CÂU HỎI ÔN TẬP

Phần thi lý thuyết thực tập sinh học phân tử sẽ nằm trong cuốn giáo trình thực
tập, các phần thầy cô giảng trong lúc thực tập (các bạn nên nghe giảng và note
lại), các câu hỏi đầu giờ và Bài 9. Một số phương pháp và kỹ thuật cơ bản
trong sinh học phân tử trong sách Sinh học phân tử. Lưu ý là có điểm liệt nha
.Dưới đây là phần ôn tập các bạn có thể tham khảo. Chúc các bạn đạt được số điểm
xứng với công sức bỏ ra ^.^
BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN
1/ Chức năng của máy lắc rung ( Vortex) ?

Lắc trôn các dung dịch hay phân tán cắn trong tube

2/ Chế độ vận hành của máy lắc rung (Vortex) ?

Có 2 chế độ vận hành

Liên tục: Rotor quay liên tục

Kích hoạt: Khi ta dặt tube vào rotor rồi nhấn xuống thì roto mới quay

3/Khi sử dụng Vortex cần lưu ý ?

-Đậy nắp kỹ tránh dung dịch bắn ra ngoài

-Chất lỏng không nên đầy ( không Vortex được), không quá ít (dính lên thành ống )

4/ Chức năng máy ly tâm ?

Sử dụng lực ly tâm để làm lắng cặn như tế bào hay tủa hay tách pha các hỗn dịch
hay nhũ tương

5/ Rotor của máy thuộc loại rotor góc có thể thay đổi tùy theo số tube hay loại
tube. Máy ly tâm nhỏ được sử dụng để ly tâm eppendorf và tube.

6.Chế độ sử dụng của máy ly tâm

Có 2 chế độ sử dụng:

- Ly tâm nhanh (pulse/spin): nhấn và giữ luôn nút Pulse (hay nút
Start/Quick), khi muốn dừng thả tay ra, áp dụng để dồn các thành phần
đang dính trên thành tube xuống đáy.
- Ly tâm: để lắng cặn. Chọn tốc độ và thời gian thích hợp rồi nhấn nút Start.

7/ Một số tube, eppendorf thành mỏng (tube PCR) không chịu được tốc độ ly tâm
cao nên có thể bị thủng

8/ Sau khi ly tâm tủa sẽ lắng ở đáy và thành ống ở phía xa nhất so với tâm của
rotor, do đó nên đặt ống vào rotor sao cho quai nắp hướng ra ngoài, khi đó ta dễ
dàng hút phần dịch nổi mà không ảnh hưởng đến cắn.

9/ Tốc độ quay rotor tính bằng vòng / phút

10/ Micropipet là dụng cụ dùng để lấy chất lỏng có thể tích nhỏ hàng microlit

11/ Micropipet có nhiều cỡ kèm theo tip tương ứng : 0.1 -> 10µl (trắng) ; 10 ->
200µl (vàng) ; 100 ->1000µl (xanh)
12/ Cấu tạo micro pipet: cần bơm, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích
được chọn, bộ phận đẩy tip, đầu hút

13: Sử dụng: cầm chắc pipet trong lòng bàn tay sao cho ngàm tựa tì lên ngón
trỏ, dùng ngón cái để bấm cần bơm và núm đẩy tip.

14/ Không dùng đầu hút để hút mà phải dùng tip.

15/ Cách sử dụng pipet (xem kĩ giáo trình )

BÀI 2 : CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN CỦA VI KHUẨN.

