Các Phương Pháp Sàng Lọc Tác Dụng Sinh Học Từ Dược Liệu

ĐẠI HỌC Y DƯỢC – THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ
MÔN DƯỢC LIỆU - KHOA DƯỢC
Các phương pháp sàng lọc tác

dụng sinh học từ dược liệu
(Bioassay for higher plants
Screening)
PGS.TS. Huỳnh Ngọc Thụy
12-2021
PP này làm ở GĐ nào trong thực hiện đề tài? GĐ đầu (xđ
ng.liệu, độ tinh khiết, nhận định sơ bộ,…), phát triển song song
với NCHH trong DL
1
Các phương pháp sàng lọc tác dụng sinh học
từ dược liệu
A. Các phương pháp sàng lọc sinh học từ
dược liệu 1.Mục đích
2. Ý nghĩa
3. Các bước tiến hành cho thử nghiệm sinh học
B. Phương pháp sàng lọc các tác dụng
1. Sàng lọc tác dụng chống oxi hoá
2. Sàng lọc tác dụng ức chế xanthinoxidase
3. Sàng lọc tác dụng ức chế alpha-glucosidase
4. Sàng lọc tác dụng hạ men gan, bảo vệ gan
C. Sàng lọc sinh học trên tế bào động vật
1.Lịch sử nuôi cấy tế bào
2. Đại cương nuôi cấy tế bào động vật
3.Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
D. Ứng dụng sàng lọc sinh học trong nghiên cưu dược liệu
1.Thử nghiệm in vitro
2. Thử nghiệm ex vivo
3. Thử nghiệm in vivo
Các phương pháp sàng lọc sinh học từ dược
liệu
 Mục đích
 Ý nghĩa
 Các bước tiến hành cho thử nghiệm sinh
học
3
Tl cho câu hỏi “có hay k có td shoc” -> Phục vụ cho nghiên cứu
Mục đích – ý nghĩa hóa học là chính, loại bỏ bớt tạp để lấy cao toàn phần tinh khiết,
đánh giá định tính để không bị lẫn lộn với các mục đích khác của
chuyên ngành khác.
Mục đích:
1. Đánh giá định tính tác dụng sinh học trên các mẫu thử:
 Trên cao toàn phần từ dược liệu Làm sao biết sd dmoi gì để chiết, chọn phân đoạn nào
 Các phân đoạn chiết phân lập? Nhờ thử nghiệm sàng lọc shoc để biết được
 Các hợp chất tinh khiết định hướng cần làm
2. Định hướng, hướng dẫn cho việc chiết tách phân đoạn
3.Sơ bộ định lượng mức độ tác dụng của mẫu thử qua kết quả IC50
Các thử nghiệm sinh học được sử dụng song song khảo sát hóa
học trong suốt quá trình nghiên cứu của đề tài
IC50: nồng đồ ỨC chế 50% -> 1 chat đã tinh khiết nhưng cần khảo sát
= cách tang dần nồng độ nó lên để tra td shoc của nó VD: IC50 càng
Ý nghĩa của sàng lọc sinh học: thấp có nghĩa tác dụng càng mạnh thì càng tốt
Thực hiện nhanh, ít tốn thời gian

Số lượng mẫu thử lớn, lượng mẫu dùng ít
Kết quả nhanh, có ý nghĩa thống kê
Vẫn làm invivo nhưng đã được qua sàng lọc invitro rồi nên lượng mẫu phải
Chi phí thấp thử sẽ ít đi, giúp rút ngắn được thời gian thử ban đầu.
Số lượng mẫu thử lớn: VD: thử trên các dòng TB các PƯSH sd giếng 96 or 384
-> cần dung nhiều giếng với mỗi giếng 1 nồng độ khác nhau. Tuy nhiên lượng
mẫu cần dung 1 lg mẫu ít pha thành dd mẹ dung cho all các giếng
Ý nghĩa thống kê rất quan trọng: VD thuốc covid k đủ lượng mẫu thử nghiệm ở
VN k được cấp phép vì k ng thử nghiệm -> k ktra được hiệu quả td. Ở4nơi thủ
nghiệm ó thể thử với số lượng rất nhiều số lượng mẫu -> chi phí thấp: mua 1
dòng TB nhưng áp dung PP cấy truyền tạo nhiều mẫu hơn
Các bước tiến hành một thử nghiệm sàng lọc
sinh học
1. Đối tượng thử nghiệm:dược liệu, cao chiết, phân đoạn
chiết, chất chiết tinh khiết…
2. Nguyên liệu dùng thử nghiệm
3. Phương pháp thử
4. Chuẩn bị nguyên liệu thử
5. Thiết kế thí nghiệm
6. Bố trí thí nghiệm
7. Tiến hành thử nghiệm
8. Đánh giá kết quả thử nghiệm
5
Sàng lọc sinhĐào
họctạo đểrút
giúp dược sĩ ở
ngắn nghiên cứu nghiên cứu thôi còn giai đoạn tiền lâm
giai đoạn
sàng, thử lâm sàng phía sau đều phải đi theo đúng lộ trình
Nghiên cứu thuốc
• Sứ mệnh của các công ty nghiên cứu dược phẩm là chuyển những hiểu biết về bệnh để mang tới
cho bệnh nhân một phương pháp trị liệu mới an toàn và hiệu quả hơn
Rồi xin giấy phép, đăng kí thuốc
Trừ trường hợp khẩn cấp và đặc

biệt
Giai đoạn 4, 5 thử nghiệm
Đầu tiên chọn lựa lâm sàng và tiền lâm sàng
nguyên liệu mà chúng pha 1,2,3 sau đó đăng kí
ta cần Khám phá thuốc mới rồi mới sản xuất
Khám phá/tìm được đích tác

dụng của nó
Đánh giá an toàn. Đánh giá
chuyển hóa dược động
Con đường nghiên cứu dài và mạo hiểm và nhiều rủi ro, bước đầu discovery đã phải tìm hiểu trên rất nhiều thuốc, khi sàng lọc trên mô
hình này chất đó có thể không có tác dụng không có nghĩa là vô ích vì nó có thể có tác dụng trên một mô hình khác, trên một dòng tế bào
khác. Đến giai đoạn lâm sàng chỉ còn 250 chất, đến bước thử nghiệm pha 1,2,3 thì còn rất ít chất và mất 6-7 năm cho quá trình lâm sàng
này. Mất thêm 2 năm để đăng kí và mới được sản xuất thuốc.
Phải tìm hiểu và sàng lọc cơ chế
Thường sd vỏ cây để chiết
Tránh nhầm lẫn cây thông đỏ vs cây thuỷ tùng (Glytostrobus pensilis)
Quy trình bioreactor thường họ chỉ nghĩ đến sinh khối thu được, và rất ít khi đánh giá được hoạt chất
trong đó có đủ hay có hiệu quả hay không
Ghi nhận lại kinh nghiệm sử
dụng để tạo thành một danh
sách có thể sử dụng
Tìm hiểu các cây thuốc ở các vùng khác nhau

tiến hành đánh giá để có hướng đi sâu vào
nghiên cứu hơn
dựa vào các cách sử dụng thuốc truyền thống
của các thầy thuốc để đánh giá, từ đó tạo ra một
danh sách các cây thuốc.
Sau khi có được danh sách cây thuốc và dựa vào kinh nghiệm dân gian, ta tiến hành sàng lọc sinh học để lấy ra một cái danh sách khác.
Từ đó xác định trong danh sách này hoạt chất hay nhóm hoạt chất chính có tác dụng là gì. Thì phải tiếp tục nghiên cứu bằng cách sàng lọc
để định hướng cho các nghiên cứu hoa học. Và cuối cùng có được thuốc có tính dược lý được chứng minh tính dân tộc học của nó
Nếu ta thấy được những hoạt chất tinh khiết và Sàng lọc là để hướng dẫn tìm
đánh giá được về mặt hóa học, đánh giá được tác tới được hoạt chất chính
dụng và tác dụng chính thì ta có thể làm marker,
làm chất đánh dấu cho chất chuẩn đó,cho sản
phẩm đó, xây dựng kiểm nghiệm
Con đường mới: sau khi đi theo quy trình slide
trước, ta tìm được chất mà chất đó phải là chất có Trước đây phân lập được chất hóa học rồi, thì ta tiếp
tác dụng theo mục đích mà ta đang nghiên cứu,. tục đánh giá công thức, đo NMR một chiều, hai chiều
Việc này cho thấy việc thử sàng lọc sinh học với để đánh giá và xác định công thức hóa học của nó. Trả
nghiên cứu hóa học phải cùng đi với nhau, cùng lời cho câu hỏi đó là chất đã biết chưa, chất mới hay
hợp tác với nhau để định hướng. Đây là xu hướng chất cũ, chất đó đã được nghiên cứu sinh học chưa,
thời đại. Không được đi phân lập đủ thứ rồi mới đi đây là con đường cũ, ra đến chất mới bắt đầu tìm hiểu
thử tác dụng sinh học xem nó có tác dụng sinh học gì hay không
Thử nghiệm trên choột hay trên mô hình hay trên dòng tế bào
Phải ghi rõ thử theo pp nào, nếu đổi PP khác so với PP đang làm thì
phải đánh giá lại PP từ đầu (độ đúng,…)
1.Đối tượng thử nghiệm
 Đối tượng thử nghiệm: dược liệu, cao chiết, phân đoạn
chiết, chất chiết tinh khiết…
 Chuẩn bị mẫu Đối tượng thử nghiệm là cái gì mà mình muốn tìm câu tl trong NC -> phải ghi
rõi địa điểm thu hái, thời gian thu hái, không thể lấy một cây để làm đại diện
cho một vùng vì nó không có ý nghĩa thống kê, ý nghĩa thống kê rất quan
trọng trên số lượng mẫu phải đa dạng hay không và đại diện hay không
 Pha loãng mẫu
 Lưu trữ mẫu

