đó.
Ví dụ: Chọn hệ dung môi c là phù hợp vì năng lực rửa giải quá yếu làm chất không bị rửa
giải (như hình a) hay quá mạnh làm chất đi quá nhanh (như hình b). Tuy nhiên cần thực hiện
thêm 1 vài nồng độ xung quanh để tách xa thêm 2 vết trên hình c.

Mẫu là cao thô chiết xuất từ cây cỏ (gồm nhiều hợp chất từ không phân cực đến rất phân
cực): Chọn hệ dung môi đầu tiên sao cho chất ít phân cực nhất có Rf = 0,5 và hệ dung môi sau
đó sao cho chất phân cực nhất có Rf = 0,2.
Áp dụng hệ dung môi trên cho sắc ký cột, có thể giảm độ phân cực của hệ dung môi một
chút vì chất lượng pha tĩnh trên cột kém hơn chất lượng pha tĩnh trên bản mỏng.

6.6. Kiểm tra độ tinh khiết của chất

Thay thế cho HPLC
Chuẩn bị 3 bản và giải ly mẫu với 3 hệ dung môi khác nhau về độ phân cực
Ví dụ: Hexane : CHCl3 (3:1), CHCl3 : EtOAc (1:1), CHCl3 : MeOH (9:1)
Nếu cả 3 bản cùng cho vết tròn, gọn là mẫu tinh khiết, nếu có thêm vết khác là mẫu còn tạp
chất cần tinh chế thêm.

6.7. Công bố đặc điểm sơ bộ sản phẩm mới

Giá trị Rf của một chất mới tổng hợp hay mới cô lập có ý nghĩa cung cấp thêm thông tin
đặc trưng của chất đó bên cạnh các dữ liệu như NMR, MS, IR, EA và nhiệt độ nóng chảy.
Tuy nhiên do giá trị Rf dễ thay đổi theo nhiều yếu tố nên không có độ tin cậy cao.

Trang 133
VII. SẮC KÝ BẢN MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPTLC – HIGH PERFORMANCE THIN
LAYER CHROMATOGRAPHY)
Sắc ký bản mỏng hiệu năng cao dựa trên cùng nguyên lý với TLC, tuy nhiên được điều
chỉnh để hiệu suất phân tách đạt cao hơn và có thể định lượng/xác định cấu trúc ngay trong quá
trình. Hiện nay bộ các thiết bị phục vụ cho HPTLC đã được thương mại hóa.

Thiết bị HPTLC có thể:

- Sử dụng bản mỏng với kích thước pha tĩnh mịn hơn, đồng đều hơn → Tăng hiệu quả
phân tách
- Tự động thực hiện các thao tác: Load mẫu trên bản mỏng, sử dụng dung môi giải ly →
Thao tác chính xác, hạn chế lỗi, thực hiện nhanh, có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu
trong thời gian ngắn
- Phần mềm theo dõi và điều khiển các thao tác: Điều khiển lượng dung môi giải ly, đặt
và lấy bản mỏng lúc phân tích, kiểm soát điều khiển khí không trong buồng giải ly,
kiểm soát gradient dung môi khi chạy sắc ký

Trang 134
- Lắp đặt cùng với các thiết bị đo độ đen, đầu dò khối phổ, UV, … để phân tích định
lượng & cấu trúc của chất đồng thời với kết quả.

Thiết bị chấm mẫu tự động lên bản TLC

Trang 135
 Buồng giải ly HPTLC

• So sánh TLC và HPTLC



Trang 136
 CHƯƠNG 3.4 – SẮC KÝ CỘT
(CC – COLUMN CHROMATOGRAPHY)

I. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ CỘT

1.1 Nguyên tắc

- Pha tĩnh: Chất hấp phụ được nhồi trên cột, thường sử dụng silicagel, boned-phase silica gel,
alumina, polystyrene
- Pha động dung môi được cho chạy liên tục từ trên xuống. Dung môi di chuyển xuống do
trọng lực, chảy qua chất phân tích, kéo các chất phân tích xuống với các tốc độ khác nhau.
1.2 Mục đích sử dụng
- Tách & tinh chế các chất hữu cơ (chất tổng hợp, chất tự nhiên)
- Định lượng các thành phần trong mẫu, có thể xác định cấu trúc khi kết hợp với khối phổ

Trang 137
 1.3 Cấu tạo cột sắc ký
Cột thủy tinh hình trụ, chiều dài cột vài cm – 1 m, đường
kính trung bình khoảng 1/15 chiều dài.
Trọng lượng silica gel khoảng 25 – 50 lần trọng lượng
của mẫu.
Chiều cao silica gel và đường kính cột = 10:1.
Đáy cột được bít bằng bông.
Trên lớp bông là lớp cát  1 cm.
Trên lớp cát là lớp pha tĩnh: silica gel hay alumina, bề
mặt lớp này càng bằng phẳng càng tốt.
Trên lớp pha tĩnh, cuối cùng là lớp cát  1 cm.

II. TRÌNH TỰ THỰC HIỆN

2.1 Nhồi cột
Có 2 cách nhồi cột: Nhồi cột ướt & cột khô
- Cột ướt: Cho pha tĩnh & dung môi hòa tan rồi mới cho vào cột
- Cột khô: Cho pha tĩnh vào trước, dung môi hòa tan vào sau
→ Cột ướt ưu điểm hơn do dễ ổn định trước (kiểm soát không để bọt khí, pha tĩnh trương
đều, …), khi cho vào cột hệ đã ổn định rồi.

