BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

Bài thí nghiệm số 3: Định lượng vi sinh vật

Họ và tên: Nguyễn Thị Hương
Mssv: 20180466
I. Mục đích thí nghiệm
- Tìm hiểu về phương pháp định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc( theo cách gián tiếp).
- Biết cách thao tác tiến hành để định lượng vi sinh vật bằng phương pháp
định lượng gián tiếp đối với mẫu đất, nước hồ Tiền, không khí.
- Định lượng gián tiếp: gieo cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu
lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36- 48h sau đó đếm số
khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.
II. Vật liệu và phương pháp
1. Vật liệu
- Chuẩn bị mẫu: đất, nước hồ Tiền
- Chuẩn bị nước vô trùng: bằng cách pha nước muối sinh lý 0,85%, pha 2
bình 99ml nước muối sinh lý sau đó đem đi thanh trùng ở 0.5at, 105℃
trong vòng 30 phút.
2. Phương pháp
2.1. Pha loãng canh trường
a) Mẫu đất
- Cân 1g đất cho vào bình tam giác chứa 99ml nước đã thanh trùng( pha
loãng 100 lần).
- Lắc đều cho đến khi mẫu tan hết.
- Tiến hành pha loãng 8 lần như sau:
 Lấy 8 ống effendorf để vào giá và đánh số thứ tự để phân biệt các ống.
 Dùng pipet hút 0,9ml nước vô trùng vào mỗi ống effendorf.
 Cho 0,1ml mẫu đã pha loãng cho vào ống effendorf thứ nhất bằng
pipet, sau đó đem đi lắc đều bằng máy lắc.
 Lấy 0,1 ml dung dịch từ ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 rồi lại đem đi
lắc bằng máy lắc.
 Cứ tiếp tục thực hiện như vậy cho đến ống effendorf thứ 10 => ta thu
được môi trường pha loãng 10-8 ; 10-9 ; 10-10 lần.
b) Mẫu nước hồ Tiền
- Lấy 1ml nước cần phân tích cho vào bình tam giác chứa 99ml nước vô
trùng và lắc đều.
- Tiến hành pha loãng 5 lần tương tự như mẫu đất => ta sẽ thu được môi
trường pha loãng 10-5; 10-6; 10-7 lần của mẫu nước.
 c) Mẫu không khí
- Sử dụng không khí của môi trường.
2.2. Gieo cấy trên môi trường thạch hộp
a. Mẫu đất, nước hồ Tiên
- Tiến hành ở trong tủ cấy để đảm bảo môi trường vô trùng
- Đưa lượng canh trường đã pha loãng trên vào giữa bề mặt thạch hộp petri
đã vô trùng.
- Dùng que trang ( đã vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn, làm nguội), dàn đều
lượng canh trường lên toàn bộ bề mặt môi trường thạch hộp. Dàn đến khi
bề mặt môi trường khô, se lại.
b. Mẫu không khí
- Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng, mở nắp hộp ra chỗ không
khí muốn định lượng vi sinh vật. Mở nắp hộp trong khoảng 5 phút rồi đậy
nắp lại.
 Sau đó ta mang tất cả các hộp petri vừa gieo cấy bọc lại bằng giấy báo và
cho vào tủ ấm. Hai ngày sau lấy ra để quan sát sự phát triển của khuẩn
lạc, từ đó ta có thể định lượng được vi sinh vật có trong các mẫu nghiên
cứu.
2.3. Định lượng gián tiếp
- Đối với mẫu đất, nước: Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực
tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp. Nếu số khuẩn lạc nhiều quá ta
dùng kính Lafa, đó là một tấm kính hình vuông có kích thước 15x 15cm.
Mặt kính được chia thành những ô có diện tích bằng nhau. Đếm số khuẩn
lạc có trên 5- 10 ô. Lấy trung bình cho 1 ô, sau đó đo đường kính trong
của đáy hộp. Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4.
- Đối với mẫu không khí
Theo phương pháp lắng của Omelianxki: theo ước tính trên một diện tích
rộng 100cm2, mở ra trong 5p thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương
với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí.
Đo đường kính hộp petri để tính diện tích rồi suy ra lượng vi sinh vật có
trong 1 lít hay 1m3 không khí.
III. Kết quả
1. Đối với mẫu nước hồ Tiền
 Hộp 1( 10-5)
 Số lượng khuẩn lạc rất là
nhiều do các khuẩn lạc
lan ra khắp mép hộp
thạch, dính vào nhau =>
không đếm được.
- Bề mặt: xù xì, phía
trong hơi lõm
xuống, có thùy, bên
ngoài nhô lên.
- Màu sắc: trắng đục
- Hình dạng: không
xác định được
- Mặt cắt: nhô lên ít
trên bề mặt thạch
- Mép khuẩn lạc:
không tròn đều,
mép nhăn nheo, xù
xì, dạng sóng.

