Brigita Rašić

 ELEKTROFOREZA je metoda za razdvajanje

nabijenih molekula u električnom polju na
osnovu razlike u naboju molekula pri
određenom pH

 Elektroforeza se može provoditi u

slobodnoj otopini ili u poroznim nosačima.
Elektroforeza proteina se najčešće izvodi u
poroznim gelovima (gelovi poliakrilamida,
gelovi agaroze)
 Proteini se mogu razdvajati u nativnom
obliku ili se prije elektroforeze mogu
denaturirati.

 Proteini se najčešće denaturiraju anionskim

detergentom Na-dodecil sulfatom (sodium
dodecyl sulfate – SDS)

 Proteini se sastoje od velikog broja različitih

aminokiselina koje su vezane peptidnim
vezama.
 analitičke svrhe:
- identifikacija proteina
- određivanje molekulske mase proteina
- određivanje broja podjedinica proteina
- određivanje čistoće proteina

preparativne, odnosno semipreparativne

svrhe:
– izdvajanje određenog proteina iz
proteinske otopine
 Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu

 Elektroforetska pokretljivost proteina ovisi o

gustoći njihovog naboja, tj. o omjeru naboja i
mase. Što je ovaj omjer viši, pokretljivost je
veća.
 Ukoliko je uzorak na početku prisutan kao
vrlo uska zona, proteini različite pokretljivosti
putovat će kao zasebne zone i razdvojit će se.
 Ovakav pristup poznat je kao zonalna
elektroforeza.
Elektroforeza u cjevčicama
Premda je ova tehnika istisnuta "pločastim"
gelovima, još uvijek se koristi u specifičnim
slučajevima, pri izolaciji pojedinih proteina,
itd.
Elektroforeza na pločama
Plosnati gelovi na pločama najčešće se
koriste, jer omogućavaju istodobnu analizu
većeg broja uzoraka na istom gelu, pod
jednakim uvjetima
Pločasti gelovi mogu biti vertikalni i
horizontalni.
 Elektroforeza u nativnim uvjetima

Elektroforeza u nativnim uvjetima

primjenjuje se kada je potrebno sačuvati
interakcije među proteinskim
podjedinicama i njihovu nativnu
konformaciju, što omogućava analizu
biološke aktivnosti proteina (npr. aktivnost
enzima, vezanje antitijela, aktivnost
receptora).
Elektroforeza u prisutnosti aditiva
Elektroforeza u nativnim uvjetima pogodna
je za analizu topljivih proteina. Kada su
proteini u uzorku netopljivi elektroforetsko
razdvajanje može se postići samo uz
dodatak odgovarajućih aditiva.

 Aditivi su:
 Urea se koristi kao aditiv koji povećava
topljivost proteina i spriječava agregaciju.
 Detergenti: dodavanje detergenta u uzorke i
gel popularna je i vrlo efikasna metoda
povećavanja topljivosti proteina koje želimo
elektroforetski analizirati. Četiri su osnovne
kategorije detergenata: neionski, amfoterni ili
zwitterionski, anionski i kationski
 Natrij dodecil sulfat - poliakrilamid gel
elektroforeza (SDS-PAGE)
SDS-PAGE najšire korištena elektroforetska
tehnika za analizu proteina, prvenstveno
zahvaljujući sposobnosti SDS-a da, u
prisutnosti reagensa za razaranje disulfidnih
veza, solubilizira, denaturira i rastavlja većinu
proteina u pojedinačne polipeptidne lance.
 Fiksiranje
Po završetku elektroforeze gelovi se moraju
fiksirati. Gelovi koji će se koristiti pri
identifikaciji enzimske aktivnosti proteina
ne smiju se prethodno fiksirati.
Bojanje
 Bojanje bojom Coomassie Briliant Blue
Najpopularnija i najčešća tehnika. Boja koja
se u kiseloj sredini elektrostatskim silama
veže za amino skupine proteina. Glavni
nedostatak metode je relativno slaba
osjetljivost.
Bojanje bojom Coomassie Briliant Blue
Fluorescencijsko bojanje
Veća osjetljivost detekcije može se postići
upotrebom fluorescencijskih tvari, za što
postoje dva pristupa. U prvom se proteini
vežu s fluorescencijskim bojama prije
elektroforeze i fluorescirajuće proteinske
pruge se detektiraju skeniranjem gela.
Bojanje srebrom
Tehnike zasnovane na bojanju srebrom
osjetljive su što ih čini izuzetno važnima pri
analizi uzoraka raspoloživih u ograničenim
količinama.
Elektroferogram serumskih proteina
 Elektroforetskim razdvajanjem dobiva se 5
frakcija serumskih proteina koji imaju
određenu proteinsku strukturu, molekulsku
masu i fiziološku ulogu. Shodno ulozi koju
imaju u organizmu njihova koncentracija se
mijenja u raznim patološkim stanjima.
 Albumin je serumski protein koji se nalazi u
najvećoj koncentraciji u usporedbi sa
ostalim proteinima (od ukupne mase
proteina pola otpada na albumin).
 Klinički značaj albumina
1. Hiperalbuminemija je rijetka i bez
kliničkog značenja.
2. Hipoalbuminemija je posljedica povećanog
gubitka albumina (nefrotski sindrom) i
smanjene sinteze (malnutricija, malresorpcija,
oštećenje jetre).
 3. Analbuminemija je rijetko genetsko
oboljenje a manifestira se izostankom
albuminske frakcije.
 4. Bisalbuminemija je genetsko oboljenje
(postoje dva gena koja sintetiziraju dvije
 vrste albumina), pa se nakon elektroforeze
javljaju dvije trake istog intenziteta
 α1-frakcija sadrži:
 1. α1 lipoprotein – HDL
 2. α1 antitripsin - protein akutne faze i
povećava se u akutnim infekcijama i kod
oštećenja tkiva.
 3. α1- kiseli glikoprotein – protein akutne
faze
 4. α1-anti-hromotripsin – protein akutne
faze
 5. α1-fetoprotein - je fetalni protein i obično
se koristi za skrining abnormalnosti kod
fetusa, kao tumor marker kod malignih
promjena na jetri.
 α2-frakcija sadrži:
 1. α1-makroglobulin - Sintetizira se u jetri a
povećana mu je koncentracija u nefrozi jer je
veliki protein i teško prelazi u urin. On nije
protein akutne faze.

 2. α1-haptoglobin - sintetizira se u jetri, a

ima ulogu u vezivanju i čuvanju hemoglobina.
Niske su mu vrijednosti kod intravaskularne
hemolize, a povišene u akutnoj fazi.
 β-frakcija sadrži:
1. transferin - protein koji transportira Fe.
Povišene vrijednosti su kod nedostatka Fe, u
trudnoći i u terapiji estrogenima. Snižen je u
akutnoj inflamaciji.

2. β1-lipoprotein – LDL - zbog velike

molekulske mase povišen je u nefrozi i u tipu
II hiperkolesterolemije.

3. IgA
 γ-frakcija sadrži:

imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD and IgE)

CRP - najosetljiviji indikator reakcije akutne

faze.
 HVALA NA PAŽNJI !