Trình tự nhồi cột ướt:

Cho silica vào cột rỗng để đo một lượng silica thích hợp.
Cho silica đã đo vào erlen 250 mL, cho vào dung môi kém phân cực (dung môi trắng) ngập
lớp silica.
Bít đáy cột bằng bông: Lượng bông chỉ đủ để cát không lọt qua vòi khóa cột mà không làm
thay đổi tốc độ pha động.
Giữ cột cố định bằng kẹp trên và kẹp dưới: cột phải được giữ thẳng đứng.
Thêm vào lớp cát thô (loại dành cho sắc ký).
Thêm vào lớp dung môi khoảng 5 cm.
Gõ vào cột để cố định lại lớp cát.
Nhồi cột bằng silica: lớp silica phải luôn ngập trong dung môi, không để cột khô.
Vừa nhồi vừa gõ cột để cố định lớp silica.

Trang 138
 Chú ý:
- Dung môi trắng sử dụng thường là hexane hoặc chloroform (càng ít phân cực càng
tốt). Dung môi trắng được dùng để cho silicagel vào cột dễ dàng hơn, không ảnh
hưởng tới kết quả.

2.2 Chuẩn bị mẫu

Nếu mẫu ở dạng khô (không tan được trong dung môi): Cho mẫu, silica gel và dung môi
theo tỷ lệ khối lượng 01:10:50, khuấy trộn để phân tán đều, sau đó cô quay hỗn hợp trong chân
không cho đến khi khô. Mẫu phân tán lúc này trộn lẫn với pha tĩnh, sau đó cho vào cột.
Nếu mẫu tan được trong dung môi: Hòa tan vào tối thiểu dung môi (độ phân cực thấp
nhất) rồi cho vào cột, tốt nhất sử dụng hệ dung môi rửa giải, nếu không:
- Dùng CH2Cl2/toluene nếu Rf < 0,3
- Cho mẫu khan dung môi nếu Rf lớn
Khóa vòi cột, cho trước vào cột lớp dung môi 1 – 2 mm.
Dùng pipette Pasteur để cho mẫu vào cột sắc ký sao cho không làm xáo trộn lớp cát và
không để mẫu thấm vào lớp silica trước khi cho hết mẫu.

Pipette Pasteur
Sau khi cho hết mẫu, bắt đầu cho dung môi chạy, luôn đảm bảo lượng dung môi cao hơn
lớp cát 3 – 10 cm.

• Lưu ý:
- Cho mẫu dùng pipette sát thành cột, cho chảy thành dải đều xuống: Để không ảnh hưởng
đến bề mặt cột, tạo bọt khí – vùng không liên tục gây sai kết quả phân tích
- Đảm bảo mẫu được hấp phụ vào pha tĩnh rồi mới cho dung môi giải ly. Nếu dung dịch
chưa hấp phụ vào bề mặt cột mà đổ dung môi vào → Hòa tan vào dung môi phía trên,
không tách được
Trang 139
 2.3 Chạy cột
Rửa giải cột với tốc độ  5 cm/phút, thu mỗi phân đoạn mỗi 30s.
Kiểm tra thành phần mỗi phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, phổ UV-VIS, NMR, MS.
Gom các phân đoạn có thành phần giống nhau lại và loại bỏ dung môi để thu được sản
phẩm mong muốn.



Trang 140
 CHƯƠNG 3.5 – SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC – HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

I. ĐẠI CƯƠNG & THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.1 Nguyên tắc
Cùng nguyên tắc với sắc ký cột nhưng sử dụng kỹ thuật để nâng cao hiệu quả phân tách:
- Pha tĩnh: Độ nén, độ đồng đều cao → Diện tích bề mặt lớn, độ phân giải cao hơn
- Áp suất vận hành cao, 3000 – 4000 psi
- Hệ thống pha động gồm nhóm các hệ dung môi, phục vụ cho việc chạy dung môi
gradient (sơ đồ trên), tăng hiệu quả phân tách & giảm thời gian phân tách khi cần thiết

Trang 141
 1.2 Bình chứa dung môi
Nếu dung môi môi không được sử dụng trực tiếp từ bình chứa gốc thì cần phải lọc (0,5 hoặc
0,8 micrometer) trước khi dùng để loại bỏ các hạt có thể làm hỏng bơm, tắc các ống dẫn và cột
phân tích.
Dung môi cần được khử khí, đặc biệt là các dung môi phân cực có khả năng hoà tan khí
tương đối cao, các bong bóng khí hòa tan sẽ xuất hiện ở detector, làm baseline không được ổn
định sinh ra các extra peak ảnh hưởng đến độ chính xác kết quả phân tích. Peak có thể bị nhỏ do
oxygen hoà tan trong dung dịch hấp thu UV ở bước sóng thấp làm giảm cường độ huỳnh quang.
Có thể khử khí bằng siêu âm, helium hoặc thiết bị chuyên biệt (có màng chọn lọc khí và lỏng
trong môi trường chân không).
Nếu hệ dùng gradient dùng môi thì mỗi dung môi để ở 1 bình chứa riêng biệt và nối với bộ
phận phân phối dung môi.

1.3 Bộ phận phân phối dung môi (valve định lượng, bơm, buồng khuấy, pulse
damper)
Do pha động có thể có độ nhớt cao và được ép đi qua pha tĩnh nhồi rất đặc khít nên bơm
cần tạo áp suất cao để cho dòng chảy ổn định, chính xác với yêu cầu.
Có thể đo lượng dung môi cần thiết trước, vào buồng khuấy sau đó mới đến bơm cao áp (i)
hoặc từng bơm cao áp sẽ bơm lượng dung môi riêng sau đó mới vào buồng khuấy cao áp (ii).
Bơm có thể cung cấp một chuỗi các xung đập của pha động trong khi đa số các detector
đều nhạy cảm với các xung này nên chúng cần được loại bỏ bằng pulse damper.
Isocratic: Bơm thành phần pha động không thay đổi.
Gradient: Bơm thành phần pha động thay đổi để đảm bảo các cấu tử bị rửa giải nhanh vẫn
tách tốt và các cấu tử bị lưu giữ mạnh thì được rửa giải nhanh hơn.

