УНИВЕРЗИТЕТ У ПРИШТИНИ

ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ- ЛЕШАК

СЕМИНАРСКИ РАД

ДИЈАГНОЗА БИЉНИХ ПАТОГЕНА

ВИРУСНА ОБОЉЕЊА ВИНОВЕ ЛОЗЕ И НАЧИНИ ЊИХОВЕ

ДЕТЕКЦИЈЕ

Професор: Студент:

Проф. др Славиша Гуџић Никола Димић, 04/21

Лешак, 2021.
 САДРЖАЈ

УВОД.........................................................................................................................1

1. ВИРУС ИНФЕКТИВНЕ ДЕГЕНЕРАЦИЈЕ ВИНОВЕ ЛОЗЕ (GFLV)........2

1.1. ДЕТЕКЦИЈА ВИРУСА ИНФЕКТИВНЕ ДЕГЕНЕРАЦИЈЕ ВИНОВЕ
ЛОЗЕ….......................................................................................................................3

1.1.1. Серолошка тестирања – ЕЛИСА тест у детекцији GFLV.............................3

1.1.2. Молекуларна тестирања – RT – PCR, qRT – PCR. у детекцији GFLV..........4
1.1.3. Узимање и руковање узорцима винове лозе на присуство GFLV.................6
2. УВИЈЕНОС ЛИСТА ВИНОВЕ ЛОЗЕ ПРИДРУЖЕНИ ВИРУС 3
(Grapevine leafrollassociated virus 3, GLRaV-3)...........................................6
3. А-ВИРУС ВИНОВЕ ЛОЗЕ (Grapevine virus A, GVA)................................9
4. ИЗВОР ВИРУСА И ДЕТЕКЦИЈА..............................................................10
4.1. Оснивање колоније штитастих ваши и детерминација.....................................11

4.2. Пренос вируса штитастим вашима.....................................................................12

4.3. ELISA.....................................................................................................................12

4.4. RT- PCR................................................................................................................14

4.5. Резултати истраживања........................................................................................15

5. ЗАКЉУЧАК..................................................................................................16
6. ЛИТЕРАТУРА..............................................................................................17
 УВОД

Винова лоза (Vitis vinifera L.) је врста велике агрономске важности, највише са
аспекта производње вина. Патогени који паразитирају на виновој лози, смањују приносе и
чине велику штету винској индустрији. Саднице винове лозе заражене вирусима дају
знатно лошију сировину за производњу вина и скраћују животни век винограда.
Продуктивни век винограда услед инфекције вирусом инфективне дегенерације винове
лозе (Grapevine fanleaf virus- ГФЛВ) износи 15-20 година уместо 30-40 или више. Квалитет
грожђа је смањен због ниже концентрације шећера и повећане укупне киселости, а
економски губици износе чак и до 80% (Andret-Link i sar ., 2004), односно 100% (Raski i
sar., 1983; Диклић, 2014). Према EPPO (2018) сертификационој шеми и Правилнику о
здравственом прегледу усева и објеката за производњу семена, расада и садног материјала
и здравственом прегледу семена, расада и садног материјала (“Сл. гласник РС” 2008),
сертификован садни материјал винове лозе мора бити слободан од свих вируса. Најчешће
присутни и економски најзначајнији вируси на виновој лози су: Grapevine fanleaf virus
(GFLV), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) и А-вирус винове лозе (Grapevine
virus A, GVA).

Велики проблем у пољопривредној производњи представља сузбијање вирусних

зараза и спречавање њихове појаве. Наиме, један од главних разлога је што хемијске мере
које су делотворне код других проузроковача биљних болести нису ефикасне у сузбијању
вирусних зараза. Једном заражене биљке остају трајно заражене. Стога, најзначајнији вид
борбе против фитопатогених вируса јесте производња здравог, безвирусног садног
материјала. У стварању здравог биљног материјала користе се методе као што су
хемотерапија, термотерапија и култура меристема. Иако су наведене мере показале
позитиван ефекат у производњи здравог безвирусног биљног материјала, неопходно је
прибећи мерама испитивања садног и сетвеног материјала на економски значајне вирусе и
пре подизања засада (Bagi i sar., 2016).
 1. ВИРУС ИНФЕКТИВНЕ ДЕГЕНЕРАЦИЈЕ ВИНОВЕ ЛОЗЕ
(GFLV)

