ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS

NHÓM 7
Thành viên

Nguyễn Như Quỳnh 2005191240

Hồ An Ni 2005191517
Hoàng Hải Quỳnh 2005190550
Nguyễn Thị Yến Nhi 2005190431
Nguyễn Hoàng Phương 2005191506
 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus 1

2 Đặc điểm sinh học

Cơ sở phân tích 3

4 Quy trình phân tích

Dụng cụ, môi trường và thiết bị 5

6 Giải thích quy trình

An toàn trong phân tích 7

 1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự nhiên

và có thể được tìm thấy trong nhiều loại đất,
trầm tích, bụi và thực vật. Bào tử có thể lây
lan một cách thụ động và do đó cũng được
tìm thấy bên ngoài môi trường sống tự nhiên.
B.cereus có thể nảy mầm, phát triển và tạo
bào tử trong đất, do đó thể hiện vòng đời hoại
sinh. Ruột của côn trùng có thể làm môi
trường sống cho B. cereus khi vi khuẩn tạo
bào tử, được phân lập từ ruột của các loài
chân đốt sống trong đất, nơi vi khuẩn dường
như tồn tại cộng sinh với vật chủ là động vật
không xương sống của chúng
 1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Ngoài vòng đời đầy đủ trong đất, B. cereus cũng thích nghi với lối sống trong
vật chủ, như một mầm bệnh hoặc có thể là một phần của hệ thực vật đường
ruột, cũng như để phát triển trong các loại thực phẩm. Khả năng thích nghi
của B. cereus với môi trường ruột động vật có thể là cơ sở cho tác dụng lợi
khuẩn được đề xuất của chúng. Việc sử dụng như vậy không thể được coi là
an toàn đối với con người vì tất cả các chủng B. cereus đều có thể tạo ra ít
nhất một trong các độc tố liên quan đến bệnh tiêu chảy. Tuy nhiên, một số
chủng tạo ra một lượng độc tố không đáng kể ở 37 C đã được Cơ quan An
toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) cho phép sử dụng chế phẩm sinh học.
 1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

• Bacillus cereus có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và thành
phần thực phẩm khác nhau, bao gồm gạo, các sản phẩm từ sữa, gia vị,
thực phẩm khô và rau.
• Khi thu hoạch, tế bào hoặc bào tử B. cereus có thể đi cùng nguyên liệu thực
vật vào các khu vực sản xuất thực phẩm và hình thành trên thiết bị chế biến
thực phẩm.
• Bacillus cereus là chất gây ô nhiễm phổ biến trong sữa, và nó có thể gây ra
một khuyết tật được gọi là sữa đông ngọt trong các sản phẩm sữa. Bào tử
hoặc tế bào của B. cereus có thể gây ô nhiễm bầu vú của bò trong quá trình
chăn thả, hoặc xâm nhập vào trang trại bò sữa qua vật liệu lót chuồng hoặc
thức ăn.
 1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Xét đến sự hiện diện phổ biến của

B.cereus, không loại thực phẩm nào có
độ pH> 4,8 có thể bị loại trừ như một
phương tiện có thể xảy ra hoặc là một
nguy cơ hư hỏng thực phẩm hoặc bệnh
do thực phẩm. Người tiêu dùng không
tuân thủ các quy tắc chuẩn bị thực phẩm
cơ bản, tức là làm lạnh chậm hoặc không
đủ, bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung
quanh hoặc giữ nhiệt kéo dài ở <60 C, có
thể cho phép B. cereus phát triển
2 Đặc điểm sinh học

Là trực khuẩn Không tạo giáp

 
Kích thước 0,5- mô và không
Gram dương,
1,5 x 2-4 di động
nội bào tử
 2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm nuôi cấy:

Hiếu khí và khị khí tùy ý. Nhiệt độ 5-50, tối ưu 35-40.
pH 4,5-9,3 thích hợp 7-7,2

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo nhóm

lớn, nhăn nheo, xù xì

Trên môi trường MYP: khóm hồng xung quanh có

vòng sáng.

Trên môi trường Mossel: khóm to hồng chung quanh

có vòng sáng.

Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau
cặn lợn cợn
2 Đặc điểm sinh học

Tính chất sinh hóa

Trên môi trường đường: lên men
glucose trong điều kiện hiếu khí và khị
khí, không lên men mannitol.

Phản ứng khử VP (+) Phân giải Tyroxin

Khử nitrat bằng nitrit

Catalase (+), Citrate (+)

Mọc trên NB + 0,001% lyzozym

2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

- Độc tố:

• Độc tố gây tiêu chảy

Diarhoed • Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị. Bản
chất là một loại protein gây phân hủy hoại biểu bì và
Toxin niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến
tính mạng.