1.4 Bộ tiêm mẫu

Bộ tiêm mẫu thường: Chỉ áp dụng được với áp suất dưới 100bar
Loop injector: Sử dụng áp suất cao. Ở vị trí load, loop được làm đầy ở áp suất khí quyển.
Phần mẫu thừa được thải ra ngoài loop để bảm bảo không còn vết của mẫu cũ sót lại. Khi chuyển
valve từ vị trí load sang vị trí inject, loop sẽ được kết nối với dòng pha động ở áp suất cao, theo
đó được đưa vào cột

Trang 142
 Autosampler: Tự động hoá với công nghệ robot để tăng khả năng tái sử dụng và cho phép
xử lý liên tục nhiều mẫu cùng lúc. Mẫu được đựng trong các lọ, các lọ này có thể ở trong giá đỡ
hoặc đĩa. Ống tiêm sẽ định vị mẫu, sau đó hút mẫu với lượng đã được cài đặt trước và tiêm vào
loop. Kim tiêm sẽ được rửa sau mỗi lần tiêm mẫu, thường với pha động nhưng không có chất
đệm.

1.5 Cột phân tích

Đa số các cột HPLC được làm bằng thép không gỉ (316) hoặc thủy tinh, nhựa, …để chịu
được áp suất cao và tương đối trơ với ăn mòn hoá học, bề mặt trong không được gồ ghề.
Có thể có các phần phụ:
- Buồng điều nhiệt cho cột phân tích
- Precolumns được đặt trước vị trí tiêm mẫu để điều chỉnh pha động. Cột chứa silica
thô để những dung môi nào có khả năng hoà tan silica để tạo silicic acid đều đã bão
hoà với silicic acid trước khi vào cột phân tích.
- Guard columns được đặt giữa vị trí tiêm mẫu với cột phân tích. Cột được nhồi với
pha tĩnh giống y hệt hoặc tương tự với cột phân tích để ngăn các tạp chất như những
cấu tử bị lưu giữ mạnh khỏi làm bẩn cột phân tích.
- Post-column apparatus: Tạo dẫn xuất sau cột, để phân tích nếu cần thiết

Trang 143
 1.6 Detector
Detector nhận biết thời điểm chất phân tích được rửa giải khỏi cột, theo dõi sự thay đổi về
thành phần pha động rồi chuyển thành tín hiệu điện, thể hiện qua màn hình bằng độ chênh lệch
với baseline tạo thành các peak.
Đầu dò tử ngoại (UV):
Đầu dò UV thông thường sử dụng đèn phóng điện Deuteurium (đèn D2) cho bức xạ bước
sóng 190 – 380 nm. Nếu cấu tử có nhiều liên kết đôi, người ta sử dụng detector UV/VIS, sử dụng
thêm đèn Tungsten (W) cho bức xạ bước sóng từ 190 – 700 nm.
Bức xạ từ các đèn được phản xạ lại bởi cách tử sao cho với mỗi góc quay của cách tử, chỉ
duy nhất 1 bức xạ với bước sóng xác định đi qua gương và đi thẳng vào flow-cell. Bằng cách đổi
góc quay cách tử có thể thay đổi bước sóng tia UV/VIS dùng để đo. Gương cũng có vai trò phản
xạ một phần bức xạ và thu nhận tia so sánh để đảm bảo không có sai lệch bước sóng.
Pha động đi qua một flow-cell có thể tích nhỏ có đặt máy đo cường độ của tia UV/VIS. Khi
cấu tử có cấu tử đi cùng với pha động, cấu tử hấp thu tia UV/VIS đi qua flow-cell, làm cường độ
tia UV/VIS đầu ra thay đổi so với cường độ đầu ra khi chỉ có pha động. Từ sự khác biệt về cường
độ tia UV/VIS và hệ số hấp thu mol của cấu tử và dung môi sẽ cho kết quả về nồng độ của mẫu.

Phổ biến nhất, ít bị ảnh hưởng bới nhiệt độ và phù hợp với rửa giải gradient nhưng phụ
thuộc lớn vào khả năng hấp thu UV của hợp chất. Với hợp chất có độ hấp thu thấp (các hợp chất
bão hòa) thì không sử dụng đầu dò UV. Ngược lại một số hợp chất có độ hấp thu quá lớn sẽ làm
peak hiển thị rất lớn dù nồng độ nhỏ, ảnh hưởng đến độ chính xác.

Trang 144
 Đầu dò Phototodiode Array (PDA – Photodiode Array):
Cùng nguồn sáng với đầu dò UV-VIS (Đèn Tungsteng và Deuteurium), bức xạ gồm hỗn
hợp nhiều bước sóng được dẫn thẳng qua flow-cell. Dung môi và cấu tử sẽ hấp thu theo khả năng
ở các bước sóng. Sau đó bức xạ ra được dẫn vào cách tử nhiễu xạ để tán xạ thành một dải các tia
sáng và dẫn vào diode quang học.

Diode quang học là các bán dẫn, khi nhận tia bức xạ sẽ tạo thành các lỗ trống, từ đó dẫn
điện. Ứng với mỗi bước sóng ở từng vị trí, dựa vào cường độ dòng điện mà đo được cường độ
đầu ra của từng bước sóng, từ đó xác định được sự hiện diện của cấu tử.