1/ Nguyên tắc chung :

- Phá vỡ tế bào
- Chiết tách với phenol/ choloroform/ isoamyl alcohol đệm tủa khác để loại
bỏ protein, mảnh vỡ tế bào, thu dịch acid nucleic.
- Tủa acid nucleic bằng ethanol với hiện diện muối cation hóa trị 1, hoặc tủa
bằng isopropanol

2/ Đệm giải Bacillus (để phân tán cắn tế bào và làm môi trường): 50 mM EDTA
( ổn định pH, khóa Mg2+ làm ADN không hoạt động), 0,1M NaCl (dùy trì áp suất
thẩm thấu, đẳng trương). PH 7,5

3/ Lysozym : để phân hủy thành tế bào của vi khuẩn (điều kiện hoạt động ở 37 oC )

4/ Đệm ly giải nucleic: phân tán cắn tế bào, phá vỡ màng tế bào để bộc lộ tế bào
chất.

5/ Đệm tủa protein: tủa protein, các mảnh vỡ tế bào.

6/ Isopropanol : tủa ADN tỉ lệ 0.6 : 1

7/ Tủa bằng ethanol với hiện diện muối cation hóa trị 1: tỉ lệ 2.5:1

8/ Ethanol 70% : rửa ADN, cồn 80% 90% vẫn dùng để rửa được, nhưng không dùng
cồn tuyệt đối.

9/ RNAse: loại bỏ ARN

10/ Phenol/choloroform/isoamyl alcohol : tỉ lệ 25/24/1

11/ So sánh các phương pháp thu hồi DNA từ dịch chiết

Quy trình kết tủa với etanol

-Đơn giản, rẻ, etanol dễ bay hơi, hòa tan trong muối tốt
-Tỷ lệ dịch ADN thấp 1:2.5

-Cần cation hóa trị I

Qui trình kết tủa khác:

- Isopropanol: tủa được nhiều dịch ADN hơn ( 1:0.7), không cần cation, bay hơi và
hòa tan muối kém

- LiCL 8M mà không có etanol: tủa ARN lớn

Thu hồi bằng hấp phụ

-Dễ thực hiện, tự động hóa, hiệu suất thu hồi và chất lượng tốt

-Đắt tiền không hiệu quả đối với acid nucleic nhỏ

12/ Quá trình tách chiết ADN cần chú ý bước nào để tăng hiệu suất ?

- Loại bỏ tạp chất (hút bỏ dịch nổi bằng micropipet)

- Tủa ADN (càng nhiều càng tốt )

13/ Các bước tách chiếc ADN

- Phá vỡ tế bào
- Loại bỏ tạp chất
- Kết tủa DNA
- Tinh sạch DNA
- Bảo quản

BÀI 4: CHIẾT TÁCH PLASMID pBLUESCRIPT TỪ

E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU NHỎ
1/Khác biệt giữa chiết tách ADN plasmid và ADN bộ gen?

Phải tách ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắt thể

2/ Tách ADN plasmid khỏi ADN NST có thể dựa vào khác biệt về kích thước hoặc
cấu dạng. Plasmid lớn nhất cũng chỉ bằng 8% kích thước của NST E.coli.

3/ Chủng E.coli mang plasmid pBluescript có đề kháng ampicillin

4/ Vì sao không dùng lysozym để phá hủy thành TB của E.coli (bài 2 dùng
lysozym phá hủy thành tế bào của chủng Bacillus subtilis ) ?

Vì chủng Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương có vách rất dày gồm peptidogly
can
Còn E.coli là vi khuẩn gram âm vách TB có 3 lớp, màng tế bào trong cùng,
peptidoglycan mỏng và lớp ngoài cùng với lipoprotein và lipopolysaccharide tạo
phức hợp lipid- polysaccharide

5/SDS kiềm dùng để làm gì ?

Biến tính ADN sợi đôi thành sợi đơn, phá vỡ thành và màng tế bào bằng cách nhũ
tương hóa các thành phần lipit, biến tính protein

6/ Vai trò KOAc ?

Trung hòa pH kiểm, hồi tính ADN, tủa protein, hỗ trợ tủa ADN bằng cồn

7/ Vì sao phải bổ sung KOAc ?

