Detekcija i identifikacija 6 podvrsta Monilinia spp.

Uzročnika smeđe truleži, koristeći TaqMan Real-Time PCR

metod iz monokulturalnog uzorka i inficiranog ploda
jabuke

Abstrakt
Smeđa trulež je opaka bolest koja napada koštunjavo i semenkasto voće. Nedavno je potvrđeno da je
ova bolest uzrokovana infekcijom sledećim, usko srodnim bakrerijskim kulturama: Monilinia
fructicola, M. laxa, M. fructigena, Monilia poly-stroma, M. mumecola, i M. yunnanensis. Usled razlika
u geografskoj rasprostranjenosti, neke od ovih vrsta su izolovane kao značajni patogeni u nekim
zemljama. U ovoj studiji, razvili smo TagMan real-time polymerase chain reaction (PCR) test da bi
identifikovali ovih 6 vrsta. Parovi prajmera i sonde su posebno dizajnirane za Monilinia fructicola, M.
fructigena, M. laxa, and Monilia polystroma, a bazirane na sekventnim razlikama u laccase-2 genima.
Takodje smo razvili parove prajmera i sonde za for Monilia mumecola and M. yunnanensis, na istoj
bazi. PCR testovi su imali mogucnost da identifikuju ciljane patogene, sa dometom detekcije od 10 do
100fg DNK, sto je ekvivalentno jednoj do sedam spora (conidia). Testovi su takodje mogli da detektuju
ciljane patogene u uzorcima u kojima je bila smesa različitih DNK, u kojima se nalazilo svih 6 vrsta
Monilinia spp. , kao i srodnih vrsta. PCR testovi su precizno otkrivali ciljane gljive u plodovima
jabuke. Valja dodati i da su rezultati ovog istraživanja u skladu sa onima dobijeniom tradicionalnim
morfoloskim metodama.

