ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

THÍ NGHIỆM HÓA HỌC – HÓA SINH THỰC PHẨM

.
Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Nguyên
Lớp: L01 (Sáng thứ Sáu)
Nhóm: 2

Sinh viên thực hiện MSSV

Lê Minh Tường Khánh 2053113

Nguyễn Hoàng Trúc Linh 2211857

Ngô Hoàng Bích Ngân 2212179

Thành Phố Hồ Chí Minh, 2024

Bài 4:
PROTEIN
1. AXIT AMIN PHẢN ỨNG VỚI NIHYDRIN
1.1. Nguyên tắc
Phản ứng màu đặc trưng của ninhydrin và acid amin và cường độ màu của dung
dịch sau phản ứng là cơ sở của việc sử dụng ninhydrin trong các phương pháp định tính
và định lượng acid amin bằng kỹ thuật so màu.
1.2. Dụng cụ - thiết bị
- Năm ống nghiệm 18ml
- Kẹp, giá đựng ống nghiệm
- Năm pipette dung tích 1ml
- Nồi cách thủy
- Bếp ga (hoặc bếp điện)
1.3. Hóa chất
- Thuốc thử ninhydrin 1% trong acetone 95%.
- Các dung dịch acid min: glutamic; leucin; prolin có nồng độ 0,05%.
- Một dung dịch hỗn hợp acid amin.
1.4. Cách tiến hành
- Sử dụng pipette dung tích 1 ml để lấy vào 5 ống nghiệm được đánh số thứ tự như
sau:
• Ống thứ nhất: 1ml dung dịch glutamic
• Ống thứ hai: 1ml dung dịch leucin
• Ống thứ ba: 1ml dung dịch prolin
• Ống thứ tư: 1ml dung dịch hỗn hợp acid amin
• Ống thứ năm: 0,5 ml dung dịch hỗn hợp amin và 0,5 ml nước cất
- Dùng pipette 1ml để lấy vào mỗi ống 0,2 ml thuốc thử ninhydrin. Đặt các ống
nghiệm vào nồi cách thủy hoặc tủ sấy (90 – 95℃) trong 10 phút. Sau đó lấy ra, ghi
lại màu dung dịch trong các ống nghiệm và viết phản ứng.
1.5. Kết quả

Hình 1.1. Axit amin phản ứng với ninhydrin

1
Ống 1 2 3 4 5

Hỗn hợp
Dung dịch Dung dịch Dung dịch Hỗn hợp
Hóa chất amino acid
glutamic leucine proline amino acid
và nước cất

Màu Xanh tím Xanh tím Vàng cam Xanh tím Xanh tím

Cường độ
+ ++ (*) ++++ +++
màu

Nhận xét
- Ống 1 (Glutamic) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh tím nhạt.
- Ống 2 (Leucin) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh tím.
- Ống 3 (Prolin) sau khi đun nóng dung dịch có màu vàng.
- Ống 4 (hỗn hợp acid amin) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh đen.
- Ống 5 (hỗn hợp acid amin + nước cất) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh tím
đậm.
Giải thích kết quả
Dựa vào nguyên tắc phản ứng oxy hóa – khử của ninhydrin với amino acid,
trong đó ninhydrin là tác nhân oxy hóa, khi tiếp xúc với nhóm amino (−𝑁𝐻2 ) là
một tác nhân khử của amino acid, ninhydrin sẽ oxy hóa amino acid và loại đi 2 khí
𝐶𝑂2 , 𝑁𝐻3 . Khi đó, ninhydrin sẽ bị khử về hydrindantin, và một aldehyde tương ứng
với gốc bên R được hình thành. Lúc này ammonia (𝑁𝐻3 ) sẽ tác dụng với một phân
tử ninhydrin khác để tạo thành diketohydrin (hay còn biết đến là phức Ruhemann),
chính phức này làm cho màu hỗn hợp sau phản ứng có màu xanh tím.
Thành phần (tỉ lệ) theo khối lượng nhóm amino càng nhiều trong mẫu phân tích
thì màu xanh tím càng đậm. Do đó:
- Hỗn hợp amino acid có thành phần nhóm amino cao nhất (đặc biệt là khi các amino
acid có 2 nhóm amino trong phân tử) nên có màu xanh tím đậm nhất (++++).
- Hỗn hợp amino acid với nước cất sẽ giảm độ đậm của màu xanh tím (+++).
- Dung dịch leucine là một monoamino monocarboxylic acid nên độ đậm của màu
xanh tím vừa phải (++).
- Dung dịch glutamic là một monoamino dicarboxylic acid nên độ đậm của màu xanh
tím là yếu nhất (+).
- Trường hợp của proline là một imino acid, không chứa nhóm amino mà chứa
nitrogen dạng vòng. Phản ứng không đi qua việc loại 𝑁𝐻3 mà đi qua con đường
ngưng tụ loại 𝐶𝑂2 để tạo thành một phức màu vàng (vàng hơi cam) (*).