Вирус инфективне дегенерације винове лозе (GFLV) један је од најзначајнијих

вирусних болести винове лозе широм света. Такође је један од најстарије познатих
вирусних болести V. vinifera са описима симптома, који су пријављени у Европи још 1841.
године (Fuchs i sar., 2009). GFLV припада реду Picornavirales, фамилији Secoviridae, роду
Nepovirus. Домаћин вируса је винова лоза, а вештачким инокулацијама се може пренети на
експерименталне домаћине (Баги и сар., 2016). Вирус се раширио у све регионе гајења
винове лозе путем зараженог садног материјала. Преноси се и калемљењем. За локално
ширење вируса одговорна је пре свега нематода Xiphinema index , а као повремени вектор
се наводи и X. italiae (Cohn et al., 1970). Према Lázár et al . (1990) вирус се преноси
семеном винове лозе, те сејанци могу бити заражени. Симптоми обухватају морфолошке и
хроматске промене (Maliogka et al., 2015). Вирус је добио име по променама на лискама
заражене винове лозе, које губе карактеристичан облик за дату сорту, па настају промене у
облику које се крећу од першунавости до лепезавости листова, односно потпуног
нестајања режњева. На листовима се могу образовати и енације. Услед хипоплазије долази
до скраћивања интернодија на ластарима винове лозе, што проузрокује приближавање
коленаца и њихово спајање (двојна коленца). Ластари често имају неправилан „цик-цак“
пораст. Може доћи и до абнормалног гранања и пљоснатог облика пресека стабла. Услед
заразе настаје и посебна патолошка творевина у ткиву ксилема, „ендоваскуларни кордон“,
који представља здрвењену траку ткива у судовима. Формира се мањи број гроздова који
су рехуљави, са проређеним ситним бобицама. Бобице неравномерно сазревају. Садржај
шећера у бобицама је умањен. Хроматске промене се најчешће карактеришу жутим
мозаиком или жућењем листова, које је израженије током пролећа, него у каснијем делу
вегетације. Код заражених чокота корен је слабије развијен и са мањим бројем жилица.
Губици у приносу зависе од сорте, соја вируса и еколошких чинилаца и могу бити умерени
(5-10%) до веома високи (преко 90%). Вирус смањује успешност срастања подлоге и
племке, као и укорењивање садница (Martelli et al., 2001).
 1.1. ДЕТЕКЦИЈА ВИРУСА ИНФЕКТИВНЕ ДЕГЕНЕРАЦИЈЕ
ВИНОВЕ ЛОЗЕ

У циљу успешне и поуздане детекције GFLV, за препоруку је примена

лабораторијских метода које се заснивају на детекцији протеина вирусних честица –
ЕЛИСА тест или нуклеинских киселина –RT-PCR и qRT-PCR. Примена ових метода
посебно је значајна у случају латентних инфекција винове лозе, када не наступа појава
симптома болести. Како се ради о вирусним обољењима, тачну дијагнозу није могуће
одредити на основу симптома, већ само коришћењем адекватних серолошких или
молекуларних лабораторијских метода (Weber i sar., 2020).

1.1.1. Серолошка тестирања – ELISA тест у детекцији GFLV

Ензимски имуноадсорбциони тест ((Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) је

први пут описана 1971 од стране Engvall и Perlmann (1971) и Van Weemen и Schuurs (1971).
Након иницијалног описивања бројни научници користе ову методу, прилагођавају је
специфичним потребама чиме се стварају бројне варијације (Aydin, 2015). Свака ELISA
метода заснива се на хемијској интеракцији између антигена и антитела. Двоструки
сендвич антитела ELISA (Double antibody sandwich- ELSIA, DAS-ELSIA) је најчешће
коришћена метода за детекцију вируса у биљним ткивима (Clark i Adams, 1977). Код ове
методе циљани антиген бива заробљен између два антитела (налази се у сендвичу) одакле
назив метода води порекло. На самом почетку површина бунарчића микротитар плоче се
облаже одговарајућим антителима (Anti-GFLV-IgG) након чега се додаје узорак и
инкубира одређени временски период зависно од произвођача реагената. Током
инкубације долази до реакције између антигена и антитела и њиховог међусобног
везивања. Вишак невезаних антигена из узорка се одстрањује испирањем микоротитар
плоче. У следећем кораку додају се антитела која су обележена ензимом (Anti-GFLV-IgG-
AP-conjugate). Микротитар плоча се поново инкубира и испира, након чега се додаје
субстрат, најчешће диетаноламин. У случају да је дошло до реакције антиген-антитело,
долази до промене боје смеше услед реакције између ензима (алкална фосфатаза) и п -
нитрофенилфосфата (PNPP), а интензитет обојености се одређује помоћу
спектрофотометра (Aydin, 2015; Sakamoto i sar. 2018) Појава жуте боје указује на
присуство вируса, док се на основу вредности очитавања на спектрофотометру доноси
коначан закључак. Узорак се сматра позитивним (зараженим) уколико је очитана вредност
апсорпције бар два пута виша од очитане вредности негативне контроле.

