ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI

MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

1. Quan sát thước đo vật kính và biết được giá trị độ dài của mỗi vạch
2. Cách đo kích thước tế bào trên kính hiển vi
3. Xác định được hệ số dài của một khoảng thị kính và kích thước trung bình của tế
bào hồng cầu

I. LÝ THUYẾT
Muốn đo kích thước của những vạch nhỏ đang quan sát dưới kính hiển vi như hạt phấn
hoa, tế bào hay kích thước sợi bông, sợi tóc… thì không thể đo trực tiếp bằng cách dùng
những thước đo chiều dài bình thường, mà phải đo một cách gián tiếp thông qua một thước
đo khác được gắn vào thị kính của kính hiển vi. Thước đo đó được gọi là trắc vi thị kính
(thước đo thị kính).

1. Thước đo thị kính

Thường gặp hai loại :

- Loại đơn giản là một miếng kính hình tròn, ở giữa có một vạch dài 5mm được chia ra
làm 50 khoảng cách đều nhau. Khi sử dụng được đặt vào một cái gờ giữa hai thấu kính của
thị kính.

- Loại cải tiến được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm là loại AM-9-2. Nó được
cấu tạo từ một thị kính 15x và một hệ thống chia vạch để đo. Hệ thống chia vạch gồm một
kính phẳng cố định, trên đó khắc các vạch cách đều nhau đánh số từ 0 đến 8. Ngoài ra, còn
một kính di động có khắc hai vạch chéo nhau đi kèm với hai vạch song song. Kính di động
này được gắn liền với một trống chia độ bên ngoài. Xung quanh vòng tròn trống chia độ
được chia thành 100 vạch bằng nhau. Khi vặn trống chia độ hết một vòng (đi hết 100 vạch)
thì sẽ làm dịch chuyển 1 vạch trên kính cố định (dịch được 1mm). Như vậy mỗi vạch trên
trống chia độ tương ứng với 1/100 vạch ở kính cố định.
2. Thước đo vật kính
Thước đo vật kính là một phiến kính có kích thước 26 x 76 x15mm. Ở chính giữa
phiến kính có khắc một thước đo dài 1mm thành 100 vạch bằng nhau. Chiều dài mỗi vạch
là 0,01mm (10µm). Thước đo này được bảo vệ bởi một miếng kính nhỏ, tròn bằng
cách gắn lên trên thước đo. Xung quanh thước đo được đánh dấu bằng một vòng tròn màu
đen. Thước này đặt lên bàn kính hiển vi để xác định độ dài của mỗi vạch chia trên thước đo
thị kính đã được dùng để đánh dấu khoảng cách, hoặc kích thước vật muốn đo.

Cách đo

Muốn đo kích thước của bất kỳ vật hiển vi nào dưới kính hiển vi ở độ phóng đại nào
đó, người ta phải xác định chiều dài (tính ra µm) của mỗi khoảng cách trên thước đo thị
kính khi quan sát ở độ phóng đại ấy. Muốn vậy, người ta đặt thước đo vật kính vào bàn
kính hiển vi, sau đó điều chỉnh sao cho vạch đầu tiên của thước đo thị kính trùng với vạch
đầu tiên của thước đo vật kính, sau đó đếm xem có bao nhiêu khoảng của thước đo thị kính
vừa vặn trùng với bao nhiêu khoảng của thước đo vật kính.

Ví dụ 1

Ở độ phóng đại 32 (thị kính 10x, vật kính 3,2) thì 5 khoảng cách ở thước đo thị kính (ký
hiệu là a) trùng khít hoàn toàn với 22 khoảng cách của thước đo vật kính (ký hiệu b). Như
vậy, mỗi khoảng cách của thước đo vật kính có độ dài 10µm, thì chiều dài một khoảng
cách trên thước đo thj kính ở độ phóng đại trên là :

Khi đã biết độ dài một khoảng của thước đo thị kính, lấy thước đo vật kính ra và thay
bằng tiêu bản vật cần đo lên bàn kính hiển vi, xác định xem vật đó có độ dài là mấy khoảng
của thước đo thị kính.

Ví dụ 2

Vật cần đo hoặc tế bào vi sinh vật có độ dài là ba khoảng của thước đo thị kính ở cùng
độ phóng đại nêu trên (là 32) thì giá trị độ dài của nó là :

44µm x 3 = 132µm

Muốn đo được chính xác, người ta thường đo nhiều lần rồi lấy giá trị trung bình.
 Nếu dùng thước đo thị kính loại AM-9-2 ta làm như sau : Nhìn vào thị kính, điều chỉnh
trống chia độ cho giao điểm của vạch chéo chạy về số 0. Đồng thời điều chỉnh cho giới hạn
thứ nhất của vật cần đo rơi vào trùng giao điểm trên. Tiếp theo, vặn trống chia độ cho giao
diểm của vạch chéo chạy sang điểm giới hạn thứ hai của vật đo. Đọc số chẵn trên thước đo
cố định của thị kính và số lẻ trên trống chia độ.

Ví dụ 3

Chiều dài của vật cần đo ứng với ba vạch trên thước cố định và 25 vạch trên trống
chia độ. Giả sử độ phóng đại đang đo hệ số một khoảng trên thước đo cố định của thị kính
là 44µm thì độ dài của vật đo sẽ là :

II. THỰC HÀNH

1. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị
- Kính hiển vi

- Thước đo thị kính AM-9-2

- Thước đo vật kính

- Tế bào hồng cầu

2. Các bước tiến hành

Bước 1 : Quan sát tế bào trên tiêu bản.

Bước 2 : Tiến hành đo kích thước của 20 đến 30 tế bào ở các vị trí khác nhau trên tiêu
bản theo cách đã hướng dẫn trong phần lý thuyết.

Bước 3 : Sử dụng quy tắc toán thống kê tính kích thước trung bình của tế bào.