2
2. Định lượng nito acid amin bằng phương pháp chuẩn độ formol (P.P Sorensen)
2.1. Nguyên tắc
Các aldehyt dễ kết hợp với nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dụng với acid
amin, nhóm amin bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylen imino acid.
Hợp chất tạo thành sẽ có tính acid mạnh hơn so với ban đầu, nhóm carboxyl lúc này
dễ dàng được phân định bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của acid
amin có trong dung dịch.
Khi dùng phương pháp này cần chú ý các điểm sau:
- Để cho phản ứng tạo thành methylen imino acid diễn ra hoàn toàn, cần có dư một ít
dung dịch formaldehyde và phản ứng trung hòa hoàn toàn carboxyl được thực hiện
khi môi trường pH đạt tới 9,2 ÷ 9,5.
- Nếu trong dung dịch có chứa nhiều NH3, nhất là trong các dịch thủy phân protein thì
phải loại trừ NH3 trước trong chân không ở nhiệt độ 40℃.
- Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu màu đậm thì rất khó
nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ.
- Dùng phương pháp này kết quả chỉ thật đúng đối với trường hợp của acid monoacid
monocarboxylic. Để kết quả đúng với mọi trường hợp cần phải trung hòa dung dịch
đến pH 7 trước khi phân tích.
- Để xác định điểm bắt đầu (pH 7) và điểm kết thúc (pH 9,2), người ta dùng phương
pháp so màu. Tạo ra hai thang màu chuẩn ở pH 7 và pH 9,2 rồi đưa pH của mẫu về
7 (so sánh màu với màu với màu chuẩn pH 7) sau đó định phân đến pH 9,2 (so sánh
màu với màu chuẩn pH 9,2).
2.2 Dụng cụ
- Năm ống nghiệm 18ml
- Bình định mức 100mL
- Erlen 100mL
- Pipette 1mL; 20mL
- Burette 25mL
- Becher 100mL
2.3. Nguyên liệu - Hóa chất
- Nước mắm
- Dung dịch đệm pH 7; pH 9,2
- NaOH 0,05N
- HCl / H2SO4 0,05N
- Formol trung tính
- Phenolphtalein
- Bromthymol blue
2.4. Tiến hành
Chuẩn bị hai thang màu có pH 7 và pH 9,2
Lấy hai bình erlen có dung tích 100ml:
3
- Cho vào bình thứ nhất: 20ml dung dịch có pH 7 và 5 giọt bromthymol blue 0,04%.
- Cho vào bình thứ hai: 20ml dung dịch có pH 9,2 và 5 giọt bromthymol blue 0,04%
và 3 giọt phenolphtalein 0,5%.
Khi đó dung dịch trong bình 1 có màu xanh lục nhạt, dung dịch trong bình 2 có màu
tím xanh. Màu của các dung dịch trên giữ trong bình kín có thể bền trong nửa tháng
Tiến hành định phân mẫu:
Xác định hàm lượng nito amin trong nước mắm. Do nước mắm có màu tối nên cần
phải pha thật loãng mới có thể so màu của chất chỉ thị.
Lấy vào bình định mức (dung tích 100ml) 1ml nước mắm, dùng nước cất định mức
thành 100ml, lắc đều.
Lấy vào bình nón (dung tích 100ml) 20ml dịch mẫu nước mắm pha loãng từ bình
định mức, thêm vào đó 5 giọt bromythol blue: Nếu dung dịch có màu xanh dương thì
thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0,05N. Còn nếu dung dịch có màu vàng thì thêm từng
giọt NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0.
Thêm vào bình chứa dịch mẫu 3 giọt phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính rồi
chuẩn độ bằng NaOH 0,05N cho đến khi hỗn hợp có màu ứng với màu của dung dịch
trong bình 2 có pH 9,2.
Song song tiến hành lầm thí nghiệm kiểm chứng, thay thế dung dịch chứa mẫu nước
mắm bằng nước cất.
2.5. Bảng số liệu và công thúc tính
Mẫu 𝑎 (𝑚𝐿) 𝑏 (𝑚𝐿) 𝑇 𝑉 (𝑚𝐿)