1.1.2. Молекуларна тестирања - RT-PCR, qRT-PCR. у детекцији GFLV

Ланчана реакција полимеразе (Polymerase Chain Reaction, PCR) је лабораторијска

техника која представља процес репликације DNK in vitro. Kary B. Mullis је 1983 поставио
теоријске основе методе за умножавање DNK, а 1986 први пут описује детаље и сваки од
корака PCR методе (Mullis i sar., 1986; Mullis i Faloona, 1987). За ово револуционарно
откриће Др. Mullis је 1993. године добио Нобелову награду за хемију. PCR метода се
користи за умножавање циљане секвенце DNK што се постиже применом
олигонуклеотидних прајмера која се везују са супротне ланце DNK молекула и на тај
начин оивичавају регион од интереса (Erlich, 1989). Кључну улогу у умножавању DNK
игра ензим DNK полимераза која користи слободне деоксинуклеотиде (dATP, dCTP, dTTP
i dGTP) и формира нови ланац почевши од специфичних прајмера (Garibyan i Avashia,
2013). Амплификација циљаног фрагмента DNK се постиже кроз серију цикличних
загревања и хлађења реакционе смеше: 1. загревање реакционе смеше најчешће на 94-95 ° C
чиме се раздвајају ланци DNK молекула (денатурација); 2. хлађење реакционе смеше (50-
60° C) услед чега долази до везивања прајмера (анилинг); 3. поновно загревање на 72 ° C
како би DNK полинераза (Таку полимераза) синтетисала нови DNK ланац (екстензија)
(Caetano-Anollés, 2013). PCR је техника која се данас користи у готово свим областима
биолошких истраживања, биотехнологији, клиничким истраживањима, клиничкој
дијагностици, форензици, прехрамбеној технологији, испитивањима животне средине,
археологији, антропологији, али и у дијагностици фитопатогених организама (Wages,
2005). Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (qRT-PCR)
представља модификацију стандардне PCR методе која се огледа у томе што се у
реакциону смешу додају флуоресцентно обележене пробе чија је секвенца комплементарна
циљаном локусу који се налази између пара прајмера. Проба на свом 5’ крају има
флуоресцентну боју коју називамо “репортер” (reporter, R), а на свом 3’ крају
“пригушивач” (quencher, Q). Количина емитованог флуоресцентног сигнала је у директној
пропорцији са количином умножене DNK (Holland i sar., 1991; Butler, 2012; Nestorov i sar.,
2013). Овим је омогућена квантификација умноженог DNK фрагмента, а самим тим могуће
је одредити и његову заступљеност у узорку што је чини погодном за рутинску дијагнозу и
детекцију патогена (Trujillo i sar., 2006; Bruisson i sar., 2016). RT-PCR i qRT-PCR су веома
успешно примењене у детекцији GFLV вируса у неколико истраживања, а детаљи о
прајмерима и флуоресцентним пробама дати су у табели број 1.

Табела број 1. Прајмери и пробе за RT-PCR и qRT-PCR детекцију GFLV

Prajme/ Sekvenca Gen Veličina Referenca

Proba produkta
F ATGCTGGATATCGTGACCCTGT (Gambino i
Gribaudo,
2006)
R GAAGGTATGCCTGCTTCAGTGG RdRP 118
F GGGACCACTATGGATGGAATGA
R TTCGGTGATATGGAGAGCGAAT
P TAMRA- CP 151 Osman i
AAGTATCCCGGGGTGTATGTGGAAGAGGA- Rowhani,
FAM 2006
F AGCTGCGGCACTYTTTGC
P1 FAM-TGCTCAARCATACCACTTG-MGB
P2 FAM-ATGCTTAARCATACCACTTG-MGB HP 128 Čepin i
Sar.,2010
R TCATCACTRGTGTCATACCACTTCCT
F GGTWTRTTCGGGCCAYTGT
R TYATCACTRGYGTCATACCACTTCC HP 181 Bruisson i
Sar., 2016
P ROX-GGGANGAGTCGAGAGCTGCGGCA-
BBQ
F- forward prajmer, R- reverse prajmer, P- proba, CP- coat protein, HP- homing protein, RdRP –
RNK zavisna RNK transkriptaza

