KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM MÁU CHẨN ĐOÁN

KÍ SINH TRÙNG SỐT RÉT

1. Chuẩn bị:
* Dụng cụ:
- Kính hiển vi.
- Lam kính sạch, không dính dầu mỡ, chất lượng tốt, loại bỏ những lam kém
phẩm chất (lam có ánh sắc hay màu trắng hoặc đục mờ, lam cũ, mặt bị sước hay bờ
lam bị sứt mẻ).
- Lam dàn máu: lam kính mài nhẵn hai đầu, có ghi nhãn, chỉ dùng dàn máu.
- Kim chích máu.
- Ống đong khắc độ 10 - 50 ml.
- Ống nhỏ giọt.
- Bông hút.
- Giá để lam: giá nằm, giá nghiêng.
- Bút viết kính để đánh dấu.
* Hóa chất:
- Thuốc nhuộm Giêmsa cốt (Giêmsa mẹ, Giêmsa đậm đặc):
- Dung dịch để pha loãng Giêmsa: có thể dùng nước cất trung tính (pH = 7,2),
nếu không có nước cất có thể dùng nước mưa hoặc nước máy. Tốt nhất dùng dung
dịch đệm phosphat (PBS) có pH = 7,2.
Nếu dung dịch Giêmsa cốt pha theo công thức của Largeron, thì pha dung
dịch nhuộm: 10% (10 phần dung dịch Giêmsa cốt + 90 phần nước cất).
Dung dịch Giêmsa cốt pha theo công thức của WHO (1994), pha dung dịch
nhuộm: 3% (3 phần dung dịch Giêmsa cốt + 97 phần nước cất).
Dung dịch Giêmsa pha loãng chỉ dùng trong ngày, dùng ngày nào phải pha
ngày đó.
- Cồn metylic hoặc cồn etylic 960 để cố định.
- Cồn etylic 700 để sát trùng.
- Dầu bạch hương.
2. Kỹ thuật:
- Số tiêu bản: 02 (tiêu bản giọt dày và tiêu bản giọt mỏng).
- Mục đích của các tiêu bản:

1
 + Tiêu bản giọt dày để phát hiện KSTSR;
+ Tiêu bản giọt mỏng là định loại KSTSR (dựa vào hình thể KSTSR và
những đặc điểm của hồng cầu).
- Thời điểm lấy máu: nên lấy vào thời kì bệnh đang cấp tính, không nhất thiết
phải lấy lúc đang lên cơn sốt, mà tốt nhất là khi chưa dùng thuốc. Muốn tìm các giai
đoạn phát triển của KSTSR thì cứ cách một khoảng thời gian nhất định lại lấy máu
một lần (ví dụ: 8 giờ lấy một lần).
- Vị trí lấy máu: thường lấy máu ở đầu ngón tay thứ 4 (hoặc thứ 3), tay trái của bệnh
nhân. Lấy ở đầu ngón tay nhưng ở bên cạnh, vì chỗ đó ít va chạm nên đỡ đau và tránh
được nhiễm trùng. Đối với trẻ em có thể lấy máu ở đầu ngón chân cái hoặc dái tai.
2.1. Kỹ thuật lấy máu và dàn tiêu bản:
* Lấy máu:
- Sát trùng tại chỗ bằng bông (gạc) có thấm cồn 70 0, lau mạnh cho sạch bụi, bẩn
và mỡ ở đầu ngón tay. Dùng bông sạch lau khô ngón tay.

INCLUDEPICTURE
"http://www.malariasite.com/malaria/smeara.jpg" \* MERGEFORMAT

Hình 1: Xác định vị trí lấy máu và vô khuẩn trước khi chích lấy máu
- Dùng kim chích máu vô khuẩn chích nhanh, nhẹ vào đầu ngón tay.
- Bóp nhẹ ngón tay, nặn ra giọt máu đầu và lau đi bằng miếng gạc hay bông
khô. Chú ý không để sợi bông nào dính ở ngón tay, nếu có sẽ bị trộn lẫn với máu.

