SEMUNDJET E LINDURA TE

METABOLIZMIT

Prof. Dr. Anila Babameto-Laku

 SEMUNDJET E LINDURA TE METABOLIZMIT
▪ Semundje nga defekte enzimatike
Semundjet e metabolizmit te aminoacideve, semundjet e
mbingarkeses lizozomale,etj.

▪ Semundje nga defekte ne proteinat receptore

Semundjet e metabolizmit te lipideve

▪ Semundje nga defekte te proteinave te transportit

Fibroza kistike

▪ Semundje nga defekte te proteinave strukturore

Distrofia muskulare Duchenne/Becker
FIBROZA KISTIKE
 FIBROZA KISTIKE (FC; OMIM 219700)

• U njoh si entitet me vete ne vitin 1936

• Termi ”mukoviscidoze” per shkak te akumulimit te sekrecioneve te trasha

mukoze qe cojne ne bllokimin e rrugeve te frymemarrjes dhe infeksione
sekondare

• Antibiotiket dhe fizioterapia shume efektive ne rritjen e moshes mesatare

te nje femije me FC nga me pak se 5 vjet ne rreth 30 vjec ne ditet e sotme

• Shkak i rendesishem i semundjes kronike dhe vdekjes ne moshe feminore

dhe adoleshencen e hershme

• Nje nga semundjet me te shpeshta recesive autozomike te individet me

origjine nga Europa perendimore, ku incidencat variojne nga 1:2000 ne
1:3000 individe
Ne 1938, Dorothy Hansine Andersen
publikoi nje artikull te titulluar
“Fibroza kistike e pankreasit dhe lidhja
e saj me semundjen celiake: studim
klinik dhe patologjik" ne American
Journal of Diseases of Children

Ne 1952, Paul di Sant' Agnese zbuloi

anomali te elektroliteve ne djerse;
testi i djerses u realizua dhe
permiresua ne dekaden pasardhese
 Klinika

Organet e prekura me teper ne FC pulmonet dhe pankreasi

▪ Semundja pulmonare kronike shkaktohet nga infeksionet

interkurrente qe cojne ne ndryshime fibrotike ne mushkeri me
insuficience kardiake sekondare (kor pulmonar)

▪ 85% te te semureve me FC insuficience pankreatike

•sekretim i reduktuar i enzimave per shkak te bllokimit te dukteve pankreatike
nga sekrecionet
• malabsorbim me rritje te permbajtjes yndyrore ne fece
• trajtohet me suplemente orale te enzimave pankreatike
 Klinika

▪ Probleme te tjera, polipet nazale, prolapsi rektal, cirroza dhe

diabeti i sheqerit
▪ 10% e femijeve me FC ne moshen e te porsalindurit ileus
mekonial
▪ Steriliteti - mungesa bilaterale e lindur e vas deferens
(congenital bilateral absence of the vas deferens - CBAVD)
Ne disa raste CBAVD problemi i vetem klinik i rendesishem

▪ Ne raste te rralla pankreatit kronik, bronkektazi difuze dhe

aspergiloze alergjike bronkopulmonare
 Gjenetika

Trashegimi recesive
autozomike
 Hartezimi dhe izolimi i gjenit te FC
▪ Lokusi i FC ne kromozomin 7q31 (1985)
• Dy lokuse marker polimorfike te ADN-se, MET dhe D7S8, ne te dy anet e lokusit
• Marker te rinj te ADN-se shume prane lokusit CF ne disekuiliber lidhje
• Mutacioni FC me nje haplotip te vecante ne 84% te rasteve
• Regjion 500 kb qe permban gjenin ne brendesi

▪ Gjeni i FC u klonua nga dy grupe shkencetaresh ne Ameriken Veriore ne 1989

▪ U emertua gjeni CFTR (transmembrane conductance regulator),

shtrihet ne nje regjion gjenomik 250 kb, permban 27 ekzone
 Hartezimi dhe izolimi i gjenit te FC
Proteina Regulatore e Percueshmerise Transmembranore (CFTR)

