中国组织工程研究 研究原著

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灸法预处理减轻脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤的机制

1 2 1 1 1
蒋 洁 ，刘 娟 ，于燕艳 ，杨 越 ，王千慧

https://doi.org/10.12307/2024.308
文章快速阅读：灸法预处理对脑缺血再灌注后大鼠氧化应激损伤的影响
投稿日期：2023-02-22
采用日期：2023-04-18
研究起点 研究来源 脑缺血再 研究分支 研究去脉
修回日期：2023-06-06 SIRT1
• 脑卒中 • 脑缺血再灌注损伤 灌注损伤 • 氧化应激 • 脑缺血再
在线日期：2023-06-21
• 脑缺血再灌注损伤 • 脑缺血 • 丙二醛 灌注损伤
FoxO3
中图分类号： • 缺血再灌注损伤 • 脑卒中 关注 信号 • 超氧化物歧化酶 • 信号通路
• 脑缺血 • 缺血再灌注损伤 热点 • 相关机制 • 氧化应激
R496；R318；R446 通路
• 再灌注损伤 • 氧化应激 • 脑缺血再灌注损伤 • 活性氧
文章编号： 氧化应激
• 艾灸 • 灸法 大鼠模型 • 灸法 • 神经功能
2095-4344(2024)16-02488-06 • 信号通路 • SIRT1 • 信号通路 • 预处理
• FoxO3 灸法 • 大鼠模型
文献标识码：B

文题释义：
灸法预处理：属于中医治未病的范畴，在前驱症状出现时给予艾灸预处理在多种疾病发病过程中可明显减轻发病症状，延缓发病进程。
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，在脑缺血后的再灌注损伤过程中发挥重要作用。

摘要
背景：艾灸预处理属于中医治未病的范畴，在前驱症状出现时给予艾灸预处理在多种疾病发病过程中可明显减轻发病症状，延缓发病进
程，但其具体起效机制仍待研究。
目的：探讨SIRT1/FoxO3通路在灸法预处理改善脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤的作用机制。
方法：将48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、灸法预处理组、灸法预处理+EX527(SIRT1抑制剂)组，每组各12只。灸法预处理组在造模
前给予百会、大椎、足三里麦粒灸，每穴灸3壮，每日1次，共治疗7 d；灸法预处理+EX527组在每次艾灸前30 min给予腹腔注射SIRT1抑制
剂EX527(15 mg/kg)。在末次艾灸30 min后，除假手术组外，其他各组采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉栓塞大鼠模型，脑缺血处理2 h
后，拔除中动脉线栓，再灌注12 h；假手术组仅给予颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉剥离，而并不插入线栓。再灌注12 h后对大鼠进行神
经功能缺损评分，采用TTC染色法计算各组大鼠脑梗死体积，试剂盒检测梗死组织中氧化应激因子水平，Western-blot法检测大脑皮质缺血
区中SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、脑源性神经营养因子的蛋白表达。
结果与结论：①缺血再灌注12 h后，大鼠神经行为学评分模型组明显高于假手术组(P < 0.01)，灸法预处理组明显低于模型组(P < 0.01)，
灸法预处理组低于灸法预处理+EX527组(P < 0.05)。②假手术组大鼠脑组织未见明显梗死灶，模型组大鼠右侧脑组织可见明显缺血灶(P <
0.01)，灸法预处理组大鼠右侧梗死体积较模型组明显减少 (P < 0.01)，灸法预处理+EX527组大鼠右侧梗死体积较灸法预处理组变大 (P <
0.01)。③再灌注12 h后，与假手术组比较，模型组丙二醛表达明显升高(P < 0.01)，超氧化物歧化酶表达明显降低(P < 0.01)；与模型组和
灸法预处理+EX527组相比，灸法预处理组丙二醛表达明显降低(P < 0.01，P < 0.05)，超氧化物歧化酶表达明显升高(P < 0.01，P < 0.05)。
④与假手术组比较，模型组SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、脑源性神经营养因子蛋白表达均明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，灸法预处理
组SIRT1、FoxO3、脑源性神经营养因子明显升高(P < 0.01)，p-FoxO3表达明显降低(P < 0.01)；与灸法预处理+EX527组相比，灸法预处理组
SIRT1、FoxO3、脑源性神经营养因子升高(P < 0.05)，p-FoxO3表达差异无显著性意义(P > 0.05)。⑤结论：灸法预处理可显著改善脑缺血再灌
注后大鼠的神经功能，其机制可能与激活SIRT1/FoxO3通路减轻脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤有关。
关键词：灸法预处理；缺血再灌注；氧化应激；SIRT1；FoxO3