Nguyên tắc tương tự với đầu dò UV-VIS nhưng có thể đo với một dải các bước sóng khác
nhau chứ không đo cường độ ở 1 bước sóng nhất định. PDA dễ bị ảnh hưởng bởi nhiễu do cường
độ bức xạ của từng bước sóng nhỏ và không có tia so sánh nên không xác định được sai lệch từ
vị trí, khả năng phát xạ của đèn và cách tử.

Trang 145
 Đầu dò tán xạ ánh sáng (ELS – Evaporative Light-Scattering):
Đầu dò dựa trên khả năng tán xạ ánh sáng của cấu tử. Dung môi và cấu tử sau khi ra khỏi
HPLC (HPLC effluent) được dẫn qua thiết bị phun sương (nebulizer) và dẫn đồng thời khí
Nitrogen để hóa hơi dung môi, cấu tử đi qua Light-scattering cell là buồng được chiếu xạ ánh
sáng Laser đơn sắc, dựa trên cường độ tia tán xạ đo được và khả năng tán xạ của dung môi và
cấu tử sẽ tính toán được nồng độ.

Đầu dò ELS thường được áp dụng chung với đầu dò UV để định lượng được toàn bộ các
cấu tử có thể có trong mẫu (cả mẫu hấp thu & không hấp thu UV).

Đầu dò tán xạ ánh sáng có thể định lượng được cả các hợp chất không hấp thu tia UV như
carbohydrates, lipid, polymer, … và áp dụng với các chất khó bay hơi.

Trang 146
 Đầu dò huỳnh quang (FL – Fluorescene):
Dựa vào tính huỳnh quang của các cơ chất. Ánh sáng phát ra được dò ở vị trí vuông góc
với tia chiếu xạ để hạn chế nhiễu, sau đó được phát hiện tương tự như UV/VIS detector.

Ưu điểm: đầu dò huỳnh quang nhạy cảm và có tính chọn lọc với các hợp chất có tính chất
trên. Hơn nữa do bước sóng kích thích và phát ra có thể khác nhau càng làm tăng độ chọn lọc.
Nhược điểm: Đa số trường hợp phải tạo dẫn xuất với các thực thể huỳnh quang do khá ít
chất có huỳnh quang tự nhiên.
Đầu dò chiết suất (RI – Refractive index):
Ghi lại toàn bộ vùng rửa giải có chiết suất khác với pha động thuần (không chứa mẫu). Tín
hiệu sẽ mạnh hơn nếu chiết suất giữa mẫu mà pha động càng lớn.

RI detector kém nhạy do:

- Sự khác biệt về chiết suất giữa các chất phân tích với nhau và giữa dung môi khi có
và không có chất phân tích
- Nhạy với nhiệt độ và áp suất
- Cần thời gian đủ lâu để đo chiết suất
→ Không dùng trong rửa giải gradient.

Trang 147
 Đầu dò độ dẫn (CD – Conductivity): Theo dõi sự khác biệt về khả năng dẫn điện của
dòng rửa giải có chứa mẫu và không chứa mẫu. Độ nhạy giảm khi độ dẫn của pha động tăng.

Đầu dò điện hoá (EC – Electrochemical): Liên quan với sự oxi hoá hoặc khử của chất
hoà tan khi chúng được rửa giải ra khỏi cột. Độ tương thích của đầu dò này còn phụ thuộc vào
tính chất oxy hoá khử của các phân tử hoà tan trong môi trường pha động. Ưu điểm, độ nhạy, độ
chọn lọc cao, phạm vi tuyến tính rộng.

Mass Spectrometry (MS): Kết hợp với bộ phận ion hóa và phân tích khối phổ (MS) để
đồng thời định danh từng peak. Thông thường, dòng sản phẩm ra được tách dòng, 1 phần nhỏ
dẫn vào thiết bị phân tích khối phổ, phần còn lại đi qua detector thông thường để không tiêu tốn
lượng hoạt chất quý hiếm.

Trang 148
 Bộ phận thường qua 2 bước:
Bước 1: Hóa hơi mẫu
Bước 2: Ion hóa hơi nguyên tử trung hòa thành ion, có 2 phương pháp chính:
• Electron impact ionization
Tạo electron điện thế cao, bay tốc độ lớn, va chạm vào phân tử → Đá văng electron ra ngoài
và bẻ gãy liên kết (70eV)
Nếu không đủ năng lượng (< 70 eV): Đi xuyên qua và không va chạm với liên kết
Phun hỗn hợp qua và va chạm và electron, electron bắn phá làm phân tử bị mất electron,
phá vỡ liên kết tạo các mảnh ion nhỏ hơn, các ion phân tử và mảnh ion bị đẩy ra và qua bộ phân
phân tích.

Do ion phân tử dễ bị phá vỡ tạo ra nhiều mảnh nhỏ ion con → Ion mẹ không phải nhiều
nhất mà ion con nhiều nhất → Nếu ion mẹ bị phân mảnh ra sẽ khó xác định phân tử gốc.

• Ion hóa mềm (Soft Ionization)

Giữ nguyên được cấu trúc ion phân tử. Nếu ion phân tử bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion
nhỏ sẽ khó nhận biết ion phân tử gốc.
Tuy nhiên, thông tin về cấu trúc sẽ ít hơn. Do đó, thông thường ion hóa mềm hay kết hợp
với khối phổ song song (tandem mass spectrometry – MS/MS).
Gồm: ESI (Electrospray Ionization) & APCI/CI [ (Atmospheric-Pressure) Chemical
Ionization).

Trang 149
 ESI (Electrospray Ionization)

APCI/CI [ (Atmospheric-Pressure) Chemical Ionization): Đưa dòng khí tác nhân phản
ứng với chất phân tích để tạo thành ion.