(1) 4,5 0,3 1 1

(2) 4,4 0,3 1 1

(3) 4,6 0,3 1 1

𝑎1 +𝑎2 +𝑎3 4,5+4,4+4,6

𝑎̅ =
3
= 3
= 4,5 ;mL
- Số gam nitơ axit amin có trong 1 lít nước mắm:
(𝑎 − 𝑏) × 𝑇 × 0,0007 × 100 × 1000
𝑥=
20 × 𝑉
Trong đó:
𝒙 (𝑔) – lượng gam nitơ axit amin có trong 1 lít nước mắm
𝒂 (𝑚𝐿) – thể tích 𝑁𝑎𝑂𝐻 0,05𝑁 dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm;
𝒃 (𝑚𝐿) – thể tích 𝑁𝑎𝑂𝐻 0,05𝑁 dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng;
𝑻 – hệ số điều chỉnh nồng độ của dung dịch 𝑁𝑎𝑂𝐻 đem dùng so với nồng độ chuẩn;
𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟕 – số gam nitrogen ứng với 1 𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻 0,05𝑁;
𝑽 (𝑚𝐿) – thể tích nước mắm cho vào bình định mức.

4
2.6. Kết quả
- Số gam nitơ axit amin có trong 1 lít nước mắm:

𝑥 = (4,5−0,3)×1×0,0007×100×1000 = 14,7000 ;g
20×1
Nhận xét:
- Bảng số liệu của 6 nhóm:
1 2 3 4 5 6
15,7500 14,7000 15,5166 15,6333 14,5835 15,7500
Phương pháp định lượng acid amin bằng chuẩn độ formol là phương pháp cổ
điển. Hiện nay có nhiều phương pháp để định lượng acid amin chính xác hơn bao
gồm, phương pháp HPLC hoặc phương pháp sắc ký ion.
Khi so sánh kết quả giữa các nhóm, chúng em nhận thấy lượng nitơ acid amin
của các nhóm thu được ở khoảng từ 14,5835 đến 15,7500. Kết quả sai số có thể đến
từ các nguyên nhân sau:
• Điều kiện thực hiện ở phòng thì nghiệm chưa phải là điều kiện tiêu chuẩn
hoàn toàn, vẫn còn bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và môi trường khá lớn.
• Trong quá trình chuẩn độ, ta chỉ quan sát, so sánh và đối chứng giữa các
mẫu bằng mắt thường, dẫn đến kết quả được đưa ra ở giá trị tương đối.
Tóm lại, kết quả thu được là hoàn toàn hợp lý.