3. Kết quả thực hành

Tính kích thước trung bình của tế bào theo quy tắc của toán thống kê sinh học
 QUY TRÌNH NHUỘM TIÊU BẢN MÁU BẰNG THUỐC
NHUỘM GIEMSA
Phương pháp nhuộm Giemsa được gọi theo tên của nhà vi khuẩn học người Đức,
Gustab Giemsa (1867-1948), khi ông sử dụng phương pháp này để tìm ký sinh trùng sốt rét
và các ký sinh trùng khác (các sinh vật đơn bào, xoắn khuẩn) trên phiến đồ tế bào học. Sau
đó, kỹ thuật này còn được áp dụng cho nhuộm các Chlamydia, phiến đồ máu, các thể vùi
virus. Nguyên lý của phương pháp này dựa trên nhóm phosphate của phẩm nhuộm gắn với
liên kết adenine - thymine, liên kết có nhiều ở DNA trong tế bào. Phản ứng oxy hóa sẽ tạo
ra màu xanh của methylen ở nhân tế bào, bào tương tế bào có thể bắt màu xanh hoặc hồng.
Hiện nay, phương pháp nhuộm Giemsa được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán tế bào học
trên các phiến đồ chọc hút kim nhỏ hay phiến đồ áp.
1. Chuẩn bị:
− Mẫu máu tĩnh mạch/ mao mạch.
− Lame (tiêu bản)
− Cồn tuyệt đối (99,90 trở lên)
− Thuốc nhuộm Giemsa
− Kính hiển vi
− Micropipet 10µL
− Giá để ống nghiệm

* Dụng cụ:
- Lame kính sạch, không dính dầu mỡ, chất lượng tốt, loại bỏ những lam kém chất
lượng (lame có ánh sắc hay màu trắng hoặc đục mờ, lame cũ, mặt bị sước hay bờ lam bị sứt
mẻ).
- Lame dàn máu: lame kính mài nhẵn hai đầu, chỉ dùng dàn máu.
* Hóa chất:
- Mẫu máu: Máu để dàn lame có thể là máu mao mạch hoặc tĩnh mạch được chống
đông bằng EDTA hoặc Heparin.
- Thuốc nhuộm Giemsa gốc (Giemsa mẹ, Giemsa đậm đặc).
 - Giemsa 10% : dung dịch để pha loãng giemsa có thể dùng nước cất trung tính (pH =
7,2). Tốt nhất dùng dung dịch đệm phosphat (PBS) có pH = 7,2.
- Cồn metylic hoặc cồn etylic tuyệt đối để cố định.
2. Kỹ thuật:
- Dàn tiêu bản: Đây là yếu tố ảnh hưởng chính đến chất lượng lame máu. Nhỏ máu về
một đầu của lame cách mép khoảng 1 cm, đặt lame dàn ở phía trước giọt máu, tạo với lame
kính thành góc 300. Kéo lùi lame dàn tiếp xúc với giọt máu, đợi máu lan dọc ra hai bên,
nâng cao lame dàn tạo thành một góc 450, đẩy nhanh lame dàn dọc theo lame kính đến hết
lame kính. Tốc độ đẩy vừa phải, nếu đẩy nhanh quá lame máu sẽ ngắn và dày còn nếu bạn
đẩy chậm quá lam sẽ dài và tạo thành các lớp sóng. Cầm lame kéo thật thoải mái, đẩy nhẹ
về phía trước, trong quá trình đẩy phải đảm bảo lame dàn luôn tiếp xúc với bề mặt của lame
máu.

Hình 1: Cách dàn tiêu bản máu

 2.2. Kĩ thuật nhuộm tiêu bản:

Hút 5μl mẫu Trãi mẫu trên lame Cố́ định mẫu trong
máu => Để khô cồn tuyệt đối => để

Nhuộm mẫu với Rửa dưới vòi Nhuộm mẫu với thuốc
Giemsa 10% ( 10 phút) nước chảy nhẹ nhuộm Giemsa gốc ( 2 phút)

Rửa dưới vòi Để khô tự nhiên Quan sát dưới

nước chảy nhẹ kính hiển vi

Hình 2: Quy trình nhuộm tiêu bản máu bằng thuốc nhuộm Giemsa

Lưu ý: Tiêu bản sau khi nhuộm được rửa sạch với nước. Tiêu bản nên rửa dưới vòi nước
chảy nhẹ để tránh làm bong tiêu bản. Phải rửa bằng phương pháp rửa đuổi tức là dùng nước để
đẩy thuốc nhuộm ra chứ không được đổ hóa chất trên lam đi trước khi xả nước vì như vậy sẽ
bị cặn bám lại trên biêu bản gây nhầm lẫn khi quan sát.
3. Yêu cầu
− Tiêu bản không bị bong.
− Phần máu dàn chiếm khoảng 2/3 tiêu bản.
− Máu mỏng dần đều về phía cuối tiêu bản.
− Đuôi tiêu bản hình lưỡi bò (lưỡi mèo) hoặc răng cưa.
− Các tế bào đứng riêng rẽ, bắt màu rõ ràng.
− Không có cặn hóa chất trên tiêu bản.
 XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BAGIERAST
MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Phân tích vai trò và ý nghĩa của áp suất thẩm thấu đối với cơ thể sinh vật;
2. Khắc sâu bản chất của áp suất thẩm thấu;
3. Nắm vững điều kiện để quan sát và xác định giá trị của áp suất thẩm thấu;
4. Nắm vững nguyên tắc của phương pháp Bagierast;
5. Thành thạo phương pháp xác định áp suất thẩm thấu của dịch sinh vật.

I. LÝ THUYẾT

Đối với hệ thống sống sự khuếch tán và thẩm thấu có một vai trò quan trọng trong quá
trình trao đổi chất. Ở thực vật, những quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng từ đất vào rễ,
rồi lên thân đến lá, sự vận chuyển các chất nhựa theo dọc thân cây đều gắn liền với giá trị của
áp suất thẩm thấu. Ở động vật, sự có mặt của áp suất thẩm thấu keo đóng một vai trò quan
trọng trong việc điều hòa nước trong máu. Ở các loài tiêm mao nước ngọt, có cơ quan điều hòa
áp suất thẩm thấu, cơ quan này chính là những không bào có khả năng co bóp và tiết ra các
dung dịch nhược trương để duy trì áp suất thẩm thấu, nhờ đó mà tế bào không bị trương.
Ngoài quá trình điều hòa nước, áp suất thẩm thấu còn có vai trò quan trọng trong việc bài tiết
các chất cặn bã, còn gây nên lực hóa thẩm thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp ATP – một quá
trình sinh năng lượng quan trọng và chủ yếu của cơ thể sinh vật.
Giá trị của áp suất thẩm thấu ở một số đối tượng bậc thấp có thể dao động trong một
khoảng nào đó tùy thuộc vào nồng độ các chất ở môi trường xung quanh, còn ở các cơ thể bậc
cao có giá trị tương đối ổn định mặc dù nồng độ của các chất ở môi trường xung quanh có thể
thay đổi. Chẳng hạn áp suất thẩm thấu của huyết thanh máu người ở trạng thái sinh lí bình
thường có giá trị là 7,4at (dao động trong khoảng 7,35 – 7,45 at).