2
 Hình 2: Chích máu và lấy máu lên lam
- Bóp nhẹ ngón tay lấy 2 hoặc 3 giọt máu vào 1/3 ngoài của lam kính để làm
tiêu bản giọt dày.
- Lấy tiếp 1 giọt nhỏ hơn vào khoảng giữa lam (cách giọt máu để làm giọt dày
1,5 cm).
- Dùng miếng bông cồn lau sạch máu ở đầu ngón tay bệnh nhân, đồng thời để
bệnh nhân giữ cầm máu.
* Dàn tiêu bản máu:
- Dàn giọt mỏng: đặt lam dàn ở phía trước giọt máu nhỏ, tạo với lam kính thành
góc 300. Kéo lùi lam dàn tiếp xúc với giọt máu nhỏ, đợi máu lan ra dọc ra hai bên
theo bờ lam dàn, nâng cao lam dàn tạo thành một góc 45 0, đẩy nhanh lam dàn dọc
theo lam kính đến hết lam kính. Trong quá trình đẩy phải đảm bảo lam dàn luôn tiếp
xúc với bề mặt của lam máu.
- Dàn giọt dày: dùng góc của lam dàn máu đánh giọt máu theo đường vòng tròn
nhanh và đều. Đánh từ trong ra ngoài rồi từ ngoài vào trong, đến giữa giọt máu thì
nhấc lam dàn ra. Đường kính giọt dày khoảng 1,5 cm.

Hình 3: Dàn máu và ghi nhãn (ký hiệu) cho tiêu bản
- Đặt úp tiêu bản trên giá để khô tiêu bản (tránh bụi và tránh ruồi ăn máu).
- Ghi tên hoặc mã số bệnh nhân, ngày tháng lấy máu vào phần đầu tiêu bản, chỗ
không có máu. Nếu không có bút viết kính có thể dùng bút chì mềm, bút bi hết mực
viết lên phần dày hơn của giọt mỏng khi giọt máu đã khô.

3
 - Nếu không nhuộm được tiêu bản thì gói các lam cùng với tờ báo cáo bệnh
nhân gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt.

Hình 4: Lam máu sau khi dàn

- Yêu cầu:
Tiêu bản giọt mỏng: máu phải dàn đều, không có vệt dọc hoặc vệt ngang, không
có chỗ trống, có đuôi mỏng.
Tiêu bản giọt dày: đảm bảo đủ độ dày. Kiểm tra bằng cách: đặt tiêu bản lên tờ
giấy in chữ to, chữ in ở dưới gần như không thấy rõ là được. Nếu dày quá, khi khô
máu sẽ co lại tạo thành những vết rạn, dễ bong. Trái lại, nếu mỏng quá thì không
khác gì tiêu bản giọt mỏng.
2.2. Kĩ thuật nhuộm tiêu bản:
* Phương pháp thường quy:
- Trước khi nhuộm:
Cố định hồng cầu ở giọt mỏng: khi tiêu bản máu đã khô, nhỏ cồn 96 0 lên tiêu
bản mỏng, để khoảng 10 giây. Có thể cho cồn vào một bình trụ nhỏ, nhúng phần
giọt mỏng vào trong cồn khoảng 10 giây. Khi cố định cần chú ý không để cồn tràn
sang giọt dày vì cần phải phá vỡ hồng cầu.
Phá vỡ hồng cầu ở giọt dày: bằng nước cất. Nếu pha dung dịch Giêmsa bằng
nước cất thì không cần phải phá vỡ hồng cầu trước khi nhuộm, vì nước cất dùng để
pha Giêmsa sẽ phá vỡ hồng cầu trong quá trình nhuộm.
Để khô tiêu bản.
- Nhuộm tiêu bản:
Đặt tiêu bản lên giá cho bằng phẳng.
Nhỏ dung dịch Giêmsa vào tiêu bản giọt dày.
5 phút sau thì nhỏ dung dịch Giêmsa vào giọt mỏng.
Để thêm 30 phút nữa (thời gian nhuộm giọt mỏng là 30 phút, giọt dày là 45 phút).
- Rửa tiêu bản:
Rửa tiêu bản bằng nước cất hoặc nước lã: nhúng cả tiêu bản vào chậu nước, lắc
nhẹ hoặc đưa tiêu bản vào nước chảy nhẹ, chú ý không để vòi nước chảy trực tiếp
vào giữa tiêu bản, có thể sẽ làm bong và hỏng tiêu bản.