• Độc tố gây nôn mữa

• Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại.
Emetic Toxin Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao
không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

• Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là

một loại protein gây độc mạnh có thể gây chết
người. Độc tố này có thể bị trung hòa bởi
cholesterol trong huyết thanh nhưng nó có thể
góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
• Bacillus Cereus có thể gây nhiễm trùng và
nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu,
viêm màng não và nhiễm trùng mắt.
2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

- triệu chứng gây độc

Thực ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực

phẩm đủ gây độc

Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn, nôn sau 1-5 giờ ăn
phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo
dài 24 giờ.

Biện pháp phòng ngừa: không ăn thức ăn để nguội

qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80 trước khi ăn.
3 Cơ sở phân tích

•TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO 7932 :

2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN
NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ
ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30OC.

•TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007

WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ HƯỚNG DẪN
KIỂM TRA VI SINH VẬT.
 3 Cơ sở phân tích

Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định
có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở
30oC. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
• Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi.

• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
 3 Cơ sở phân tích

Thuật ngữ - định nghĩa

Bacillus cereus giả định (presumptive Bacillus cereus)
Để cho phương pháp thử mang tính thực tiễn thì giai đoạn khẳng định đã giới
hạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu. Do đó, thuật ngữ "giả
định" đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng định không thể
phân biệt được B.cereus với các loài Bacillus khác có liên quan mật thiết.
 3 Cơ sở phân tích

Nguyên tắc
•Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một
lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môi
trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri.

•Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch
pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

•Ủ trong các điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC từ 18 h đến 48 h.

•Tính số lượng B.cereus trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số lượng
khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết
quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định.
3 Cơ sở phân tích

Phép thử Kết quả khẳng định Bacillus cereus giả định

Hình thành khuẩn lạc màu hồng được bao quanh

Thạch MYP bởi một vùng kết tủa.

Phản ứng dương tính, độ rộng của vùng hồng cầu

Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu có thể thay đổi
 3 Cơ sở phân tích

Quyết định 46/2007/QĐ-BYT

GIỚI HẠN B. cereus
Sản phẩm
(Trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)
Sữa dạng bột 102
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miến,
102
mỳ sợi (có xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu, đỗ: bánh,
10
bột (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Rau quả muối, rau quả khô 102
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
102
thế đặc biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi 10
sử dụng)
 3 Cơ sở phân tích

QCVN 8-3: 2012/BYT

Giới hạn cho phép B. cereus giả định (CFU/ml hoặc

Sản phẩm CFU/g)
m M

Sản phẩm dinh dưỡng công

thức dạng bột cho trẻ đến12 5x101 5x102
tháng tuổi

Sản phẩm dinh dưỡng công

thức với các mục đích y tế
5x101 5x102
đặc biệt cho trẻ đến 12
tháng tuổi
4 Quy trình phân tích
4 Quy trình phân tích
 4 Quy trình phân tích

Bảng dụng cụ

STT Dụng cụ Mục đích

1 Bình tam giác Chứa dung dịch hóa chất, chứa mẫu

2 Pipet Vận chuyển một lượng thể tích (huyền phù hoặc dung
dịch pha loãng) xác định

3 Đĩa petri Nuôi cấy vi sinh vật

4 Que cấy trải Trải đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa

5 Quy trải Trải mẫu vật, làm mịn bề mặt thạch

4 Quy trình phân tích

Bảng môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW (Saline Peptone Water) Pha loãng mẫu

MYP agar base (Mannitol -

Egg Yolk - Polymixin)
Nuôi cấy B.cereus
Polymixin B
Egg Yolk
Blood agar base Khẳng định B.cereus giả định
Sheep blood Được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng
phát triển cho các loài vi sinh vật khó mọc

HCl và NaOH 10% Điều chỉnh pH

 4 Quy trình phân tích

Bảng thiết bị
STT Thiết bị Mục đích
1 Cân Cân lượng mẫu rắn
2 Máy lắc vortex Trộn mẫu
3 Máy dập Stomacher Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng
4 Máy đếm khuẩn lạc Nhìn thấy độ khuếch đại của khuẩn lạc để dễ dàng đếm

5 Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng vi khuẩn cho các thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Máy dập Máy đếm Nồi hấp

Cân Máy lắc vortex tiệt trùng
Stomacher khuẩn lạc
 6 Giải thích quy trình

Cách tiến hành

Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

• Cân chính xác 10g đối với • Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW
mẫu rắn hoặc đong 10ml trong máy dập mẫu hoặc lắc đều bình tam
đối với mẫu lỏng, sai số cho giác.
phép ± 5%, cho vào túi nhựa
vô trùng (bình tam giác). • Do các bào tử lắng xuống nhanh trong
pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang khi
• Cho dung dịch pha loãng được làm đầy với một thể tích của huyền
SPW 90ml (sai số cho phép ± phù. Lắc huyền phù ban đầu và các dung
5% ) vô trùng vào túi nhựa dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh
(bình tam giác) chứa mẫu. các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.
 6 Giải thích quy trình

Bước 2. Pha loãng mẫu

• Hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha
loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

• Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 – 10s để thu được dung dịch pha loãng 10 -
2
. Nếu cần, có thể lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3 ,
10-4,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.