Smeđa buđ je jedna od ekonomski najznačajnijih bolesti u koštunjavom voću, kao što je breskva
i nektarina, jer može da donese ogromne gubitke u fazi formiranja ploda i nakon same berbe. Gljive
koje izazivaju smeđu buđ takođe izazivaju bolesti u semenkastom voću, kao što su jabuke i kruške, ali i
voću mnogih drugih biljaka, kao što je grožđe, glog, guava i paradajz (Byrde and Willetts 1977). Pored
plodova, smeđa buđ može da pogodi i lišće i cvetove (Berrie and Holb 2014; Byrde and Willetts 1977).
U Kini se smeđa buđ javlja u 20 – 100% slučajeva(Zhu et al. 2008). U Evropi su uočeni gubici od 7 do
25% u fazi razvoja ploda, kako u konvencionalnim, tako i u organskim voćnjacima(Berrie and Holb
(2014).
Šest srodnih vrsta smeđe buđi su isolovane iz koštunjavog i semenkastog voća i uključuju:
Monilinia fructicola (G. Winter) Honey, M. laxa (Aderh. & Ruhland) Honey, M. fructigena Honey,
Monilia polystroma G. Leeuwen, M. yunnanensis M. J. Hu & C. X. Luo, and M. mumecola Y. Harada,
Y. Sasaki & Sano (Byrde and Willetts 1977; Harada et al. 2004; Hu et al. 2011; Van Leeuwen et al.
2002). Ove vrste su u različito rasprostranjene širom sveta, pa su dve ili više uglavnom prisutne u
svakoj pojedinačnoj državi ili regionu. Na primer M. fructicola i M. laxa su uglavnom prisutne u
Severnoj Americi. M. fructigena i M. laxa se najčešće pronalaze u Evropi, zajedno sa par izolovanih M.
fructicola i M. polystroma (Bosshard et al. 2006; De Cal et al. 2009; Duchoslavova et al. ́ 2007;
Grabke et al. 2011; Hilber-Bodmer et al. 2010; Munda and Virsˇcek Marn 2010; Pellegrino et al. 2009;
Petr ˇ oczy and ́ Palkovics 2006; Poniatowska et al. 2013; Vasic et al. 2012). Vredi dodati da su
infekcije izazvane M. fructicola, M. laxa, M. polystroma, and M. mumecola takođe česte u Japanu, dok
su M. fructicola, M. yunnanensis, M. polystroma, and M. mumecola često prisutne u Kini, uz M. laxa
and M. fructigena, koje su pronađene u divljem voću u Xinjiangu (Hu et al. 2011; Niu et al. 2016; Yin
et al. 2015; Zhu and Guo 2010; Zhu et al. 2005, 2011, 2016).
U prošlosti, različite vrste Monilinia spp. su identifikovane prema morfološkim i kulturnim
karakteristikama (Byrde and Willetts 1977; van Leeuwen and van Kesteren 1998). Ipak, morfološke
karakteristike su različite u različitim uslovima uzgoja, pa su često nedovoljno pouzdane kako bi se
koristile za rutinsko identifikovanje vrste. Par PCR metoda je nedavno razvijeno kako bi se
identifikovala Monilinia spp., koristeći razlike u sekvencama u genetskim markerima, kao što je prosto
ponavljanje sekvenci (Ma et al. 2003) i nasumično pojačane polimorfne DNK sekvence (Cotˆ e et al.
2004; Gell et al. 2007). Ostale PCR metode za identifikaciju Monilinia-e se fokusiraju na specifične
genetske regione, uključujući unutrašnji transkribovani odstojnik (ITS), region 1 i 2 (Gell et al. 2007;