Mechanism by which moxibustion pretreatment attenuates oxidative stress injury in a rat model of
cerebral ischemia-reperfusion
Jiang Jie1, Liu Juan2, Yu Yanyan1, Yang Yue1, Wang Qianhui1
1
School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Affiliated Hospital of
Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Jiang Jie, Master, Associate professor, School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region,
China
Corresponding author: Jiang Jie, School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region,
China

1 2
新疆医科大学中医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054； 新疆医科大学附属中医医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
第一作者：蒋洁，女， 1981 年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2008 年上海中医药大学毕业，硕士，副教授，主要从事针灸作用机制的研究。
通讯作者：蒋洁，硕士，副教授，新疆医科大学中医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
https://orcid.org/0000-0001-6517-8617( 蒋洁 )
基金资助：新疆维吾尔自治区高校科研计划项目 (XJEDU2021Y025)，项目负责人：蒋洁；“十四五”自治区高等学校重点学科 ( 特
色学科 ) 中医学
引用本文：蒋洁，刘娟，于燕艳，杨越，王千慧 . 灸法预处理减轻脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤的机制 [J]. 中国组织工程研究，
2024，28(16):2488-2493.

2488｜中国组织工程研究｜第28卷｜第16期｜2024年6月
研究原著 中国组织工程研究
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Abstract
BACKGROUND: Pretreatment with moxibustion is a preventive treatment in traditional Chinese medicine. Pretreatment with moxibustion at the onset of
prodromal symptoms can significantly reduce the symptoms and delay the onset of many diseases, but the exact mechanism remains to be studied.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of SIRT1/FoxO3 pathway in moxibustion pretreatment to ameliorate oxidative stress injury in cerebral ischemia-
reperfusion model rats.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group, model group, moxibustion pretreatment group, and
moxibustion pretreatment+EX527 (SIRT1 inhibitor) group, with 12 rats in each group. The moxibustion pretreatment group was given moxibustion with seed-
sized moxa cone at Baihui, Dazhui, and Zusanli before modeling, three moxa-cones per acupoint, once a day for 7 days. In the model group, moxibustion
pretreatment group and moxibustion pretreatment+EX527 group, the rat model of middle cerebral artery occlusion was made by suturing of the middle
cerebral artery 30 minutes after the last moxibustion. After 2 hours of cerebral ischemia, the middle artery suture was removed and the rats were reperfused
for 12 hours. In the sham-operated group, only the common carotid artery, internal carotid artery, and external carotid artery were dissected without suturing
the middle cerebral artery. In the moxibustion pretreatment+EX527 group, EX527 (15 mg/kg) was given intraperitoneally 30 minutes before each moxibustion.
After 12 hours of reperfusion, the rats were scored for neurological deficits, and the cerebral infarct volume was calculated by 2,3,5-triphenyltetrazolium
chloride staining method. The levels of oxidative stress factors in the infarcted tissues were detected by the kit method, and western-blot method was used to
detect the expression levels of SIRT1, FoxO3, p-FoxO3 and brain-derived neurotrophic factor in the ischemic area of the cerebral cortex.
RESULTS AND CONCLUSION: After 12 hours of reperfusion, the neurobehavioral score in the model group was significantly higher than that in the sham-
operated group (P < 0.01), while the score in the moxibustion pretreatment group was significantly lower than that in the model group (P < 0.01) and
moxibustion pretreatment+EX527 group (P < 0.05). There were no obvious infarct foci in the brain tissue of the sham-operated rats, but obvious ischemic
foci were observed in the right side of the brain tissue of the rats in the model group (P < 0.01). The right infarct volume in the moxibustion pretreatment
group was significantly reduced compared with the model group (P < 0.01), while the right infarct volume in the moxibustion pretreatment+EX527 group
was significantly enlarged compared with the moxibustion pretreatment group. After 12 hours of reperfusion, the level of malondialdehyde was significantly
elevated (P < 0.01) and the expression of superoxide dismutase was significantly decreased (P < 0.01) in the model group compared with the sham-operated
group. The levels of malondialdehyde was significantly decreased (P < 0.01, P < 0.05) and the expression of superoxide dismutase was significantly increased
(P < 0.01, P < 0.05) in the moxibustion pretreatment group compared with the model group and the moxibustion pretreatment+EX527 group. Western blot
results showed that the expression levels of SIRT1, FoxO3, p-FoxO3, and brain-derived neurotrophic factor proteins were significantly higher in the model group
compared with the sham-operated group (P < 0.01); compared with the model group, the expression levels of SIRT1, FoxO3, and brain-derived neurotrophic
factor were significantly higher in the moxibustion pretreatment group (P < 0.01), and p-FoxO3 expression was significantly lower (P < 0.01); compared with
the moxibustion pretreatment+EX527 group, the expression levels of SIRT1, FoxO3, and brain-derived neurotrophic factor were elevated in the moxibustion
pretreatment group (P < 0.05), and no statistically significant difference was found in the p-FoxO3 expression (P > 0.05). To conclude, moxibustion pretreatment
can significantly improve neurological function in rats after cerebral ischemia-reperfusion, and the mechanism may be related to the activation of SIRT1/FoxO3
pathway to reduce oxidative stress injury in the rat model of cerebral ischemia-reperfusion.
Key words: moxibustion pretreatment; ischemia-reperfusion; oxidative stress; SIRT1; FoxO3

