MASTER COURSE:

PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI TRONG

KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
CHƯƠNG 4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

NGUYEN TIEN GIANG, Ph.D

BUI HUU TRUNG, Ph.D.
Email: ntgiang@hcmute.edu.vn
 References.

1. Chromatographic method. Braithwaite and F.J. Smith

2. Analytical Chemistry for Technicians . John Kenkel

Part 1. Introduction
HISTORY OF CHROMATOGRAPHY
Sắc ký là gì?
➢ TÁCH

➢ ĐỊNH LƯỢNG

Sắc ký cột Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Quá trình sắc kí?
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử
của chất phân tích lên hai pha, một pha đứng yên, có khả năng hấp
phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh. Một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là
pha động. Do ái lực khác nhau của pha tĩnh với từng cấu tử chất phân
tích có trong pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách
ra khỏi nhau.
Quá trình sắc kí?
Quá trình sắc kí?

Separated mixture components

elute from the column and pass
through an electronic sensor.
 THÀNH PHẦN CHÍNH CỦA HỆ SẮC KÝ

1. PHA TĨNH (STATIONARY PHASE) Sự tương tác

trong cột sắc ký
2. PHA ĐỘNG (MOBILE PHASE)

3. CHẤT PHÂN TÍCH

3
(a,b,c)

1 2
PHÂN LOẠI PP SẮC KÍ

Hydrophobic- Ưa dầu
Hydrophilic-Ưa nước
SK hấp phụ: dựa trên sự phân bố
chất phân tích giựa pha động và
pha tĩnh nhơ tương tác phân tử
(VDW) thông qua trung tâm hấp
phụ
- Pha tĩnh: R có diện tích bề mặt
lớn, bền vững hóa học
SK phân bố L-L sự phân bố chất
phân tích giữa 2 pha lỏng (pha tĩnh
và pha động) tương tự như quá trình
chiết
- Pha tĩnh: màng mỏng chất lỏng,
không bền vững hóa học, hiện tượng
trôi mất pha tĩnh, giảm độ lặp lại
SK trao đổi ion: dựa trên khả năng
SK rây phân tử: Pha tĩnh có diện
trao đổi ion giữa chất phân tích
tích bề mặt lớn, xốp, chứa các mao
trong pha động với pha tĩnh. Do đó,
quản nhỏ (kích cỡ phân tử). Các
lực liện kết chủ yếu là lực tĩnh điện,
analyte có thể đi vào tùy vào kích
phụ thuộc pH, bán kính hydrat hóa
thước phân tử, nên thời gian rửa
và điện tích ion chất phân tích
giải khác nhau
- Pha tĩnh: cationit và anionit (Rắn)
SK ái lực: Là phương pháp tách riêng biệt và
đặc hiệu sinh chất, dựa vào khả năng đặc hiệu
của chúng vào nền sắc ký thông qua tương tác
VD: làm sạch enzym
giữa kháng nguyên-kháng thể, enzyme-cơ
chất... Sau đó dùng đệm phù hợp để rửa trôi
sinh chất mong muốn ra khỏi cột.
Sắc ký?
Sắc ký?
 Interactions in chromatography
(các lực liên kết trong sắc kí)

Lực phân tán-dispersion force (lực VDW giữa các

hợp chất không phân cực)
Lực liên kết ion- ionic force (giữa ion-ion)
Lực phân cực- polar force (giữa các lưỡng cực)
 Lực phân tán

- Là lực liên phân tử yếu nhất

- Xuất hiện với cả phân tử phân cực và không phân cực
- Phân tử càng lớn và nặng thì lực phân tán càng mạnh
- Diện tích tiếp xúc càng lớn thì lực phân tán càng mạnh.

n-pentane
n-Pentane is a liquid at 25oC. neopentane
Neopentane is a gas at 25oC.
 Lực phân cực
Dipole-dipole force
- Yếu hơn lực ion và cộng hóa trị
- Mạnh hơn lực phân tán
Hydrogen Bonding
- Xảy ra khi nguyên tố H
gắn trên O, N, F ở phân tử
này tương tác với một
nguyên tố còn cặp e chưa
liên kết ở phân tử khác
Lực ion-ion