▪ Struktura e CFTR
Proteine 1480 aa me peshe molekulare 168 kDa

dy domene transmembranore (TM) qe lidhen ne membranen qelizore

dy palosje nukleotidike (NBF) qe lidhin ATP
nje domen regulator (R), i cili fosforilohet nga protein kinaza A

www.genet.sickkids.on.ca.cftr
 Roli primar i CFTR eshte te veproje si kanal i transportit te Cl-
Aktivizimi nga fosforilimi i domenit regulator R dhe lidhja e ATP-se ne domenet NBF

est

int
dominio-R
N ATP ATP

protein kinasi A C
cAMP-dipendente
 Roli primar i proteines CFTR
proces vecanerisht i rendesishem ne nivelin e epiteleve pulmonare

Na+ Na+
Cl- lumeni Cl-
siperfaqja • Hap kanalin per daljen
“apikale” ne mjedisin jashteqelizor
te joneve te Cl

• Ka efekt negativ ne
absorbimin intraqelizor
te Na nga mbyllja e
kanalit epitelial te
natriumit

Efekti
reduktimi i nivelit te Cl
dhe Na intraqelizor, qe
permireson cilesine e
sekrecioneve mukoze
qelizore
Siperfaqja “bazale”
* Ne rastin e epiteleve pulmonare hollon mukusin
duke favorizuar shkembimet respiratore
Gjendra e djerses
• Ne epitelin e gjendrave te djerses transporti
i Cl- ne drejtim te kundert nga lumeni ne
qelize

• Anomalia e kanaleve te Cl-

Defekt ne reabsorbimin e Cl- dhe si pasoje te Na

Perqendrim i larte i kripes ne djerse
 Mutacionet ne gjenin CFTR

▪ Mutacioni i pare i identifikuar ne gjenin CFTR

delecioni i tre bazave ne kodonin 508
mungesa e aminoacidit fenilalanine Mutacioni ∆F508
identifikohet nga PCR
duke perdorur primers
Mutacioni ∆F508 perreth kodonit 508
70% te te gjitha mutacioneve ne gjenin CFTR

Shperndarja e mutacionit ∆F508 ne Europe

Danimarka 88%
Hollanda 79%
UK 78%
Irlanda 75%
Franca 75%
USA 66%
Gjermania 65%
Polonia 55%
Italia 50%
Turqia 30%
 Mutacionet ne gjenin CFTR
▪ Jane identifikuar me teper se 1500 mutacione
• missense
• frameshift
• te sitit te prerjes
• nonsens
• delecione

▪ Shumica e mutacioneve jane te rralla

G542X (12%) dhe G551D (3%)
ne ebrenjte Ashkenazi dhe popullatat
kaukaziane te Amerikes Veriore

▪ 90% e bartesve identifikohen duke perdorur

kitet komerciale te bazuara ne PCR multipleks
Rreziku per te qene bartes i nje individi te shendoshe
nga 1:25 (rreziku ne popullate) reduktohet ne me pak
se 1:200
Mutacionet ne gjenin CFTR te lidhura me mjekimin

• Kalydeco (kuh-LYE-deh-koh), tablete orale merret dy here ne dite per

trajtimin e FC tek femijet mbi 6 vjec, te cilet kane mutacionin G551D
(~ 4% )

• Kalydeco ndihmon ne funksionin e proteines CFTR, duke lejuar

transportin e Na e Cl ne siperfaqen e mushkerise dhe hollimin e
mukusit

Aprovuar nga FDA ne janar 2012

 Korrelacioni gjenotip-fenotip
Mutacionet ne gjenin CFTR ndikojne ne funksionin e produktit proteinik

1. Reduktim i plote ose i pjesshem i sintezes, G542X dhe IVS8-6 (5T)

2. Pengohet fiksimi ne membranen epiteliale, psh. ∆F508
3. Funksionimi jokorrekt kur arrin ne lokalizimin final, G551D dhe R117H
CFTR-DF508 normalisht nuk arrin membranen plazmatike