1.1.3. Узимање и руковање узорцима винове лозе на присуство GFLV

Узимање узорака са одређених делова биљке у одређено доба године повећава

поузданост тестирања. За детекцију GFLV узимају се листови и младари, а касније у
лабораторији се издвајају лисни нерви и петељке, док се са младара узима ткиво испод
коре (ксилем, флоем), јер се у овим биљним деловима очекује највеће присуство вируса.
Узорци се могу узимати од кретања вегетације па све до појаве првих мразева. За
поузданост тестирања битно је и правилно руковање и достављање узорака лабораторији.
То подразумева правилно паковање и обележавање узорака. Сакупљени, запаковани и
шифрирани узорци би се требали доставити у лабораторију у што краћем временском
року. Уколико су узорци били изложени неумереној врућини, сушењу или су предуго
чувани, могућност за добијање поузданих резулата се смањује. Приликом узимања узорака
винове лозе, пожељно је тестирање већег броја узорака. Број узорака за тестирање којима
подлеже винова лоза дефинисан је Правилником о здравственом прегледу усева и објеката
за производњу семена, расада и садног материјала и здравственом прегледу семена, расада
и садног материјала (“Сл. гласник РС” 2008), који подразумева да се од укупног броја
чокота, тестира 10%.

2. УВИЈЕНОС ЛИСТА ВИНОВЕ ЛОЗЕ ПРИДРУЖЕНИ ВИРУС 3

(Grapevine leafrollassociated virus 3, GLRaV-3)

GLRaV-3 се сматра најзначајнијим чланом и главним узрочником комплекса

болести увијености листа винове лозе (GLD), уз још четири преостала вируса. По свом
утицају на производњу грожђа, сврстава се у исту категорију са најважнијим гљивичним
болестима винове лозе, као што су пепелница (Uncinula necator) или пламењача
(Plasmopara viticola). Овај вирус се преноси вегетативним размножавањем, а уз то припада
породици Closteroviridae, која се с обзиром на могућност векторског преноса, дели на
четири рода. Тако овај вирус припада роду Ampelovirus који се успешно преноси
штитастим вашима. Према Балтимореовој класификацији припада шестој групи вируса
који садрже једноланчан +RNA молекул као нуклеинску киселину, познати и као
ретровируси. Изглед честица је нитаст и врло издужен, у распону од 1400 - 2000 nm те је
други највећи од свих описаних биљних вируса (Слика 1.). Тренутно је описано осам
различитих филогенетских група које припадају GLRaV-3, али још увек није познат њихов
индивидуални допринос развитку комплекса болести увијања листа винове лозе (GLD)
(Meng i sar., 2017).

Слика 1. Негативно контрастне честице GLRaV-3 вируса под светлосним микроскопом

(Извор: https://www.researchgate.net/figure/Transmission-electron-micrograph-of-negatively-
stained-purifiedGLRaV-3-particles-using_fig6_236173215)

Већина сорти винове лозе (Vitis vinifera L.) је осетљива на GLRaV-3 и након
инфекције показују типичне симптоме GLD-а, који се већином јављају касније током
вегетације без обзира на присуство вируса у дужем временском периоду у биљци, а могу
се заменити са неким гљивичним болестима, попут црвене палежи винове лозе
(Pseudopeziza tracheiphila). Типични симптоми су међупросторно црвенило листова и
некроза са увијање листова код црних сорти (Слика 2.) и хлоротичне пеге на листу са
његовим увијањем код белих сорти (Слика 3.).

Главни ефекти на производњу се манифестују кроз: смањени принос (5 до 70%),

слабију бујност винове лозе (20 до 70%), одложено сазревање грожђа и грожђе лошијег
квалитета (шећер: 0 до - 2,5 Brix°, киселине: 0 до + 1,5 g / l). Нека истраживања спроведена
у Њујорку (САД) показују да се економски губици због инфекције овим вирусом крећу од
25.000 до 40.000 долара по ha / година (Fuller i sar., 2015).