- Xảy ra giữa 2 ion tích điện trái dấu

- Điện tích càng lớn, lực ion-ion càng mạnh

 Các tương tác trong sắc ký
• Like attracts like

Pha thuận: SiO2, polyethylene glycol Pha đảo: C8, C18

- Chất phân tích:

- Alcohol, acid
- Hydrocarbon
Có hai loại - cột sử dụng trong sắc ký khí:
- Cột nhồi
- Cột mao quản
 MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ
Thời gian lưu, thể tích lưu (retention time/volume)

• Thời gian chết tM: thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột
• Thời gian chất phân tích bị giữ lại ở pha tĩnh tS
• Thời gian lưu tR: Tổng thời gian chất phân tích bị giữ lại trong cột sắc
ký, là thời gian từ khi bơm mẫu vào cột tới khi peak đạt cực đại
• Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R: thời gian lưu không tính thời gian chết
V=u.t
u: Tốc độ dòng
to hay tm: thời gian
chết
MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

Distribution constant (Hằng số phân bố), K

The difference in the partitioning of an analyte between the

mobile and stationary phases is governed by the distribution
K
[𝑨𝒔 ]
As Am 𝑲=
[𝑨𝒎 ]

[As]: nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

[Am]: nồng độ chất phân tích trong pha động
How does a solute migrate along a
chromatography column?

Solutes move in the column only when they are in the mobile phase
Separation of a mixture of A, B and C.
Plate theory, Rate theory, van Deemter equation, HETP
Plate theory, Rate theory, van Deemter equation, HETP
Plate theory, Rate theory, van Deemter equation, HETP
Plate theory, Rate theory, van Deemter equation, HETP
 van Deemter equation

H=H1 + H2 + H3
𝑩
=A+ + C𝒖𝒙
𝒖𝒙

A = Eddy diffusion or Multiple paths (khuếch

tán xoáy-packed columns only)
B = Longitudinal Diffusion (khuếch tán theo
chiều dọc)
C = Mass Transfer ( đặc trưng cho quá
trình chuyển khối lượng)

u (ml/min): Tốc độ dòng chảy

Chiều cao đĩa lý thuyết : đặc trưng cho

độ giãn rộng của vùng chất phân tích
1. A = Eddy diffusion or Multiple paths (khuếch tán xoáy -
packed columns only)
B = Longitudinal Diffusion (khuếch tán theo chiều dọc)
C = Mass Transfer ( đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng)
 Column efficiency parameter
Number of Plates ( số đĩa lý thuyết), N)
- Đĩa lý thuyết là phần nhỏ của cột khi đạt được sự cân bằng phân
bố chất phân tích
- N càng lớn thì peak càng hẹp
- H: chiều cao đĩa lý thuyết (càng nhỏ peak càng hẹp)

where L is the length of the column and H is the height of each plate
tR is the retention time, W is the width of the peak and W1/2 is half the width of
the peak.
 MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

Retention factor (Hệ số lưu), k

Với chất phân tích A

An optimum range for k values is between 1 and 5

The selectivity (or separation) factor (α) is the ability of the chromatographic
system to ‘chemically’ distinguish between sample components. It is usually
measured as a ratio of the retention (capacity) factors (k) of the two peaks in
question and can be visualized as the distance between the apices of the
two peaks.