WT CFTR

CFTR-DF508
 Korrelacioni gjenotip-fenotip

Efekti i mutacioneve eshte reduktimi i aktivitetit funksional normal

te proteines CFTR

▪ Nivelet me pak se 3%, FC “klasike” te rende, me insuficience pankreatike, (PI)

▪ Nivelet 3% e 8%, forme “atipike” me te lehte, pa insuficience pankreatike, (PS)

• semundje te sistemit respirator
• funksion pankreatik relativisht normal

▪ 8% dhe 12% fenotip me i lehte, CBAVD te meshkujt

 Korrelacioni gjenotip-fenotip

▪ FC klasike e rende
• Homozigotet per mutacionin ∆F508
• Heterozigotet e perbere me ∆F508 dhe G551D ose G542X

▪ Varianti IVS8-6 poli T

Tre variante 5T, 7T dhe 9T
• Varianti 9T, aktivitet normal
• Aleli 5T, sinteze e reduktuar te proteines normale
- shpeshtesia 5% ne popullate
- me shpesh te te semuret me CBAVD (congenital bilateral absence of
the vas deferens) (40%-50%) ose bronkektazi(30%)
 Korrelacioni gjenotip-fenotip

▪ Numri i timinave influencon efektin e mutacionit R117H

•R117H ne pozicion cis me 5T, formen PS (pancreatic sufficient), kur nje
mutacion tjeter ndodhet ne alelin tjeter
•Heterozigotet e perbere (∆F508/ R117H) ku R117H ne cis me 7T, fenotip
variabel por me te lehte, qe varion nga CBAVD ne PS

Rritja e numrit te mutacioneve te gjenit CFTR dhe variabiliteti fenotipeve

Spektrumi i “semundjes CFTR”

 Testi i djerses

• Djersitje e induktuar nga jonoforeza me pilokarpine

• Mbledhja e djerses

• Vleresimi analitik

>60 mEq/L test pozitiv

40-60 mEq/L borderline
<40 mEq/L test negativ
 Metodat molekulare te
diagnostikimit
ANALIZA E NIVELIT I
RDB (REVERSE DOT BLOT):
Hibridizimi invers i acideve nukleike
 ANALIZA E NIVELIT I
Hibridizimi evidentohet nga nje
RDB (REVERSE DOT BLOT):
reaksion imunokimik qe jep nje
Hibridizimi invers i acideve nukleike
perzierje te ngjyrosur

homozigote
MM

heterozigote
NM

homozigote
NN
 RDB i SHUMEFISHTE
analiza e 36 mutacioneve te Fibrozes Kistike (gjeni CFTR)
 ANALIZA E NIVELIT II
12 esoni PCR dei 27 esoni 15 esoni
a 57°C a 61°C

DHPLC Sequenziamento
Ex 1,3,4,8,13,14a,15, Ex 2,5,6a,6b,7,9,10,11,
16,18,19,20,22,23 12,14b,17a,17b,21,24
 DHPLC:
Kromatografia Likuide Denatyruese me Performance te Larte

Bazohet ne te njejtin princip te

DGGE: fragmente te ADN me
sekuence te ndryshme kane Tm te
ndryshme. Perdoret nje kolone
kromatografike
Makrodelecionet CFTR
 Analiza e nivelit III:
Kerkimi i makrodelecioneve CFTR
MLPA=Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
• karakterizohen delecionet e • Sonda e perbere MLPA perbehet nga 43
dyfishimet qe perfshijne nje ose me sonda per secilin nga 27 ekzonet e gjenit
teper ekzone ne nje reaksion te e per gjenet e kontrollit
vetem amplifikimi
• Shtohet ADN gjenomike e denatyruar
• Produktet e amplifikimit ndahen ne
elektroforezen kapilare • Cdo sonde hibridizon dy sekuenca fqinje

• Krahasimi ndermjet llojit te • Lidhja e sondave behet nepermjet nje

amplifikimit te kampionit te interesit ligaze termostabile
dhe te kontrollit tregon cili /ekzon/ka
numer jonormal kopjesh • Nepermjet nje kopje primer universale
amplifikohen te gjitha sondat e lidhura