Funding: Xinjiang Uygur Autonomous Region University Research Program, No. XJEDU2021Y025 (to JJ); Key (Special) Disciplines of Traditional Chinese Medicine
in Xinjiang Uygur Autonomous Region Universities during the 14th Five-Year Plan
How to cite this article: JIANG J, LIU J, YU YY, YANG Y, WANG QH. Mechanism by which moxibustion pretreatment attenuates oxidative stress injury in a rat
model of cerebral ischemia-reperfusion. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2024;28(16):2488-2493.

0 引言 Introduction 1 材料和方法 Materials and methods

脑卒中是急性神经系统疾病，因其死亡率、致残率、 1.1 设计 随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分
复发率高，给人类和社会带来沉重的精神和经济负担。缺血 析与 LSD-t 检验。
性脑卒中是最常见的类型，主要致病因素包括脑血栓、腔隙 1.2 时间及地点 实验于 2022 年 6 月至 2023 年 1 月在新疆
性梗死、脑栓塞等。据流行病学资料显示，全球缺血性脑卒 医科大学完成。
[1]
中患者人数已达 3 300 万，到 2030 年可能增至 7 700 万 。 1.3 材料
缺血性脑卒中的发病机制主要为脑供血不足导致的责任血管 1.3.1 实验动物及分组 SPF 级健康雄性 SD 大鼠 48 只，体质
[2]
区域脑组织缺血性坏死，引起神经元损伤和脑功能障碍 。 量 (250.0±5.0) g，由新疆医科大学实验动物中心提供，生产
缺血性脑卒中患者由于疾病的发展，其认知功能和日常生活 许可证号：SCXK( 新 )2018-0003。分笼饲养，饲养环境模拟
活动能力将受到不同程度的损害，这将给患者及其家庭带 自然昼夜条件，明暗周期 12 h，温度 (21±2) ℃，湿度 40%-
[3]
来沉重的经济和心理负担 。既往研究表明，如果不能及 50%，自由饮水，适应性饲养 7 d。采用随机数字表法将大鼠
时治疗，缺血性脑卒中会导致严重的后遗症，甚至是残疾 随机分为假手术组、模型组、灸法预处理组、灸法预处理 +
[4]
和死亡 。因此，寻找如何更好地预防脑卒中发病的手段 EX527 组，每组 12 只。
显得极为重要。 实验方案经新疆医科大学动物实验伦理委员会批准 ( 批
灸法作为中医学疗法之一，在防治脑卒中方面显示出 准号为 IACUC-20210303-26)。动物的使用符合科技部《关于
[5-6]
明显的临床疗效 。艾灸预处理属于中医治未病的范畴， 善待实验动物的指导性意见》相关规定。
在前驱症状出现时给予艾灸预处理在多种疾病发病过程中 1.3.2 主要仪器和试剂 MCAO 线栓 ( 北京默沙东生物技术有
[7-8]
可明显减轻发病症状，延缓发病进程 。课题组前期研究 限公司 )，BX43 显微镜 ( 日本 OLYMPUS 公司 )，戊巴比妥钠
已发现艾灸预处理可显著改善缺血再灌注后大鼠的神经功 ( 阿拉丁试剂有限公司 )，SIRT1 抑制剂 EX527( 美国 Selleck 公
[9]
能 ，其机制可能与激活自噬抑制炎症因子表达有关。此 司 )，丙二醛 ( 批号 20210120)、超氧化物歧化酶 (Superoxide
次研究拟进一步明确灸法预处理对大脑中动脉栓塞 (middle dismutase，SOD，批号 20210113) 试剂盒购自南京建成生物
cerebral artery occlusion，MCAO) 大鼠氧化应激损伤的影响， 工程研究所；兔抗鼠 SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、脑源性神经
并探讨 SIRT1/FoxO3 通路在该过程中的介导机制，为临床应 营养因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF) 抗体及山
用灸法防治脑卒中提供临床依据。 羊抗兔 IgG 二抗 (Abcam 公司 )。

Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 28｜No.16｜June 2024｜2489

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1.4 实验方法 在每次艾灸前 30 min 给予腹腔注射 EX527(15 mg/kg)。各组分
1.4.1 造模方法 大脑中动脉栓塞模型的造模方法参照 别在缺血再灌注后 12 h 麻醉后处死大鼠进行同步取材。
[10]
LONGA 等 改良后的大脑中动脉线栓法，具体方法如下： 1.4.3 TTC 染色测定各组大鼠脑梗死百分比 各组大鼠均随
以 3% 戊巴比妥钠 (60 mg/kg) 腹腔注射麻醉，将大鼠腹腔注 机选取 6 只取脑组织，-20 ℃冰箱冷藏后将脑组织置于脑槽
射麻醉后，从大鼠颈部右侧剪开切口，仔细分离并暴露右侧 内沿冠状面进行切片，切片厚度 2-2.5 μm，将切好的薄片
颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。结扎颈总动脉近心端和颈 放置在 2%TTC 溶液中，用锡箔纸包好后放入 37 ℃温箱孵育
外动脉，然后用微动脉夹夹闭远端颈内动脉。在颈总动脉上 20 min，期间不断上下翻动切片，以保证脑组织可以均匀沾
近分叉处 3.0-4.0 mm 处剪一“V”型切口，将备好的线栓经 染染色液；用 40 g/L 多聚甲醛固定 2 h 后进行拍照。采用
颈总动脉插入颈内动脉，当感觉到有少许阻力感时，表明已 Image J 软件测量大鼠脑梗死体积。计算公式：梗死脑体积百
阻断大脑中动脉入口处，插入 18-20 mm，之后结扎颈内动脉， 分比 (%)= 梗死区体积 / 整个大脑体积 ×100%。
常规行手术缝合，预留部分线栓在皮肤外。在缺血 2 h 后， 1.4.4 试剂盒检测梗死组织中氧化应激因子水平 取 5 mg 脑
拔除线栓到颈总动脉主干分叉处，使血流再灌注 24 h。假手 梗死组织放于 1.5 mL EP 管中，制备成脑组织匀浆液后，采
术组仅给予颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉剥离，而并不插 用酶联免疫吸附法检测梗死区脑组织中丙二醛、超氧化物歧
入线栓。 化酶的表达。
[10]
待大鼠自然苏醒后，采用 LONGA 等 的 5 分制评分法 1.4.5 Western-blot 检测 各组随机选取 6 只大鼠麻醉后处死
对所有大鼠进行神经功能缺损评定，评分标准：0 分，无神 取脑组织，取等量缺血区脑组织 (100 mg) 放入 1.5 mL EP 管
经功能损伤；1 分，不能完全伸展对侧前肢；2 分，行走时 中，加入 1 mL 预冷的组织蛋白裂解液，用匀浆机研磨均匀，
向对侧转圈；3 分，行走时向对侧倾倒；4 分，不能自发行走， 放置于冰上裂解 20 min，然后，于 4 ℃、14 000×g 离心机离
意识丧失。评分在 2-4 分为造模成功。 心 10 min，取上清液，BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。
取裂解蛋白 50 μg，80 V 电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，
组织工程实验动物造模过程中的相关问题
然后换为 100 V 电泳 70 min，以大体观察溴酚蓝的条带距胶
造模目的 探讨 SIRT1/FoxO3 通路在灸法预处理改善脑缺血再灌注模型大
鼠氧化应激损伤的作用机制  底 1 cm 左右停止电泳，换 100 V 电转 70 min，5% 的脱脂奶
选择动物的条件 SPF 级健康雄性 SD 大鼠 粉封闭 2 h，一抗 (SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、BDNF 抗体，1 ∶