- kB là hệ số lưu của phân tích bị lưu lại mạnh hơn trong pha tĩnh
- kA là hệ số lưu của chất phân tích bị lưu lại kém hơn trong pha tĩnh
Điều kiện để hai chất A và B tách khỏi nhau là α > 1
Resolution (Độ phân giải R)
R thể hiện mức độ tách các cấu tử khỏi nhau
R càng lớn thì cấu tử A và B càng tách khỏi nhau

R=2t/(W1 + W2)
= 1.18*(t/(W0.5h1+W0.5h2))
EXAMPLE: Substances A and B were found to
have retention times of 6.4 and 14.4 min,
respectively, on a 22.6 cm column. An
unretained sample of air passed through the
column in 1.30 min. The widths of the peak
bases were 0.45 and 1.07 min. Calculate the:
(a.) column resolution

2((tR)y - (tR)x) 2(14.4 - 6.4)

Rs = ----------------- = ---------------- = 10.5
Wx + Wy (0.45 + 1.07)

Dr. S. M. Condren
 CÁCH LÀM TĂNG ĐỘ PHÂN GIẢI

Thay đổi cấu trúc cột:
+ Tăng chiều dài cột
+ Sử dụng chất nhồi có kích
thước nhỏ hơn và đồng đều hơn
+ Giảm đường kính cột
Thay đổi vận hành cột
+ Tối ưu hóa tốc độ MB
+ Giảm lượng mẫu
+ Giảm nhiệt độ cột (GC)
+ Thay đổi thành phần
pha động
 Why are GC and LC referred to as
Chromatography of EFFICIENCY and
SELECTIVITY???
Applications of Chromatography
• Qualitative Analysis
• Quantitative Analysis
• Analyses Based on Peak Height
• Analyses Based on Peak Areas
• Calibration and Standards
• The Internal Standard Method
• The Area Normalization Method
Quantification in Chromatography
Quantification in Chromatography
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ
SẮC KÝ LỎNG

NGUYEN TIEN GIANG, Ph.D

BUI HUU TRUNG, Ph.D.
Email: ntgiang@hcmute.edu.vn
 References.

1. Chromatographic method. Braithwaite and F.J. Smith

2. Analytical Chemistry for Technicians . John Kenkel

Part 2.

High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
 Ứng dụng HPLC

Phân tích
hàm lượng Phân tích Phân tích
phụ gia tồn dư và hợp chất
thực phẩm chất gây ô tự nhiên
nhiễm
Chất tạo chua,
chất chống oxi Anion vô cơ,
hóa, chất bảo Dư lượng hóa trị
và thuốc chống lipid, acid béo,
quản, chất tạo carbohydrate,
ngọt nhân tạo, ký sinh trùng,
độc tố nấm, vitamin, amin
chất màu, sinh học, amino
hương,... thuốc trừ sâu,...
acid, peptide,... 4
 Introduction
HPLC uses high pressure to force solvent through closed columns
containing fine particles that give high resolution separation
 Mobile phase (pha động)
Pha động là dung môi rửa giải các chất tan ra khỏi cột
tách SK
Là yếu tố thứ 2 ảnh hướng tới quá trình tách

- Ảnh hưởng tới tR

- Độ chọn lọc của hệ pha
- Độ phân giải
- Hiệu lực của cột tách
- Độ rộng của peak
 Mobile phase (pha động)

Yêu cầu của pha động

- Pha động phải trơ với pha tĩnh
- Hòa tan chất phân tích
- Bền vững theo thời gian
- Độ tinh khiết cao (for HPLC)
- Nhanh đạt cân bằng động trong SK
- Phù hợp với detector
- Tính kinh tế cao
 Mobile phase (pha động)
* PRE-FILTERING: The problem is solved by pre-filtering
all mobile phases and samples before beginning the
experiment. For mobile phases and large sample volumes,
this involves utilizing a vacuum apparatus that draws the
liquid through a 0.45-μm filter.
 Mobile phase (pha động)

* DEGASSING: Removing air from the mobile phase, called

degassing, in advance of the chromatography is a routine
matter, however, and can be done in one of several ways.