Trang 150
 Tandem Mass Spectroscopy (MS/MS): Ion mẹ từ thiết bị MS thứ nhất được phân mảnh
thứ cấp ở bộ phận MS thứ hai → Cung cấp thêm thông tin cấu trúc.

1.7 Bộ thu thập và xử lý dữ liệu

Kết nối với đầu ra của đầu dò, lấy tín hiệu điện đó để xuất ra sắc ký đồ tương ứng để định
tính và định lượng.


Trang 151
 CHƯƠNG 3.6 – PHÂN TÍCH CÁC THÔNG SỐ TỪ SẮC KÝ ĐỒ
& TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

I. CÁC THÔNG SỐ TỪ SẮC KÝ ĐỒ

1. Sắc ký đồ
Là đồ thị mô tả độ mạnh yếu của tín hiệu từ detector theo thời gian phân tích. Sắc ký đồ
cung cấp các thông tin quan trọng cho quá trình sắc ký như thời gian lưu, bề rộng chân peak để
tính toán các thông số và đánh giá hiệu quả sắc ký.

2. Thời gian lưu

Thời gian lưu của cấu tử là khoảng thời gian cấu tử bị giữ lại trong thiết bị sắc ký, tính từ
lúc tiêm mẫu đến khi tín hiệu của của cấu tử đó đạt cực đại.
Thời gian lưu chết là thời gian của cấu tử hoàn toàn không tương tác với pha tĩnh (như
methane, argon, …) bị rửa giải ra khỏi thiết bị. Các cấu tử này di chuyển cùng tốc độ với pha
động và được cho thêm vào để đo tốc độ pha động.
Thời gian lưu hiệu chỉnh là khoảng cách giữa thời gian lưu và thời gian lưu chết.

3. Diện tích – Chiều cao – Bề rộng chân peak

Theo lý thuyết, peak sắc ký sẽ nhọn và là một đường gần như thẳng đứng. Tuy nhiên do
trong quá trình di chuyển, các phân tử cùng loại có thể va chạm với nhau dẫn đến một số cấu tử
di chuyển nhanh hơn, một số cấu tử di chuyển chậm hơn là dãn rộng peak. Bề rộng chân peak w
là khoảng cách giữa hai giao điểm của đường tiếp tuyến với điểm uốn của peak với trục hoành.
Trang 152
 Diện tích peak tỉ lệ thuận với nồng độ của cấu tử trong cột: S = kC và thường được ứng
dụng để định lượng trong sắc ký.
Chiều cao peak có thể xem xấp xỉ tỉ lệ thuận với nồng độ cấu tử trong cột và thay thế diện
tích trong định lượng nhưng kém chính xác hơn do chiều cao peak tỉ lệ nghịch với bề rộng chân
peak nên nếu điều kiện sắc ký thay đổi làm bề rộng chân peak của các cấu tử khác nhau dãn cách
nhau dẫn đến chiều cao peak thay đổi không đồng đều nên giảm độ chính xác.
4. Độ bất đối xứng của peak
Trong trường hợp lý tưởng, hình dạng của peak sẽ gần giống như hình dạng của biểu đồ
phân phối chuẩn và đối xứng với nhau. Trường hợp này xảy ra khi hệ số phân bố của cấu tử giữa
hai pha tĩnh và pha động là không đổi với mọi nồng độ.
Trong một số trường hợp, do ảnh hưởng của điều kiện sắc ký sẽ làm cột bất đối xứng:
• Hình a: “Tailing”, hình dáng peak trải dài ra về phía đuôi, thường xả ra khi load
cột với quá nhiều mẫu.
• Hình b: “Fronting”, hình dáng peak trải dài ra về phía trước, thường do pha tĩnh
có ái lực không đồng đều giữa những vị trí khác nhau trong cột.

Để đo đường độ bất đối xứng của cột, người ta xác định độ bất đối xứng của cột như sau:

Trang 153
 Để có thể đo lường các thông số chính xác, độ bất đối xứng của peak được giới hạn:

II. CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

1. Độ phân giải
Biểu diễn khả năng phân tách của cột phân tích giữa hai peak sắc ký
tr , B − tr , A
R=
0,5 ( w B + w A )

Độ phân giải cho biết sự chồng lấp của các peak như sau:
- R = 0,75: Hai peak không tách được
- R = 1,0: Hai peak chồng lấp ≈ 4%;
- R = 1,5: Hai peak chồng lấp ≈ 0,3%
- A và B được xem là tách hoàn toàn nếu R ≥ 1,5

2. Hệ số chứa:
Biểu diễn khả năng lưu giữ chất phân tích bởi pha tĩnh/
tr − tm tr' V
k'= = =D s
tm tm Vm

Hiệu quả cột sắc ký tốt khi giá trị hệ số chứa nằm trong khoảng từ 1 đến 10.
Hệ số chứa càng lớn, mẫu càng bị lưu giữ mạnh trong cột trong thời gian dài do tương tác
mạnh với pha tĩnh. Nếu quá lớn dẫn đến thời gian phân tích dài quá mức cần thiết.
Nếu quá nhỏ, chất cần phân tích bị giữ lại kém và hầu như không tương tác với pha tĩnh
nên có thể năng bị rửa giải chung với các cấu tử khác.
Trang 154
 3. Độ chọn lọc của cột
Biểu diễn tính chọn lọc của cột đối với một trong các chất tan, thể hiện khả năng phân biệt
về mặt hóa học của cột với các cấu tử.
k B' tr , B − tm
= =
k A' tr , A − tm