(1) Ví dụ cây trường xuân làm cao chiết thuốc ho, cây này có hai loài thì phải biết là
đang sử dụng loài nào, một loài yếu một loài mạnh. Phải nói ra tên chính xác
Chuẩn bị mẫu

 Mẫu nguyên liệu phải được xác định chính xác loài sử
dụng (1)
 Phải ghi rõ nơi thu nhận mẫu, thời gian lấy mẫu
 Phải chụp hình ảnh rõ về cây, thân, lá, hoa, quả, rễ
 Tiến hành vi học, soi bột (DNA nếu cần) Nếu cả hình thái, vi học, soi bột mà
vẫn không phân biệt được thì mới
 Thử tinh khiết mẫu phải tìm DNA chứ không phải lúc
nào cũng làm DNA
 Xác định hàm lượng chất chiết được
 Lưu mẫu:
 Trong điều kiện bảo quản thích hợp
 Mã hóa mẫu và lưu giữ nơi khô ráo
Thử tinh khiết Là một yêu cầu quan trọng của nguyên liệu làm thuốc
Xđ hàm lượng chat chiết được cc nhiều th.tin cho NC: có bị nhầm lẫn DL k, có bị làm giả k, sau khi sàng lọc shoc xong thì
xđ được trong dmoi nào thu được lượng chat nhiều nhất
2
3
Pha loãng mẫu – Lưu trữ mẫu
Nguyên liệu đầu chỉ lấy tối đa 100g? vì nếu nhiều hơn
 Chuẩn bị mẫu: theo quy trình thường quy, số đó ví dụ chiết 2kg hay 50kg, xong lấy một phần dịch
với khối lượng tối đa 100g nguyên liệu đầu. chiết để thử thì phần lấy ra này nó không đại diện toàn
bộ cho cao chiết (sự hiện diện của hoạt chất), vì nó có
Các cao phân đoạn có thể dùng cao phân thể có nhiều tạp hơn hay là nhiều hoạt chất hơn. Và
đoạn đã tách từ cao toàn phần’ lượng chat cần đem đi thử sinh học không cần nhiều
 Pha mẫu trong hệ đệm, chất trợ tan

Nếu trong trường hợp thử nghiệm trên tế bào thì qt nồng độ
- nếu dùng chất trợ tan phải thăm dò tỷ lệ chất
chất trợ tan. ví dụ dùng thêm DMSO thì tỷ lệ chất trợ tan cho
trợ tan hòa tan hoàn toàn mẫu. phép chỉ là 1% trở xuống không được nhiều hơn vì thử trên tế
- T h ă m d ò mức độ ảnh hưởng của chất trợ bào thì phải như vậy do các chất trợ tan này nó ảnh hưởng lên
tan tới phản ứng của thử nghiệm màng tế bào, làm chết tế bào, làm ảnh hưởng quá trình thử
nghiệm của mình.
 Pha loãng mẫu có nồng độ chính xác Để pha loãng được nồng độ 9 xác cần các dung cụ 9 xác
(micropipet,…) để sau khi thử nghiệm sinh học, thử nghiệm các
- để tính toán liều thử và quy ra liều tác dụng của thứ xong phải tính toán trả lời được liều cho tác dụng là bao
cao chiết hoặc của dược liệu nhiêu -> tránh tính sai dính vào liều độc, gây quá/ k đủ lieu dẫn
 Lưu trữ mẫu trong điều kiện -20 oC, đến sinh td k mong muốn
Lưu mẫu trong chai/lọ nhựa chịu được nhiệt thấp -> đảm bào
- bảo đảm có thể dùng lại trong suốt thời gian thử cho KQ lặp lại, không bị hư hỏng. Lặp lại trong shoc k giống
nghiệm mà không bị hư hỏng trong đlg (đlg: cho 1 khoảng sai số nhất định giữa các lần lặp
 Khi sử dụng mẫu phải giải đông và pha lại), còn sinh hoá (90 cũng là 100) vì nó chỉ ước lượng chứ k thể
9 xác nằm trong 1 khoảng nhất định, k thể lặp lại 1 cách 9 xác
loãng với điều kiện thích hợp được
- để có thể sử dụng ngay
- cho kết quả ổn định, lặp lại so với các đợt thử
nghiệm trước đó
8
1.Đối tượng thử nghiệm (Cô pass)
• Chuẩn bị mẫu:
Đối tượng thử • suốt

pha dung dịchthử
quá trình mẹ nghiệm.
1 lần dùng cho
nghiệm: • quy trình cần có độ chính xác, đô
- dược liệu lặp lại cao để kết quả có thể tính
toán IC50 và quy đổi liều tác
-cao chiết dụng trên dược liệu, cao
chiết .v.v.
-phân đoạn • Pha loãng mẫu:
• pha loãng từ dung dịch mẹ, trong
chiết bình định mức với dụng cụ và thao
-chất chiết tinh tác chính xác, để tính toán liều tác
dụng theo nồng độ pha loãng
khiết… • Lưu trữ mẫu:
• trong điều kiện bảo quản thích
hợp
9
• (-4 tới -20 oC)
Trường hợp chất tinh khiết thì mới cân và sử dụng nồng độ mol
Trường hợp chất tinh khiết thì ta cân và sử dụng nồng độ mol
nh xác
ưng số
ể khác
h theo
ất tinh
mol
Cao chiết tinh theo khối lượng. Hợp chất tinh khiết tính theo nồng độ
mol
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sàng lọc in vitro tác dụng của dược liệu

Dự đoán sơ bộ chất trong DL tan trong dmoi có độ pcuc ntn
Mỗi phân đoạn có cần chiết kiệt k? chiết 3 phân đoạn mục đích lấy hết chất gì
Qui trình chuẩn bị mẫu thử tan được trong CHCl3, EtOH, nc. Trong CHCl3 có chất kém pcuc-pcuc TB- pcuc
trong dmoi, nếu chiết tốt thì phần pcuc của CHCl3 tan rất ít trong phần kém
Bột dược liệu tối đa là 100g pcuc của EtOH -> bản ski phần CHCl3 tách hoàn toàn/ giao rất ít với EtOH. Nếu
chiết k kĩ phần đánh giá xem pđoạn nào có kq sàng lọc tốt sẽ bị sai
(10 - 50 g)
CHCl3 Dịch chiết CHCl3
Phải bão hòa DM trước để tránh ngậm
H2O của phân đoạn dưới Loại dung môi
Bột dược liệu (1) Cao CHCl3 (1)
SÀNG
EtOH Dịch chiết EtOH LỌC
Loại dung môi TÁC
Bột dược liệu (2) Cao EtOH (2) DỤNG
H2O Dịch chiết H2O SINH
Loại dung môi HỌC

Bột dược liệu (3) Cao H2O (3)
10
Chiết xuất, phân lập thành phần hóa học hướng tác
Cách chiết này thường
dùng hơn cách trên
dụng ức chế enzym α - glucosdase
Lưu ý: kĩ thuật chiết/ lắc
pbo các pđoạn thường bị
Bột dược liệu <= 100g
lẫn vào nhau, chứ k tách Cồn 96%, 3 lần x 3h - Cô dung môi
khỏi hoàn toàn
Cao cồn Bã dược liệu

Phân tán vào nước
Lắc phân bố với CHCl3
Dịch CHCl3 Dịch nước 1 Lấy phân đoạn pcuc TB của cao cồn
Loại dung môi DC nước k thể lắc pbo tr.tiếp vs

Lắc phân bố với EtOAc MeOH mà cần cô cắn/ trộn vs cát
trước khi lắc MeOH -> chiết R-L
Cao CHCl3
Dịch EtOAc Dịch nước 2
Loại dung môi Lắc phân bố với MeOH
Cao EtOAc
Dịch MeOH Dịch nước 3
Loại dung môi
THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ENZYME α -GLUCOSIDASE 1C1ao
Ví dụ: Chuẩn bị mẫu
Dược liệu
Extraction
Solvent suitable
Cao chiết toàn phần Sàng lọc sinh học
Chiết tách Phân bố lỏng - lỏng
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3

Sàng lọc sinh học 12
Sàng lọc sinh học
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3

Sàng lọc sinh học
VLC, FC, MPLC
Phân đoạn 2a Phân đoạn 2b Phân đoạn 2c

Sàng lọc sinh học CC, (Isolera (Biotage)
Phân đoạn 2b1 Phân đoạn 2b2 Phân đoạn 2b3

Sàng lọc sinh học CC, HPLC
Phân lập
Chất A Phân đoạn 2b2a Chất B

Các pđoạn nhỏ hơn sẽ tinh khiết hơn -> tiếp tục thử td shoc để cho định hướng
Isolera/ biotage là các pmem khi nạp vào cột sẽ chạy ra các pic đưa ra nhận định 13
TH plap ra chất có hàm lượng rất nhỏ but vẫn đi xem xét tdshoc, nếu nó có tdshoc thì cần báo cáo
2.Vật liệu dùng thử nghiệm
2. Tế bào tách từ các cơ

