Professional Documents
Culture Documents
عرض بكتيريا
عرض بكتيريا
في البكتيريا ،يحتوي جين rRNA 16Sعلى مناطق شديدة التباين تحيط بها مناطق محفوظة تسمح
بمضاعفة PCRللتسلسالت المستهدفة.
ويمكن استخدام هذه المتواليات داخل المناطق شديدة التباين لتحديد العالقات الجينية للبكتيريا.
تحليل تسلسل الجين 16S rRNAهو أداة مقبولة للتحديد الجزيئي للبكتيريا ويمكن استخدام إما مستعمرات
مثقفة أو عينة مريضة مباشرة.
تم إجراء تسلسل PCRلـ 16S rRNAوتسلسل ampliconللمساعدة في تحديد الكائنات الحية التي
يصعب استزراعها ،في تحديد الكائنات الحية التي يمكن تربيتها ولكن لم يتم التعرف عليها بسهولة ،وفي
اكتشاف الكائنات الحية في النتيجة السلبية للمستعمرات حيث تكون العدوى مشتبه بها .
قد يحقق اختبار PCR 16S rRNAنتيجة إيجابية أو نتيجة سالبة دون اكتشاف أي كائن حي.
الهدف: ) )WHAT
كانت أهداف هذه الدراسة لتقييم التأثير االيجابي لـ 16S rRNAفي تحديد طول المعالجة بالمضادات الحيوية
( ) LOTومعدل وقف المضادات الحيوية.
ampliconقد يساعد في توجيه الكشف عن الكائنات الحية بواسطة 16S rRNAمتبوًع ا بتحديد متسلسل
العالج المضاد للميكروبات في المرضى الذين يعانون من ثقافة سلبية
األهمية : ) ) WHY
التقنيات المستندة إلى الثقافة التقليدية ،مثل نمو الكائنات الحية الدقيقة في الوسائط الصلبة أو المرق ،وتقنيات تحديد الهوية ،مثل التلوين
البكتيري (على سبيل المثال ،صبغة غرام) والتفاعالت الكيميائية ،تساعد في تحديد الكائنات الدقيقة في المرضى الذين يشتبه في
.إصابتهم بالعدوى
قد يعزى الفشل في التعرف على الكائنات الحية إلى عدم قدرة الكائن على التكاثر في المختبر ،أو تلقي المريض للمضادات الحيوية قبل
.اخذ العينة وزراعها
.من دون التعافي والتعرف على الكائنات الحية بنجاح ،قد يتلقى المرضى دورات ممتدة أو غير ضرورية من العالج المضاد للميكروبات
قد يتلقى المريض أيًضا عالًج ا واسع النطاق بدون داع ،حيث أنه بدون بيانات واضحه ،لن يكون هناك قدرة على اختيار نظام مضاد
.للميكروبات محدد وضيق
إذا كان هناك أي تأخير ،يتم تخزين العينة في 8-2درجة مئوية .
استخراج العينة
كمية العينة التي تخضع الستخراج الحمض النووي هي ما يقرب من 200ميكرولتر من السوائل
أو 0.03غرام من المادة الصلبة.
يتم استخراج الحمض النووي البكتيري من العينة باستخدام مجموعة قوالب وتضاف الى 100ميكرولتر من
الماء.
يتم استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري ثم يتم تضخيم جزء من rDNA 16Sعبر ، PCRومن ثم يتم
عمل تسلسل .amplicons
تحضير العينة
يتم تعيين PCR
.1باستخدام 16Sبادئ امامي
.2و 16Sبادئ عكسي .
لضمان جودة استخالص الحمض النووي وعملية تفاعل البلمرة المتسلسل ،يتم تضمين ثالث مجموعات من
الضوابط مع كل عملية تفاعل بوليميراز متسلسل.
يؤكد الكنترول السلبي للتأكد من عدم وجود تلوث خالل العملية بأكملها.
مضاعفة العينة :
يتم تشغيل عينات المريض وعناصر التحكم بالشروط التالية:
تمسخ 95درجة مئوية لمدة 5دقائق 35 ،دورة من كل تمسخ لمدة 30ثانية .
نسبة التشابه المقبول ٪ 97من تسلسل BLASTللجنس ،و ٪ 99من تسلسل BLASTالمقدمة لألنواع .يجب أن
يتطابق التسلسالن األمامي والعكسي مع هوية الكائن الحي.
ومع ذلك ،فإن اختبار 16S rRNAنفسه لديه بعض التحذيرات الستخدامه.
لم يتم اعتماد بعد من قبل ، FDAوقد ال يشعر األطباء باالرتياح الستخدام نتائج االختبار في الممارسة السريرية.
ليست ذات حساسية وخصوصية محددة بشكل جيد في جميع أنواع العدوى .
ال يقدم درجة حساسية الكائن الحي ضد المضاد ،مما يتطلب من األطباء استخدام أنماط الحساسية المحلية أو بيانات المراقبة األوسع الختيار
أفضل عامل مضاد للميكروبات للمريض
تشكل اإلصابات الميكروبية مشكلة أيًض ا ألن اإلجراءات الموصوفة غير قادرة على التعرف على العديد من
الكائنات الحية في نفس العينة
قد تكون هناك حاجة للتسلسل العميق للتعرف بدقة على األنواع البكتيرية من عينات المرضى المعقدة
لم يكن باإلمكان اإلبالغ عن تفاعل إيجابي اذا تم اعتبار أن الكائن الحي منخفض االحتمالية إلصابة المريض أو
بأنه قد تم تلوثه.
ANY Q ?
Reference:
Gilbert, Elise M., et al. “Use of Organism Identification by 16S Ribosomal RNA
Polymerase Chain Reaction to Shorten Antimicrobial Length of
Therapy.” Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol. 88, no. 2, June
2017, pp. 163–167., doi:10.1016/j.diagmicrobio.2017.03.013.