4. Hiệu năng của cột – Số đĩa lý thuyết:

Khi chất phân tích qua cột sắc ký, do ảnh hưởng của cột mà các chất phân tích cùng loại
không đi cùng với một tốc độ, dẫn đến dãn rộng chân peak, làm giảm hiệu quả phân tách. Hiệu
năng của cột dùng để đánh giá sự dãn rộng chân peak trong quá trinhfsawsc ký.
Trong việc đánh giá hiệu năng của cột dựa trên đĩa lý thuyết, cột được xem như chia thành
nhiều đoạn rất nhỏ rời rạc với nhau mà trong mỗi đoạn nhỏ đó các cấu tử phân bố giữa hai pha
tĩnh và pha động đạt đến trạng thái cân bằng (sự trao đổi đạt tối đa có thể). Đoạn nhỏ này được
xem như đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết càng nhiều, khả năng phân bố cấu tử của cột vào hai pha tĩnh và động càng
tốt, bề rộng của peak càng hẹp lại.
𝐿 𝑡𝑟 2
𝑁 = = 16 ( )
𝐻 𝑤

III. CÁC BIỆN PHÁP CẢI THIỆN ĐỘ PHÂN GIẢI

Từ biểu thức trên, để cải thiện độ phân giải, có 3 yếu tố cần phải quan tâm: Hiệu suất cột
(số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lý thuyết), hệ số chứa và độ phân giải.
1. Thay đổi hệ số chứa
a) Là một trong những phương pháp đơn giản nhất để cải thiện độ phân giải.
b) Phương pháp thực hiện
tr − tm tr' V
k'= = =D s
tm tm Vm

Thay đổi điều kiện sắc ký sao cho việc gia tăng hệ số chứa là đồng đều nhất có thể giữa các
cấu tử để tránh thay đổi độ chọn lọc.

Trang 155
 • Thay đổi thời gian lưu
- Với sắc ký khí: Thường được thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ của cột sắc ký. Nhiệt độ
thấp sẽ làm áp suất hơi của chất tan giảm, làm các chất tan bị giữ lại trong pha tĩnh nhiều
hơn (khó bay hơi hơn)
- Với sắc ký lỏng: Thay đổi độ phân cực của dung môi pha động. Việc giảm độ phân cực
của dung môi pha động sẽ làm cho các cấu tử bị giữ lại trong pha tĩnh không phân cực
nhiều hơn và ngược lại.
• Thay đổi thể tích pha tĩnh
c) Lưu ý
Khi độ chọn lọc  gần bằng 1, việc tăng hệ số chứa hay số đĩa lý thuyết thường không hiệu
 −1
quả. Do  0 . Lúc này phải tính đến phương án cải thiện độ phân giải bằng cách tăng độ

chọn lọc.
Chỉ có hiệu quả lớn khi hệ số chứa ban đầu nhỏ. Độ lớn hệ số chứa tăng lên không tỉ lệ với
độ lớn mà độ phân giải tăng lên.

Việc tăng hệ số chứa dẫn đến việc tăng thời gian phân tích.

Ví dụ: Tăng hệ số chứa từ 1 lên 10 thì độ phân giải cải thiện 82% nhưng tăng hệ số chứa từ
1 lên 15 thì độ phân giải chỉ cải thiện 87,5%.

Trang 156
 Giản đồ trên biểu diễn mối quan hệ giữa số lần hệ số chứa tăng lên (từ giá trị hệ số chứa
ban đầu là 1) và số lần mà độ phân giải tăng lên (đường 1) và số lần mà thời gian phân tích tăng
lên.
Ở đường 1, khi giá trị trục hoành càng tăng, độ dốc của đồ thị càng giảm, chứng tỏ việc
tăng độ phân giải ở các hệ số chứa càng lớn thì càng không hiệu quả.

d) Ưu điểm

Tăng hay giảm hệ số chứa sẽ làm tăng hay giảm tương ứng thời gian lưu. Có thể tận dụng
tính chất này để giảm đáng kể thời gian sắc ký. Từ đồ thị 1, ở đường 2, khi hệ số chứa lớn, việc
giảm hệ số chứa sẽ làm giảm đáng kể thời gian phân tích mà chỉ làm giảm một lượng nhỏ độ
phân giải.

e) Nhược điểm: Việc tăng hệ số chứa để làm tăng độ phân giải giữa cặp cấu tử A và
B nằm gần nhau có thể làm tăng đáng kể thời gian phân tích của các cấu tử phía
sau dù các cấu tử phía sau đã có thể tự phân tách mà không cần tăng độ phân giải.
Ngược lại, nếu áp dụng việc giảm hệ số chứa để giảm thời gian sắc ký có thể sẽ
làm giảm độ phân giải của các cấu tử vốn đã nằm gần nhau.

f) Phương pháp hạn chế hiện tượng trên:

• Sử dụng các chương trình điều khiển để thay đổi điều kiện sắc ký từ từ trong khoảng thời
gian phân tích.

Trang 157
 • Khi có các cấu tử nằm liền kề nhau, điều kiện phân tích sẽ gia tăng hệ số chứa để cải thiện
độ phân giải giúp phân tách hoàn toàn các cấu tử này.
• Khi đã phân tách các cấu tử nằm liền kề xong, điều kiện phân tích sẽ thay đổi theo hướng
giảm hệ số chứa, giảm thời gian lưu để giảm thời gian phân tích mà vẫn đảm bảo độ phân
giải đạt yêu cầu.
• Trong sắc ký khí: Thực hiện bằng các chương trình điều khiển nhiệt độ
• Trong sắc ký lỏng: Thay đổi độ phân cực của dung môi bằng cách sử dụng nhiều bình
dung môi với các độ phân cực khác nhau và thay đổi thành phần các dung môi này.