1. Hóa học: dùng các phản quan của thú thử nghiệm-
ứng hóa học, chuyển hóa, primary cell- ex vivo
sinh hóa, đánh giá Tế bào được tách ra từ các cơ quan của động vật, của thú thử
b ằ n g các phương pháp nghiệm, nếu thử trong vòng 24h và không tính thời gian chuẩn bị,
thông thường quá trình chỉ là ủ => lấy ra nhuộm => thì gọi là Ex vivo: thử nghiệm
bên ngoài cơ thể sống. Nếu thời gian nuôi cấy cũng trên TB song
Các pp thông thường như tính %, tam suất, để tính nhưng thử nghiệm kéo dài trên 24h thì gọi là in vitro. Ex vivo là thử
ra kết quả. nghiệm ngắn
3. Dòng tế bào – cell

culture: Tế bào tách từ các
mảnh mô của các cơ quan
được chọn lọc, chuẩn hóa 4. Thử nghiệm trên thú -
theo đúng dòng tế bào của thử nghiệm In vivo – ít
cơ quan đó rồi nuôi cấy cho dùng để sàng lọc
thử nghiệm. Thử nghiệm Ít dung vì số lượng mẫu dung trong sàng lọc rất lớn -> thử in
In vitro vivo time kéo dài, rất tốn kém. Chỉ dung để đánh giá tác dụng
Xem các sản phẩm chuyển hóa của các tế bào mình nuôi cấy vào những bước cuối, khi mà đã chọn được chất có tác dụng,
với các chất của mình, ta tiến hành đánh giá sự thay đổi cần tìm liều để đánh giá lại IC50 hoặc LD50 thì mới dung, sàng
lọc với số lượng rất ít, đỡ tốn kém hơn. Thường là14
các mảnh
mô được tách từ TB ra đem đi nuôi cấy, thử trên ĐV
2.Nguyên liệu dùng thử nghiệm
2.1 Hóa học: dùng các phản ứng hóa học
Các test thử nghiệm dựa trên phản ứng hóa học, các phản ứng sinh hóa
trong cơ thể
Thường dựa vào PỨ tạo màu của chất or PP đo màu
Các kít thử nghiệm: các loại enzyme, các antibody test kit, chất nền, chất
tham gia phản ứng
Nguyên tắc chung là tạo phản ứng màu, có thể phát hiện được bằng UV
hay sử dụng các đầu dò khác để phát hiện sản phẩm chuyển hóa hoặc các
sản phẩm trung gian, sản phẩm phụ….,
Các điều kiện thử nghiệm: có thể điều chỉnh trong từng điều kiện và
được thẩm định lại quy trình sau khi sửa đổi điều kiện
Thẩm định lại để đảm bảo rằng nó vẫn đáp ứng được các yêu cầu về độ đúng, độ chính xác, độ lặp lại,…
15
2.Nguyên liệu dùng thử nghiệm
2.2 Trong thử tế bào thử nghiệm trong cơ thể nó có sản sinh ra các sản phẩm sinh hóa tác động qua
lại ở các cơ quan, nên nhiều khi thử nghiệm trên toàn bộ cơ thể cho ra kết quả
không đúng.
Ngành vi sinh thường thử nghiệm trên tế bào được phân lập
từ cơ thể sống hơn là thử nghiệm trên toàn bộ cơ thể (invivo).
Khi các tế bào được phân lập, được nuôi cấy và được thử
nghiệm phân tích, đó là thử nghiệm in vitro.
Nuôi cấy tế bào từ những mẩu sinh thiết cơ quan của cơ
thể sống với một vài điều kiện đặc biệt đó là thử nghiệm
ex vivo.
16
Có 3 phương pháp thử (xưa: là 4PP) và với mỗi pp thử thì có các mô hình thử khác nhau,
VD thử nuôi cấy tế bào, sau khi thử đánh giá kết quả bằng cách nhuộm MTT, SRB hoặc chỉ soi UV, hoặc làm miễn dịch
huỳnh quang hay bất cứ thứ gì, thì đều là để đánh giá kết quả. Chứ không phải là phương pháp thử.
3.Phương pháp thử - Method
In vitro: Dùng các phản ứng hóa học, sinh

hóa, enzyme để thử trên dụng cụ thí nghiệm
Dùng tế bào tách từ cơ quan của động vật,
chọn lọc đặc tính tốt, chuẩn hóa để nuôi cấy
In vivo: thư ̉ cho đến khi đạt mật độ tế bào theo yêu cầu,
nghiệm tiến hành thử nghiệm tác dụng của đối In
trên động vật tượng thử nghiệm trên dòng tế bào silico
???
Ex vivo: thử trên tế bào ban đầu- primary cell, trên 1 bộ
phận của cơ thể động vật, trên 1 phần của cơ thể sống
Dùng tế bào tách từ cơ quan động vật,
nuôi cấy trong vài giờ đồng hồ,
thử nghiệm trên tế bào trong vòng 24
giơ
17
3.Phương pháp thử- in vitro
Mục đích: khảo sát sự biến đổi trong điều kiện một phần của
các cơ quan hoặc các phần của cơ thể .
Phân loại: có 3 loại chính cùng đồng thời phát triển tùy theo
mục đích nghiên cứu trong từng giai đoạn khác nhau của
thử nghiệm
Các khảo sát sử dụng:

1. các cơ quan, các mảnh mô, các tế bào, các thành phần tê
bào, protein,
2. khảo sát các sản phẩm chuyển hóa trong cơ thể,
3. các phản ứng hóa học và sinh học phân tử đ ể n g h i ê n
cứu sàng lọc sinh học của nguyên liệu làm thuốc với những
mức độ sàng lọc khác nhau tùy thử nghiệm
4. Các phản ứng liên quan đến enzyme, kháng thể
18
Vd xuyên tâm liên trên thực tế sử dụng thì nó có tính kháng khuẩn, kháng viêm rất là mạnh, thử trên các dòng tế bào cũng biểu hiện
rất tốt nhưng khi thử in vivo trên chuột thì không thấy được tác dụng này bởi vì chỉ khi vào cơ thể người thì xuyên tâm liên mới kích
hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (tuyến thượng than), từ đó mới tiết corticoid kháng viêm, chỉ xảy ra trong cơ thể ngừời
3.Phương pháp thử – in vitro

Thử nghiệm in vitro: thử nghiệm trên dụng cụ thí nghiệm
như đĩa petri, ống nghiệm, dĩa 6, 24, 96, 384… trong điều
kiện nhất định, không phải những thử nghiệm trên cơ thê
sống.
Thử nghiệm trêǹ tế bào và sinh học tế bào được tiến
hành bên ngoài cơ thể sống.
Lưu ý: Do các điều kiện thử nghiệm bên ngoài cơ thể có
thể không tương ứng với các điều kiện bên trong cơ thể,
dẫn tới kết quả không tương thích với các tình trạng diễn
ra hoặc phát sinh trong cơ thể sống.
Đôi khi các kết quả thử nghiệm in vitro có thể có kết luận
trái ngược với thử nghiệm in vivo
19
Nghiên cứu In vitro thích hợp hơn thử nghiệm in vivo
trong theo dõi cơ chế tác dụng sinh học của thuốc.
Lợi điểm: số lượng mẫu thử lớn
- Số lượng mẫu thử lớn:

Với một vài biến số và các phản ứng được khuyếch
đại lên -> thấy được những thay đổi dù là nhỏ nhất
-Những kết quả thường được mô tả kỹ lưỡng cho kết
quả nhận biết thêm rõ ràng hơn.
- Khảo sát sinh học phân tử in vitro trên số lượng lớn
mẫu thí nghiệm, chi phí thấp
Cho KQ giúp định hướng sơ bộ
- Tạo ra sự t h a y đổi không ngừng cho nghiên cứu

in vitro thay vì dùng in vivo với điều kiện tiến hành
tốn kém và mất nhiều thời gian hơn
20
Cũng có những sai lệch trong KQ thử invitro và in vivo

Hiện nay thử nghiệm in vitro là phô
biến
Do thử được tới mức độ

Cho ra kết quả có chất lượng phân tử
cao.
Do các điều kiện thử nghiệm in vitro có

những khác biệt với thử nghiệm in vivo,
Dẫn tới những sai biệt trong kết

Để xác nhận lại kết quả của
quả.
invitro mà thường 2 KQ này
tỉ lệ thuận với nhau ->
Tiếp
Kết quả thu đượctheo
từ cácnhững thử
thí nghiệm nghiệm
in vitro thường không thể được chuyển Ch
21
in vitro
đổi, thường dung để dự đoán phản ứng của toàn bộ sinh vật in vivo
phải tiến hành thử nghiệm in
Phải nắm được nguyên nhân của các sai lệch do chủ
quan và khách quan này để khắc phục vấn đề
3.Phương pháp thử- in vitro Sai biệt do khách

quan như các dụng cụ
Câu hỏi: Tại sao giữa invitro và invivo phòng thí nghiệm từ nhựa,
có sai biệt
- Chủ quan ̉ thủy tinh, nhiệt độ khi
- Khách quan sấy hấp tiệt trùng làm sinh ra
Các sai biệt do những sản phẩm độc hại
nguyên nhân chu cho thử nghiệm.
quan
Trong sinh hóa, các

chất không có chức Chuỗi protein có thể bị Trong thử nghiệm in vitro
năng sinh lý ở nồng đô sai biệt trong tế bào nơi các điều kiện có thể
đậm đặc có thể gây ̣ DNA có thể bị có mật độ cao của các không tụ họp lại thành
chép thành các dạng
kích hoạt các men sao
khác, vd như A-DNA protein lạ và từ đó hệ sai biệt lớn nên không bị
theo hướng ngược thống có thể bị sao
chiều của phản ứng or K-DNA sao chép sai lạc
Tạo 1 dạng chép sự khác biệt đó
sinh hóa bình thường.
AND khác để
ứng biến/
thích nghi
Vd một vài men trong được với tình
chu trình Krebs có thể huống -> AND
xuất hiện không theo sao chép sai
đúng quy luật tại thời điểm
đó
22
Đk MT nhân tạo: cố gắng mô phỏng giống đk trong body
Vấn đề đạo đức: trước khi tiến hành thực nghiệm cần thông qua hội đồng đạo đức trong việc lên KH thực hiện
3.Phương pháp thử – ex vivo