Bản chất của áp suất thẩm thấu là do nồng độ phân tử của các chất hòa tan gây nên. Vì vậy
giá trị của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào giá trị nồng độ, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào nhiệt
độ tuyệt đối của môi trường. Van’t Hoff đã tính toán và đưa ra công thức xác định áp suất
thẩm thấu (P) như sau:

Trong đó : C - là nồng độ chất tan (mol); R - là hằng số khí (8.31.103 jun/kmol.độ); T -

là nhiệt độ tuyệt đối (oK) ; α - hệ số phân li.
 Điều này cũng có nghĩa áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào số lượng các tiểu phần (số ion, số
phân tử, số hạt) trong dung dịch. Cho nên đối với các dung dịch keo có nồng độ loãng thì định
luật Van’t Hoff không còn chính xác nữa, bởi vì các hạt keo có khả năng keo tụ làm cho số
lượng hạt trong hệ giảm đi. Tính chất này giúp chúng ta dễ dàng giải thích được vì sao áp suất
thẩm thấu của các dung dịch keo thường có giá trị nhỏ hơn của dung dịch thực, hay vì sao áp
suất thẩm thấu của hai hệ keo tuy có cùng nồng độ trọng lượng, chỉ khác nhau về kích thước
của hạt mà giá trị của chúng lại khác nhau.

Thực nghiệm cho thấy rằng áp suất thẩm thấu keo tỷ lệ với lũy thừa bậc ba bán kính của
hạt, vì thế cho nên khi kích thước của hạt thay đổi không đáng kể cũng sẽ dẫn đến thay đổi giá
trị của áp suất thẩm thấu rất lớn. Ví dụ : kích thước hạt mới thay đổi hai lần thì áp suất thẩm
thấu đã thay đổi tới tám lần. Trong trường hợp khi dung dịch có nồng độ tương đối đậm đặc thì
phương trình Van’t Hoff có dạng như sau :

Trong đó: M - trọng lượng phân tử chất tan; B - hằng số đặc trưng cho sự tương tác giữa
các hạt với nhau.

Điều kiện để quan sát được hiện tượng thẩm thấu là phải có sự chênh lệch về nồng độ các
chất hòa tan giữa hai pha được ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm. Màng bán thấm là
màng chỉ cho phân tử dung môi mà không cho phân tử chất hòa tan đi qua.

Trên hình 3 cho thấy bình A và B được

ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm M, giả sử
chúng cùng chứa một loại dung dịch, nhưng nồng
độ dung dịch ở bình A nhỏ hơn ở bình B (CA
< CB), khi đó sẽ có một dòng dung môi chuyển
từ A sang B làm cho mực chất lỏng trong bình B
dâng cao hơn trong bình A. Cột chất lỏng ấy gây
nên một áp suất tác dụng lên màng M, ngăn cản
dòng dung môi tiếp tục chuyển sang B. Khi đạt tới
trạng thái cân bằng (có bao nhiêu phân tử nước
chuyển từ A sang B thì có bấy nhiêu chuyển từ B Hình 3. Thí nghiệm quan sát hiện
tượng thẩm thấu
sang A) áp suất do cột chất lỏng .
gây nên đạt giá trị (Po). Đại lượng này có thể dùng đặc trưng định lượng cho áp suất thẩm thấu
của dung dịch.

Trong thực tế, có một màng bán thấm lí tưởng như vậy để quan sát và xác định áp suất
thẩm thấu một cách trực tiếp là rất khó, cho nên người ta thường đo áp suất thẩm thấu bằng
phương pháp gián tiếp dựa trên nguyên tắc về sự phụ thuộc của áp suất hơi trên bề mặt vào
nồng độ dung dịch. Dung dịch nào có nồng độ cao (tương ứng với áp suất thẩm thấu lớn) thì
áp suất hơi trên bề mặt nhỏ. Ngược lại, dung dịch nào có nồng độ thấp (có áp suất thẩm thấu
nhỏ) thì áp suất hơi trên bề mặt của nó lớn. Nếu cho bề mặt thoáng của hai dung dịch này tiếp
xúc với nhau sẽ xảy ra hiện tượng dịch chuyển của các phân tử dung môi ở thể hơi về phía
dung dịch có nồng độ cao hơn làm cho thể tích của nó tăng lên, còn thể tích của dung dịch có
nồng độ nhỏ sẽ bị giảm đi. Dựa vào hiện tượng này Bagierast đã xây dựng phương pháp xác
định áp suất thẩm thấu dựa vào quan sát sự chuyển động của bọt khí giữa hai dung dịch có
nồng độ khác nhau trong mao quản. Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt
độ phòng, lượng chất cần thiết để nghiên cứu ít nên phù hợp với các đối tượng sinh vật.

II. THỰC HÀNH

1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

− 1 kính hiển vi có thước đo − 50 mao quản có đường kính 1,5 mm

vật kính và chiều dài 5 – 7 cm

− 2 đĩa đồng hồ − 10 lam kính

− 50g paraphin − 1 đũa thủy tinh.

− 1 đèn cồn − 250 ml nước cất

− 1 giá ống nghiệm − 250 ml dung dịch NaCl (1%)

− 1 giá pipet. − 50 ml dung dịch nghiên cứu (dung dịch

NaCl mà sinh viên không biết trước
− 10 ống nghiệm loại 5 – 10ml nồng độ)

− 2 pipet loại 5ml − 50 ml huyết thanh nguyên chất

2. Các bước tiến hành
2.1. Xác định áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu

Bước 1. Chuẩn bị dung dịch kiểm tra

Dùng nước cất và dung dịch NaCl 1% để pha các dung dịch có nồng độ 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;
0,6; 0,7; 0,8% vào các ống nghiệm khác nhau. Các dung dịch đó được gọi là dung dịch kiểm
tra.

Bước 2. Chuẩn bị tiêu bản để soi kính hiển vi

Rót khoảng 3 ml dung dịch nghiên cứu ra một đĩa đồng hồ, dùng một đĩa khác để rót một
trong các dung dịch kiểm tra với thể tích như trên.
Lấy một mao quản, cầm nghiêng và nhúng một đầu vào đĩa đựng dung dịch kiểm tra, do có
hiện tượng mao dẫn dung dịch sẽ từ từ dâng lên trong mao quản. Khi chất lỏng dâng lên đến
giữa mao quản thì nhấc ra khỏi đĩa đồng hồ, quay ngược cho chất lỏng chảy sang đầu kia của
mao quản, khi mực chất lỏng cách đầu mút mao quản chừng 1 – 1,5 mm thì lập tức nhúng vào
đĩa đồng hồ đựng dung dịch nghiên cứu. Dung dịch này sẽ dâng lên đẩy dung dịch kiểm tra trở
về vị trí ban đầu và tạo thành bọt khí ở giữa.

Hình 4. a. Tiêu bản mao quản dùng để quan sát sự chuyển động của bọt khí.
b. Vòng cung bọt khí trong hiển vi trường.

− Đặt mao quản lên lam kính (nhớ ghi ký hiệu để không bị nhầm lẫn dung dịch ở hai
đầu mao quản). Hơ trên đèn cồn cho paraphin nóng chảy rồi dùng nó để gắn kín hai đầu của
mao quản lại ta được một tiêu bản để quan sát trên kính hiển vi.