Dưới tác dụng của SDS kiềm: plasmid và NST đều bị tách thành dạng thẳng, khi cho
KOAc thì ADN NST không phục hồi được cấu trúc ban đầu, còn plasmid do kích thước
nhỏ nên hồi tính. Do đó tách được ADN plasmid khỏi ADN NST.

8/ Tủa ADN bằng cồn cần điều kiện gì ?

Sự hiện diện của Cation hóa trị I

BÀI 5: PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN

1/Nguyên lí PCR?

- Kỹ thuật PCR dựa trên đặc điểm của quá trình sao chép gene trong tế bào
- Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa đặc hiệu
- Trong điều kiện có sẵn nucleotid, ADN polymerase sẽ kéo dài mồi theo
nguyên tắc bổ sung với khuôn ADN sợi đơn nếu đầu 3’OH của mồi còn
trống tạo thành sản phẩm sợi đôi
- Phản ứng được quay vòng nhờ mồi thừa và sử dụng nhiệt độ cao để tái tạo
khuôn ADN sợi đơn từ sản phẩm sợi đôi

2/Các bước tiến hành 1 phản ứng PCR?

- Biến tính ADN sợi đôi thành các sợi đơn nhờ nhiệt độ 92 – 96 OC
- ủ các đoạn mồi (chuổi oligonucleotid gắn đặc hiệu với DNA khuôn mẫu) và
các sợi đơn ADN ở nhiệt độ 45 – 65oC
- Enzym polymarse kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với
khuôn mẫu tạo thành 2 sợi đôi mới ở nhiệt độ 72 oC

3/Chu kỳ nhiệt điển hình của PCR?

Mỗi phản ứng PCR gồm khoảng 25 – 40 chu kỳ. Một chu kỳ nhiệt PCR điển hình như
sau
Biến tính khởi đầu: 95oC trong 5 – 10 phút (ở nhiệt độ này tất cả ADN sợi đôi bất
kể chiều dài đều bị biến tính)

Chu kỳ nhiệt: Gồm 3 bước lặp lại 20 -40 lần

- Biến tính: 94 -95 độ trong 30 giây đến vài phút

- Gắn mồi: 40 đến 70 độ trong 30 đến 60 giây
- Kéo dài: 65 đến 74 độ thời gian tùy theo độ dài khuôn

Kéo dài kết thúc: 72 đến 74 độ và thời gian gấp vài lần thời gian kéo dài.

4/Vai trò và thành phần trong phản ứng PCR

Thành phần phản ứng 20 -100µl

- Khuôn mẫu: 1pg - 1µg, nồng độ quá cao gây ức chế phản ứng
- Mồi 0.1 - 1µM, nồng độ quá cao sẽ dẫn đến bắt cặp sai và làm giảm tính
đặc hiệu
- Đệm: cung cấp pH thích hợp cho phản ứng và có nồng độ Mg 2+ thay đổi
(cần tối ưu hóa), thường trong khoảng 0,5 – 5mM
- Hỗn hợp các dNTP: A, T, G và C nồng độ 200 - 250µM
- ADN polymerase chịu nhiệt : 0,5 – 2,5 IU cho mỗi phản ứng
- Nước vừa đủ

5/Các yếu tố cần được tối ưu hóa:

- Khuôn mẫu của polymerease, cần tối ưu hóa cho từng khuôn mẫu khác
nhau . thường trong khoảng 0.5 – 5mM
- Nhiệt độ gắn mồi = Tm -5oC ( cần đươc tối ưu)
. quyết định tính đặc hiệu của phản ứng
. quá cao phản ứng khó diễn ra, quá thấp  không đặc hiệu .