Ioos and Frey 2000) and the b-tubulin (Fan et al. 2014; Hu et al. 2011; Ma et al. 2003) and cytb I genes
(Hily et al. 2011; Miessner and Stammler 2010).
Reč je o sledećim molekularnim metodama: konvencijalni PCR (Cotˆ e et al. 2004; Gell ́et al.
2007; Hily et al. 2011; Hu et al. 2011; Miessner and Stammler 2010), PRC u realnom vremenu (real-
time) (Fan et al. 2014; Garcia-Benitez et al. 2017; Papavasileiou et al. 2016; Van Brouwershaven et al.
2010) kako bi se izdvojilo do 4 Monilinia spp. od jednom. Ipak, nakadni pokušaji drugih istraživača da
upotrebom istih metoda identifikuju neke izolate nisu bili uspešni(Fan et al. 2007; Hu et al. 2011; Zhu
et al. 2011). Poređenjem sekvenci Monilinia je otkriveno da su genetske razlike jedino prisutne u
malim segmentima. Uz to, prajmeri koji su dizajnirani za PCR metode ne mogu da pojačaju sekvence
nedavno otkrivenih vrsta, kao što su M. polystroma, M. mumecola i M. yunnanensis. Prema tome,
testovi koji se koriste za identifikaciju Monilinia spp. moraju da imaju mogućnost da razlikuju svih 6
vrsta srodnih Monilinia spp. U prethodnoj studiji, dizajnirali smo prajmere pojedinačno za svih 6 vrsta
Monilinia spp. , prema lakaznom genu, kao i univerzalni PRC metod koji može da identifikuje pet od
šest Monilinia spp. (Zhu et al. 2016). Konvencionalni PCR ne poseduje dovoljnu osetljivost da
identifikuje M. fructigena. PCR u realnom vremenu (real-time) je možda bolja opcija od
konvencijalnog PCR zbog njegove specifičnosti i osetljivosti.
Pouzdan metod preciznog i brzog identifikovanja Monilinia spp. je esencijalan za fitosanitarnu
inspekciju kao i za ispravnost i sklad sa regulacijama pri uvozu i izvozu voća (npr. brekvi, jabuka i
krušaka). Prema tome, ciljevi ove studije su da se (i) dizajniraju prajmeri i sonde pojedinačno za
lakazne gene i faktora elongacije Monilinia spp. i (ii) razvoj Taq-Man real-time PCR testova za
diferencijaciju svih šest vrsta Monilinia spp. u monokulturalnim voćnjacima i iz inficiranog ploda
jabuke.
Materijali i metode
Skupljanje gljivičnog uzorka. Analizirano je ukupno 54 izolata svih 6 vrsta Monilinia ili
Monilia, koje uzrokuju smeđu trulež koštunjavog i semenastog voća. Ovi uzorci su prikupljeni sa 35
geografskih populacija iz devet država: Kina, SAD, Francuska, Japan, Holandija, Poljska, Španija,
Engleska i Irska (tabela 1). Svi uzorci su identifikovani koristeći morfološku i PCR metodu,
prajmerima koji su napravljeni pojedinačno za svaku vrstu ili poređenjem ITS-a b-tubulin i lakaznih
gena u prošlim studijama (Zhu et al. 2011, 2016). Pritom su otkrivene sledeće vrste patogena koje
uzrokuju bolesti u koštunjavom i semenkastom voću, a koje inicijalno nisu bile deo istraživanja:
Botrytis cinerea,
Botryosphaeria dothidea, Alternaria sp., Penicillium sp., and Colletotrichum fructicola (tabela 1).