- (1) helium spariging (Helium does not saturate the

solution because it is so light in weight. At a helium flow
rate of 300 mL/min, complete degassing takes just a few
minutes),
- (2) ultrasonic agitation,
- (3) drawing a vacuum over the surface of the liquid,
- (4) a combination of items 2 and 3.
 Solvent deliver system (Pump)
The purpose of the pump is to maintain a constant flow of
mobile phase through the HPLC system

Yêu cầu
◼ Cung cấp dòng dung môi từ 0.1 đến 10 ml/min ở P đến 40MPa
◼ Tương hợp với các loại dung môi hữu cơ thông dụng, đệm ion, muối.
◼ Vận hành ổn định, lặp lại với tuổi thọ seal pump dài
◼ Khả năng cấp và trộn dung môi chính xác trong gradien (với pump đa
kênh)
◼ Dể bảo trì và sửa chữa
 Solvent deliver system (Pump)

Yêu cầu: Tìm hiểu về pump trong hệ thống HPLC:

1. Các loại pump
2. Cấu tạo
3. Hoạt động
4. Phụ kiện
There are two mobile phase elution methods that are
used to elute mixture components from the stationary
phase:
***Isocratic elution (Đẳng dòng-đẳng dung môi): a
single mobile phase composition is in use for the entire
separation experiment.

***Gradient elution (gradient): the mobile phase

composition is changed, often gradually, in the middle of
the run.

Low-pressure gradient system
Điểm trộn trước pump, dung môi
vào pump theo từng đoạn, sự sai
lệch độ nhớt và khối lượng riêng
làm tăng nhiễu xung của pump →
đường nền kém ổn định

Bộ Valve đổi xung (Gồm 4 valve):

Mixer: chứa các hạt trơ, làm đồng
khi bơm, lần lượt từng valve
nhất dung môi
được mở, tỉ lệ dung môi tương
ứng với tỉ lệ thời gian mở từng
valve

Mixer
 INJECTION VALVE

➢ Measure amounts of sample onto the column

❖ Operation:
− Manually
− Automatically
− An intergral part of autosampler
Valve automation more accuracy and precision than
manual injection.
→ Importance: precise and accurate sample injection
Loop:
vòng lặp
 VAN 6 CHIỀU- 1 VÒNG MẪU (LOOP)
❖ Load position

− Loop connects injection

and valve port
− Fill loop with sample
− Flow from pump to column
− Waste port vents the loop
 ❖ Inject position

Loop- pump-column is
connected

Loop is fluxed on to column by MP from pump

 INJECTION TECHNIQUES

Typically, size of loop → Injection volume

but can inject smaller loop size

❖ Filled-loop injection: loop is filled entirely with sample

− Vinjection is determined by Vloop

Vsample > 2 – 3 Vloop

eg. Vloop is 20µl → Vsample 60µl, Vexcess flows to waste

➢ To change Vinjection, change the loop
❖ Partial-loop injection: Vsample < Vloop

Vinjection is determined by Vsyringe

eg. Vloop 50µl, Vinjection 20µl

➢ 2 important things:

− Careful taking sample

− Vsample < ½ Vloop

 Hệ thống Auto sample
➢Mẫu được
chuẩn bị và
chiếc vào vial,
sau đó cho
vào Tray, đặt
tên mẫu ứng
với từng vị trí
vial. Hệ thống
có cánh tay
Robot tự động
hút mẫu và
tiêm vào hệ
thống.

11/03/2024 30
Tiêm bằng tay:

-Cắm xilanh vào cổng tiêm ở vị trí inject

-Vặn van về vị trí load→ tiêm mẫu → vặn

về inject
-Rút xilanh khỏi cổng tiêm , rửa cổng tiêm.