6/ Yếu tố quyết định kích thước đoạn khuếch đại

- Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược

- RE được chọn để cắt cần lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu tù hay đầu dính

7/ Yêu cầu mồi PCR : gồm mồi xuôi và mồi ngược

- Chiều dài 18 – 30 nucleotid ( tối thiểu là 15, có thể dài hơn 30)
- Khoảng cách các vị trí bắt cặp không quá 10kb
- Tỷ lệ GC chiếm 40-60%
- Nhiệt độ chảy 2 mồi phải gần nhau khoảng 40-65 độ, tốt nhất là 52 -58 độ

8/Cách tính nhiệt độ gắn mồi :

Nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ chảy khoảng 3 -5 oC. Tm (oC)= 4(GC)
+2(AT)
9/Vai trò của maxtermix

- Tăng độ đồng đều các chất

- Thao tác nhanh hơn
- Hút chính xác hơn các chất có thể tích nhỏ
- Tiết kiệm thời gian
- Tiết kiệm vật liệu (đầu tip)

10/Ưu nhược điểm PCR

Ưu: Nhanh, đơn giản, nhảy, đặc hiệu

Nhược: Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi ; Ngoại nhiễm mất tính đặc hiệu.

BÀI 6: ĐỊNH LƯỢNG ADN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO

MẬT ĐỘ QUANG
1/ Nguyên tắc chung:

Acidnucleic có đỉnh hấp thu trong vùng ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm.
Protein hấp thu ánh sang ở bước sóng 280nm. Tính tỉ lệ OD260/OD280 giúp ước
lượng độ tinh khiết của dung dịch acid nucleotid. Nếu tỉ lệ trong khoảng 1,8 – 2,0
dung dịch acid nucleotid được xem là sạch.

2/ Polysaccharid hấp thu cực đại tại bước sóng 230nm, đối với ADN thực vật cần
xác định thêm tỉ lệ OD260/ OD 230

3/ Tỉ lệ OD260/ OD280 :

- < 1,8 nồng độ protein cao xử lí bằng phenol

- > 2 bị lẫn ARN xử lí bằng enzym phân hủy ARNase

BÀI 7: PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

1/ Nguyên tắc chung

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động
của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử ADN ARN,
protein dựa trên đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về
các cực dương hoặc âm tùy theo điện tích của chúng. ADN và ARN tích điện âm
không đổi nhờ khung phosphat và vì thế sẽ dịch chuyển từ cực âm đến cực
đương. Các phân tử nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như
giấy cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide.
2/ Safe view là gì ?

Là chất nhuộm huỳnh quang, nó gắn với ADN hay ARN và hấp thu ánh sáng UV ở
bước sóng 290 – 320nm và phát huỳnh quang xanh ở bước sóng 515nm giúp xác
định vị trí băng ADN trên gle agarose hay polyacrylamide.

3/Đệm tải (LB) chứa glycerol nhắm tăng tỷ trong giúp ADN lọt vào giếng dễ
dàng ; bromophenol blue để đánh dấu đỉnh di chuyển của ADN trong quá trình
điện di. Đệm tải thường dùng là đệm 6X hoặc 10X

4/Thang chuẩn ADN 1 Kb : chạy điện di song song với ADN khảo sát để đối chiếu
kích thước ADN

5/Máy điện di nằm ngang

6/ Nồng độ từ 0,5 – 2% agarose

- Nồng độ cao : mắt lưới nhỏ  di chuyển chậm

- Nồng độ thấp : mắt lưới lớn  Di chuyển nhanh

7/Dung dịch đệm điện di: vai trò bảo vệ ADN và dẫn điện

BÀI 8: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ ĐA HÌNH ĐỘ DÀI

CỦA ĐOẠN CẮT GIỚI HẠN
1/ Nguyên tắc chung

RFL : dựa trên việc phân tích sự đa hình về chiều dại của mẫu ADN sau khi bị
cắt bởi 1 hay nhiều enzym cắt giới hạn.