DNK ekstrakcija. Micelija svih uzoraka je održavana na agar dekstrozi iz krompira (PDA)
naginje se na 4°C ili u 15% glicerola na -80°C (Zhu and Xiao 2015) vraćena je u život sa PDA i
prebačena u čorbu od graška. Micelija je uzgajana u Petri sudovima koji su sadržali čorbu od graška
(bez interferencije) na 22°C u tami tokom 5 dana. Micelijalni DNK je ekstraktovan kao što je opisao
Yhu et al. (2011), i koncentracija DNK je izmerena koristeći NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,
Wilmington, DE).
TaqMan sonda i PCR prajmer dizajn. Lakaza i faktor elongacije genetskih sekvenci svih šest
vrsta Monilinia spp. , kao i dve blisko srodne gljive (koje nisu deo ovog istraživanja) Botrytis cinerea i
Sclerotinia sclerotiorum, su preuzete iz prethodne studije (Zhu et al. 2016), i zaokružene su
korišćenjem DNAMAN, verzija 6.0. . TaqMan sonde i PCR (real-time) prajmeri specijalno napravljene
za M. fructicola, M. laxa, M. fructigena, M. polystroma, M. yunnanensis i M. mumecola su dizajnirani
da pronađu razlike u genetskim sekvencama. TaqMan sonde su morale da zadovolje sledeće kriterijume
(i) 13 do 30bp dužine gasitelja crne rupe (black-hole quencher) i 13 do 25bp dužine za vezivo manjeg
zleba (MGB) , (ii) 30 do 80% GC sadržaja, (iii) bez guanin baza na 5‘ kraja i bez guanina kao druge
baze ako se taguje sa 6-karboksifloresceinom (FAM) bez šest sekvencijalnih A baza, (iv) manje od dve
G i C baze u pet baza na 3‘ kraju, (v) sonde bi trebalo da budu što je bliže moguće prajmeru i (vi)
nikakve dodatne sekundarne strukture.
Kriterijum koji se koristi za dizajn PCR (real-time) prajmera je sledeći: (i) 18 do 30bp dužine,
(ii)40 do 60% GC sadržaja, (iii) bez A baza na 3‘ kraja, (iv) 50- do 150-bp amplikona, (v) bez izražene
strukture ukosnice, (vi) vezano za vrste koje se istražuju, (vii) optimalna grejna temperatura. Sve
prajmere je sintetizirao Shanghai Genecore Biotech (Shanghai, China).
Procena specifičnosti prajmera za Monilinia spp. u konvencijalnom PCR. Kako bi procenili
optimalnu temperaturu zagrevanja za svaki par prajmera, sproveden je PCR test sa temperaturama od
50 do 66°C. Po tri uzorka od svih vrsta Monilinia sp. su uzeta za početni PCR test. PCR test je
sproveden u fiksnoj zapremini od 25- μm i sadržao je 2.5 μm od 10× PCR bafera (TaKaRa Bio,
Dalian, Kina), 200μm od svakog dNTP, 0.4μM za prethodni i sledeći prajmer, 0.5U Ex Taq DNK
polimeraze i 20 do 30ng genomskog DNK. PCR testiranje je urađeno pod sledećim uslovima:
94°C ukupno tri minuta, 30 ciklusa od 94°C od po 30 sekundi, zagrevanje od 30 sekundi, i
72°C ukupno 40s, takođe 72°C ukupno 4 minuta. PCR testiranje je izvršeno u ABI 9902 96-
well pojačivaču (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Proizvod PCR testiranja je razdvojen
koristeći elektroforieazu u 2% agarozne gelove, koristeći Trisacetate EDTA bafer. Pojačani
proizvod sa tragovima etidium-bromida su vizualizovani i uslikani koristeći MultiImage Light
Cab-inet (Alpha Innotech Corporation, SAD). Specifičnost prajmera se ocenjena u
konvencijalnom PCR testiranju koristeći DNK iz 20 uzoraka svih šest patogena i drugih
fungalnih patogena koji nisu meta istraživanja. PCR testiranje je izvešeno kako je opisano u
prvom delu teksta, koristeći optimizovanu temperaturu.