Слика 2. Типични симптоми GLRaV-3 Слика 3. Типични симптоми GLRaV-3

на листу црних сорти винове лозе на листу белих сорти винове лозе

(Извор: https://www.frontiersin.org/files/Articles/45092/fmicb-04-00082-HTML/image_m/
fmicb-04-00082-g001.jpg)
 3. А-ВИРУС ВИНОВЕ ЛОЗЕ (Grapevine virus A, GVA)

Према (Mengu i sar. 2017) GVA је један од припадника рода Vitivirus који је
узрочник комплекса боре од дрвета. Осим што има исти тип нуклеинске киселине као
GLRaV-3, једноланчане + RNK молекула, честица овог вируса је такође нитасто издужена,
али много краћа (дужина 700 nm и пречника 12 nm) (Слика 4.) и поред вегетативне
трансмисије, може се преносити векторски, штитастим вашима.

Слика 4. Негативно контрастне честица GVA вируса под електронским микроскопом.

Ознака представља 100 nm.

(Извор: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/positive-sense-rna-viruses2011/
w/posrna_viruses/242/betaflexiviridae-figures)

Симптоми синдрома бора на дрвету се манифестују на централном цилиндру трупа,

ткиву камбијум и кора, у виду отицања и финоће ткива (Слика 5.) младих садница након
пресађивања, пуцање коре са мање или више израженом пролиферацијом и ломљењем
дрвета (Слика 6.). И док су учинци GLRaV-3 на принос винове лозе истражени и описани,
учинци GVA на принос још нису потпуно разјашњени.
Слика 5. Здраво дрво (лево) и симптом Слика 6. Плутавост коре након убризгавања
удубљења дрвета (десно) након инфекције вируса из рода Vitivirus

вирусом из рода Vitivirus

(Извор: https://www.google.com/search?q=zdravo+drvo+(lijevo)+i+simptom+jami
%C4%8Davosti+drveta+(desno)
+nakon+infekcije+virusom+iz+roda+vitivirus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwi
Gq8ixwN70AhX4RPEDHdlqBZ0Q_AUoAXoECAEQAw&biw=1280&bih=689&dpr=1#imgrc=
bLKK7LC-4JW3dM)

4. ИЗВОР ВИРУСА И ДЕТЕКЦИЈА

Као извор GLRaV-3 и GVA вируса коришћена је биљка винове лозе Влашка која је део
институционалне „in vivo” колекције под интерном шифром VVL-112 (Слика 7.).
Присутност оба вируса потврђена је ензимско-серолошком методом на чврстој фази ((eng.
enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) и методом ланчане реакције полимеразом
након обрнутог преписивања (eng. reverse transcription polymerase chain reaction, RT- PCR).
Детаљнији опис обе методе налази се у наставку. Од ове матичне биљке добијене су
саднице заражене вирусом које су касније коришћене у поступку векторског преноса.

Слика 7. Биљка винове лозе сорте Влашка (VVL-112) употребљена као извор GLRaV-3 и
GVA

(Извор: M. Poletti Kopešić)

4.1. Оснивање колоније штитастих ваши и детерминација

За потребе векторског преноса вируса коришћена је лозна штитаста ваш

(Planococcus ficus) која је присутна и у нашим виноградарским крајевима. Једна женка ове
врсте пренета је на тиквицу познатију под именом „Butternut“ тиква (Cucurbita
moschata),где је основала своју колонију ваши. Ткива су са вашима држана у стакленом
суду са перфорираном мрежицом на врху која је омогућавала довод ваздуха, али и
онемогућавала излазак ларви (Слика 8.).

Пре поступка преноса вируса, обављена је детерминација врсте коришћењем 10

јединки различитих развојних стадијума из којих је изоловна DNK коришћењем DNeasy
Plant мини кит (Qiagen, SAD), а сама детерминација спроведена је помоћу PCR методе
према протоколу (Daane i sar. 2011).
 У истраживању су коришћене само ларве првог стадијума, јер имају највећу
покретљивост и капацитет исхране свих осталих стадијума, показују највећи векторски
капацитет за проучаване вирусе.

Слика 8. Колонија штитастих ваши (P. ficus) на врсти Cucurbita moschata у стакленој
посуди

(Извор: https://repozitorij.agr.unizg.hr/islandora/object/agr%3A1259/datastream/PDF/view)

4.2. Пренос вируса штитастим вашима

Сви тестови векторског преноса као и детекције вируса у биљкама рађени су у виролошкој
лабораторији. Они се пре свега односе на спречавање контаминације тестиране колоније
штитастих ваши другим популацијама, као и адекватно третирање инокулисаних биљака
инсектицидом и њихово даље изоловање на тестирање на вирусе.