Bước 3. Quan sát sự chuyển động của bọt khí

− Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi, chỉnh kính và tiêu bản sao cho một trong hai mép
của bọt khí (có hình vòng cung) trùng với điểm giao nhau của hai đường chéo trong hiển vi
trường rồi theo dõi hướng chuyển động của vòng cung bọt khí. Bọt khí ở giữa hai dung dịch có
nồng độ khác nhau trong mao quản bao giờ cũng chuyển động về phía có nồng độ
thấp hơn (cần lưu ý rằng hướng chuyển động quan sát dưới hính hiển vi ngược chiều với thực
tế). Dựa vào hướng chuyển động của vòng cung ta biết được dung dịch kiểm tra (đã biết trước
nồng độ) có nồng độ lớn hơn hay bé hơn dung dịch nghiên cứu.
− Ghi lại kết quả theo hướng dẫn ở bảng 1. Tiến hành tương tự với các dung dịch kiểm
tra khác cho đến khi vòng cung bọt khí đứng im, không dịch chuyển khỏi vị trí ban đầu. Nồng
độ dung dịch nghiên cứu có giá trị đúng bằng nồng độ của dung dịch kiểm tra đó (trong ví dụ
ở bảng 1 là 0,5%)
Bảng 1
[C] Dung dịch kiểm tra, Hướng của vòng cung Dung dịch nghiên cứu
%
0.2  

0,3  

0.4  

0,5  

0,6 → 

0,7 → 

0,8 → 

Trường hợp nếu vòng cung dịch chuyển ít nhưng về hai hướng ngược nhau
trong một khoảng nồng độ (chẳng hạn khoảng giữa 0,6% và 0,7 %) ta cần chuẩn bị một
số dung dịch kiểm tra khác có nồng độ chênh lệch nhau ít hơn (chẳng hạn cần pha
dung dịch 0,62, 0,64, 0,66, 0,68%), rồi tiến hành như đã nêu để tìm ra kết quả chính
xác hơn. Kết quả cũng được lập bảng tương tự:

Bảng 2
[C] dung dịch kiểm tra, % Hướng của vòng cung Dung dịch nghiên cứu

0,62  

0,64  

0,66  

0,68 → 
 Bước 4. Tính nồng độ áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu

− Nồng độ % của dung dịch nghiên cứu được xác định được ở trên cần chuyển đổi
thành nồng độ phân tử gam (mol).

Ví dụ: chuyển nồng độ 0,5% dung dịch NaCl ra mol: 5,0/58,5 = 0,085 mol

− Tính áp suất thẩm thấu của dung dịch trên ở nhiệt độ 170C theo công thức sau:

P =αCRT (vì NaCl phân ly thành 2 ion nên α = 2 )

P = 2 x 0,085mol x 8,31.103 jun / kmol. độ x (273+17) độ

= 0,17mol x 8,31 jun/mol.độ x 290 độ

= 409,68 N.m  4,1 at

Báo cáo kết quả này cho cán bộ hướng dẫn, sau đó chuyển sang xác định áp suất thẩm
thấu của huyết thanh

2.2. Xác định áp suất thẩm thấu của huyết thanh nguyên

Dung dịch nghiên cứu được thay thế bằng huyết thanh nguyên, sau đó lặp lại các bước tiến
hành đã nêu trên để tính áp suất thẩm thấu của nó.

3. Kết quả thực hành

a. Ghi lại kết quả theo hướng dẫn ở bảng 1 và bảng 2.

b. Ghi lại kết quả với dung dịch nghiên cứu là huyết thanh nguyên.
QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG PHÂN CỰC DƯỚI TÁC DỤNG CỦA DÒNG
ĐIỆN MỘT CHIỀU
Mục tiêu
Những yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
1. Bản chất hiện tượng phân cực trong tế bào và mô.
2. Giải thích được tại sao khi nghiên cứu tính chất điện thụ động của tế bào và mô người ta không sử
dụng nguồn điện một chiều?
3. Hiểu rõ trong tế bào và mô ngoài điện trở thuần còn có điện trở kháng?
4. Biết một số ứng dụng của dòng một chiều trong y học?
5. Quan sát và vẽ được đồ thị giảm cường độ dòng điện theo thời gian.

I. LÝ THUYẾT
Chúng ta biết trong thành phần cấu tạo của tế bào và mô ngoài các ion ở trang thái tự do còn
có nhiều nguyên tử, phân tử phân cực (như protein, hydratcacbon) hoặc không phân cực (như lipit)
ở trạng thái liên kết. Do vậy tính chất dẫn điện của các đối tượng, sinh vật có những đặc điểm
giống như của các chất điện phần và điện môi.
Nhiều nghiên cứu tính chất điện của tế bào và mô được thực hiện từ thế kỷ XIX đã sử dụng
nguồn điện một chiều để tìm hiểu độ dẫn điện của chúng. Kết quả cho thấy có sự mâu thuẫn giữa
độ dẫn điện rất thấp (điện trở lớn) của tế bào và mô so với lượng lớn các chất điện li chứa trong
đó. Hơn nữa người ta còn quan sát thấy cường độ của dòng điện bên ngoài giảm đi rất nhanh theo
thời gian. Hiện tượng này được giải thích dựa trên quan điểm cho rằng trong hệ thống sống ngoài
điện trở thuần còn có thành phần của "điện dung" nữa nên dẫn đến có điện trở kháng. Sự có mặt
của điện trở kháng làm dòng điện một chiều không được dẫn đi trong hệ, làm xuất hiện một suất
điện động có dòng ngược chiều với dòng điện bên ngoài, triệt tiêu giá trị của nó, làm cho nó giảm
dần theo thời gian. "Điện dung" trong hệ sinh vật thực chất là các phân tử hợp chất hữu cơ không
có hoặc có cực ở trạng thái liên kết, bị cong một chiều làm cho bị phân cực hoặc phân cực mạnh
thêm nên chúng tích một lượng điện nào đó.
Hiện tượng này giống hiện tượng khi cho dòng một chiều đi qua chất điện phân. Khác với
chất điện mối đồng chất và đẳng hướng, tế bào và mô là một hệ dị thể, khác hướng nên dưới tác
dụng của dòng điện không đổi sự phân cực xảy ra trong toàn bộ thể tích của tế bào và mô.