1
2
3
35
 TABELA ELEKTRONIKE
Paraqitja e produktit te amplifikuar te cdo sonde ne fleten elektronike

• Tabela elektronike ne EXCEL

analizon zonat ose lartesite e
kulmeve te
elektroferogrames

• Ne Sx te tabeles ka dy kolona
nje per vlerat e pacientit
tjetra e kontrollit

• Vlerat me sfond te kuq ose

te gjelber tregojne raportin
ndermjet kontrollit e
pacientit
 0
0.5
1
1.5
C2

C5

58kb <

ex13

ex23

ex1

ex14

C19

ex24

Delecioni CFTR 2,3

ex14

C19

ex24

ex2

ex15

C12

ex3

ex16

ex1

ex4

ex17

C19

ex6

ex17

ex12
130-480bp

ex6

ex18

C1

ex7
Elektroforeza kapilare

ex5

ex19

ex8

C13

ex20

ex9

C5

ex21

ex11

C7

ex22

58kb >
Produktet e amplifikimit specifik per cdo sonde kane nje gjatesi ndermjet

C15

ex10

C1P

C17
 Analiza Direkte

• Niveli I : Reverse Dot Blot • Niveli II :

Analiza e 36 mutacioneve me te - DHPLC
shpeshta
- SEKUENCIMI

• Niveli III : MLPA

 Analiza Indirekte

PADRE 200 204

MADRE 202 210

IVS8GT IVS17bCA
IVS17bTA

• Perjashton kontaminimin e ADN fetale FIGLIO FC 202 204

nga ADN amtare ose heterologe

• Kontrollon korrelacionin korrekt familjar
VILLO 200 210

• Kontrollon atesine ne rastin e dyshimit

diagnostik
IVS8GT 1 3 1 2
IVS17bCA 2 2 1 3
IVS17bTA 1 1 2 2

CFTR dele17a,17b,18 W1282X

3 2 3 1
3 3 3 1
2 2 2 2

CFTR dele17a,17b,18/W1282X CFTR dele17a,17b,18/+

 0
0.5
1
1.5
2
C2

C5

58kb <

ex13

ex23

ex1

ex14

C19

ex24

ex14

C19

ex24

ex2

ex15

C12

ex3
Delecioni CFTR 17a-17b-18

ex16

ex1

ex4

ex17

C19

ex6

ex17

ex12

ex6

ex18

C1

ex7

ex5

ex19

ex8

C13

ex20

ex9

C5

ex21

ex11

C7

ex22

58kb >

C15

ex10

C1P

C17
 NEXT generation sequencing

MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical

Sequencing Assay

Complete View of the CFTR Gene

Capture all variants in the protein

coding regions and intron/exon
boundaries of the CFTR gene
 Diagnoza Prenatale FC

• Prinder te pacienteve me FC

• Prinder te fetusit me Intestin Hiperekogjen

 DIAGNOZA E HIPEREKOGJENICITETIT INTESTINAL

2 mutacione 1 mutacion 0 mutacione

Diagnoza e FC e sigurt Rreziku FC 11% Rreziku FC i ulet
 Diagrama

Pacienti FC

Kerkimi i mutacioneve me te
shpeshta

2 mutacione 0 mutacione
1 mutacion i
te te
karakterizuar
karakterizuara karakterizuara

DHPLC e sekuencimi i gjenit Kerkimi i makrodelecioneve te gjenit

CFTR CFTR
Analiza e segregimit ne familjen me rrezik per fibrozen kistike tregon qe
mutacioni CFTR M348K eshte nje polimorfizem i pademshem
 Aplikimet klinike dhe perspektivat e se ardhmes

▪ Prinderve te nje femije te semure i ofrohet diagnoza e paralindjes

• analiza direkte e mutacionit ne ADN-ne nga vilet koriale
• analiza e lidhjes duke perdorur markeret polimorfike intragjenike nese njeri ose te
dy mutacionet te femija i semure nuk mund te identifikohen