4.3. ELISA

За потребе детекције вируса ELISA методом измерено је 0,1 г биљног ткива (углавном
петељке листа) (Слика 17.) које је уситњено у малтеру уз помоћ течног азота коришћењем
лупања у фини прах. Здробљено биљно ткиво је коришћено као потенцијални извор
антигена у детекција коришћењем ELISA прибора из Агритеста (Валенцано, Италија). У
откривању и једног и другог вируса, коришћена је метода двоструког антитела и сендвича
и сви кораци испитивања су обављени према упутствима произвођача (слике 18 - 20).
Резултати методе ELISA очитани су на спектрофотометру ELX800 (Биотек, САД) два сата
након додавања супстрата на таласној дужини од 405 nm (Слика 21.).
Спектрофотометријска очитања најмање три пута већа од просека вредности негативних
контрола су сматране позитивним. Код ELISA-позитивних узорака присутност GLRaV-3 и
GVA додатно је проверена методом RT-PCR.

Слика 17. Одређена маса биљног материјала Слика 18. Узорци биљног ткива спремни

за детекцију вируса за уситњавање коришћењем течног азота

(Извор: https://repozitorij.agr.unizg.hr/islandora/object/agr%3A1259/datastream/PDF/view)

Слика 19. Узорак у епрувети са Слика 20. Припрема узорака за испитивање

ELISA кодом биљака методом ELISA

(Извор: Исто)
 Слика 21. Спектрофотометар ELX800 (Биотек, САД)

(Извор: Исто)

4.4. RT-PCR

За потребе RT-PCR реакције, уситњени узорци стављени су на центрифугирање на 10 мин

при брзини од 16000 окретања/мин (центрифуга 5415 Р, Еппендорф, Немачка). Након тога
8 µl супернатант помешано је са 100 µl пуфера за денатурацију - GES (7.51 g/l glicina, 0.05
M NaCl, 0.001 M EDTA, 0.5 % Triton X, pH 9,0), након чега је уследила денатурација у
термоциклеру (Еппендорф, Немачка) на 95°C у трајању од 10 минута. Један микролитар
денатурисане RNK је коришћена у ланчаној реакцији полимеразе након обрнутог
преписивања (RT-PCR) при реакционој запремини од 10 µl, при чему се реакцијска смеша
састојала од: 5.8 µl микробиолошки чисте воде, 0.4 µl dNTP (10 µM), 0.6 µl сваког прајмера
(10 µM), 0.4 µl ензимске смеше и 1 µl реакционог пуфера. За откривање вируса коришћени
су следећи иницијали: GLRaV-3 Glr3s: 5'-GCGTCGTTGTTGAACAGAT-3' i Glr3as: 5'-
GTACTTCACACCAACCTTCATC-3' (Saldarelli, лични контакт) а за GVA H587: 5'-
GACAAATGGCACACTACG -3' i C995: 5'- AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG -3' (Minafra i
Hadidi, 1994), где су очекивани производи били величине 150 и 430 базних парова (пб).
RT-PCR услови реакције коришћењем опреме за RT-PCR у једном кораку (Киаген, САД)
биле су следеће: обрнутa транскрипција 50°C 30 мин, почетна деактивација 95°C 15 мин;
35 понављања: денатурација 94 ° C 1 мин, почетна адхезија 55 ° C 30 с, издуживање ланца
72 ° C 1 мин; завршено издужење ланца 72 ° C у трајању од 10 мин. Добијени производи су
визуелизовани електрофорезом на 1,5% агарозном гелу за 60 мин на 70 V / cm. У гел је пре
хлађења и просипања додата једна кап ГелРед течности (Олеруп, Шведска). Након
електрофорезе, гел је пребачен у УВ трансилуминатор (Био-Рад, САД) и снимљено
камером, а слика је пребачена у црно-белу верзију.

4.5. РЕЗУЛТАТИ ИСТРАЖИВАЊА

Пренос вируса векторским путем од инфициране лозе на корове/тест биљке доказан је

методом ЕЛИСА, а касније потврђен методом RT-PCR. Испитивања су показала различиту
осетљивост корова/тест биљака на GLRaV-3 и GVA, односно различит спектар њихових
потенцијалних домаћина.
 5. ЗАКЉУЧАК

Вирусни патогени се сматрају важним узрочнцима биљних болести широм света.