Chú ý : không sử dụng những kim tiêm

có đầu nhọn ( vì có thể đâm thủng
màng seal)
 Tiêm mẫu tự động:

Khi bật chế độ lấy mẫu tự động, khay đựng mẫu

sẽ quay đến khi lọ chứa mẫu cần phân tích nằm
ngay dưới kim tiêm mẫu, kim tiêm hạ xuống cho
đến khi chạm vào lọ đựng mẫu và mẫu được rút
ra đi vào vòng mẫu. Van quay để tiêm mẫu vào
cột sắc ký
 Stationary phase (pha tĩnh)

ĐIỀU KIỆN PHA TĨNH TRONG HPLC

- Trơ, bền với đk chạy sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc

- Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng độ xốp

- Cỡ hạt đồng nhất: >85% hạt có kích thước trung bình

- Cân bằng động học của sự tách SK xảy ra nhanh, lặp

lại tốt
 PHÂN LOẠI

• Phân loại theo cơ

chế tách
• Phân loại theo trạng
thái pha tĩnh
• Phân loại theo cấu
trúc xốp của pha
tĩnh
Phân loại theo cơ chế tách
COLUMN PACKING CHARACTERISTIC
Ex. ✓ ACE C18, 5µm, 240-4.6mm
✓ Purospher RP18-e, 5µm, 240-4.6mm
✓ Zobax ODS, 5µm, 240-4.6mm

• Support type
• Bonded Groups
• Particle Size
• Pore Size - Surface Area
• Bonded-Phase Density (Carbon load)
 Support Type

✓ Silicagel (SiO2)
✓ Polymer (Polystiren-Divinybezene, polyethers…)
✓ Alumina (Al2O3)
✓ Zirconia (ZiO2)
Silica trung tính (silica trần) -NP-HPLC
 Silicagel-SiO2
✓ Advantages: Excellent physical and chromatographic
performance
• Stability structure, inert
• Easy to make bonded-phase by
silane reaction

✓ Disadvantages: • pH working range is 2-8

• Acidic residual silanol (Si-OH, Si-OM+)
 Support Type
Silicagel (SiO2)

Mobile phase working range: pH 2-8

 Novel Bonding Chemistries

✓Sterically Hindered Group

✓Polyfunctional Silane Chemistry

(monomeric/polymeric bonded
phase)

✓Polar-Embedded Groups:
Carbamate, amide, urea, ether…
Bonded Groups
 Particle Size
✓Conventional: 5 µm
✓Others: 10 µm, 7 µm, 3 µm, 2.2 µm, 2 µm, 1.8 µm…
✓Same column volume, smaller particle → larger surface area
→ increase column efficiency and peak resolution and also
increase peak height and sensitivity
 Surface area - Pore size
✓Decrease pore size, increase surface area
→ longer retention time
 Surface area - Pore size

Pore size defines an ability of the analyte molecules to

penetrate inside the particle and interact with its inner
surface. This is especially important because the ratio of
the outer particle surface to its inner one is about 1:1000.
The surface molecular interaction mainly occurs on the
inner particle surface.
11/03/2024 47
 Column Selecton Guides

✓50–100mm × 4.6mm for simple samples

✓50–150mm × 3.0–4.6mm for purity testing or more complex samples

✓20–150mm × 2.0mm columns for LC/MS

✓For low-pH applications (pH < 2.0), select columns resistant to acid
hydrolysis of the bonded groups.

✓For high-pH applications (pH > 8), select columns stable at high pH
 Guard Column in HPLC
Tại sao cần cột bảo vệ???

11/03/2024 49
11/03/2024 50
Desirable features of guard columns

• Should have preferably the same packing as the analytical column to

eliminate separation complications

• Internal ID of guard column should be comparable to analytical

column to minimize back-pressure. Shorter guard column length is
preferable but it should be long enough to prevent strongly retained
compounds from reaching the main column

• Frit facing the injector should be removable for cleaning by removal

of about 2 mm of material and filling with fresh material

• Disposable cartridge type guard columns are convenient and

economical to use compared to refillable guard columns.
 Discussion
1. Tại sao phải đuổi khí trong pha động trước khi dùng?

2. Các nguyên nhân gây ra “ fronting” và “tailing”

peak sắc kí?