模型与所研究疾病 研究表明，大脑中动脉栓塞大鼠模型为局灶性脑缺血损伤的
1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 1 h，
的关系 标准动物模型，被广泛用于各种实验研究 洗 膜 后 加 入 显 影 试 剂， 化 学 发 光、 显 影。Alpha Innotech®
动物品系 SD 大鼠由新疆医科大学实验动物中心提供 Fluor Chem FC2 凝胶成像系统采集图像，用 Image J 软件对条
造模技术描述 结扎大鼠颈总动脉近心端和颈外动脉，然后用微动脉夹夹闭 带计算 SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、BDNF 蛋白表达的灰度值。
远端颈内动脉。在颈总动脉上近分叉处 3.0-4.0 mm 处剪一“V”
以目的蛋白 /GAPDH 表示蛋白相对表达。
型切口，将备好的线栓经颈总动脉插入颈内动脉，当感觉到
有少许阻力感时，表明已阻断大脑中动脉入口处，插入 18- 1.5 主要观察指标 ①大鼠神经行为学评分；②脑梗死体
20 mm，之后结扎颈内动脉，常规行手术缝合，预留部分线栓 积；③梗死组织中氧化应激因子水平；④脑组织中 SIRT1、
在皮肤外。在缺血 2 h 后，拔除线栓到颈总动脉主干分叉处，
FoxO3、p-FoxO3、BDNF 蛋白表达。
使血流再灌注 24 h，建立大脑中动脉栓塞大鼠模型
1.6 统计学分析 应用 SPSS 21. 0 统计软件进行统计学处理，
动物数量及分组方 48 只大鼠采用随机数字表法随机分为假手术组、模型组、灸
-
法 法预处理组、灸法预处理 +EX527 组，每组 12 只  各组数据以 x±s 表示。结果采用单因素方差分析 (One-Way
造模成功评价指标 LONGA 评分 2-4 分为造模成功 ANOVA)，服从正态分布且方差齐的数据组间比较采用 LSD-t
造模后实验观察指 ①大鼠神经行为学评分；②脑梗死体积；③梗死组织中氧化 检验法，方差不齐时采用 Welch 检验。以 P < 0.05 为差异有
标 应 激 因 子 水 平； ④ 脑 组 织 中 SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、BDNF 显著性意义，P < 0.01 为差异有非常显著性意义。文章的统
蛋白的表达
计学方法已经新疆医科大学生物统计学专家审核。
造模后动物处理 各组大鼠在缺血再灌注后 12 h 处死大鼠进行同步取材

伦理委员会批准 实验方案经新疆医科大学动物实验伦理委员会批准 ( 批准号为

IACUC-20210303-26)  2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 在实验过程中，4 组 48 只大鼠均无
1.4.2 干预方法 假手术组和模型组不进行灸法治疗，灸法 脱失，全部进入结果分析。
预处理组在正式造模前 7 d 开始给予艾灸预处理，方法如下： 2.2 大鼠神经行为学评分 结果显示，假手术组大鼠未表现
将大鼠固定于操作台上，选取大鼠百会、大椎、足三里，穴 出神经功能丧失症状；模型组大鼠神经行为学症状较明显，
[11]
位定位标准参照《实验针灸学》常用实验动物穴位图谱 。 表现为左前肢不能充分伸展，呈瘫痪状，行走时可表现为向
以麦粒型艾炷 ( 南阳汉医艾绒有限责任公司，质量约 10 mg/ 壮 ) 左环行转圈样运动；灸法预处理组仅出现轻度局灶神经功能
在大鼠百会、大椎、足三里穴行麦粒灸 3 壮，每天每穴治疗 1 次， 丧失症状，较模型组明显减轻；SIRT1 抑制剂 EX527 降低了
共治疗 7 d。末次艾灸 30 min 后造模。灸法预处理 +EX527 组 灸法预处理的疗效。模型组神经行为学评分明显高于假手术