2. Thay đổi độ chọn lọc

a) Phương pháp thực hiện
Thay đổi điều kiện sắc ký sao cho quá trình sắc ký xảy ra chọn lọc hơn với một cấu tử nhất
định và liên quan đến tương tác hóa học giữa các cấu tử với nhau và với pha tĩnh, pha động.
Thuon gừ thực hiện bằng cách cho riêng một cấu tử tham gia vào một cân bằng hóa học thứ hai
nào đó.
TRONG SẮC KÝ LỎNG: Thường được thực hiện bằng cách thay đổi thành phần của pha
động.
Ví dụ: Trong quá trình tiến hành phân tách hỗn hợp benzoic acid và aspartame trong một
mẫu soda bằng HPLC pha đảo, khi thay đổi pH, thời gian lưu của các cấu tử thay đổi theo đồ thị
bên dưới:

Trang 158
 1.9
9
1.8
8 1.7
Thời gian lưu hiệu chỉnh

Độ chọn lọc
7 1.6
1.5
6
1.4
5
(phút)

1.3
4 1.2
3 3.5 4 4.5 1.1
1
pH
3 3.5 4 4.5

Benzene Aspartame pH

Do sắc ký pha đảo nên pha động là pha phân cực.

Với benzoic acid:
Trong dung dịch luôn tồn tại cân bằng: RCOOH  RCOO− + H +
Trong môi trường acid, pH thấp, cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch, benzoic
acid tồn tại chủ yếu dưới dạng phân tử trung hòa về điện.
Ở các pH cao hơn, nồng độ H+ giảm xuống, cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận, benzoic acid
dần chuyển sang dạng ion RCOO− phân cực hơn. Pha động là pha phân cực nên thời gian lưu
của benzoic acid giảm dần khi tăng pH.
Với aspartame:
Trong dung dịch tồn tại cân bằng:
R − N ( R '' ) − R '  R − NH + ( R '' ) − R ' + OH −

Trong môi trường acid, pH thấp, cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận,
aspartame và caffeine chuyển sang dạng phân cực hơn nên thời gian lưu nhỏ.
Ở pH cao, nồng độ OH- tăng lên, cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch, aspartame và caffeine
chuyển sang dạng phân tử trung hòa về điện nên thời gian lưu tăng dần.
Do đó, việc thay đổi pH của pha động làm thay đổi độ chọn lọc của cột với hai cấu tử, từ đó có
thể điều chỉnh để tăng độ phân giải của cột.

TRONG SẮC KÝ KHÍ:

• Các phương pháp thay đổi độ chọn lọc với sắc ký khí thường hạn chế hơn so với HPLC
nhưng do GC thường phân tách hiệu quả việc thay đổi độ chọn lọc với GC thường ít gặp
hơn.

Trang 159
 • Có 3 phương pháp thường gặp: Thay đổi nhiệt độ, thay đổi pha tĩnh và thay đổi tỉ số pha.
Thay đổi nhiệt độ thường được chạy thử trước do tiện lợi tuy hiệu quả khó dự đoán được.
Sau đó nếu thay đổi nhiệt đổi không hiệu quả, dựa vào bản chất hóa học mà thay đổi pha
tĩnh hay tỉ lệ pha.

Thông số Ứng dụng

Nhiệt độ
Pha tĩnh (thay đổi tương tác liên phân tử, phân
cực, liên kết hydro, …)
Tỉ lệ pha (tỉ số giữa lưu lượng pha động và lưu
lượng pha tĩnh, thường liên quan đến đường kính
trong của cột, bề dày lớp phim pha tĩnh, …)
Chỉ có hiệu quả với một số chất nhất định và hiệu
quả thường khó dự đoán trước nên cần chạy thực
nghiệm trước khi sử dụng
Tuy nhiên, thay đổi nhiệt độ thường tiện lợi hơn
vì thường GC có các thiết bị kiểm soát nhiệt độ
mà không cần thay đổi cột sắc ký.
Thay đôi bản chất hóa học của pha tĩnh là hương
pháp hiệu quả cao và có thể dự đoán trước được
hiệu quả lên quá trình sắc ký nhưng thường
không tiện lợi.
Thay đổi tỉ lệ giữa khí mang và pha tĩnh làm thay
đổi hệ số phân bố của các phân tử, dẫn đến thay
đổi độ chọn lọc. Không tiện lợi nhưng có hiệu quả
cao.

Ví dụ: Trong quá trình phân tách n-tridecane, undecanol, n-tetradecane và dodecanol, việc thay
từ pha tĩnh là DB1 (không phân cực, 100% polydimethylsiloxane) thành DB35 (bổ sung 35%
nhóm chức phenol, làm pha tĩnh phân cực hơn) nên giữ các alcohol tốt hơn.

Trang 160
Ví dụ: Việc tăng tỉ lệ giữa pha tĩnh và pha động (bằng cách thay đổi đường kính trong và bề dày
lớp phim pha tĩnh trên thành cột) giúp các chất phân tích có khả năng tương tác với pha tĩnh
nhiều hơn, từ đó thay đổi hệ số phân bố của các chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động.

c) Lưu ý
• Thay đổi độ chọn lọc có ảnh hưởng rất mạnh đến độ phân giải của cột.