Ex vivo (Latin: "out of the living“-bên ngoài cơ thể sống) là thử
nghiệm với bộ phận hoặc tế bào đã được lấy ra khỏi cơ thể.
ex vivo được thử nghiệm với mảnh mô, những cơ quan,

những bộ phận thuộc cơ thể động vật lấy ra bên ngoài, với
những điều kiện môi trường nhân tạo, trong sự biến đổi tối
thiểu của điều kiện tự nhiên trong thời gian thử nghiệm ngắn
Thử nghiệm ex vivo được tiến hành với các điều kiện thử
nghiệm được kiểm soát nhiều hơn trong in vivo, và chỉ với
những thay đổi trong môi trường tự nhiên.
Thuận lợi trong thử nghiệm ex vivo là khả năng thử hoặc
đo lường bên ngoài cơ thể mà điều này không thể thực
hiện bên trong cơ thể sống vì lý do đạo đức.
23
3.Phương pháp thử – ex vivo
Ex vivo không nuôi cấy dài ngày như in vitro, còn lại thì giống nhau
Qui trình thử ex vivo

thường liên quan đến tế Các thử nghiệm
Ex vivo khác invitro bào sống hoặc các mảnh dùng tế bào sống
("within the glass") trong đo nhưng thời gian dài
các mảnh mô hoặc tế bàó mô lấy ra từ cơ quan động
vật, được nuôi cấy trong
không cần nuôi cấy dài điều kiện trang thiết hơn thì được xem
ngày như in vitro. phòng thi bị như là thử nghiệm in
́ vitro.
nghiệm,
dưới điều kiện vô
trùng trong
vòng 24 giờ.
24
3.Phương pháp thử – in vivo
Thử nghiệm In vivo
In vivo ("within the living") là thử nghiệm trong toàn bộ cơ
thể sống ngược lại với thử 1 phần cơ quan hoặc trên cơ thể
đã chết.
In vivo là thử nghiệm trên thú vật hay thử nghiệm lâm
sàng. Thường tiến hành sau khi thử in vitro để khảo sát
thêm trong cơ thể sống. Xem có gì khác biệt với thử nghiệm in vitro không, xem có tỷ lệ thuận với kết quả
của in vitro không, xem in vivo có thể hiện độc tính hay không.
Lưu ý là người ta nhân kết quả thử nghiệm với một hệ số để tìm liều trên người.
Chi phí cho thử nghiệm rất lớn, mất rất nhiều thời gian
25
HTS (Thử sàng lọc thông lượng cao) chỉ có ở trường đhoc lớn/ VKN, nó
cũng là in vitro, phương pháp này thử được với hàng ngàn mẫu thử
nghiệm trong cùng một điều kiện thử nghiệm. Người ta có thể điều khiển
toàn bộ quy trình thử bằng robot, phòng thử nghiệm được tự động hóa
trong việc chuẩn bị mẫu, xử lý, phân tích dữ liệu mẫu, thu được dữ liệu rất
lớn và độ tin cậy cao
Gíup trả lời nhanh câu hỏi: Chất có tác dụng hay không? Tác dụng gì? Do
thử trên rất nhiều mô hình nhờ robot
Có nhiều cách đọc kết quả như đọc độ đục, đọc độ trong, đọc màu, đếm khóm sống, đếm
khóm phát triển, khóm chết,sự thay đổi màu sắc, các hình thức đọc này sẽ tiết kiệm được
chi phí và rất hữu ích để trả lời các câu hỏi sinh học đã được xác định.
Cánh tay robo xử lý dữ liệu và truyền thông tin cho người sử dụng, các đĩa nuôi cấy
được cung cấp thông qua cánh tay robot đưa vào bên trong tủ để bảo vệ khỏi các nguy
cơ sinh học gây lây nhiễm, giúp không gây hại cho người sử dụng cũng như không gây
hại cho dòng tế bào mà ta đang thử nghiệm.
3.Phương pháp thử
High-throughput screening
High-throughput screening (HTS) dùng đặc biệt trong nghiên cứu về thuốc va
các lãnh vực liên quan như sinh học, hóa học.
Dùng máy móc, cho dữ liệu hàng loạt và được kiểm soát bởi phần mềm, sư
dụng dung môi hóa chất, bộ phận phát hiện rất nhạy, HTS cho phép thực hiện
hàng triệu các phản ứng sinh hóa, test thông thường và cac test về dược lý
thu được kết quả qua hàng loạt số liệu đồng thời, có ý nghĩa thống kê.
Nhanh chóng tìm ra các hoạt chất, các kháng thể, các gen hoặc một phần của
chuỗi gen mong muốn trong sinh học phân tử .
Các kết quả của thử nghiệm cung cấp cho việc thiết kế thuốc và hiểu biết về
tương tác thuốc cũng như vai trò của sinh học phân tử nói riêng trong sinh
học.
Cô pass 26
Cô pass
Chuẩn bị Nguyên vật liệu có pha hóa chất dung môi,
phản ứng sinh hóa, phần pha hóa chất dung môi phần
protocol của các mô hình rất rõ rang, hướng dẫn cân
pha thế nào, nồng độ bao nhiêu. Làm phản ứng sinh
hóa thì làm theo protocol
4.Chuẩn bị nguyên liệu thử PHA
HÓA CHẤT – DUNG MÔI
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY (tế
bào)
Tế bào Một vài môi

được nuôi trường như Một số môi
Có rất
DMEM - trường
cấy trong nhiều công
Dulbecco’s khác, như
hỗn hợp thức chuẩn
modified’s Ham’s F
dung dịch cho môi
medium- 12, chứa
hóa học, trường
có nồng độ một loạt
cung cấp nuôi cấy va ̀
acid amin các chất
một vài
chất dinh công thức
đậm đặc khác nhau
dưỡng cung cấp có thể đáp
riêng cho
cho sư đủ chất ứng được
̣ nuôi
việc dinh dưỡng cho nhiều
phát triển cấy các loại
cho quá dòng tê
của một tế bào đặc
trình nuôi bào khác
vài thế hê ̣ biệt. cấy kéo nhau.
tế bào. dài.
Khi môi trường dơ, cạn Có những dòng tế bào không đòi
kiệt dinh dưỡng thì thay hỏi DMEM thì đừng mua phí
mới môi trường tiền, nên dùng đúng môi trường 28
mà người ta yêu cầu
Nên mua dạng lỏng đóng chai pha sẵn, dùng hết chai này qua chai
khác tránh nhiễm khuẩn vào môi trường, đã mở nắp là dùng hết,
không mở ra đóng vào nhiều lần.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY (trong thử tế bào)
Dịch môi trường có thể cung cấp dưới dạng lỏng hoặc dạng bột
cô đặc.
• Dạng bột cô đặc khi dùng được hòa trong nước cất. Lọc qua
các màng lọc 0.22 m.
Một vài loại môi trường trong thành phần có thể có một vài chất
không ổn định nên khi sử dụng không được hấp tiệt trùng hoặc
chỉ dùng trong thời gian hấp cho phép.
Một vài loại môi trường không có chứa các chất không ổn định
(glutamin, bicarbonate) có thể lưu trữ trong nhiệt độ 4 oC trong thời
gian cho phép cho đến khi cần dùng.
29
Đầu tiên phải thử LD50 để đánh giá mức độ độc của nó và
suy ra liều để thử nghiệm tiếp theo. Vd: muốn biết có
flavonoid k thì thử theo thứ 1-4, sau đó thử tiếp OH phenol
vì flavonoid có nhóm OH phenol -> kl có hay k có flavonoid
5.Thiết kế thí nghiệm
Ví dụ:
1. Thử LD50
2. Thử sàng lọc tác dụng
của cao chiết toàn phần
Tùy mục của nhiều mẫu dược liệu
đích, thiết kê 3. Thử sàng lọc tác dụng
phân đoạn chiết của cao
các nội dung chiết có tác dụng
thử nghiệm 4. Thử sàng lọc tác dụng
của chất chiết tinh khiết
trong phân đoạn chiết có
tác dụng 5. Dò liều có tác dụng
• Lưu ý TLTK cách trình bày
trong bài báo khoa học và
luận án sẽ khác nhau
30
TLTK trích dẫn phải in nghiêng
5.Thiết kế thí nghiệm (tt)
Ví dụ
Thiết kế nội dung nghiên cứu
1 Khảo sát sự phát triển tuyến tính của tế bào
2 Khảo sát nồng độ gây độc của chất độc trên thú
thử nghiệm (hoặc trên tế bào)
3 Khảo sát thời gian nồng độ chất độc tăng cao nhất,
chọn thời gian đó để thử tác dụng của thuốc
31
Lô trắng: lô sinh lý, nuôi cùng điều kiện thử nghiệm với thú thử nghiệm để loại trừ ĐK thử nghiệm có
khả năng gây độc
Lô chứng dương còn có td gì nữa? Lô chứng chuẩn đối chiếu không chỉ để đánh giá kết quả, mà còn
chứng tỏ là bạn làm đúng, bạn thực hiện đúng, đúng phương pháp. thì kết quả nó đúng. VD: Đánh giá
6.Bố trí thí nghiệm
td trên gan của Actiso với Cynarin, mình làm tác dụng Cynarin yếu xìu => mình làm sai
Tùy mục đích thí nghiệm, số lô chia khác nhau.
Cơ bản chia 4 lô như sau
• Lô trắng chứng: lô chứng (âm) không dùng thuốc, không gây độc, cho uống
nước và nuôi trong cùng điều kiện thử nghiệm
• Lô chứng độc: so sánh kết quả thử nghiệm
• Lô chứng chuẩn đối chiếu (chứng dương): so sánh kết quả thử nghiệm
• Lô chứng thử: nhằm loại bỏ ảnh hưởng phụ của chất thử đến kết quả thí
nghiệm (thường chỉ thử trong thử nghiệm tìm liều độc LD50)
• Lô thử: có thể nhiều mẫu thử, mỗi mẫu một lô, hoặc thử nhiều chất, hoặc thử
nhiều nồng độ theo thứ tự thử từ mẫu thô, kết quả loại trừ dần các mẫu không có
tác dụng rồi thử đến mẫu tinh khiết của mẫu thô có tác dụng
Số mẫu mỗi lô thử, số lần thử phải đủ để kết quả có ý nghĩa thống kê:
n ≥ 6, N ≥ 30Chuột trong 1 lô tối thiểu 6, ng ta thường làm 10
Số lần thử 3/5 lần trên 30 con chuột
7. Tiến hành thử nghiệm
32
8.Đánh giá kết quả thử nghiệm
 Theo cách tính của phương pháp thử đã chọn