На виновој лози паразитирају на бројним вирусима, али не захтевају све економски
оправдане мере за њихову контролу. Вирус инфективне дегенерације винове лозе (GFLV)
је један од економски најважнијих вируса који инфицира винову лозу. Инфекција овим
вирусом узрокује брз губитак виталности биљке, смањен пораст винове лозе и принос
грожђа. Вирус се преноси нематодама Xiphinema index и Xiphinema longidorus. Ширење на
веће удаљености је условљено зараженим садним материјалом винове лозе. Због тога је
веома важно примењивати све расположиве и поуздане серолошке и молекуларне методе
детекције на присуство GFLV у садном материјалу винове лозе. Технике детекције GFLV
описане у овом раду, омогућавају ефикасну контролу садног материјала винове лозе и већу
сигурност у промету здравог садног материјала. Вирус 3 повезан са увијањем винове лозе
(GLRaV-3), који се сматра најважнијим чланом и главним узрочником болести увијања
листова винове лозе (GLD) и А-вирус винове лозе (Grapevine virus A, GVA), који припада
комплексу удубљења дрвета, економски су важни вируси распрострањени у свим
виноградарским регионима света. Ови вируси на виновој лози изазивају низ симптома који
имају квантитативни и квалитативни утицај на принос.
 6. ЛИТЕРАТУРА