2/ Phương pháp nguyên thủy: sử dụng ADN NST để phân tích, ADN sau khi cắt
được phân tách trên gel và chuyển lên màng nhờ kỹ thuật Southrern blot, một
đoàn dò có đánh dấu được cho vào để nhận diện một số trình tự đặc biệt và kết quả
ghi lại bằng tự xạ ký. Chỉ các band được nhận diện bởi đoạn dò mới cho tín hiệu
trên tự xạ đồ. Phân tích band này cho phép phân biệt các loài

3/ Quy trình

- Khuếch đại gen đặc hiệu

- Cắt bằng RE
- Phân tích bằng PAGE (polyAcrylamide Gel Electrophoresis)

BÀI 9: ĐIỆN DI TRONG GEL POLYACRYLMIDE

1/ Phương pháp điện di gel đứng

2/ So sánh với agarose gel, polyacryamide gel có các ưu nhược điểm sau:

Ưu điểm

- Khả năng phân giải cao, phân biệt đến từng nucleotid
- Khả năng dung nạp mẫu lớn, có thể dùng để phân tích lượng mẫu lớn hơn

Nhược điểm

- Khoảng kích thước có thể phân tích nhỏ ( 1- 500bp) so với agarose có thể
phân tích ADN từ 50pd đến vài megabase
- Khó thao tác, chi phí cao hơn

3/Vai trò của aps 10% : tạo gốc tự do

4/ Có thể nhuộm bằng thuốc nhộm Ag không vì sao ?

Có thể vì

- Gắn được vớIadn

- Có màu
- Phát huỳnh quang khi phát ánh sáng kích thích

BÀI 10: BIẾN NẠP PLASMID VÀO E.COLI

1/ Vai trò của vector tạo dòng trong SHPT và yêu cầu của vector tạo dòng

Vai trò : vật liệu di truyền trung gian để chuyển gen giữa các tế bào do chúng có
khả năng được sao chép và phân phối vào các tế bào mới trong quá trình phân bào,
nhờ đó gen đang nghiên cứu cũng được sao chép và hiện diện ở tất cả các tế bào
xuất phát từ tế bào nhận gen ban đầu

Yêu cầu :

- Có thể được sao chép bởi tế bào nhận nó

- Có trình tự nhận diện của enzym giới hạn để cắt và đưa gen ngoại lai vào
- Mang một hay nhiều yếu tố chọn lọc để phân biệt hoặc chọn tọc tế bào
nhận được vetor với tế bào không nhận được .

2/ Đặc điểm và yêu cầu của vector Plasmid

Plasmid là một phân tử ADN sợi đôi, dạng vòng kín, nhỏ, có thể nhân bản độc lập với
NST trong tế bào

Yêu cầu:
 - Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp. Thường là một hay nhiều
gen kháng kháng sinh
- Có điểm khởi đầu sao chép cho phép nhân bản plasmid trong TB không
phụ thuộc NST
- Có vùng tạo dòng trình tự ADN ngắn, mang trình tự nhận diện duy nhất
của RE khác nhau, để cắt mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn
vào.
- Mang yếu tố đánh dấu đoạn chèn để nhận biết plasmid sau khi đưa vào TB
đã được nối với gen ngoại lai trong vùng tao dòng hay chưa
- Plasmid được đưa vào TB chủ bằng biến nạp hay thẩm điện

3/ Chức năng CaCl2

- Làm cho ADN kết tủa trên mặt ngoài của tế bào hay muối gây ra một số
thay đổi trên thành tế bào vi khuẩn làm cho nó dễ gắn với ADN hơn.

4/ Các phương pháp đưa gene vào tế bào

Biến nạp, tải nạp, thẩm điện, chuyển nhiễm, đạn sinh học

5/ Biến nạp để đưa gene vào tế bào

- Chuẩn bị tế bào khả nạp

- Xử lí với CaCl2 (ADN chỉ dính ở mặt ngoài chứ chưa vào trong)
- Tế bào khả nạp phải được bảo quản lạnh và sử dụng ở nhiệt độ thấp (4 oC)