▪ Njohja e njerit ose te dy mutacioneve te femija i semure mundeson

detektimin e bartesve ne te afermit e ngushte te familjes
• Depistimi ne forme kaskade ne te gjitha familjet ku eshte identifikuar mutacioni
• Depistimi i popullates per bartesit e FC dhe depistimi neonatal per homozigotet e
semure
 Aplikimet klinike dhe perspektivat e se ardhmes

▪ FC eshte kandidati i pare per terapine gjenike per shkak te mundesise

relative qe ofrojne organet target, psh, mushkerite

▪ Studimet e transferimit te gjenit te kryera duke perdorur adenoviruset

dhe komplekset lipozom- cADN CFTR kane rezultuar ne rivendosjen e
sekretimit te klorit te minjte transgjenike me FC

▪ Probleme jane shfaqur nga eficienca e paket te vektoreve dhe reaksionet

inflamatore
DISTROFIA MUSKULARE
DUCHENNE/BECKER
 Distrofia muskulare Duchenne (DMD)

▪ DMD, forma me e rende dhe me e shpeshte e distrofise muskulare

▪ 1861, Guillame Duchenne

▪ Incidenca ne lindje, 1:3500 meshkuj te lindur gjalle

▪ Distrofia muskulare Becker (BMD), forme me e lehte, mutacione

ne te njejtin gjen

▪ Incidenca 1:20000 meshkuj

 Te dhenat klinike

• Fillimi rreth moshes 3 dhe 5 vjec me dobesi muskulare progresive,

ecje karakteristike, pamundesi per te vrapuar, renie te shpeshta,
veshtiresi ne ngjitjen e shkalleve (shenja Gowers pozitive)

• Atrofi progresive fillimisht muskujt proksimale te ekstremiteteve

te poshtme me vone te ekstremiteteve te siperme,
karrike me rrota ne moshen 11 vjecare

• Lordoze lumbare, kontraktura te artikulacioneve e insuficience

kardiorespiratore

• Kardiomiopatia ne 95% te rasteve vitet e fundit te jetes

• Ne ekzaminim, rritje te dukshme te muskujve gastroknemius, zevendesim

i fibrave muskulare nga indi lidhor e dhjamor (pseudohipertrofi)
distrofia muskulare pseudohipertrofike

• Rreth 1/3 e meshkujve ulje te lehte ose te moderuar te intelektit,

IQ mesatarisht 83
 Distrofia muskulare Becker (BMD)

Te dhenat klinike

• shume e ngjashme me DMD por progredon ne menyre me pak agresive

• mosha mesatare e fillimit te semundjes 11 vjec, mund te levizin normalisht

ne moshe te rritur

• jetegjatesia reduktohet lehtesisht

• nje numer i vogel te semuresh asimptomatike ne dekaden e peste te

gjashte te jetes
 Gjenetika

DMD dhe BMD

• Trashegimi recesive te lidhur me kromozomin X

• Meshkujt me DMD nuk riprodhojne

• Fitnesi gjenetik 0

• Niveli i mutacionit: incidenca te meshkujt e semure/3 1:10000

• Nje nga nivelet me te larta te mutacioneve te njohur te njerezit

 Izolimi i gjenit te DMD
▪ Studimet e para mbi lokalizimin e lokusit DMD
Rastet e disa femrave te semura me DMD me translokacion te ekuilibruar
X-autozom me piken e thyerjes ne Xp21

• Lokalizimi i gjenit te distrofines ne Xp21

•nga identifikimi i meshkujve te semure me mikrodelecione te dukshme
qe perfshijne Xp21
•nga analiza e lidhjes duke perdorur markeret polimorfike te ADN-se te
regjionit Xp21

▪ Sekuenca e plote u izolua ne 1987

▪ Gjeni i distrofines gjeni me i madh i zbulur deri tani te njeriu

• 2,3 Mb te ADN-se gjenomike, vetem 14 kb kopjohen ne mARN

• 79 ekzone, kopjohet jo vetem ne muskuj por dhe ne indin cerebral
▪ Gjatesia e madhe e gjenit shpjegon nivelin e larte te mutacionit
 Mutacionet ne gjenin e distrofines