1. Andret-Link, P., Laporte, C., Valat, L., Ritzenthaler, C., Demangeat, G. et al.. (2004):
Grapevine fanleaf virus: Still a major threat to the grapevine industry. Journal of Plant
Pathology 86 (3), 183-195.
2. Aydin, S. (2015): A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory
experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72: 4-15.
https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012.
3. Bagi, F., Jasnić, S., Budakov, Dragana (2016): Viroze biljaka. Univerzitet u Novom Sadu,
Poljoprivredni fakultet.
4. Bruisson, S., Lebel, S., Walter, B., Prevotat, L., Seddas, S., Schellenbaum, P. (2016):
Comparative detection of a large population of grapevine viruses by TaqMan® RT-qPCR
and ELISA. J Virol Methods. 240:73-77. doi: 10.1016/j. jviromet.2016.12.003.
5. Butler, J.M. (2012): DNA Quantitation. In: Butler JM (2012): Advanced Topics in
Forensic DNA Typing: Methodology. Academic press. Pages 49-67.
6. Butler, J.M. (2012): DNA Quantitation. In: Butler JM (2012): Advanced Topics in
Forensic DNA Typing: Methodology. Academic press. Pages 49-67
7. Clark, M.F. i Adams, A.N. (1977): Characteristics of the micro-plate method of enzyme-
linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34: 475-483.
8. Cohn, E., Tanne, E., and Nitzany, F. E. (1970): Xiphinema italiae, a new vector of
Grapevine fanleaf virus, Phytopathology, 60, 181-182.
9. Caetano-Anollés, D. (2013): Polymerase Chain Reaction. In Maloy, S., and Hughes, K.
Brenner’s Encyclopedia of Genetics, 392–395. doi:10.1016/b978- 0-12-374984-0.01186-
4.
10. Čepin, U., Gutiérrez-Aguirre, I., Balažic, L., Pompe-Novak, M., Gruden, K., Ravnikar,
M. (2010): A one-step reverse transcription real-time PCR assay for thedetection and
quantitation of Grapevine fanleaf virus. J. Virol. Methods. 170,47–56,
http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2010.08.018.
11. Daane, K. M., Middleton, M. C., Sforza, R., Cooper, M. L., Walton, V. M.,, Walsh, D. B.,
Zaviezo, T., Almeida, R. P. (2011): Development of a multiplex PCR for identification of
vineyard mealybugs. Environ Entomol. 40(6): 159-1603.
12. Diklić, K. (2014): Zaraženost sorte Muškat momjanski (Vitis vinifera L.) virusima.
Diplomski rad Agronomski fakultet, Sveuþilište u Zagrebu.
13. Engvall, E., Perlmann, P. (1971): Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9): 871-874.
https://doi.org/10.1016/0019-2791(71)90454-X.
14. Erlich, H.A. (1989): Polymerase chain reaction. J Clin Immunol 9, 437–447. https://
doi.org/10.1007/BF00918012.
15. Fuchs, M., Marsella-Herrick, P., Loeb, G.M., Martinson, T.E., Hoch, H.C. (2009):
Diversity of ampeloviruses in mealybug and soft scale vectors and in grapevine hosts
from leafroll-affected vineyards. Phytopathology, 99, 1177-1184.
16. Fuller, K. B., Alston, J. M., Golino, D. A. (2015): The economic benefits from
virusscreening: A case study of grapevine leafroll in the North Coast of California. Am. J.
Enol. Vitic. 66: 112-119.
17. Gambino, G., Gribaudo, I. (2006): Simultaneous detection of nine grapevine viruses by
multiplex RT-PCR with coamplifi cation of a plant RNA as internal control.
Phytopathology 96: 1223–1229.
18. Garibyan, L., Avashia, N. (2013): Polymerase chain reaction. The Journal of investigative
dermatology, 133(3), 1–4. https://doi.org/10.1038/jid.2013.1
19. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., Gelfand, D.H. (1991): Detection of specifi c
polymerase chain reaction product by utilizing the 5’----3’ exonuclease activity of
Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl Acad Sci U S A, 88(16):7276-80. doi:
10.1073/pnas.88.16.7276.
20. Raski, D.J., Goheen, A.C., Lider, L.A., Meredith, C.P. (1983): Strategies against
Grapevine fanleaf virus and its nematode vector. Plant Disease 67 (3), 335-338.
21. Lázár, J., Kölber, M., Lehoczky, J. (1990): Detection of some nepoviruses (GFV, GFV-
YM, GCMV, ArMV) in the seeds and seedlings of grapevines by ELISA. Kertgazdaság,
22, 58-72.
22. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Erlich, H. (1986): Specific
Enzymatic Amplifi cation of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Biology 51: 263.
23. Martelli, G. P.,Walter, B., Pinck, L. (2001): Grapevine fanleaf virus. CMI/AAB
Descriptions of Plant Viruses, No 385. Commonw Mycol Inst/ Assoc Appl Biol, Kew,
UK.
24. Maliogka,V.I., Martelli, G.P., Fuchs, M., Katis, N.I. (2015): Control of viruses infecting
grapevine. Advances in Virus Research, 91, 175-227
25. Van Weemen, B.K., Schuurs, A.H.W.M. (1971): Immunoassay using antigen—enzyme
conjugates. FEBS Letters, 15(3) 232-236. https://doi.org/10.1016/0014- 5793(71)80319-8
26. Meng, B., Martelli, P. G., Golino, D. A., Fuchs, M. (2017): Grapevine Viruses: Molecular
Biology, Diagnostics and Management 978: 167-197, 229-257
27. Mullis, K.B., Faloona, F.A. (1987): Specifi c synthesis of DNA in vitro via a polymerase-
catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155:335-50. doi: 10.1016/0076-
6879(87)55023-6. PMID: 3431465.
28. Nestorov, J., Matiü, G., Elakoviü, I., Taniü, N. (2013): Gene expression studies: how to
obtain accurate and reliable data by quantitative real-time rt pcr. Journal of Medical
Biochemistry, 32(4), 325-338.
29. Osman, F., Rowhani, A. (2006): Application of a spotting sample preparation technique
for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan).
J. Virol. Methods 133, 130–136.
30. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka,
H., Morimoto, S. (2018): Enzyme-linked immunosorbent assay for the
quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. J Nat Med. 72(1):32-42.
doi: 10.1007/s11418-017-1144-z
31. Službeni Glasnik Republike Srbije br. 39/2006, 59/2006, 115/2006, 119/2007 i 107/2008:
Pravilnik o zdravstvenom pregledu useva i objekata za proizvodnju semena, rasada i
sadnog materijala i zdravstvenom pregledu semena, rasada i sadnog materijala
32. Trujillo, A.A, McCaustland, K.A., Zheng, D.P., Hadley, L.A., Vaughn, G., Adams, S.M.,
Ando, T., Glass, R.I., Monroe, S.S. (2006): Use of TaqMan real-time reverse
transcription-PCR for rapid detection, quantifi cation, and typing of norovirus. J Clin
Microbiol. 44(4):1405-12. doi: 10.1128/JCM.44.4.1405-1412.2006.
33. Wages, J.M. (2005): Polymerase Chain Reaction. In: Worsfold, P., Townshend, A., Poole,
C. Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition). Elsevier, 243- 250,
 https://doi.org/10.1016/B0-12-369397-7/00475-1.
34. Weber E., Golino D., Rowhani A. (2020): Laboratory testing for grapevine diseases.