3. Giải thích thứ tự rửa giải các chất methyl parahydroxybenzoate, ethyl
parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate và butyl
parahydroxybenzoate khi dùng cột C18 và hỗn hợp MeOH: H2O (50: 50)
làm pha động. Thứ tự rửa giải thay đổi như thế nào khi ta tăng độ phân
cực của pha động (giảm phần trăm MeOH)?
 DETECTOR

HPLC
Detector Detector
chỉ số
khúc xạ

Detector
Khối Phổ
Cuvet-
Flow cell
 Mass detector

Yêu cầu: Tìm hiểu về HPLC-MS và HPLC-MS/MS

1. Cấu tạo
2. Các kỹ tuật MS
3. Nguyên lý hoạt động
4. Định tính, định lượng
5. Độ nhạy
6. …
Polycyclic Aromatic Hydrocarbons
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ
Part 3. SẮC KÝ KHÍ

Nguyen Tien Giang, Ph.D

BUI HUU TRUNG, Ph.D.
Email: ntgiang@hcmute.edu.vn
 References.

1. Chromatographic method. Braithwaite and F.J. Smith

2. Analytical Chemistry for Technicians . John Kenkel

Part 3.

Gas Chromatography
Gas Chromatography (GC, sắc kí khí)

Buồng điều nhiệt Nhìn sơ đồ cho thấy sự

khác biệt của GC va LC?
 Principle

Volatile liquid or gaseous sample is injected through a septum

(a rubber disk) into a heated port, in which it rapidly evaporates.
Vapor is swept through the column by He, N2, or H2 carrier gas,
and separated analytes flow through a detector, whose response
is displayed on a computer.
Principle
 Cổng bơm Buồng điều
mẫu nhiệt (Cột
tách)

200°C–250°C 80°C–150°C 200°C–250°C

(1) Liquid mixture components must be “flash vaporized” upon

injection so that the flowing helium can immediately carry them into the
column. Thus, the injection port must be heated

(2) Vapor pressures and solubilities can vary substantially with

temperature. Because of this, it is useful to be able to use an elevated
column temperature and also to be able to carefully control the
temperature of the column.

(3) Mixture components should not condense when they are inside
the detector. For this reason, the detector must also be heated.
 Mobile Phase- Carrier Gas

Carrier gas : non-solvate, high purity and chemically inertness

Common carrier gas: include He, Ar, H2, N2
 Mobile Phase- Carrier Gas
Carrier Gas or Mobile phase does not affect solute retention,
but does affect:
1) Desired efficiency for the GC System
- Low Mw gases (He, H2) → larger diffusion coefficients
- Low Mw gases → faster, more efficient separations

2) Stability of column and solutes

- H2 or O2 can react with functional groups on solutes and
stationary phase or with surfaces of the injector,
connections and detector

3) Response of the detector

- Thermal conductor requires H2 or He
- Other detectors require specific carrier gas
 Mobile Phase- Carrier Gas

FIGURE 23-11: van Deemter curves for gas chromatography of n-C17H36 at 175oC,
using N2, He, or H2 in a 0.25-mm-diameter x 25-m-long wall-coated column with OV-
101 stationary phase
 Mobile Phase- Carrier Gas

Optimum practical gas velocity

 Stationary phase
(column)
• Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động, pha tĩnh
(dựa trên tối ưu hóa pt Vandemter)
• Độ thấm cao tức là độ giảm áp suất nhỏ so với 1 tốc
độ khí mang nhất định
• Tải trọng cao, khả năng hòa tan cấu tử trong pha tĩnh
(hệ số phân bố trong pha tĩnh cao)
• Bền ở nhiệt độ cao
 Stationary phase

❑ SK KHÍ –RẮN (GSC): cột sắc ký là cột nhồi

❑ SK KHÍ-LỎNG (GLC):
• Cột nhồi, pha tĩnh là chất lỏng phủ lên trên
những hạt trơ sử dụng như chất mang
• Cột mao quản, pha tĩnh là chất lỏng hay chất rắn
tráng phủ lên bề mặt trong của thành ống
 Cột sắc ký khí-rắn
• Ít phổ biến hơn GLC
• Khuyết điểm: thời gian giữ dài, kéo đuôi,
không lặp lại
• Pha tĩnh: Al2O3, carbon
• Ứng dụng chính: phân tích khí
CỘT NHỒI VÀ CỘT MAO QUẢN
 GC columns

Packed column Capillary column

- 1-3 mm i.d. - 0.1-0.33 mm i.d.