2490｜中国组织工程研究｜第28卷｜第16期｜2024年6月
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组 (P < 0.01)，模型组、灸法预处理组、灸法预处理 +EX527 表 1 ｜再灌注 12 h 后各组大鼠氧化应激因子丙二醛、超氧化物歧化酶的
表达 -±s，n=12)
(x
组神经行为学评分分别为 2.87±0.10，1.78±0.23，2.28±0.31， Table 1 ｜ Expression of malondialdehyde and superoxide dismutase in
经统计显示，灸法预处理组神经行为学评分明显低于模型组 each group of rats after 12 hours of reperfusion

和灸法预处理 +EX527 组 (P < 0.01)，见图 1。 组别 丙二醛 (nmol/L) 超氧化物歧化酶 (μg/L)

假手术组 1.38±0.11 68.11±2.88

模型组 2.71±0.20a 46.29±4.00a
a
灸法预处理组 1.80±0.12bc 57.18±2.91bc
灸法预处理 +EX527 组 2.25±0.15 51.35±2.35
b
a b
表注：与假手术组比较， P < 0.01；与模型组比较， P < 0.01；与灸法预处理 +
EX527 组相比，cP < 0.05。EX527：SIRT1 抑制剂

假手 模型组 灸法预 灸法预处理 +

2.5 脑组织 SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、BDNF 蛋白表达 Western-
术组 处理组 EX527 组
blot 检 测 结 果 显 示， 与 假 手 术 组 比 较， 模 型 组 SIRT1、
a
图注：与假手术组比较， P < 0.01；与模型组、灸法预处理 +EX527 组比
b FoxO3、p-FoxO3、BDNF 蛋白表达均明显升高 (P < 0.01)；与模
较， P < 0.01。EX527：SIRT1 抑制剂
图 1 ｜各组大鼠神经行为学评分比较 (x -±s，n=12) 型组比较，灸法预处理组 SIRT1、FoxO3、BDNF 明显升高 (P <
-±s,
Figure 1 ｜ Comparison of rat neurobehavioral scores among groups (x 0.01)，p-FoxO3 表 达 明 显 降 低 (P < 0.01)； 与 灸 法 预 处 理 +
n=12)
EX527 组相比，灸法预处理组 SIRT1、FoxO3、BDNF 升高 (P <
2.3 大鼠脑梗死体积 TTC 染色法观察结果显示：假手术组 0.05)，p-FoxO3 表达未见明显统计学差异 (P > 0.05)，见图 3。
大鼠脑组织未见明显梗死灶，模型组、灸法预处理组、灸法
假手 灸法预 灸法预处理 +
A
预处理 +EX527 组可见明显缺血灶，灸法预处理组大鼠右侧
模型组
术组 处理组 EX527 组

梗死体积小于模型组和灸法预处理 +EX527 组 (P < 0.01，P <

0.05)，见图 2。

灸法预 灸法预处理 +
假手术组 模型组 处理组 EX527 组

GAPDH

B
bc 假手术组
a 模型组
bc 灸法预处理组
bc 灸法预处理 +
EX527 组
相对蛋白表达量

a
a
a
b

a
脑梗死百分比

图注：图 A 为蛋白免疫印迹条带图；B 为蛋白的统计分析结果，与假手

a b
术组相比， P < 0.01；与模型组相比， P < 0.01，与灸法预处理 +EX527 组，
c
bc P < 0.05。EX527：SIRT1 抑制剂；BDNF：脑源性神经营养因子
图 3 ｜各组大鼠缺血脑组织中 SIRT1、FoxO3、p-FoxO3、BDNF 蛋白表达
比较 (x -±s，n=6)
假手 模型组 灸法预 灸法预处理 +
术组 处理组 EX527 组 Figure 3 ｜ Comparison of SIRT1, FoxO3, p-FoxO3, and brain-derived
图注：上图脑白色区域为缺血梗死区，红色正常脑区。与假手术组比较， neurotrophic factor protein expression in ischemic brain tissue of rats (x±s,
-
a
P < 0.01； 与 模 型 组 比 较， P < 0.01； 与 灸 法 预 处 理 + n=6)
b