4
 Trước khi rửa không được hất thuốc, làm như vậy cặn sẽ bám chặt vào tiêu bản,
rửa cũng khó sạch.
- Để khô.
- Soi kính với vật kính dầu (100) tìm KSTSR .
- Tiêu chuẩn một tiêu bản nhuộm tốt:
Xem bạch cầu: nhân bạch cầu có màu xanh tím, nguyên sinh chất của bạch cầu
lympho có màu xanh lơ nhạt, bạch cầu đa nhân trung tính có những hạt không đều,
màu từ xanh lơ đến đỏ. Hạt của bạch cầu ái toan rất rõ, đều như màu đồng đỏ.
* Phương pháp nhuộm nhanh:
- Để lam giọt dày thật khô, nếu yêu cầu trả lời kết quả nhanh có thể làm khô
bằng cách quạt hay phơi lam bằng hơi nóng nhẹ như đèn ở kính hiển vi hay hơi
nóng của máy sấy tóc. Phải thật cẩn thận tránh quá nóng, nếu không lam giọt dày sẽ
bị cố định do nhiệt độ.
- Cố định giọt mỏng: áp nhẹ miếng bông có nhúng cồn methanol hoặc nhúng
lam máu vào bình đựng cồn methanol trong vài giây, tránh không để cồn methanol
hay hơi cồn tiếp xúc với lam.
- Pha dung dịch Giêmsa 10%, nếu số lượng lam nhuộm ít chỉ cần 3 giọt thuốc
nhuộm với 1 ml nước. Một lam cần khoảng 3 ml thuốc nhuộm đã pha.
- Giót nhẹ thuốc nhuộm lên lam, có thể dùng 1 pipet để nhỏ giọt. Có thể đặt úp
mặt lam vào 1 khay nhuộm hình lòng chảo và cho thuốc nhuộm vào phía dưới lam.
- Nhuộm trong 5 - 10 phút.
- Đẩy nhẹ nhàng thuốc nhuộm khỏi lam bằng cách nhỏ thêm những giọt nước
sạch vào lam. Không được đẩy trực tiếp thuốc nhuộm khỏi lam và sau đó rửa, làm
như vậy sẽ để lại 1 lớp váng trên mặt tiêu bản.
- Đặt lam máu lên giá để lam sao cho giọt dày không chạm vào giá để lam. Để
khô tiêu bản, đem soi kính hiển vi, tìm KSTSR.

5
 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1: Nêu mục đích tiêu bản giọt mỏng, tiêu bản giọt dày?
Câu 2: Trình bày kỹ thuật lấy máu và dàn tiêu bản?
Câu 3: Những căn cứ để chẩn đoán loài ký sinh trùng sốt rét?
Câu 4: Tiêu chuẩn của một tiêu bản máu dàn tốt, nhuộm tốt là gì?

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bé m«n SR - KST - CT, Häc viÖn Qu©n Y (2001). Kü thuËt ký sinh trïng y
häc. Nhµ xuÊt b¶n Qu©n ®éi nh©n d©n, Hµ Néi, tr: 27 - 35.
2. Bé Y tÕ (2008). Ký sinh trïng thùc hµnh. Nhµ xuÊt b¶n gi¸o dôc, Hµ Néi, tr:
158 - 170.
3. Vò V¨n Phong, §ç D¬ng Th¸i, Vi Kim Ngäc (1974). Kü thuËt ký sinh trïng y
häc, tr: 32 - 52.
4. Ðtinene LÐvi - Lambert, Basic technique for laboratory (B¶n dÞch tiÕng
viÖt). Nhµ xuÊt b¶n y häc, Hµ Néi (1978), tr: 35 - 38.
5. WHO (2003): Manual of basic techniques for health laboratory, page 135 - 138.

Ngµy th¸ng n¨m 2010

Ngêi biªn so¹n

6
 Thîng óy, Bs. §ç Ngäc ¸nh