Ngoài các nguyên tử, phân tử hữu cơ nằm trong thành phần cấu tạo của tế bào còn có nhiều
chất điện phân, phân bố không đồng đều giữa nội bào với môi trường ngoài tế bào nên khi dòng
điện chạy qua tế bào cũng giống như khi chúng đi qua chất điện phân. Bản chất dòng điện trong
chất điện phân là dòng chuyển dời có hướng của các ion dương theo chiều điện trường về phía
cực âm, và của các ion âm ngược chiều điện trường về phía cực dương. Tại cực âm, các ion dương
nhận được điện tử, ngược lại ở cực dương các ion âm nhường điện tử để trở thành các nguyên tử
hay phân tử trung hoà. Ở trạng thái trung hoà chúng có thể bám vào các điện cực, có thể bay hơi
ra khỏi dung dịch hoặc tác dụng với điện cực và dung môi gây nên các phản ứng hoá học khác
Có thể minh hoạ điều đó bằng các phản ứng sau đây ở các điện cực:

Chẳng hạn với dung dịch điện phân là NaCl thì:

Tại cực âm xảy ra:
Na+ + 2e– + 2H2O → 2NaOH + H2
Tại cực dương xảy ra:
2Cl– + H2O → 2e+ + 2HCl + 1/2O2
Hoặc với dung dịch CuSO4 và cực dương làm bằng chính kim loại Cu của muối đó thì:

Tại cực âm xảy ra:

Cu2+ + 2e → Cu bám vào catot
Tại cực dương xảy ra:

SO42– + Cu → CuSO4 nhường cho cực âm

Muối CuSO4 vừa hình thành ở cực dương lại bị tan ngay và ion Cu2+ lại chuyển về cực âm.
Điều đó diễn ra làm tan dần thanh kim loại đồng – là cực dương và đến kết tủa ở cực âm.
Những phản ứng hoá học thuộc dạng trên gây ra những tác nhân sinh lý đặc biệt như làm giảm
ngưỡng kích thích của tế bào và mô, giảm khả năng đáp ứng của thần kinh cảm giác do đó giảm
đau, hoặc gây giãn mạch máu dẫn đến tăng cường khả năng dinh dưỡng ở xung quanh vùng cắm
điện cực.
Ứng dụng các tính chất đó của dòng điện một chiều khi chạy qua tế bào và mô nhằm gây ra
các tác dụng sinh lý hoặc trị liệu được gọi là liệu pháp điện giải. Đặc biệt là khi sử dụng các điện
cực trơ (bạch kim chẳng hạn) thì việc các axít hoặc kiềm giải phóng ra sẽ có tác dụng tiêu diệt
các ổ viêm xung quanh hoặc sử dụng các điện cực đặc biệt có thể tạo ra các hóa chất đặc biệt
được chỉ định dùng trong các điều trị bệnh cụ thể.
II. THỰC HÀNH

2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu cần thiết

- 1 miliampe kế

- 1 biến trở

- 1 đồng hồ bấm giây

- 1 bộ bình đựng dung dịch nghiên cứu với 2 điện cực

- 200 ml dung dịch NaCl 0,1N và 0,5N

- 100 ml nước cất 2 lần

- 100 ml huyết thanh nguyên

2.2. Các bước tiến hành

2.2.1. Mắc mạch điện

Mắc mạch điện theo sơ đồ Hình 5.

Hình 5: Sơ đồ đo cường độ dòng điện qua dung dịch nghiên cứu
 2.2.2. Quan sát và ghi giá trị cường độ dòng điện giảm theo thời gian

Sau khi mắc mạch theo sơ đồ, đổ dung dịch nghiên cứu là NaCl 0,1N vào bình sao cho ngập
lá diện cực. Đóng khoá K. Lúc đó kim đồng hồ ampe kế sẽ chỉ một giá trị nhất định, ghi lại giá trị
cường độ I đó. Sau mỗi một đơn vị thời gian (chọn tuỳ ý 1", 2" hay 3"… phụ thuộc vào tới đó
giảm cường độ dòng) ghi lại giá trị cường độ. Ghi ít nhất 10 giá trị để vẽ đồ thị sự phụ thuộc của
I vào t.

Rửa bình, thay bằng dung dịch NaCl 0,5N, huyết thanh. Tiến hành thí nghiệm như trên. Kết
quả thu được lập bảng báo cáo và vẽ đồ thị.
Bảng tổng kết

Thời
STT gian Cường độ dòng điện (mA)
(s) NaCl 0,1N NaCl 0,5N Huyết thanh
1 0
2 2''
3 4''
4 6''
5 8''
6 10''
7 12''
8 14''
9 16''
10 18''

Lưu ý: Mỗi lần thay đổi dung dịch cần rửa bình sạch và tráng lại bằng nước cất
 KHẢO SÁT ĐỘ BỀN MÀNG HỒNG CẦU

Mục tiêu:

Những yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này

1. Phân biệt thế nào là môi trường ưu, nhược và đẳng trương
2. Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các loại môi trường đó
3. Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp cho nó có thể thay đổi thể tích trong
một giới hạn nhất định
4. Thế nào là độ bền của màng hồng cầu? ý nghĩa?
5. Thành thạo phương pháp sử dụng dung dịch nhược trương xác định độ bền của màng hồng cầu

I. LÝ THUYẾT

Chúng ta biết màng tế bào có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào. Frank
U.B. – một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn ra trên “sân khấu”
màng. Màng ở đây được hiểu theo một ý nghĩa rộng: gồm các loại màng có mặt ở bên trong tế
bào và màng nguyên sinh chất.

Màng nguyên sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào với môi
trường bên ngoài. Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo,
tính chất và chức năng của màng.

Hình 6: Tế bào hồng cầu người qua kính hiển vi điện tử
 Trên hình 6 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người qua kính hiển vi điện tử. Tế bào có bề
mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường ngoài. Hồng cầu trưởng thành là một tế bào
không nhân. Cấu tạo màng hồng cầu, nhìn chung giống như màng nguyên sinh chất của các loại
tế bào khác, gồm ba lớp: protein – lipit kép, protein khảm vào nhau. Có một điểm khác biệt là ở
bề mặt bên trong màng tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc là protein dạng sợi và được
gọi là Spectrin. Spectrin chiếm một tỉ lệ là 30% tổng số protein của màng và là phức hợp của
hai sợi polypeptit có trọng lượng chừng 220.000- 240.000 dalton (hình 7). Cùng với một vài loại
protein khác, Spectrin tham gia vào quá trình biến đổi hình dạng của hồng cầu thông qua việc co
ngắn hay duỗi dài dạng sợi của mình. Bằng cách đó tế bào hồng cầu có thể biến đổi hình dạng
giúp cho nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti ở khắp cơ thể. Đặc biệt là ở lách, những tế bào
hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức năng, khả năng đàn hồi co giãn các sợi Spectrin kém,
không có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát của cơ quan màng và bị lách tiêu hủy.

Hình 7: Mạng lưới Spectrin ở bề mặt bên trong của hồng cầu và các thành phần của nó
 Ở trạng thái sinh lý bình thường, màng hồng cầu khá bền vững. Thể tích của tế bào thường
không thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hòa tan bên trong và bên ngoài tế bào.
Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan trong tế bào là một hằng số ổn định. Do đó thể
tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của môi trường bên ngoài. Chúng ta biết có ba loại môi
trường: môi trường ưu trương, đẳng trương và nhược trương.