 Sử dụng các phần mềm riêng (SigmaPlot…)
 Tính % tác dụng ức chế hoặc tác dụng kích thích
 Tính % số lượng sống sót hoặc % số lượng chết
 Liều thử nghiệm trong các phương pháp thử bằng
phản ứng sinh hóa được tính toán theo cách tính
của phương pháp
Tính theo % chỉ cho đánh giá sơ bộ do có biên độ sai số lớn

Nghe lại 3h10ph 33
8. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Vật liệu thử nghiệm
Tế bào, Động vật thí nghiệm in vitro, in vivo:
— - Loài/chủng đã dùng;
— - Số lượng, tuổi, giống;
— - Nguồn gốc, điều kiện chăm sóc, chế độ ăn.
2. Điều kiện, phương pháp thử nghiệm:
— Chi tiết về chuẩn bị mẫu thử, nồng độ, độ ổn định, tính đồng nhất của
mẫu thử;
— Dung môi pha mẫu thử, chú ý giải thích nếu dùng dung môi khác không
phải là nước;
— Chuyển đổi từ nồng độ chất thử/dung dịch cho uống hoặc thức ăn ra
liều thực đã dùng (mg/kg thể trọng/ngày);
— Nguyên tắc chọn mức liều thử;
— Mô tả cách dùng mẫu thử trong thử nghiệm;
— Quy định lượng thức ăn, nước uống hàng ngày;
— Tình trạng, mức độ và thời gian quan sát lâm sàng (có quan sát hồi
phục không); 34
Chỉ số trị liệu càng lớn thì độ an toàn càng cao
B. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC
TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ DƯỢC LIỆU
35
Cơ quan bị gốc tự do tác động nhiều nhất là gan
Tác dụng chống oxi hóa
dập tắt gốc tự do
Tác dụng chống oxi hóa của dược liệu chính là tác dụng bảo vệ cơ
thể chống lại các bệnh tật.
Gốc tự do gây bệnh về lâu về dài, âm thầm và chỉ xuất hiện với các triệu
chứng mờ nhạt lúc đầu, khiến người bệnh không biết và không phòng ngừa.
Để phát huy tác dụng bảo vệ, các chất chống oxi hóa cần được sử dụng
hàng ngày để có thể ngăn chặn và dập tắt tác hại của gốc tự do. Bảo vệ các
cơ quan của cơ thể và bảo vệ cơ thể khỏe mạnh.
Tác dụng “Bổ” chính là từ những tác dụng như chống oxi hóa mạnh, dẫn
theo tác dụng bảo vệ cơ thể, tăng lực, tăng sức đề kháng cho cơ thể
Tác dụng bổ: thường là polysaccharide, saponin, flavonoid, polypenol
36
Tác dụng chống oxi hóa
dập tắt gốc tự do
 Gốc tự do là những nguyên tử hoặc phân tử có một
hay nhiều electron tự do. Ở mức năng lượng cao, các
electron này rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào
nhiều phản ứng hóa học như oxy hóa – khử, polymer
hóa…
 Các gốc tự do ROS (Reactive Oxygen Species) và
RNS (Reactive Nitrogen Species), là các dẫn xuất
dạng khử của oxy hoặc nitơ phân tử, gây tổn thương
tế bào và các đại phân tử sinh học, là nguyên nhân
của rất nhiều bệnh trong cơ thể, bệnh tuổi già…
37
Tác nhân sinh ra gốc tự do
38
Tác hại của gốc tư ̣ do
39
9.Một số phương pháp sàng lọc sinh học thường dùng
Chất gây hại cho tế bào gan • Chất chống oxy hoá có khả năng ngăn chặn
sự peroxid hoá lipid, là nhân tố bảo vệ sức
chủ yếu do sự peroxid hoá khoẻ quan trọng như ngăn ngừa một số bệnh
lipid và những thương tổn về hệ thần kinh, ung thư và rối loạn chức
do stress oxy hóa gây ra. năng của cơ quan trong cơ thể sinh vật sống.
• Pp ORAC (oxygen radical

Có nhiều phương pháp để absorbance capacity) đo khả năng hấp thu
gốc TRAP
• Pp oxy (total radical trapping antioxidant
đo khả năng chống oxy hoá parameter) đo khả năng bẫy hoàn toàn các
gốc tự do của các chất chống oxy hóa
• Pp FRAP (Ferric ion Reducing

Có nhiều phương pháp để
Antioxidant
đo khả năng khử, peroxid • Power)
Pp loại gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-
hóa picrylhydrazyl)
2-
• Pp đo khả năng peroxid hóa lipid…
40
Các gốc tự do gây ra bệnh tật một cách thầm lặng, nhưng để lại nhiều hậu quả, nên ta hay sàng lọc đặc tính chống oxy hóa của
dược liệu, có ý kiến cho rằng không thử cũng biết có tính chống oxy hóa (vì polyphenol ít nhiều đều tồn tại trong hầu hét các
DL) nhưng ta vẫn thử để cố gắng để tìm được IC50 của nó, để đánh giá xem cái nào mạnh và vượt trội hơn, có 1 số loài IC50
rất nhỏ nhưng cho hoạt tính rất cao. Từ đó sàng lọc ra được các chất mạnh hơn và tinh khiết hơn. Nhưng các bước sàng lọc
gốc OXH chỉ là bước tiền sàng lọc (sơ bộ nhìn thấy khả năng có td của nó) để từ đó nghiên cứu sâu hơn về đường huyết, ỨC
glucosidase,oxidase,... Tìm kiếm đặc hiệu hơn chứ k đơn giản là chống OXY hoá thôi, thử xem nó mạnh/ yếu ntn.
 9.1 Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity: đánh
giá chất có khả năng ỨC gốc free)
Mục đích: Đánh giá các chất chống oxy hóa ức chế gốc peroxyd, phản
ứng của các gốc chống oxy hóa với lipid trong thực phẩm và trong hệ
thống sinh lý học.
Phương pháp này phát hiện các chất chống oxy hóa phân cực và kém
phân cực bằng cách thay đổi dung môi sử dụng.
Nguyên lý khả năng hấp thụ oxy. Xét nghiệm khả năng hấp thụ gốc oxy
(ORAC), đo lường khả năng phá vỡ chuỗi gốc của các chất chống oxy
hóa bằng cách theo dõi sự ức chế quá trình oxy hóa gốc peroxyl.
 Các peroxit vô cơ có tính chất ion, muối, các peroxit hữu cơ bị chi phối
bởi các liên kết đồng hóa trị.
 Các liên kết hóa học oxy-oxy của peroxit là không ổn định và dễ dàng
phân chia thành các gốc phản ứng thông qua sự phân chia homolytic
R-O-O-R Homolytic: phân chia thành các nhóm giống

41nhau
 Phương pháp ORAC xác định khả năng hấp thu gốc tự do chứa oxy hoạt
động, đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự
hiện diện của gốc peroxy.
 Dùng chất chuẩn là Trolox (hay vitamin E) và mẫu chứa chất chống oxy hóa
(mẫu thử) cần xác định hoạt tính trong cùng điều kiện thử nghiệm.
 Khi fluorescein bị oxy hóa bởi gốc peroxy cường độ phát huỳnh quang sẽ
giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35
phút sau khi thêm chất oxy hóa vào.
 Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây
dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo
thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán.
 Kết quả tính toán mmol Trolox/g mẫu.
Trolox: dẫn xuất của vitE tan trong nước, vitE tan trong dầu 42
Xét nghiệm đo lường sự thoái hóa oxy hóa của các phân tử huỳnh quang
(hoặc beta-phycoerythrin hoặc fluorescein) sau khi được trộn với các chất
sinh gốc tự do. Cô đọc câu này còn lại cô pass
Các chất khởi đầu tạo ra gốc peroxyl bằng nhiệt, làm phân hủy phân tử
huỳnh quang, dẫn đến mất huỳnh quang.
Chất chống oxy hóa được coi là để bảo vệ các phân tử huỳnh quang khỏi
sự thoái hóa oxy hóa.
Mức độ bảo vệ được định lượng bằng cách sử dụng fluorometer.
Fluorescein hiện đang được sử dụng nhiều nhất như một đầu dò huỳnh
quang. Thiết bị có thể tự động đo và tính toán công suất có sẵn trên thị
trường (Biotek, Roche Chẩn đoán).
Phycoerythrin (PE) là một phức hợp sắc tố protein màu đỏ thuộc họ phycobilin protein hấp thu ánh
43
sáng, có trong tảo đỏ…
9. Một số phương pháp sàng lọc sinh học thường
dùng
 Ưu điểm:
 để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất có tính đến các mẫu có
và không có các pha trễ về khả năng chống oxy hóa của chúng.
 đánh giá các loại thực phẩm và chất bổ sung có chứa các thành phần phức
tạp với các chất chống oxy hóa chậm và tác dụng nhanh khác nhau, cũng
như các thành phần có tác dụng kết hợp không thể được tính toán trước.
Chủ yếu là các gốc peroxyl còn các gốc tự do khác không thấy liên quan phản
ứng này -> nếu mún đánh giá các gốc free khác thì k dung PP này. Do đó kết quả
 Hạn chế: này chưa bao quát và có thể không chính xác.
 chỉ hoạt động chống oxy hóa chống lại các gốc cụ thể (chủ yếu là peroxyl)
được đo;
 không có bằng chứng cho thấy các gốc tự do có liên quan đến phản ứng này
 không có bằng chứng cho thấy giá trị ORAC có bất kỳ ý nghĩa sinh học nào
sau khi tiêu thụ bất kỳ thực phẩm nào.
 mối quan hệ giữa các giá trị ORAC và lợi ích sức khỏe chưa được thiết lập.
44
9.2 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential)