EX527 组相比，cP < 0.05。EX527：SIRT1 抑制剂

图 2 ｜各组大鼠脑梗死体积比较 (x -±s，n=6)
-±s, 3 讨论 Discussion
Figure 2 ｜ Comparison of rat cerebral infarction volume among groups (x
n=6) 脑卒中是继癌症和冠心病之后全球第三大死亡原因，并
[12-13]
导致 80% 的患者出现永久性残疾 。缺血性脑卒中约占所
[12]
2.4 梗死组织中氧化应激因子水平 试剂盒检测结果显示： 有卒中类型的 70%，其余亚型为脑内出血或蛛网膜下腔出血 。
再灌注 12 h 后，与假手术组比较，模型组丙二醛表达明显升 目前，静脉溶栓和血管内取栓可以恢复血流，被认为是治疗
[14-15]
(P < 0.01)，超氧化物歧化酶表达明显降低 (P < 0.01)；与模型 脑缺血的有效方法 。然而，在脑卒中后的康复过程中，
组和灸法预处理 +EX527 组相比，灸法预处理组丙二醛表达 后续的神经功能丧失仍然难以解决。脑缺血后会出现一系列
[16] [17]
明显降低 (P < 0.01，P < 0.05)，超氧化物歧化酶表达明显升高 的代谢和细胞损伤，包括神经炎症 、氧化应激损伤 、
[18] [19]
(P < 0.01，P < 0.05)。结果见表 1。 自噬和凋亡的交替 、兴奋性毒性等 。

Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 28｜No.16｜June 2024｜2491

 中国组织工程研究 研究原著
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[30]
艾灸是通过灸法刺激腧穴局部，从而起到调节全身、活 从而促进抗氧化蛋白如超氧化物歧化酶的表达 。SIRT1 对
血通络、调和阴阳的目的，灸法治疗脑卒中已在针灸临床得 FOXO3 的去乙酰化可以防止 FOXO3 诱发的细胞死亡，在对刺
到广泛应用。艾灸预处理属于“逆灸”范畴，指的是在发病 激的反应中，FOXO3a 会磷酸化并与细胞核中的 14-3-3 蛋白
[31-32]
之前或发病之初即对患者进行治疗，达到舒经通络，提高机 结合，这抑制了 FOXO3a 依赖的转录 。细胞可以通过与
体免疫能力，从而防止疾病发生、延缓疾病进展的效果，其 SIRT1 一起使 FOXO3 去乙酰化来抵抗氧化应激，并诱导周期
理论基础属于中医学“治未病”思想。艾灸预处理的机制一 停滞。
[20]
部分可用针灸良性预应激假说进行阐述 ，但其具体机制仍 WU 等 [33] 发现，lncRNA SNHG12 通过激活 SIRT1/FOXO3
[34]
待阐述。此次研究选择百会、大椎、足三里 3 个穴位作为干 途径抑制缺血再灌注模型的氧化应激反应。在 DUAN 等
预穴位，百会穴、大椎穴属督脉穴位，督脉循行“上至风府， 的研究中，Akt/SIRT1/FOXO3a/PGC-1α 途径被证明受到来自
入属于脑，上巅，循额，至鼻柱，属阳脉之海”，且百会穴 Aralia taibaiensis(sAT) 的皂苷的调节，保护脑细胞免受缺血和
为手足三阳经的交会穴，具有振奋阳气、醒脑开窍的作用。 再灌注引起的线粒体功能障碍。此次研究发现灸法预处理可
《灵枢 • 口问》：“故上气不足，脑为之不满，耳为之苦聋， 显著增加 SIRT1、FoxO3 蛋白表达，应用 SIRT1 抑制剂 EX527 后，
头为之苦倾，目为之眩”。足三里为足阳明经之穴位，具有 灸法预处理的效应被抑制，说明灸法预处理起效机制可能与
明确的补气功效，气足则脑清。 激活 SIRT1/FoxO3 通路有关。
此次研究结果发现：灸法预处理可显著降低大鼠的神 综上所述，此次研究认为灸法预处理可显著改善缺血再
经行为学评分，减小缺血再灌注后的脑组织梗死面积，增加 灌注后大鼠的神经功能，其机制可能与激活 SIRT1/FoxO3 通
SIRT1、FoxO3、超氧化物歧化酶、BDNF 蛋白表达，降低丙 路减轻脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤有关。
二醛蛋白表达，应用 SIRT1 抑制剂 EX527 后，灸法预处理的 此次研究为临床应用灸法预处理防治脑卒中提供了一定
效应被抑制，说明灸法预处理可显著改善缺血再灌注后大鼠 的实验依据，然而研究仍存在一定的局限性，首先，研究的
的神经功能，其机制可能与激活 SIRT1/FoxO3 通路减轻脑缺 样本量稍显不足，以致在统计时部分数值误差值较大；其次，
血再灌注后氧化应激损伤有关。该结论与前人部分研究结果 研究仅进行了再灌注 12 h 的疗效，未进行多个时间点的动态
[21]
类似 。 观察，在灸法预处理的动态疗效方面仍缺少一定的数据支撑；
在脑卒中发病过程中，活性氧的过度产生和随后的脑损 第三，仅选择了大鼠样本进行观察，此后仍需要在其他物种
[22-23]
伤有关 。脑卒中后，线粒体过度产生活性氧，然后通过 中进一步验证灸法预处理对脑卒中缺血再灌注后氧化应激损
破坏蛋白质、脂质和核酸，对细胞功能产生一系列破坏性影 伤的疗效。
[24]
响 。此外，细胞死亡途径可由活性氧作为细胞内信使发出
[25]
信号 。因此，减少活性氧产生一直是脑卒中治疗研究的重 作者贡献：蒋洁进行实验设计，实验实施为刘娟、于燕艳、杨越、
王千慧，资料收集为杨越、王千慧，蒋洁成文，刘娟审校。
点。氧化应激是机体内活性氧生成过多或清除能力降低，丙
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不
二醛是细胞膜脂质过氧化终产物，超氧化物歧化酶是氧自由 存在利益冲突。
基清除剂之一，因此丙二醛和超氧化物歧化酶被作为衡量机 开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》
体氧化应激水平的常用指标。此次研究发现艾灸预处理可显 “署名 - 非商业性使用 - 相同方式共享 4.0”条款，在合理引用的情况下，
允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任
著增加超氧化物歧化酶表达，降低丙二醛表达，说明艾灸预
何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为
处理可显著改善脑缺血再灌注后氧化应激。 之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。
SIRT1，也被称为 sirtuin 1，是一种位于细胞核中的 NAD 版权转让：文章出版前全体作者与编辑部签署了文章版权转让协议。
依赖性去乙酰化酶
[25]
。SIRT1 已被证明在调节广泛的生理过 出版规范：文章撰写遵守了《学术研究实验与报告和医学期刊编辑
与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行
程中发挥了关键作用，包括细胞凋亡、DNA 修复、炎症反 3 次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期
[26]
应、代谢、癌症和压力 。以前的研究表明，SIRT1 可以在 刊发稿宗旨。
不同的研究领域，包括缺血再灌注诱导的肾脏、大脑和心脏
损伤中，对氧化应激炎症起保护作用
[27]
。近年来，SIRT1 被 4 参考文献 References
认为在脑卒中的发病机制中特别重要，大量研究表明，SIRT1 [1] TIAN H, ZHAO Y, DU C, et al. Expression of mir-210, mir-137, and mir-
153 in patients with acute cerebral infarction. BioMed Research
可以保护神经元免受 FOXO、核因子 κB 和 p53 诱导的氧化和
[28]
International. Biomed Res Int. 2021;2021:4464945.
炎症损伤 。FOXO3 已被证明在调节氧化应激方面起着重要 [2] HE J, XUAN X, JIANG M, et al. Long non-coding rna snhg1 relieves
作用，它能上调几种抗氧化蛋白的表达，包括超氧化物歧化 microglia activation by downregulating mir-329-3p expression in
酶、锰超氧化物歧化酶和过氧化氢酶 (CAT)，FOXO3 可以被 anin vitromodel of cerebral infarction. Experimental and Therapeutic
[29] Medicine. Exp Ther Med. 2021;22(4):1148.
磷酸化和去乙酰化以调节其转录活性 。此外，有研究表明，
[3] ZHANG X, ZHOU G. mir-199a-5p inhibition protects cognitive function
SIRT1 能使组蛋白和非组蛋白去乙酰化，包括 FOXO，SIRT1 of ischemic stroke rats by akt signaling pathway. American Journal of
通过去乙酰化和激活 FOXO 增加细胞对氧化应激的抵抗力， Translational Research. Am J Transl Res. 2020;12(10):6549-6558.

2492｜中国组织工程研究｜第28卷｜第16期｜2024年6月
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