Trang 161
 3. Thay đổi hiệu năng của cột
a) Phương pháp thực hiện
Hiệu năng cột đánh giá bởi số đĩa lý thuyết. Để tăng số đĩa lý thuyết có 2 cách chính:
▪ Tăng chiều cao cột: Dễ thực hiện nhưng làm tăng đáng kể thời gian phân tích
▪ Giảm chiều cao đĩa lý thuyết: Để giảm chiều cao đĩa lý thuyết, ta cần tìm hiểu các đại
lượng ảnh hưởng đến thông số này. Sự phụ thuộc chiều cao đĩa lý thuyết vào các thông
số thực nghiệm được thể hiện qua phương trình Van Deemter:
B
H = A+ + Cu
u
A: Quãng đường di chuyển: Các phân tử chất phân tích đi những con đường có độ dài
khác nhau qua cột chêm, dẫn đến thời gian cần đi qua cột của chúng khác nhau. Điều này xảy ra
do cột được chêm pha tĩnh không đồng nhất, kích thước giữa các vật chêm khác nhau nên con
đường đi qua chúng khác nhau.

Để đo lường ảnh hưởng này, người ta xác định: A = 2 d p với d p ,  lần lượt là đường kính

trung bình của vật chêm và hằng số đo lường mức độ đồng nhất của cột chêm.
→ Để giảm chiều cao đĩa lý thuyết:
- Giảm kích thước của pha tĩnh chêm trong cột
- Tiến hành chêm cột đồng đều với nhau
- Sử dụng cột mao quản mở, trong đó pha tĩnh được mang trên thành cột → Lúc này
không có vật chêm nên thông số A = 0, các chất phân tích không bị ảnh hưởng bởi
con đường qua vật chêm.

Trang 162
B: Khuếch tán dọc: Do sự di chuyển của cấu tử từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp.
Khi pha động mang phần lớn cấu tử đi ra khỏi cột, do nồng độ của phần pha động
mang đi lớn hơn nồng độ của phần còn lại của cột, nên các cấu tử có xu hướng
khuếch tán ngược về phía đầu của cột (làm tăng thời gian lưu) hoặc khuếch tán về
phía đầu ra của cột (giảm thời gian lưu) gây dãn perak sắc ký.
2 Dm
Về mặt định lượng: B = với Dm ,  là hệ số khuếch tán và hằng số biểu
u
thị độ chêm của cột
→ Để giảm chiều cao đĩa lý thuyết: Tăng vận tốc pha động
Do hệ số khuếch tán pha khí lớn hơn nên hiện tượng khuếch tán dọc gây ảnh
hưởng nghiệm trọng hơn với GC.

C: Truyền khối
Quá trình truyền khối để phân bố cấu tử giữa pha tĩnh và pha động gồm 2 quá trình: Cấu tử
đi đến bề mặt phân pha và khuếch tán xuyên pha. Tuy nhiên khi vận tốc pha động quá lớn, một
số cấu tử không kịp đến bề mặt phân chia pha để bị pha tĩnh giữ lại, một số cấu tử bị giữ lại bởi
pha tĩnh. Điều này dẫn đến sự dãn rộng về thời gian lưu.

Ngoài ra, khi pha tĩnh có các hố mao quản sâu, độ sâu của hố mao quản cũng ảnh hưởng
đến thời gian khuếch tán của pha tĩnh ra môi trường pha động. Cấu tử bị giữ lại càng sâu sẽ càng
tốn nhiều thời gian để đi ra.

Trang 163
→ Để hạn chế điều này: Làm giảm kích thước pha tĩnh (làm các hố mao quản nông hơn) và giảm
vận tốc pha tĩnh.
Lưu ý:
- Đại lượng A không phụ thuộc vào u, nếu u quá lớn/quá bé đều làm giảm hiệu năng:
• u lớn làm cho thành phần thứ ba rất lớn, hiệu năng của cột kém do quá trình trao
đổi chất xảy ra không kịp
• u quá bé làm cho B/u rất lớn (peak bị giãn rộng)
→ Vận hành ở u tốt nhất:

𝐵
𝑢𝑜𝑝𝑡 = √
𝐶



Trang 164
 CHƯƠNG 3.7 – ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ
Sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu Sai số do nhiễu

Thêm chuẩn Bị ảnh hưởng Không bị ảnh hưởng

Ngoại chuẩn Bị ảnh hưởng Bị ảnh hưởng

Nội chuẩn Không bị ảnh hưởng Bị ảnh hưởng

I. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN

- Chuẩn bị n bình định mức (có thể sử dụng 1 bình định mức để suy trực tiếp hoặc n
bình để lập đường chuẩn), cho mẫu cần phân tích vào từng bình định mức với thể
tích Vo bằng nhau.
- Thêm vào bình định mức thứ f một thể tích dung dịch chuẩn V f (là dung dịch chỉ

chứa chất phân tích và dung môi đã biết trước nồng độ).
- Chạy sắc ký, đo diện tích (hoặc chiều cao peak) và lập đường chuẩn:
KVoCo V
S= + K s Cs = A + BCS
Vf Vf

- Từ đó tìm được liên hệ giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích trong mẫu, suy
ra được nồng độ chất thực có trong mẫu.

Trang 165
II. PHƯƠNG PHÁP NGOẠI CHUẨN

- Chuẩn bị n bình định mức, lần lượt cho vào bình định mức thứ f một thể tích dung
dịch chuẩn với nồng độ Cf khác nhau, lần lượt từ nhỏ đến lớn.
- Chạy sắc ký, đo diện tích (hoặc chiều cao peak) và lập đường chuẩn:
S = KC f  AC f + B

III. PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUẨN

- Sử dụng chất chuẩn giống với chất trong mẫu và chất nội chuẩn 1 được pha với nhau
theo các tỷ lệ, lặp thành đường chuẩn
- Đo mẫu với dung dịch nội chuẩn 1 → Thế vào đường chuẩn tỉm ra chất nội chuẩn
𝑆𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑1 𝐾𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑1
=
𝑆𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑2 𝐶𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑2

Trang 166


Trang 167