▪ 2/3 e mutacioneve jane delecione, te nje pjese ose te gjithe gjenit

• ndryshimet ne madhesine dhe pozicionin e delecioneve

• dy “pikat e nxehta” te delecioneve, 20 ekzonet e para dhe ekzonet 45-53

• delecionet kryesisht ne mejozen amtare, kryqkembimi i pabarabarte

• nje nga “pikat e nxehta” te thyerjes ne intronin 7, grup sekuencash perseritese

te ADN- se qe favorizojne ciftezimin e pabarabarte dhe kryqkembimin

• madhesia e delecionit nuk lidhet me gravitetin e semundjes

 Mutacionet ne gjenin e distrofines

• delecionet ne DMD prekin kornizen lexuese te perkthimit

• delecionet te meshkujt me BMD nuk ndryshojne kornizen lexuese te

perkthimit

• delecionet identifikohen nga teknika e PCR multiplex, amplifikohen ekzone te

shumta brenda “pikave te nxehta” 5’ dhe 3’ te delecionit

▪ Dyfishime
 Mutacionet ne gjenin e distrofines
• Ne 1/3 e rasteve mutacione te tipit kodone stop, frameshift, te siteve te
prerjes (splicing) dhe mutacione te promotorit

• shumica e mutacioneve pikesore shkaktojne perfundimin e parakohshem

te perkthimit, duke rezultuar ne prodhimin e nje sasie te vogel te produktit
proteinik

• mutacionet pikesore nga mejoza

atnore, shumica per shkak te nje
kopje te gabuar ne dyfishimin e ADN-se
 Distrofina, produkti gjenik
• Gjeni DMD kodon per nje proteine 427 kDa,
distrofina

• Lokalizohet prane membranes muskulare dhe

lidh aktinen intraqelizore me lamininen
jashteqelizore

• Distrofina lidhet me nje kompleks glukoproteinik

ne membranen muskulare nepermjet domenit C
terminal

• Kompleksi glukoproteinik konsiston ne nennjesi,

anomalite e te cilave shkaktojne semundje te tjera
muskulare gjenetike te rralla, tipe te ndryshme te
distrofise muskulare kongenitale recesive
autozomike
 Distrofina, produkti gjenik

• Mungesa e distrofines ne meshkujt me DMD,

degjenerim gradual te qelizes muskulare

• Prania e distrofines ne kampionin e marre me

biopsi muskulare vleresohet me ane te
imunofluoreshences

• Nivelet me pak se 3% jane diagnostike per DMD

• Ne biopsite muskulare te meshkujt me BMD

distrofina ndryshime cilesore
 Zbulimi i bartesve

▪ Pema familjare e kombinuar me dozimin CK ne serum

nivelet e CK shume te rritura te djemte me DMD, te rritura ne 2/3 e
barteseve

▪ Zbulimi i barteseve te aferme te meshkujve te semure me

DMD/BMD

• analiza direkte e mutacionit tip delecion

• analiza indirekte nepermjet studimeve te lidhjes duke perdorur markeret

polimorfike intragjenike
• nese nje marker mikrosatelit lokalizohet ne regjionin e delecionit

studjohet segregimi i tij te femrat ne familjen e te semurit

 Perspektivat e trajtimit
▪ Ne DMD dhe BMD fizioterapia e nevojshme per te ruajtur levizshmerine dhe
parandaluar spazmat muskulare dhe kontrakturat e artikulacioneve

▪ Terapia gjenike ofron shpresen e vetme reale te trajtimit ne nje periudhe

te shkurter ose te mesme

• eksperimente te minjte transgjenike qe kane mutacionin me distrofi muskulare

distrofine-negative
• injektimi direkt i ADN-se rikombinante, implantimi i mioblasteve, dhe transfeksioni
me vektoret retrovirale ose adenovirale qe bartin nje minigjen te distrofines vetem
me sekuencat te cilat kodojne per domene te rendesishme funksionale

▪ Mund te kete nje menyre trajtimi me nje proteine alternative kompensatore

te tille si utropina
Utropina shprehet te fetusi ne vend te distrofines, me te cilen ka shkalle te larte
homologjie