- < 5m length - 12-150m length

- 0.1-0.4 mm dp - WCOT: Wall coated-open tubular

- PLOT: Porous layer open tubular

- SCOT: Support coated open tubular

So sánh chênh lệch áp suất đầu cột và cuối cột
của hai loại cột tách?
Cột nhồi- Packed column
 Cột nhồi- Packed column

Cột được nhồi bằng một loại chất mang có phủ

trên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng- tương ứng
có khối lượng từ 0,1-25% khối lượng so với
chất mang
Đường kính trong: 3-6 mm
Chiều dài: 1-5 m
Hiệu quả cột tách: 500-1000 đĩa/m
Lượng mẫu: 10 ng-1 mg
Áp suất: Cao
Tốc độ phân tích: chậm
Cột nhồi- Packed column
Packed columns contain fine particles of solid
support coated with nonvolatile liquid stationary
phase, or the solid itself may be the stationary
phase
Open Tubular columns - Cột mao quản hở)
Open Tubular columns - Cột mao quản hở)
CỘT MAO QUẢN LỚP XỐP CỘT MAO QUẢN PHIM MỎNG
Column Diameter and Resolution
Column Length and Resolution
 Features of Common Stationary Phase
Configurations

• WCOT has best resolution but smallest sample capacity

(lượng mẫu đưa vào cột- chỉ khoảng 10-7 g)

• SCOT has higher sample capacity but poorer resolution

• PLOT is an alternative to packed columns for certain

types of analysis (e.g., atmospheric gasses)
Stationary phase - materials
High molecular weight hydrocarbons
• Squalane (C30H62) (shark liver oil)
• Apolane-87 (C87H176)
• Apiezon greases: lubricating oils

• Poly(siloxane)

Poly(siloxane) Poly(silarylene-siloxane) A Poly(carborane-siloxane)

polymer copolymer copolymer
Polarity

Nhiệt độ chặn dưới: điểm nóng chảy

Nhiệt độ chặn trên: dựa trên áp suất hơi, độ bền nhiệt
 Column Polarity and Retention Time

non-polar polar
How the relative retention times of polar and nonpolar solutes change as the
polarity of the stationary phase changes?
(b) The strongly polar stationary phase
retains the strongly polar solutes

(a) The principal determinant of

retention on this column is the
volatility of the solutes
Isothermal Programming
Temperature Programming
Các chất có áp suất hơi (Vapor pressure) và khả năng
hòa tan (solubility) khác nhau sẽ được rửa giải (tách) ra
khỏi cột theo thứ tự nào?
the mixture components separate due to their
varying vapor pressure and solubility (in
Stationary Phase)
Injection
Injection

Tiêm KHÔNG chia dòng (splitless

injection): Thường sử dụng cho
phân tích lượng vết, van chia dòng
được đóng lại và để khí mang đi
qua liner thủy tinh để vào cột. Điều
này cho phép gần như toàn bộ mẫu
đi vào cột.
 Injection
Split Injection
Parameter Considerations
Volume Reproduce the sample volume precisely for all
injections
Solvent All sample should be dissolved in the same solvent
Syringe handling Rapid injection using the hot needle or solvent flush
method is preferred. Autosamplers capable of high
speed and reproducible injection times provide
improved performance
Release position Preproduce the needle penetration length precisely
Liner packing Precaution advised as the outcome is unpredictable
in many cases
Column temperature The initial column temperature should be fixed and
constant
standards Internal standards are recommended for
quantitative analysis
 Injection
Splitless Injection

• Solvent effect

• Accuracy of retention time

• Matrix-induced response enhancement

Injection
Injection- headspace
 Injection- headspace

Static headspace

• Standby: Sample vial is temperature equilibrated at ambient pressure.