Procena sonde PCR testiranja u realnom vremenu (real-time) i specifičnost i

osetljivost prajmera i sondi. Optimalne koncentracije sondi bile su bazirane na rezultatima
PCR testiranja za sedam razblaživanja (0.01 do 1.3 μM) za svaku od sondi. PCR testiranje je
sprovedeno u zapremini od 20-μl, u kojoj se nalazilo 10μl 2xTaqMan univerzalnog PCR
rastvora (Shanghai Genecore Biotech), 0.5μM prajmera suprotnog smera i 10-15 ng
genomskog DNK. Uslovi PCR testiranja su bili sledeći: 94°C na 3 minuta; 30 ciklusa 94°C na
po 30 sekundi, optimizovana temperatura zagrevanja na 30 sekundi i 72°C na 40 sekundi i
72°C na 4 minuta. PCR testiranje je sprovedeno u ABI 7500 96-well PCR instrumentu
(Applied Biosystems, U.S.A.).
Kako bi povećali efikasnost PCR testiranja, posebno su testirane specifičnosti sonde i
prajmera zagrevanjem do gore pomenutih temperatura. Slično konvencijalnom PCR
testiranju, specifičnost prajmera je takođe testirana za PCR u realnom vremenu, koristeći
DNK koji je preuzet od ciljanih patogena i drugih patogena koji nisu meta ove studije. PCR
testiranje je sprovedeno kako je opisano u prvom paragrafu ovog odeljka, kako bi se
optimiyovala sonda koncentracije. U prilog tome, specifičnost prajmera je testirana koristeći
smesu koja se sastojala od DNK šest Monilinia spp. i pet referentnih vrsta (npr.,
Botryosphaeria dothidea, Alternaria sp., Botrytis cinerea, C. Fructicola i Penicillium sp.). U
svakom od testova je korišteno 60-ng genomskog DNK, kao referenca.
Osetljivost metoda PCR testiranja u realnom vremenu (real-time) za Monilinia spp.
određena je serijom uzoraka sa progresivno umanjenom koncentracijom DNK. Sedam
razblaživanja uzorka (prilikom svakog je koncentracija umanjena 10 puta) iz DNK koji je uzet
iz samih gljiva (10 ng μl⁻¹ to 10 fg μl⁻¹) procenjen je koststeći tri ponavljanja za svaku od
procedura. Standardne krive koje su iscrtavale prag ciklusa (Ct) na y-osi, odnosno vrednosti
koncentracije DNK na x-osi su generisani kako bi procenili osetljivost. Efikasnost (E) ciljanog
pojačavanja je proračunata koristeći jednačinu E = (10¹/⁻ᵐ-1) × 100, gde je m = nagib
standardne krive(Ginzinger 2002).
U prirodnoj sredini, konidija Monilinia spp. je glavni uzročnik infekcije. Konidije su
preuzete i svake od vrsta Monilinia spp., osim M. fructicola, kako je opisao Zhu et al. (2014.) i
razblažena je do 10⁵ μl⁻¹ za naknadnu evaluaciju osetljivosti testova za detekciju konidije.
Konidijalni DNK je preuzet i korišćen za izradu standarnih krivih, kako je ranije opisano.
Efikasnost ciljanog pojačanja je proračunata i upoređena sa efikasnost za standardne krive,
koje se generišu koristeći DNK iz voćnjaka u kojima se gaji samo jedna kultura.
 Sposobnost uzoraka i biljaka da inhibiraju PCR testiranje je analizirana kako je opisao
Sikdar et. al. (2014). Konkretno, DNK na 2ng μl⁻¹, uzorkovan iz tkiva zdrave Fudži jabuke je
pomešan sa DNK iz patogenih gljiva (10 ng μl⁻¹ na 10fg μl⁻¹), kako bi se stvorio eksrakt
jabuke za standardnu krivu. Efikasnost ciljanog pojačanja u prisustvu nativnog ekstrakta je
proračunat kako je prethodno opisano i upoređen sa efikasnošću standardne krive, koja je
generisana koristeći DNK razblažen u vodi.
Validacija PCR testiranja u realnom vremenu koristeći veštački inokulirane
jabuke. Plod jabuke je inficiran koristeći metodu koja je ranije objavljena u naučnoj studiji
(Zhu et al. 2016). Konkretno, zrela Fudži jabuka je pažljivo oprana u vodi iz vodovoda, zatim
je površina sterilizovana 15 minuta, koristeći 0.128% NaClO, zatim isprana tri puta sterilnom,
destilovanom vodom. Svaki plod je zatim uboden ekserom (2mm u precniku i 3mm dubine).
Micelijski čep (5mm u prečniku) je isečen sa ugla PDA kolonije koja je bila aktivna 6 dana i
dodat je u jabuku. Inficirana jabuka je stavljena na donji deo Petri suda i stavljena u plastičnu
posudu na sobnoj temperaturi (24.5± 2°C). Po pet ponavljanja je analizirano za svaki od
uzoraka, sa po jednim plodom po ponavljanju. Četiri dana nakon inokulacije, PDA čepovi (sa
ili bez hife) su izvađeni iz plodova. Plod je nakon toga sterilizovan spolja za 75% etanola,
posle čega je uzrorkovan DNK iz komada 5- do 8-cm², izmeren i analiziran koristeći PCR u
realnom vrmenu, kao što je prethodno obajšnjeno. Kako bi izolovali patogene odgovorne za
primećene simpotome bolesti, komad tkiva simptomatskog ploda je preuzet sa plodova čija je
površina sterilizovana, koristeći sterial skalpel i stavljen na PDA. PDA sudovi su inkubirani na
25°C u tamnoj sredini 3-5 dana. Patogene gljive su identifikovane prema pojedinačnim
karakteristikama i rezultati su upoređeni sa rezultatima PCR testiranja u realnom vremenu.