Màng tế bào hồng cầu bền trong môi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu trương, tế bào
nhăn nhúm lại cho chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài vào. Còn trong môi trường
nhược trương thì tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do phải chịu tác động của
một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào ngày càng tăng
cao và cuối cùng, giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngoài. Độ bền của màng hồng cầu chính
là nồng độ dung dịch muối trong môi trường nhược trương, tại đó xảy ra hiện tượng tế bào hồng
cầu bị huyết tiêu.

Trong bài thực tập này chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào động vật (hồng cầu)
và thực vật khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền của màng hồng cầu.

Hình 8: Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các môi trường khác nhau
 Trong khi tế bào hồng cầu bị trương phồng và huyết tiêu trong dung dịch nhược trương thì tế
bào thực vật lại được bảo vệ bằng vách của nó. Cả hai loại tế bào đều bị co nhúm lại trong môi
trường ưu trương và màng nguyên sinh chất của tế bào thực vật tách khỏi vách của mình.
II. THỰC HÀNH
1. Dụng cụ và hóa chất cần thiết

- 10 ống nghiệm loại 10ml

- 250ml dung dịch NaCl 2%

- 500ml nước cất

- 250ml dung dịch sinh lý máu nóng pH=7.4

- Tế bào hồng cầu động vật máu nóng

- 1 pipetman 1000ul, pipet nhỏ giọt, giấy thấm, khăn lau

2. Các bước tiến hành
Lấy máu tế bào hồng cầu:

Dùng citrate natri hoặc heparin để lấy máu chống đông. Li tâm 3000 vòng/phút để bỏ huyết
tương. Sau đó, rửa tế bào hồng cầu bằng cách quay li tâm trong 5 phút ở 3000 vòng/phút trong
dung dịch sinh lý PBS (pH=7,4) từ 2 đến 3 lần.
Lưu ý: trước khi li tâm lắc nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều trong dung dịch, tránh bị
vỡ. Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung dịch PBS nói trên sao cho có mật độ
là 5.106 tế bào/ml.
 Hình 9: Sơ đồ buồng đếm hồng cầu

Hình 10: Cách đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer

Công thức tính mật độ hồng cầu:

Mật độ hồng cầu = Trung bình tb hồng cầu đếm được x độ pha loãng x 10.000

Thực hiện phép tính chuyển đổi từ mật độ pha loãng về mật độ gốc.

• Xác định độ bền hồng cầu:

 Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 9. Pha dung dịch muối NaCl có các nồng độ 0;
0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9% (mỗi ống 5ml dd NaCl) sau đó cho vào mỗi ống
nghiệm 3-4 giọt dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên. Để các ống nghiệm vào tủ ấm 37°C trong 15
phút rồi li tâm 3000 vòng/phút. Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu đỏ là màu của huyết
sắc tố thoát ra sau khi màng bị vỡ. Nồng độ muối cao nhất của các ống có màu đỏ là giới hạn
bền của màng hồng cầu. Ghi lại giá trị nồng độ.

3. Kết quả cần thu thập

3.1 Đếm mật độ hồng cầu

Ô đếm 1 2 3 4 5
Số lượng tb
hồng cầu

➔ Mật độ hồng cầu trong dung dịch ban đầu

3.2 Xác định giới hạn bền của màng hồng cầu
Nồng độ Màu sắc Tình trạng hồng cầu trong dung dịch
NaCl quan sát được (soi bằng kính hiển vi)
0%

0.1%

0.2%

0.3%

0.4%

0.5%

0.6%

0.7%

0.8%

0.9%

2%
 ĐIỆN SINH HỌC - ĐỘ DẪN ĐIỆN CỦA DỊCH SINH VẬT

Mục tiêu:
Những yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này
1. Phân biệt rõ ràng các khái niệm: Điện trở, điện trở suất, độ dẫn điện, điện dẫn suất và đơn vị
của chúng.
2. Tế bào và mô thuộc loại chất dẫn điền nào?
3. Bản chất hiện tượng dẫn điện trong tế bào và mô?
4. Điện dẫn suất của tế bào và mô, các yếu tố ảnh hưởng đến điện dẫn suất?
5. Thế nào là cầu điện trở Wheatstone? Nguyên lý hoạt động và ứng dụng?
6. Thành thạo phương pháp xác định điện dẫn suất của huyết thanh và máu chống đông

I. LÝ THUYẾT
1.1. Một số khái niệm cơ bản
Từ vật lý chúng ta biết rằng đối với một dây dẫn bằng kim loại hình trụ thì điện trở dây dẫn tỉ
lệ thuận với chiều dài (l) và tỉ lệ nghịch với tiết diện ngang (S) của dây dẫn

l
R= (1)
S
𝜌 - là hệ số tỉ lệ, phụ thuộc vào bản chất của chất dẫn điện.
Trong trường hợp l =1 cm, S=1 cm2 thì ρ = R, có thứ nguyên là |Ω. cm| và được gọi là điện trở
suất (điện trở riêng) của dây dẫn.
Độ dẫn điện của dây dẫn (L) là đại lượng nghịch đảo của điện trở. Nó được xác dinh bằng
biểu thức:

l l S
L= = . (2)
  l

1
Đại lượng được gọi là điện dẫn suất (độ dẫn điện riêng) của dây dẫn, được ký hiệu là λ,


và có thứ nguyên là |Ω-1.cm-1|.

Người ta căn cứ vào giá trị điện trở suất của các chất để phân loại chúng thành chất dẫn
điện (có ρ<103.cm), chất bán dẫn (có ρ =104 ÷ 1010Ω.cm) và chất điện mới (ρ > 1010 Ω.cm).
 Bằng thực nghiệm cho thấy tế bào và mô có ρ=106 ÷ 107Ω.cm hoặc lớn hơn. Chúng thuộc
loại bán dẫn và chất điện môi.
Vì dòng điện truyền qua dung dịch chất điện phân là do sự chuyển động của các ion về các
cực tương ứng, nên điện dẫn suất của chúng phụ thuộc vào nồng độ ion. Vào khả năng phân li
của các phân tử chất tan và vào độ linh động của các ion. Nồng độ càng cao, tốc độ chuyển
động của các ion càng mạnh thì điện dẫn suất càng lớn. Tuy nhiều trường hợp các chất hoà tan
tốt, sự tăng nồng độ quá một giới hạn nào đó sẽ làm giảm khả năng phân li, làm tăng lực hút
tương hỗ giữa các ion trái dấu dẫn đến làm giảm độ dẫn điện riêng của dung dịch.
Trong tế bào và mô có sự phân bố không đồng đều các ion giữa vùng gian bào và nội bào.
Dòng điện chủ yếu đi qua vùng gian bào nơi có nồng độ các chất điện phân lớn hơn. Cho nên
ngoài sự phụ thuộc vào nồng độ các ion như trong dung dịch điện phân, điện dẫn suất trong hệ
thống sống còn phụ thuộc vào trạng thái chức năng của hệ. Chẳng hạn khi tế bào bị kích thích
làm cho tính thấm của màng đối với các loại ion bị thay đổi. Điều đó làm thay đổi nồng độ của
chúng ở vùng nội bào và gian bào dẫn đến thay đổi điện dẫn suất của tế bào.
Tính dẫn điện của tế bào và mô còn giống tính chất dẫn điện của chất điện môi. Ta biết tính
dẫn điện của chất điện môi đặc trưng bởi khả năng phân cực của các phân tử có cực và không có
cực. Mà khả năng này của các phân tử phụ thuộc vào bản chất của điện trường bên ngoài. Như
vậy điện dẫn suất của tế bào và mô còn phụ thuộc vào bản chất dòng điện chạy qua nó. Ngoài ra,
điện dẫn suất của tế bào và mô còn phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất của môi trường: Nhiệt độ
tăng thì độ dẫn điện tăng vì khi nhiệt độ tăng, quá trình hydrát hoá các ion giảm xuống, đồng
thời độ nhớt của dung dịch cũng giảm. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó sẽ có
tác dụng ngược lại vì khi đó nó làm cản trở quá trình phân cực định hướng của các phần tử trong
hệ.