• Pressurization: Sample vial is pressurized to a pressure higher than the GC
column head pressure and equilibrated.
• Sampling: Sample vial is opened to the transfer line and the GC inlet. The
sampling time, temp., and P. drop determine the amount of sample transferred
 Injection- headspace
Dynamic headspace

Purge and trap-dynamic headspace

1. Purge gas Trap: tenax, silicagel, charcoal, molecular sieve

2. Vent Trap is heated in desorption step
3. GC carrier gas
Detector
The choice of carrier gas depends on the detector and
the desired separation efficiency and speed
Nguyên tắc: đố cháy một hợp
chất hữu cơ trên ngọn lửa air/H2
sẽ tạo ra ngọn lửa chứa e- và các
cation CHO+. Áp một điện thế
khoảng 300V qua ngọn lữa sẽ tạo
ra một dòng nhỏ tầm 10-9 – 10-12
A. Dòng điện này được khuếch
đại và cho tín hiệu phân tích
Ưu điểm:
• Cho tín hiệu với hầu hết các hợp chất hữu cơ ngoại trừ carbon
trong nhóm carbonyl và carboxylic
• Hầu hết các hợp chất vô cơ và khí như H2O, CO2 không cho
tín hiệu → hữu hiệu phân tích các hợp chất hữu cơ trong các
mẫu môi trường nướ, khí
• Rất nhạy, LOD khoảng10-11g (50 ppb), khoảng tuyến tính rộng
Nguyên tắc: đo liên tục độ
dẫn nhiệt của khí mang
(tinh khiết và khi có chất
phân tích)
Ưu điểm:
• Bởi vì tất cả các chất phân tích đề ảnh hưởng đến độ dẫn nhiệt
của pha động nên TCD là đầu dò phổ quát
• Khoảng tuyến tính rộng
• Không phân hủy chất phân tích

Nhược điểm:
• Độ nhạy thấp với hầu hết chất phân tích
 Đầu dò ECD (bắt giữ điện tử

Nguyên tắc: Khi các chất phân tích có độ âm điện cao sẽ bắt giữ
các e và dòng sẽ giảm, cho tín hiệu
Ưu điểm:
• Chọn lọc chất phân tích có độ âm điện cao như (chứa halogen,
nhóm nitro, amine, alcohol
• LOD rất thấp

Nhược điểm:
• Khoảng tuyến tính hẹp
• Không nhạy với các hợp chất hữu cơ khác
 Đầu dò MS

Nguyên tắc: các phân tử khí bị ion hóa và phân mảnh thành các
ion nhỏ hơn.Dựa trên tỷ lệ khối lượng/điện tích khác nhau mà các ion
này được tách ra khỏi nhau bằng tác dụng của điện trườn hoặc từ
trường. Tín hiệu tương ứng của các ion sẽ được ghi nhận và cho tính
hiệu dạng peaks.

Ưu điểm:
• LOD rất thấp, 25 fg – 100 pg
• Khoảng tuyến tính rộng
• Có thể định danh và định tính chất phân tích
 Applications of Chromatography

• Qualitative Analysis: tR, I

• Quantitative Analysis
– Analyses Based on Peak Height
– Analyses Based on Peak Areas
– Calibration and Standards
– The Internal Standard Method
– The Area Normalization Method
the parameters that are most important for a qualitative
analysis using most GC detectors are the retention time,
tR, and the adjusted retention time, t’R, I

Under a given set of conditions (the nature of the

stationary phase, the column temperature, the carrier flow
rate, the column length and diameter, and the instrument
dead volume), the retention time is a particular value for
each component.
 PP QUI VỀ 100 %
Áp dụng khi sắc đồ phân giải hoàn toàn
Hệ số hiệu chỉnh f=1
PP qui về 100 %, áp dụng khi sắc đồ phân giải hoàn
toàn