Rezultati

Prajmeri i sonde dizajnirani u ovoj studiji. Jedan par prajmera i proba je dizajniran za svaki
od patogena. Prajmeri i sonde za M. fructicola, M. laxa, M. fructigena i M. polystroma su dizajnirani
prema sekvenci 2 lakazna gena, dok su prajmeri i sonde za M. yunnanensis i M. mumecola dizajnirani
prema elongaciji faktorskog gena. Sonde za 6 vrsta Monilinia spp. su označene koristeći FAM, na 5‘ od
kraja. Kraj od 3‘ je obeležen sa MGB, osim kod sonde za M. fructiocola, koja je sadržala BHQ (Tabela
2)
Temperatura zagrevanja i specifičnost prajmera koji su korišćeni tokom konvencijalnog
PCR testiranja. Temperature zagrevanja za svaki od posebno dizajniranih prajmera bile su na 59-62°C
(tabela 2). Parovi prajmera za M. fructicola, M. laxa, M. fructigena, i M. mumecola su posebno pojačali
ciljano područje u svim testiranim uzorcima. Uz to, ovi parovi prajmera su se razlikovali od vrste do
vrste (odnosno, nisu se međusobno pojačavali). Ipak, pored vrsta koje su meta ovog istraživanja,
prajmeri dizajnirani za M. yunnanensis i M. polystroma su takođe pojačavali sekvence ostalih vrsta.
Ova dva para prajmera nisu pojačala sekvence drugih gljiva.
 Specifičnost i osetljivost setova prajmera pri PCR testiranja u realnom vremenu. Analize
različitih ispitanih rastvora su otkrile da je idealan koncentracija za uzorak pri PCR testiranju u realnom
vremenu između 0.2 i 1.0 μM (tabela 2). Parovi prajmera i uzorci svih 6 Monilinia spp. pojačanih
DNK iz pojedinačnih izvora ili više izvora ciljanih patogena sa Ct vrednostima manjim od 30
(Slika 2). Proizvodi pojačavanja nisu preuzeti niti su Ct vrednosti prešle 35 kada su parovi
prajmera i uzorci korišteni za analizu patogena koji nisu obihvaćeni ovom studijom. U prilog
tome, nije korišćeno pojačavanje kada je DNK iz ostalih patogena korišćen u PCR testiranju u
realnom vremenu. Na istoj temperaturi od 59°C, setovi prajmera za M. fructicola, M.
fructigena, M. laxa, M. mumecola, i M. yunnanensis su pojačali svaku od ciljanih sekvenci sa
Ct vrednošću manjom od 30.
Limiti detekcije za PCR u realnom vremenu za DNK iz monokulturalnih voćnjaka koji su
sadržali miceliju i konidiju bili su 10 do 100fg, gde je najniža Ct vrednost bila 20 (tabela 2).
Limit detekcije za svih šest vrsta bio je ekvivalentan onome kod sedam konidija (slika 3). U
prilog tome, limit detekcije za PCR testiranje u realnom vremenu bio je 10 do 100 fg za pet od
šest istraženih gljiva, kada je DNK iz tkiva jabuke dodat. Jedini izuzetak je bila M. fructigena,
čiji su prajmer i sonda imali limit detekcije od 1pg. Nije bilo pojačavanja DNK za PCR
testiranje sprovedeno koristeći genomski DNK iz tkiva zdravih jabuka. Efikasnosti PCR
testiranja u realnom vremenu proračunate koristeći pročišćen gljivični DNK u vodi ili isti DNK
pojačan uzorkom DNK iz ploda jabuke bio je 90 do 110% za svih šest vrsta. Ni kod jednog od
posebnih setova prajmera nije bilo reakcija sa drugim vrstama patogena i nemamo razloga da
verujemo da je dolazilo do reakcija kada smo testirali za ostale patogene, koji nisu
obuhvaćeni ovom studijom ili iz tkiva jabuke.

Detekcija Monilinia spp iz inficiranih plodova jabuke. PCR testiranje u realnom

vremenu koristeći DNK uzorkovan iz tkiva jabuke, zaražen posebnom vrstom Monilinia spp.,
pokazao je da se pojačavanje Ct vrednšću manjom od 30 desilo samo sa DNK koji je preuzet
iz tkiva jabuke sa vidljivim simptomima smeđe buđi. U prilog tome, prajmeri i sonde su bili
određeni za jednu od vrsta patogena, pa su tako omogućili identifikaciju patogena koji je
odgovoran za simptome. Nikakvo pojačavanje nije uočeno sa Ct vrednošću manjom od 35,
kada je korišćen DNK iz tkiva zdravog ploda jabuke. Svaka od gljiva je reizolovana iz svake
od inficiranih jabuka, koristeći metodu izolovanja tkiva i rezultati su bili konzistentni sa onima
dobijenim PCR testiranjem.