1.2. Cầu điện trở Wheatstone

Cầu điện trở Wheatstone là một mạng điện gồm 4 điện trở R1, R2, R3, R4 được mắc như hình vẽ
(hình 11).
 (c)
Hình 11.(a) Cầu điện trở Wheatstone
(b) Sơ đồ mạch điện
(c) Bình đựng dung dịch nghiên cứu
Cần dùng để đo giá trị điện trở chưa biết (Rx) khi đã biết giá trị của 3 điện trở kia (R1, R2 và R3).
Giả sử dòng điện đi qua R1, R2, R3 và Rx là I1, I2, I3 và Ix còn dòng điện qua RG là IG = 0. Đó chính là
điều kiện để cầu cân bằng điện trở. Ở điều kiện này ta thấy tại điểm M và N không có sự phân mạch dòng
điện. Nghĩa là hiệu điện thế giữa 2 điểm này là bằng 0:
UM = UN → UMN = 0
Như vậy:
UAM = UAN → I1R1=I3R3
UBM = UBN → I2R2=IXRX
Lập tỉ số giữa hai đẳng thức trên ta có:
 Vì không có sự phân mạch dòng điện tại M, N nên I1 = I2; I3 = IX. Do đó đẳng thức trên có thể viết:

Như vậy nếu biết R1, R2, R3 sẽ xác định được RX. Cầu Wheatstone được ứng dụng để đo điện trở các
đối tượng sinh vật.
II. THỰC HÀNH
2.1. Dụng cụ hóa chất, vật liệu cần thiết
- 1 hộp điện trở chuẩn 1 hộp biến trở

- 1 đồng hồ đo điện

- 1 biến thế ổn áp có nguồn ra 6,3V

- 1 bình đựng dung dịch có 2 lá điện cực bằng bạc

- 5m dây điện mềm, chốt cắm

- 100 ml dung dịch KCl 1/50N 100 ml máu chống đông

- 50 ml huyết thanh động vật máu nóng

2.2. Các bước tiến hành

2.2.1. Mắc mạch điện
Mắc mạnh điện theo sơ đồ hình 11b.
R1, R2 - được đặt trong một hộp điện trở có con chạy để thay đổi giá trị R1, R2 (gọi là biến trở).
RC - hộp điện trở chuẩn.
RX - bình đựng dịch nghiên cứu (xem hình 11c)
Sau khi mắc xong theo sơ đồ, báo cáo với cán bộ hướng dẫn trước lúc mắc mạch vào nguồn điện 6,3V.
2.2.2. Xác định hằng số bình C
Mỗi một bình đựng dung dịch nghiên cứu có một đặc điểm khác nhau ảnh hưởng đến giá trị đo được
của chất nghiêm cứu. Để xác định hằng số bình cần dựa vào một dung dịch biết trước điện dẫn suất của
nó, chẳng hạn KCl 1/50N có điện dẫn suất λ = 0,0024 Ω-1.cm-1
Hằng số hình được xác định bằng biểu thức sau:
C = λKCl.RKCl (4)
RKCl – điện trở suất của dung dịch KCl 1/50N đo được bằng cầu điện trở Wheatstone. Cần tiến hành
như sau:
Đổ dung dịch KCl 1/50N vào bình đo sao cho vừa ngập lá điện cực.
 (Lưu ý: 2 lá điện cực phải để song song, cách nhau 1cm)
Xác định giá trị R1, R2 trong hộp biến trở cho trước.
Cân bằng cầu bằng cách xoay các núm của hộp điện trở suất đến khi kim đồng hồ đo điện chỉ số "0".
Ghi lại giá trị điện trở chuẩn 𝑅𝐶1
Dịch chuyển con chạy ở hộp biến trở, để thay đổi giá trị R1, R2 rồi lại cân bằng cầu và ghi lại giá trị
𝑅𝐶2 . Cần xác định RC ít nhất 3 lần để lấy giá trị trung bình.

Xác định hằng số bình theo công thức:

2.2.3. Xác định điện dẫn suất của huyết thanh và máu chống đông
Đổ dung dịch KCl 1/50N trong bình ra, rửa sạch bình, tráng lại bằng nước cất, lau sạch 2 lá điện cực.
Cho huyết thanh vào bình sao cho vừa ngập lá điện cực. Các bước còn lại tiến hành như đối với dung
dịch KCl để xác định điện trở suất trung bình 𝑅̅ h t h của huyết thanh.
Điện dẫn suất của huyết thanh được tính như sau:
Cuối cùng thay huyết thanh bằng máu chống đông để xác định điện dẫn suất của chúng.
Kết quả được ghi vào bảng sau:
Dung dịch Kết quả
R1 R2 RC RX 𝑅̅𝑋
nghiên cứu thực nghiệm
30 70
40 60
KCl 1/50N 50 50 C=
60 40
70 30
30 70
40 60
Huyết thanh 50 50 ̅ hth =
60 40
70 30
 30 70
40 60
Máu chống đông 50 50 ̅ mcd =
60 40
70 30
 TÍNH CHẤT QUANG HỌC CỦA PHÂN TỬ HEMOGLOBIN

MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Mô tả cấu trúc của phân tử hemoglobin và chức năng của nó;

2. Nắm vững các dạng cơ bản và các dẫn xuất của oxyhemoglobin;

3. Giải thích được vì sao các dẫn xuất của phân tử hemoglobin khác nhau thì tính chất quang học của chúng
khác nhau;
4. Thành thạo phương pháp đo mật độ quang học để xác định nồng độ của chất nghiên cứu

I. LÝ THUYẾT
Phân tử hemoglobin là thành phần cơ bản của tế bào hồng cầu. Trong một tế bào hồng cầu có
khoảng 200 triệu phân tử hemoglobin. Mỗi phân tử hemoglobin chứa chừng 9000 nguyên tử các
loại như H, C, N, Fe, S, O… Trọng lượng phân tử hemoglobin rất lớn (chừng 66.000 – 68.800
Da).