• Để định lượng các bào tử Baclillus cereus giả định, cần làm nóng dung dịch
pha loãng ban đầu ở 80C trong 10 phút trên nồi cách thủy sau đó tiến hành
cấy và ủ.
 6 Giải thích quy trình

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

• Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử

dạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phù ban đầu
đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa
đĩa petri. Lặp lại qui trình với các dung dịch
pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần.

• Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi

nồng độ 2 đĩa petri. Dùng que cấy trải trải
đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử
dụng một que trải vô trùng cho mỗi đĩa.

• Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ

phòng để chất cấy bám vào thạch. Lật úp
đĩa và ủ ở 30C trong 24 giờ
 6 Giải thích quy trình

Bước 4: Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ
nuôi cấy. Khuẩn lạc B. cereus giả định là các
khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi
một vòng kết tủa. Đếm các khuẩn lạc B. cereus
giả định trên những đĩa có số đếm phù hợp.
Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít
hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc
giả định có mặt. Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc
chấm các khuẩn lạc đã chọn lên mặt thạch
máu cừu, ủ ở 30C trong 24 giờ. Đọc kết
quả.

Khuẩn
  lạc của B. Cereus môi trường thạch   B. Cereus làm tan máu mạnh và tạo
MYP: dẹt, đường kính 2-3 mm, bờ hình răng vùng tan máu hoàn toàn (,xung quanh
cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục, vùng phát triển.
tan máu .
 6 Giải thích quy trình

Tính toán

• Đối với mỗi độ pha loãng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc đã
được cấy, ghi lại số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả
định đã được khẳng định.

• Chỉ rõ các ống này là các ống dương tính.

• Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm
độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị
ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.
 6 Giải thích quy trình

Số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng
của tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:

Trong đó:
: là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2
đâm độ pha loãng tiếp theo.
V: là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml)
n1: là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
 6 Giải thích quy trình

Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả dưới dạng thập

phân giữa số 1.0 và 9.9 nhân với
(n là số mũ thích hợp của 10)

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn

Nếu chênh lệch các giá Nếu 4 đĩa của sản
lạc nào mọc, đánh giá kết quả như
trị ở 2 đậm độ lớn hơn phẩm lỏng nguyên
sau:
2 lần, thì lấy giá trị của chất hoặc đậm độ
đậm độ pha loãng pha loãng ban đầu
thấp hơn để tính kết có ít hơn 15 khuẩn
quả. lạc tính kết quả là
trung bình cộng của Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus
các khuẩn lạc đếm trong 1ml sản phẩm.
được ở cả 4 đĩa tính
ra cho 1g hoặc 1ml
sản phẩm. Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus
trong 1g sản phẩm
 7 An toàn trong phân tích
Các yêu cầu đối với phòng vi sinh
• Hạn chế tiếp cận khu vực phòng thí
nghiệm vi sinh.
• Các bề mặt bàn làm việc trong
phòng thí nghiệm phải được vệ sinh
kỹ bằng cồn 70% trước và sau khi
làm việc.
• Khi chuẩn bị hóa chất môi trường có
cảnh báo nguy hiểm, cần đọc kỹ và
tuân theo hướng dẫn pha chế.
• Khi vận hành các thiết bị có liên
quan đến tính an toàn (nồi hấp, đèn
Bunsen), cần đọc kỹ và tuân thủ
hướng dẫn sử dụng thiết bị.
Yêu cầu đối với Rác thải hoặc mẫu
• Rác thải nhiễm và mẫu thực phẩm nhiễm
vi sinh phải được hấp tiệt trùng 1210C, 30
phút trước khi cho vào thùng có nắp kín,
và chuyển cho dịch vụ thu gom rác cuối
ngày làm việc.
• Mẫu thực phẩm, môi trường nuôi cấy và
vật dụng chứa (túi mẫu, đĩa petri, ống
nghiệm) sau khi cấy và nuôi ủ.
• Đầu tip, khay đựng mẫu, cốc đựng típ, que
cấy, que trang, giá ống nghiệm và các vật
dụng tiếp xúc trực tiếp với mẫu nhiễm
hoặc có nguy cơ bị mẫu nhiễm rơi đổ.
• Găng tay, khẩu trang, bông gòn vệ sinh
mặt bàn thao tác với mẫu nhiễm.
KẾT LUẬN

Trong môi trường chọn lọc, B.Cereus tạo khuẩn lạc rất to, mọc lăn,
rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong các loại thực phẩm (Sữa, thịt,
rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…).
Hình thành 2 loại độc tố chính
1.Diarrhoeal toxin gây tiêu chảy.
2.Dmetic toxin gây nôn mửa.
B.Cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trường thạch
chọn lọc Mannitol – Egg Yolk – Polymein (MYP) hoặc Cereus Selective
Agar (MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar
(PEMBA). Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương
pháp MPN.