Diskusija

Prajmeri i sonde u PCR testiranju u realnom vremenu za M. fructicola, M. laxa, M. fructigena, M.

mumecola, M. yunnanensis, and M. polystroma su dizajnirane prema razlikama u sekvencama u lakazi
ili elongacionom faktoru gena. TaqMan PCR testiranje u realnom vremenu koje je razvijeno u ovoj
studiji je precizno identifikovalo svih šest vrsta Monilinia spp., koristeći DNK iz voćnjaka sa samo
jednom kulturom, mešavine ciljanih i neciljanih gljivičnih DNK ili DNK iz inficiranih jabuka.
Oovo je prvi izveštaj koji opisuje brzu i preciznu identifikaciju svih šest blisko srodnih
Monilinia spp. koristeći TaqMan PCR testiranje u realnom vremenu, koji se bazira na lakazi i
elongacionom faktoru gena. Prethodno opisani metodi su samo mogli da identifikuju četiri vrste
Monilinia spp. od jednom, i bili su zasnovani na univerzalnom PCR testu (Cotˆ e et al. 2004; ́Gell et al.
2007; Hily et al. 2011; Hu et al. 2011; Miessner i Stammler 2010), ili PCR testu u realnom vremenu
(Fan et al. 2014; Garcia-Benitez et al. 2017; Papavasileiou et al. 2016; Van Brouwershaven et al. 2010).
Prajmeri koji su korišćeni u prethodnom PCR testiranju radi identifikacije Monilinia spp. su
dizajnirani uglavnom prema jedno-nukleotidnim polimorfizmima. Nasuprot tome, bilo je više razlika u
lakaznoj genetskoj sekvenci između Monilinia spp. koje su korišćene da bi se razvio univerzalni PCR
test za identifikovanje pet od šest Monilinia spp. (Zhu et al. 2016). U ovoj studiji, mi smo pokušali da
dizajniramo PCR prajmere i sonde za svih šest vrsta prema sekvenci lakaznog gena, odnosno njihovim
razlikama. Ipak, ove razlike nisu bile dovoljne za dizajn prajmera i sondi radi razlikovanja M.
mumecola i M. zunnanesnsis. Prema tome, elongacioni genetski faktor, u kom se polimorfizam javlja
uglavnom u jednom predelu (Niu et al. 2016), je izabran za dizajn prajmera i sondi za ove dve vrste.
Dizajnirani prajmeri i sonde napravljeni su posebno za svaku od vrsta, o čemu svedoči
nedostatak pojačavanja kod drugih patogena, koji nisu bili uključeni u ovu studiju. U prilog tome,
prajmeri i sonde su posebno skrojeni za svaku od vrsta i bili su osteljivi na uzorke koji sadrže DNK iz
ciljanih i neciljanih patogena, ili za DNK iz ciljanih gljiva i ploda jabuke. Vredi dodati da su uzorci
Monilinia ispitani u ovoj studiji bili iz Kine, USA, Japana, Francuske, Italije i Engleske, države u
kojima je smeđa buđ široko rasprostranjena. Test efikasnosti PCR testiranja u realnom vremenu
izračunata koristeći pročišćen gljivični DNK u vodi i isti DNK koji je pojačan sa DNK iz ploda jabuke
je pokazao efikasnost od 90-110%. Limit detekcije PCR testiranja u realnom vremenu iz obe vrste
uzorka bio je 10 do 100fg i nikakvo pojačavanje nije uočeno Ct vrednostima ispod 35, kada je korišćen
DNK iz zdravog ploda jabuke. Ovi rezultati sugerišu da je metod koji smo razvili za ovu studiju
sposoban da razlikuje svaku od vrsta Monilinia spp., kao i da DNK iz jabuke ne utiče na rezultate PCR
testiranja.
Metod PCR testiranja razvijen za ovu studiju je potvrđen samo kada se radi sa DNK iz
inficiranih jabuka, koje imaju simptome smeđe buđi i DNK iz tkiva zdravih plodova jabuke. Nisko
koristili inficirane plodove jabuke bez simptoma smeđe buđi (sa latentnim infekcijama). Budući da je
limit detekcije svih šest vrsta bio ekvivalentan jednoj do sedam konidija i limite detekcije je bio između
10 i 100fg za pet od 6 ispitanih gljiva, kada je DNK iz tkiva jabuke dodat, PCR test u realnom vremenu
nije imao potencijal da detektuje latentne infekcije Monilinia spp u plodu jabuke. Prema tome, može se
koristiti za testiranje jabuka namenjenih uvozu ili izvozu na pristustvo štetnih patogena.