Phân tử hemoglobin được cấu tạo từ hai thành phần chính, đó là protein globin và nhóm chức
HEM. HEM được cấu thành từ bốn vòng pyrol gắn với một nguyên tử sắt (Fe) ở trung tâm. Chính
nguyên tử sắt này thực hiện chức năng vận chuyển oxy từ hồng cầu tới các mô, tế bào. Globin là
các loại protein có cấu trúc phức tạp gồm bốn chuỗi polypeptid: hai chuỗi thuộc nhóm α -
polypeptid và hai chuỗi kia thuộc nhóm β - polypeptid. Mỗi chuỗi gắn với một nhóm HEM.

Phân tử hemoglobin được kí hiệu là Hb; khi nó liên kết với phân tử oxy thì được gọi là
oxyhemoglobin (HbO2). Có bốn dạng oxyhemoglobin. Chúng được tạo thành như sau:
 Các phản ứng trên là thuận nghịch. Khi liên kết với phân tử oxy, phản ứng của chuỗi α và β -
polypeptid có khác nhau. Chuỗi β - polypeptid co cuộn lại khi liên kết với phân tử oxy, và duỗi ra
khi oxy tách ra khỏi chúng. Trong khi đó chuỗi α- polypeptid không thay đổi cấu hình kể cả khi ở
trạng thái liên kết với oxy cũng như ở trạng thái tự do. Có lẽ sự biến đổi cấu hình của β -
polypeptid ảnh hưởng đến tính chất quang học của các dẫn suất của phân tử hemoglobin.

Trong bốn dạng oxyhemoglobin trên thì dạng thứ tư dễ gắn và dễ tách phân tử oxy ra khỏi Hb.
Nó là dạng bão hòa oxy, đảm bảo cho quá trình hô hấp xảy ra dễ dàng.

Ngoài oxyhemoglobin, methemoglobin (metHb) là dạng dẫn xuất khác của Hemoglobin. Vì một
lý do nào đó, nguyên tử sắt trong nhóm HEM của Hb bị thay đổi hóa trị (từ hóa trị 2 thành hóa trị
3) thì Hb đó được gọi là metHb. MetHb không có khả năng tách oxy ra khỏi phân tử của nó. Nên
nếu trong máu chứa một lượng lớn metHb thì quá trình trao đổi khí sẽ không diễn ra, cơ thể bị
thiếu oxy trầm trọng.

Phổ hấp thụ của các dẫn suất Hb khác nhau có dạng khác nhau. Phổ hấp thụ đặc trưng của
HbO2 có hai vạch sẫm, hẹp trong vùng ánh sáng vàng – lục, còn Hb có một vạch sẫm nhưng rộng
hơn cũng trong vùng ánh sáng trên. Điều đó cho thấy mật độ quang học phản ánh đặc trưng của
dẫn suất Hb. Trong bài thực hành này chúng ta sẽ tiến hành tìm hiểu tính chất quang học của Hb
và các dẫn suất của nó nhờ vào quang phổ kế.
II. THỰC HÀNH
1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
• 01 máy quang phổ kế • 10ml heparin
• 01 máy li tâm • 10ml dung dịch ferixyanua
• 01 cân đĩa kali K3[Fe(CN)6]
• 04 ống li tâm 3 ml • bão hòa
• 05 pipet các loại 1 ml – 5 ml • 10 ml dung dịch detionit natri
• 10g tinh thể hemoglobin chuẩn Na2S2O4 bão hòa
• 500 ml dung dịch sinh lý PBS pH = • Máu lợn
7,2
2. Các bước tiến hành
2.1. Dựng đồ thị chuẩn
Lấy dung dịch K3[Fe(CN)6] bão hòa đã chuẩn bị để pha 6 dung dịch có nồng độ chuẩn, độ
pha loãng 2 lần so với ống liền kề trước đó. Mỗi nồng độ pha 5ml dung dịch.

Cho nồng độ cao nhất của dd K3[Fe(CN)6] trong số các nồng độ chuẩn vào cuvet để đo quang
phổ và xác định bước sóng hấp thụ tốt nhất.
Đo mật độ quang học (OD) của các dung dịch K3[Fe(CN)6] chuẩn đã pha trên ở bước sóng đó.
Kết quả được ghi vào bảng để dựng đồ thị chuẩn. Trên trục tung đặt các giá trị mật độ quang học,
trên trục hoành đặt các giá trị nồng độ tương ứng.
2.2. Thu nhận các dẫn suất của hemoglobin

Thu nhận HbO2

Lấy 4ml máu heo cho vào ống quay ly tâm

Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ huyết tương, lấy hồng cầu.

Rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS ba lần bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.

Làm huyết tiêu hồng cầu bằng cách cho 12ml nước cất vào, lắc nhẹ đều rồi li tâm loại bỏ màng
hồng cầu, dịch màu đỏ tươi trong suốt là dung dịch oxyhemoglobin (HbO2) (nếu đặc có thể pha
loãng với nước)
Thu nhận methêmoglobin (metHb)
Cho 3 ml dung dịch HbO2 mới thu được trên vào ống nghiệm ly tâm, cho thêm 1 – 2 giọt dung
dịch ferixyanua kali bão hòa vào ống nghiệm, lắc đều nhẹ tay được dung dịch có màu nâu đậm,
đó là metHb.
Thu nhận hemoglobin
Cho 3 ml dung dịch HbO2 trên vào ống nghiệm, cho thêm 1 – 2 giọt dung dịch detionit natri
Na2S2O4 bão hòa vào, lắc đều nhẹ tay được dung dịch Hb có màu xanh thẫm.
2.3. Đo mật độ quang học các dẫn suất trên bằng quang phổ kế ở bước sóng 400 nm
Dựa vào mật độ quang học đo được và đường cong đồ thị chuẩn xác định nồng độ của các dẫn
suất trên
Lưu ý:
Các thí nghiệm cần tiến hành ngay sau khi thu được HbO2 vì nếu để lâu nó sẽ bị oxy hóa thành
metHb.
Cần cho vào cuvét đựng dịch đối chứng kiểm tra một lượng tương đương K3[Fe(CN)6] nếu do
mật độ quang học của metHb và Na2S2O4 nếu đo mật độ quang học của Hb.
3. Kết quả thực hành
Kết quả thu được ghi vào bảng 1 và 2.

Bảng 1

STT Nồng độ K3[Fe(CN)6] chuẩn Mật độ quang học (OD)

Bảng 2

Dẫn suất của Hb Bước sóng hấp thụ tối đa