 Hộp 2( 10-6)
Số lượng khuẩn lạc vẫn
rất nhiều.
- Không xác định
được chính xác
số khuẩn lạc vì
khuẩn lạc mọc
lên lan ra khắp
mép hộp.
- Màu sắc: trắng
đục
- Bề mặt: xù xì
- Hình dạng:
không xác định
- Mặt cắt: nhô lên
trên bề mặt thạch
- Mép khuẩn lạc:
nhăn nheo, chia
thùy
-
 Hộp 3( 10-7)
Số lượng: 1 khuẩn lạc nấm
mốc
- Kích thước: 9cm2
- Hình dạng: dạng sợi,
bông lên
- Mặt cắt: nhô lên trên
bề mặt thạch
- Màu sắc: trắng đục
- Mép khuẩn lạc: tròn
đều

2. Đối với mẫu không khí

 Hộp 1
Xuất hiện 4 khuẩn lạc của
nấm men
- Kích thước: nhỏ
- Hình dạng: hình cầu
- Màu sắc: trắng đục
- Bề mặt: trơn bóng
- Mép khuẩn lạc: tròn
đều, trơn bóng
- Mặt cắt: phẳng
Nấm mốc: xuất hiện 2 loại
- 1 loại có tâm ở giữa
kích thước khoảng 4cm2,
bề mặt xù xì, tạo bông, tạo
sợi, mép khuẩn lạc tạo sợi..
- 1 loại lan ra khắp
mặt thạch, không có tâm,
bề mặt xù xì, tạo bông, sợi,
mặt cắt nhô lên cao, mép
tạo sợi
 Hộp 2
Xuất hiện 6 khuẩn lạc
nấm mốc màu vàng
- Kích thước: không
đồng đều
- Bề mặt:bông, dạng
sợi
- Mặt cắt: nhô lên
cao trên bề mặt
thạch
- Mép khuẩn lạc:
không tròn đều
6 khuẩn lạc nấm men, có
một khuẩn lạc nấm men
có màu hồng, 5 khuẩn lạc
còn lại có màu trắng đục
- Kích thước: nhỏ
- Bề mặt: nổi lên trên
bề mặt thạch, mép
khuẩn lạc tròn đều
3. Đối với mẫu đất
 Hộp 1( 10-8)
Không có hiện tượng gì,
không xuất hiện khuẩn
lạc
  Hộp 2(10-9)
Xuất hiện 1 khuẩn lạc nấm
men
- Kích thước: nhỏ
- Bề mặt: trơn bóng
- Màu sắc: màu trắng
- Hình dạng: hình
chấm
- Mép khuẩn lạc: tròn
đều

 Hộp 3( 10-10)
Xuất hiện 2 khuẩn lạc gồm 1
khuẩn lạc nấm men, 1 khuẩn
lạc nấm mốc
- 1 khuẩn lạc nấm men:
kích thước rất nhỏ;
màu sắc trắng đục; bề
mặt trơn bóng, láng
mịn; mặt cắt là phẳng;
mép của khuẩn lạc thì
tròn đều.
- 1 khuẩn lạc nấm mốc:
Kích thước: nhỏ
Màu sắc: trắng
Bề mặt: dạng sợi,
bông

IV. Thảo luận, kết luận

 Mẫu đất
- Ta thấy số khuẩn lạc xuất hiện ở 3 hộp không tỷ lệ với nồng độ trong các
mẫu
- Ở hộp với nồng độ 10-8 không xuất hiện khuẩn lạc nào, trong khi hộp với
nồng độ bé hơn là 10-9 lại xuất hiện 1 khuẩn lạc nấm men dạng chấm rất
nhỏ và 1 khuẩn lạc nấm mốc ở hộp với nồng độ 10-10.
 Kết quả thu được như trên là không hợp lý, có khả năng trong quá trình
hút bằng pipet chưa lắc đều trước khi hút, hoặc cũng có thể trong quá trình
gieo cấy đã làm chết vi sinh vật khi hơ nóng que trang nhưng quên chưa
làm nguội hay làm nguội chưa đủ trước khi trang.
 Mẫu nước hồ Tiền
- Cả 3 hộp đều xuất hiện khuẩn lạc với lượng rất nhiều nhưng không đếm
được cụ thể số khuẩn lạc xuất hiện ở hộp 10-5 và 10-6. Nguyên nhân là do
trong quá trình gieo cấy, khi tiến hành dàn đều vi sinh vật bằng que trang
thì trang chưa kĩ làm vsv tập trung ở mép hộp => khi vsv mọc lên bị dính
hết vào nhau nên không đếm được
 Mẫu không khí
- Ở cả 2 hộp petri đều xuất hiện khuẩn lạc
 Kết luận chung
- Qua quá trình thí nghiệm ta thấy số khuẩn lạc không bao giờ chênh nhau
10 lần khi cấy từ các vật phẩm pha loãng 10 lần.
- Định lượng gián tiếp chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật
có trong vật phẩm nghiên cứu.
- Do còn có sai sót trong quá trình thao tác khâu gieo cấy, pha loãng.. nên
chưa xác định được chính xác số lượng khuẩn lạc có trong mẫu sau quá
trình gieo cấy nên cần phải chú ý, rút kinh nghiệm trong các bài thí
nghiệm tới.