Phương pháp TRAP thường được sử dụng để đo khả năng chống oxy hóa in vivo
của huyết tương hoặc huyết thanh vì phương pháp này đo các chất chống oxy
không phải là các enzym như glutathion, acid ascorbic, tocopherol, - caroten.
 Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’- azobis(2-
amidinopropane) dihydrochloride (AAPH).
 Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa
này được đo thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực.
 Khi có mặt chất chống oxy hóa (mẫu thử) trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa
sẽ xảy ra chậm hơn.
 Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so
với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch
Trolox.
 Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/l mẫu lỏng.
45
 9.3 Phương pháp thử DPPH thường được sử dụng cho việc
khảo sát khả năng ức chế/ trung hòa gốc tự do.
Ư u đ i ể m : được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn
định, được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa.
Nguyên tắc: 30p – 1h là đã có kết quả đánh giá sơ bộ, khá là ổn định
 DPPH là một gốc tự do có bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm
và có màu tím.
 Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH
bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng
cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ
tím sang vàng.
Sàng lọc COXH thực hiện trên cuvet hoặc SKLM hoặc trên dĩa 96
46
 Nguyên tắc đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH dựa trên
phản ứng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) thành 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH – H).
 DPPH là một gốc tự do bền, có bước sóng hấp thu cực đại ở
517 nm, dưới tác động của chất chống oxy hóa, DPPH bị khử
thành DPPH – H, dung dịch DPPH màu tím chuyển sang màu
vàng của DPPH-H
 Sự thay đổi độ hấp thu của hỗn hợp trước và sau phản ứng
được ghi nhận ở bước sóng 517 nm, từ đó xác định khả năng
quét gốc tự do DPPH của tác nhân chống oxy hóa cần khảo sát.
Bản thân DPPH là một gốc tự do bền có màu tím, mẫu thử của mình
khi tác dụng cho proton để khử, thì nó sẽ mất màu tím của gốc tự do.
Đo sự giảm cường độ màu tím !!
47
2. Bản thân nó là một gốc tự do. Nên nó cũng rất dễ bị khử bởi các tác nhân bên ngoài khác,nên khi thực hiện phải thực hiện nhanh, trong
bóng tối, tránh ánh sáng, thuốc thử pha thường phải dung liền. Thực tế làm trên SKLM: pha 100ml nhưng lấy 20ml, phần còn lại bảo quản cất
trong tủ lạnh dán nhãn, trên SKLM quan sát thấy vết vàng xuất hiện vs cường độ màu khác nhau -> biết được vết nào td mạnh/yếu từ cường
độ nào tới CĐ nào. Điều kiện: V mẫu thử (C chất tan trong mẫu thử) như nhau => dung mao quản khắc vạch đưa lên.
3. Lưu ý: dược động của PỨ
xảy ra thay đổi liên tục trong
vòng 30p -> độ hấp thu sau
30p mới ổn định -> trên
cuvet/ đĩa 96 sẽ đo trong
vòng 30ph. Ủ đĩa 96 trong
bóng tối 30p để PỨ xra hoàn
517nm 1. Nếu k thể chỉnh
toàn, còn SKLM nhúng DPPH 517nm được thì có thể
chậm, lấy ra thì quan sát/
chụp hình liền là đúng nhất vì chap nhận màu ở bước
k chụp ngay đẻ ngoài kk 1 song 517 +/- 2-3nm
time thì all các vết đều lên
màu vàng do as kk tđộng của
MT làm sai lệch KQ màu của
bản ski. SKLM nhúng thuốc
thử xong và lấy ra quan sát
liền chứ để lâu những vết
trước đó vàng sẽ vàng đậm
hơn và vết không lên thì sẽ
lên màu vàng
Thử nghiệm khả năng quét gốc tự do DPPH là một trong những mô hình phổ biến
nhất dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hóa hợp chất tự nhiên hoặc
cao chiết từ dược liệu.
Các phương pháp ứng dụng cho thấy giữa các mô hình tham khảo thường có một số
điểm khác biệt giữa nồng độ DPPH, dung môi nền, thời gian phản ứng và bước sóng
phát hiện
4.Mỗi đề tài/protocol làm thì nên khảo sát dmoi nền (thường dùng methanol – pha DPPH 0,2 mmol trong 48
methanol => màu tím rất đậm, sẽ thấy màu vàng của vết) , time pứ, nồng độ DPPH cần sd, bước song phát hiện,
… k nên đi theo lối mòn của những cái trước mà dùng luôn vì PỨ sẽ chưa xra hoàn toàn,
Pđoạn khảo sát có tác dung chống gốc free, các vết tách hoàn toàn -> đẹp nhưng nồng độ IC50 thấp -> khó phân lập, bảo quản
N N
+ AH + A
N NH
O2 N NO2 O2 N NO2
NO2 NO2
49
9.4 Phương pháp đo MDA
 Peroxid hoá lipid là cơ chế thường gặp của những tế bào bị tổn
thương trong thực vật và động vật,
 được coi như là chất chỉ thị của quá trình stress oxy hóa trong
tế bào và mô.
 Việc đo Malondialdehyd (MDA) - là sản phẩm của quá trình
peroxid hoá lipid- là một phương pháp thuận tiện và nhạy cho
việc đánh giá nồng độ lipid peroxid trong nhiều mẫu thử khác
nhau bao gồm thuốc, thực phẩm và mô sinh học từ người và
động vật.
Đây là PP cũng thường được sd, VD: thử invivo trên TB gan chuột
50
9.Một số phương pháp sàng lọc sinh học thường
dùng
Người ta sử dụng thiobarbituric như là một chất nền để tác dụng,
Malondialdehyde khi loại đi hai phân tử nước cho ra sản phẩm màu hồng
O O
O OHC CH2 O
H CH CH H
H CHO H N HC N
N N – 2H2O
H S N OH O N S
S N OH HO N S
H H
H H
H
thiobarbituric Sản phẩm màu hồng
51
1. PP này làm mất nhiều time ptich hơn do quá trình chuẩn bị dài

dùng
 Phương pháp đo MDA dựa vào phản ứng với acid thiobarbituric.
 MDA phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở 90 oC trong môi

trường acid tạo phức MDA-TBA có màu hồng, 2 mol TBA kết
hợp với một mol MDA.
 Phức màu được hoà tan trong dung môi hữu cơ như butanol,
isopropanol Nên sử dụng isopropanol vì butanol mùi rất khó chịu
 đo phổ hấp thu ở bước sóng 532 nm
52
1. Dùng beta-carotene là chất COXH với acid linoleic là chất nền
Gốc tự do được tạo ra từ acid linoleic
Phải làm sao chứng minh được cái nào cạnh tranh mạnh hơn VD: beta
caroten mạnh hơn thì thằng kia bị oxh hết -> giảm màu do bản than beta
caroten -> tr.hợp này thường gặp khi cho 2 chat vào cùng luc
Mẫu mình yếu xìu, không thấy thậm chí dung chứng cho vào.
=> Trong TH này họ sẽ so sánh với Mẫu trắng, Mẫu không có Caroten => tính
 9.5 Phương pháp đánh giá khả năng antioxidant với hệ
thống -caroten- acid linoleic
 Hòa -caroten với acid linoleic và Tween 40 sau đó thêm nước
cất vào để hình thành thể nhũ tương.
 Sau đó trộn mẫu thử với thể nhũ tương này và đo ngay ở
bước sóng 450 nm, đối chiếu với mẫu trắng với mẫu không có -
caroten và cứ 30 phút lại đo tiếp tục cho đến phút thứ 420.
 Hoạt tính antioxidant của mẫu kiểm tra (AA) được đánh giá bằng
khả năng làm mất màu -caroten theo phương trình sau:
 A A = [1-(A0-At)/ (A’0-A’t)]x100
 A0 và A’0 là độ hấp thụ của giá trị đo ở thời điểm zero của mẫu
cần kiểm tra và mẫu đối chứng. At và A’t là độ hấp thụ của mẫu
thử và mẫu trắng ở thời gian sau 420 p
53
Bản chất XO là enzyme, không phải cơ chất
9.6 Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase
Xanthin oxidase là một enzym tiền oxy hóa xúc tác phản ứng oxy hóa
xanthin tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do (O2●).
=> Đáp ứng được phản ứng này có thể xem như có khả năng COXH
Phương pháp thử xanthin oxidase sử dụng UV-Vis khảo sát khả năng ức
chế enzym xanthin oxidase của các mẫu thử thông qua mật độ quang của
sản phẩm acid uric hình thành.
Không màu => khó khăn phải dung máy. Không có kính lọc ở bước song này trên ELISA
Acid uric có bước sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Chất có khả năng chống
enzym xanthin oxidase càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric,
do đó mật độ quang của acid uric sẽ giảm.
54
dùng
 Nguyên tắc chung của các mô hình thử nghiệm in vitro tác dụng ức
chế enzym xanthine oxidase dựa trên việc định lượng sơ bộ acid uric
sinh ra từ phản ứng phân giải xanthine bằng phương pháp đo quang.
 Phản ứng tạo acid uric từ hypoxanthine hoặc xanthine dưới sự xúc
tác của enzym xanthine oxidase được thêm vào tác nhân ức chế cần
khảo sát.
 Sự hiện diện của tác nhân ức chế kìm hãm phản ứng dẫn đến giảm
lượng acid uric sinh ra. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm tạo
thành được đo độ hấp thu ở 290 – 295 nm, bước sóng hấp thu cực đại
của acid uric.
 Định lượng sơ bộ acid uric sinh ra và đối chiếu kết quả với mẫu chuẩn
cho phép đánh giá khả năng ức chế enzym xanthine oxidase của
tác nhân cần khảo sát.
55
Mẫu thử mình có tác dụng thì nó sẽ ức chế XO để không thể tạo ra acid uric
Thứ tự tiến hành:

1. MT + XO
2. Xanthin + XO còn lại Acid uric
3. M ư ć độ ức chế của mẫu sẽ thể hiện qua

cường và mật độ quang của a.uric tạo thành
đo được
Nếu mẫu thử có tác dụng thì mẫu thử ức chế xanthine oxidase để không thể tạo thành xanthine và không tạo thành acid uric, nếu c ho mẫu
đồng thời với xanthin thì hai cái sẽ cạnh tranh nhau xem cái nào hơn kết quả là xanthine thường được ưu tiên phản ứng hơn, nhưng tuỳ PỨ ->
cần khảo sát trước
Thứ tự tiến hành: nên cho XO vào mẫu thử trước để ủ một thời gian xem mẫu thử của mình có ức chế XO hay không, thời gian ủ protocol có
56
không, không thì phải khảo sát (khi nào phản ứng xảy ra hoàn toàn giữa MT – XO). Sau khi ủ xong thì mới cho xanthin, xanthin lúc này mới tác
dụng với XO còn lại (không tham gia phản ứng với mẫu thử), nếu mẫu thử yếu thì XO còn rất nhiều thì xanthin sẽ tác dụng để cho ra acid uric có
dùng
 Mô hình thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế enzym

xanthine oxidase được áp dụng lần đầu tiên vào năm
1983 trong nghiên cứu của Noro và cộng sự [76].
 Các mô hình thử nghiệm không ngừng được cải thiện
nhằm tăng tính ứng dụng và độ tin cậy.
 Yếu tố ảnh hưởng:
 Thời gian phản ứng Phản ứng hoàn toàn hay chưa mình phải khảo sát động học,
 Thời điểm cho enzyme, chất nền xanthin
 Màu chất thử Lưu ý màu chất thử, phải được loại trừ được màu này. Khi cho mẫu lên đĩa 96 thì nồng
độ này rất ít rồi còn phải them các thuốc thử này nọ -> trước khi đo UV cần định lượng
xem nồng độ trên dĩa trước đo làm bn, lúc này màu mẫu thử màu đã nhạt đi nhiều
57
1. Đây là lieu tham khảo nhưng phải khảo sát liều nào thấp nhất mà có tác dụng và ít ảnh hưởng nhất đến thú thử nghiệm, cơ bản
là 4 lô, ở đây người ta dung 6 lô: lô sinh lý để khảo sát trong điều kiện thử nghiệm có tác động gì đến kết quả cuối cùng không .
2. Lô chứng bệnh gây bệnh nhưng không điều trị,

Lô thử: cho mẫu thử vào, 2-3 liều thì tăng số lô lên
Lô đối chiếu: cho uống chất chuẩn là thuốc hiện nay có cùng cơ chế đó để đánh giá tác dụng của chất của mình, VD
alopurinol là một chất tổng hợp và là một chất tinh khiết, nhưng chất của mình là cao có tạp, hai cái không tương đương
Tăng độ tin cậy
Đo acid/ máu để xác nhận kết quả invitro. Nó không tăng dù ta gây tang => có tác dụng
Phương pháp frap đo năng lực khử trong huyết tương, để phân tích các chất chống oxy hóa trong dược liệu -> KQ PP này càng
cao cho thấy khả năng khử càng mạnh -> PP có hạn chế: sai số cao do khử Fe3 càng nhiều thì KQ càng cao  nhầm tưởng
9.7 Phương pháp phân tích FRAP
Phương pháp FRAP được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng
lực khử trong huyết tương nhưng cũng được sử dụng để phân tích các chất
chống oxy hóa trong thực vật.
Nguyên tắc: Fe (III) –TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) bị khử thành p h ư ć Fe (II)

– TPTZ bằng một chất khử (chất chống oxi hóa) ở pH thấp. Fe (II) –TPTZ có
màu xanh dương đậm và có thể đo mật độ quang ở bước sóng max = 593 nm.
Tác động chống oxy hóa được đánh giá bởi sự tăng cường độ
màu của phức Fe (II) –TPTZ.
58
 Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên
khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức Fe3+ -TPTZ [2,4,6-
tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+ -TPTZ (màu xanh) trong
môi trường acid.
 Khi đó, mức độ tăng cường độ màu (xanh) tỷ lệ với hàm lượng chất chống
oxy hóa có trong nguyên liệu.
 Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593 nm so sánh với chất
chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene) (Strain và
Benzie, 1996).
 Khi cho phức Fe3+ -TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất
chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+ -TPTZ.
 Kết quả tính toán là mmol Fe2+/ g chất khô. Kết quả tính toán cao thì nghĩa là
trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là
cao.
 Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có
thể khử nhiều phức Fe3+ -TPTZ cùng lúc.
 Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.
59
dùng
Sản phẩm màu xanh dương
60
dùng
 9.8 Phương pháp FTC (ferric thiocyanat )
 Mục đích của phương pháp: khảo sát khả năng của chất chống oxy hóa
làm giảm sự peroxide hóa lipid.
 Thông thường, các gốc oxy tự do sẽ peroxide hóa lipid, tạo thành
peroxide. Peroxide sẽ oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, phức của Fe3+ có giá
trị hấp thu tối đa tại 500 nm.
 Giá trị quan sát có hấp thu cao đồng nghĩa với sự peroxide hóa lipid cao
trong suốt quá trình ủ dung dịch.
 Mẫu dung dịch có chứa chất chống oxy hóa sẽ cho giá trị độ hấp thu
thấp hơn mẫu trắng không có chất chống oxy hóa,
 Giá trị đo được càng thấp khả năng chống oxi hóa của mẫu càng cao
61
dùng
 9.9 Phương pháp đo tổng năng lực khử (reducing power)

 Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương
pháp dựa trên khả năng khử phức K3[Fe(CN)6] (potassium
ferric cyanid) thành phức K4[Fe(CN)6] (potassium ferro
cyanid) của các chất chống oxy hoá, phức này sẽ tác dụng với
FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] (màu xanh)
 Độ tăng cường màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy
hóa có trong mẫu thử, nguyên liệu.
 Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690 nm.
So sánh với chất chuẩn là dung dịch acid ascorbic
62
dùng
 9.9 Phương pháp đo sự phát quang bằng phản ứng hóa học
dùng để phân tích hydroperoxid lipid của những mẫu sinh học
như máu, huyết thanh và nước bọt là một kĩ thuật đang được áp
dụng hiện nay .
 Hiện đại hơn, phương pháp cộng hưởng từ electron và phương
pháp cộng hưởng thuận từ spin được sử dụng trên động vật và
con người để phát hiện trực tiếp các gốc superoxid.
 Những kĩ thuật này được coi là có khả năng đánh giá chính xác nhất bởi vì
cả hai phương pháp này có thể đo được trạng thái chuyển tiếp của các gốc
tự do và các phương pháp này không phụ thuộc vào sản phẩm phụ của
peroxid hoá lipid.
 Ngoài các phương pháp nêu trên còn một số phương pháp được
sử dụng như phương pháp loại gốc tự do superoxyd, hydrogen
peroxyd...
Pp chưa về tới => chưa sử dụng được
63
Mẫu thử có nhiều alpha-glucosidase thì nồng độ PNP càng giảm, càng nhạt màu đi
Thử nghiệm so sánh KQ giữa mẫu chứng (mẫu chứa alpha-glucosidase hoàn toàn k bị ỨC) vs mẫu thử
9.10. Mô hình thử nghiệm tác dụng ức chế alpha-glucosidase
Nguyên tắc chung của phương pháp:
Dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase, PNPG phân giải cho ra hai sản phẩm là α-D-
glucose và p-nitrophenol (PNP).
 PNP là một chất màu vàng, có độ hấp thu ở bước sóng 400 – 415 nm.
 Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế α-glucosidase thì hàm lượng PNP tạo thành sẽ
giảm. So sánh hàm lượng PNP sinh ra giữa mẫu thử nghiệm và mẫu chứng (α-
glucosidase hoàn toàn không bị ức chế) để xác định phần trăm ức chế α-
glucosidase của mẫu cao chiết dược liệu.
 Mức độ ức chế enzyme của mẫu thử được đánh giá dựa vào phản ứng của phần
enzyme còn lại với cơ chất PNPG qua kết quả định lượng lượng PNG được sinh ra
Mẫu thử
α-glucosidase PNP
PNPG
α-D-glucose + (màu vàng)
Thứ tự tiến hành:
1. MT + α-glucosidase
2. PNPG + α-glucosidase còn lại
64
3. M ứ c độ ức chế của mẫu sẽ được đo qua cường và
mật độ quang của PNP tạo thành
dùng
 Các bước tiến hành:

 Bước 1: Cho vào mỗi giếng thử nghiệm trên dĩa 96 giếng: 10
µl enzyme (0.1U/ml), 10 µl mẫu thử (1mg/ml), 150 µl đệm
phosphate (50mM).
 Bước 2: Ủ ở nhiệt độ 37 oC trong vòng 60 phút để sự ức chế
(nếu có) xảy ra hoàn toàn. Time PỨHT thì tuỳ PỨ nên cần khảo sát động học của từng
 Bước 3: Thêm 30 µl PNPG.
 Bước 4: Ủ mẫu ở 37 oC trong vòng 30 phút để chất PNPG phản
ứng với lượng enzyme α-glucosidase còn lại.
 Bước 5: Đo ở bước sóng 415 nm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 6 lần.
 Làm song song mẫu trắng, mẫu chứng trắng.
65
Lướt

dùng
 Đánh giá kết quả:
 Tiến hành thí nghiệm với các mẫu cao chiết ở nồng độ 1mg/ml.
Sau đó đánh giá kết quả dựa vào khả năng ức chế α-
glucosidase của các mẫu cao chiết toàn phần.
 Những mẫu cao chiết thể hiện khả năng ức chế α- glucosidase
cao ở nồng độ 1mg/ml được pha loãng ở nồng độ 0.5 mg/ml,
0.25 mg/ml để tiếp tục thử nghiệm. Đánh giá kết quả.
 Sau khi đánh giá và lựa chọn những mẫu cao chiết toàn phần
có khả năng ức chế α- glucosidase cao, tiếp tục lắc phân đoạn
cao toàn phần để thử nghiệm hoạt tính của các phân đoạn.
Tiến hành như trên.
 Lựa chọn những phân đoạn có tác dụng ức chế α- glucosidase
để tiếp tục thử in vivo hoặc phân lập được chất tinh khiết có
hoạt tính.
66
Lướt

dùng
Hiệu quả bảo vệ gan của các nguyên liệu thảo mộc được sàng lọc
tiếp trên mô hình tế bào gan ex vivo hoặc in vitro, sử dụng tế bào
gan được nuôi cấy sơ cấp và bị gây nhiễm độc với các loại chất
độc gây tổn thương gan và sau đó thử nghiệm tiếp tục trên mô
hình in vivo.
Chất độc gây tổn thương cho gan được sử dụng như ethanol,
aflatoxin, paracetamol, galactosamin, CCl4…
Khả năng bảo vệ tế bào gan của các cao chiết/ chất tinh khiết
từ dược liệu chống lại tác động gây hủy hoại tế bào gan sẽ
được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau .
Mô hình gây độc in vitro, in vivo
Mô hình thử nghiệm độc tính tế bào, mô hình thử nghiệm tác
dụng trên gan (bảo vệ tế bào gan hoặc phục hồi tế bào gan…
67
Lướt

dùng
Hiệu quả gây độc và giải độc trên mô hình in vitro (ex vivo) và in
vivo được đánh giá bằng các thông số như hoạt tính của một số
các enzym nội bào của huyết tương như alkaline phosphatase,
glutamate oxaloacetat transaminase (GOT = AST), glutamate
pyruvat transaminase (GPT=ALT) …
Hiệu quả gây độc và giải độc trên mô hình in vivo được đánh giá
bằng cách ghi nhận lại thời gian ngủ do pentobarbitol hoặc bằng
việc xem xét về mặt mô học của gan.
Sau khi gây độc gan, gan trong thử nghiệm sẽ được chữa trị
bằng các hợp chất hoặc các cao chiết thực vật cần kiểm tra hiệu
quả bảo vệ gan
Hợp chất hoặc cao chiết thử nghiệm được cho là có hiệu quả
bảo vệ gan khi hiệu quả gây độc bị ngăn chặn.
68
Dùng trong nhiều ngành, không chỉ có thuốc
Kỹ thuật Western Blot

 Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm
phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu tế bào hoặc mô hay
dịch chiết xuất mô.
 Kỹ thuật này sử dụng điện di trên gel để phân tách các protein còn
nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein đa ̃ biến tính theo độ dài
của mạch polypeptide. Để biết mức độ phản ứng của mẫu thử
 Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (thường sử dụng là
màng nitrocellulose hay màng PVDF),
 Protein đó sẽ được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu với protein
đích. Dùng kháng thể để xác định vị trí protein
 Điện di trên gel được đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm
loại trừ vấn đề của các phản ứng chéo giữa các kháng thể.
69
Kỹ thuật Western Blot
 Nhiều công ty hóa chất chuyên cung cấp các kháng thể (cả kháng thể
đơn dòng và kháng thể đa dòng) tương ứng với hàng ngàn protein khác
nhau. Các kháng thể thương mại thường có giá thành cao, mặc dù
kháng thể không liên kết có thể tái sử dụng giữa các thí nghiệm.
 Ưnǵ dụng: trong các lĩnh vực của sinh học phân tử, miễn dịch gen
và các ngành sinh học phân tử khác.
 Một số công cụ tìm kiếm, CiteAb, Antibodypedia, và SeekProducts, giúp
tìm kiếm những kháng thể thích hợp để sử dụng trong phương pháp
Western Blot.
 Những kỹ thuật liên quan khác bao gồm kỹ thuật lai phân tử (dot
blot), hóa mô miễn dịch và hóa tế bào miễn dịch, các kháng thể cũng
được sử dụng để phát hiện các protein trên mô và tế bào bằng
cách nhuộm miễn dịch, và hấp thu miễn dịch lên liên kết enzyme
(ELISA).
70
Kĩ thuật này ở VN chưa có áp
dụng -> k cần học nhiều về cái
này
71
72
B. Sàng lọc tác dụng sinh học trên tế bào
động vật
 Lịch sử nuôi cấy tế bào Lướt

 Đại cương về nuôi cấy tế bào động vật
 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
10
7
B.1 LỊCH SỬ CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ
BÀO
 Tế bào động vật thường được định nghĩa là những tế bào
được phân chia và phát triển liên tục và có thể quan sát dễ
dàng dưới kính hiển vi.
 Các kỹ thuật cần thiết cho việc nuôi cấy tế bào động vật đã
được phát triển không ngừng trong thế kỷ này.
 Một trong những kỹ thuật phát triển sớm nhất là kỹ thuật giọt
treo (Ross Harrison-1907).
 Quan sát mảnh mô của trứng ếch trong khối dịch bạch
huyết trên bản kính mỏng R. Harrison thấy được sự phát
triển kéo dài của sợi cơ thần kinh trong một vài tuần.
10
8
B.1.LỊCH SỬ CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO
 Từ thử nghiệm này, Harrison đã kết luận một số đặc tính của tế
bào:
 Tế bào tách ra từ mảnh mô phát triển được nhờ bám dính
vào bề mặt của vật đựng nuôi cấy.
 Tế bào đòi hỏi một chỗ làm giá tựa cho sự bám dính (mà
trong trường hợp này là một lame va lamell) cùng với hỗn
hợp sợi tơ fibrinogen của dịch huyết tương trong thành phấn
nuôi cấy.
 Tế bào cần chất dinh dưỡng được cung cấp bởi dịch sinh
học chứa trong huyết tương
 Tốc độ phát triển tế bào động vật chậm so với vi khuẩn do đó
dễ làm môi trường bị nhiễm khuẩn. Một số lượng nhỏ của vi
khuẩn có thể phát triển nhanh chóng trong môi trường nuôi
cấy của tế bào động vật.
75
 Alexis Carrel đã áp dụng kỹ thuật vô trùng của phòng phẫu thuật
vào phòng nuôi cấy tế bào trong suốt thời gian nuôi cấy
 Năm 1923, Carrel đã thiết kế mẫu chai giúp tế bào được nuôi cấy
trong điều kiện vô trùng.
 Việc dùng chất vô trùng trong nuôi cấy tế bào như trong phòng mổ
ngoại khoa khó áp dụng trong điều kiện bình thường do đó không thể
tiến hành rộng rãi được.
 Carrel đã sử dụng huyết tương làm môi trường cho tế bào tiếp tục phát
triển trong quá trình nuôi cấy
 Từ thí nghiệm nuôi cấy tế bào của phôi gà, Carrel đã có kết luận
rằng các tế bào luôn bất tử, không bao giờ chết.
 Giả thuyết này sau đó đã bị bác bỏ bởi Hayflick và Moorhead cho thấy
có sự kết thúc của tế bào nuôi cấy được phân lập.
Vô trùng hạn chế bị nhiễm từ bên ngoài vô

Carrel có kl sai vì ông cứ nuôi rồi cấy truyền liên tục -> sống quài nhưng76các
Nhà KH cho thấy dù cấy chuyền hoài rồi cũng sẽ già và chết
 Đã ứng dụng nuôi cấy tế bào để sản xuất khối
lượng lớn sản phẩm cho sản xuất vaccine kháng
khuẩn.
 1949, Enders nhận ra rằng virus gây bệnh bại liệt có
thể lớn nhanh trong môi trường nuôi cấy của tế bào
phôi người.
 Vaccine bại liệt, loại được chế tạo từ virus bất hoạt, đã trở thành
1 trong những sản phẩm thương mại của nuôi cấy tế bào động vật.
 Từ những năm 1950, các vaccine cho người và
cho thú y đã được sản xuất một cách thường
xuyên tư ̀ lượng lớn tê ́ bào động vật co ́ vu ́ được
nuôi cấy
. 77
 Từ năm 1950, có vài loại tế bào với tính chất nổi trội đã
được phân lập và chuẩn hóa tính chất nổi trội đó
 Vd tế bào chuột nhắt L đã được biến đổi hóa học
 Tế bào tử cung người ung thư - dòng tế bào Hela.
 Earle và Eagle đã phát triển công thức môi trường nuôi cấy hóa
học để nuôi dưỡng những dòng tế bào này thay vì dung huyết
thanh và thay thế những môi trường nuôi cấy không ổn
định được dùng trước đó.
 Thuận lợi: môi trường nuôi cấy Eagle’s minimal essential có tính
ổn định không thay đổi giữa những lô nuôi cấy, rất dễ tiệt
trùng, và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.
78
Sản phẩm MT nuôi cấy tế bào đầu tiên ra đời
B.1.LỊCH SỬ CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ
BÀO
 Năm 1960 Hayflick và Moorhead
 khẳng định có sự giới hạn trong đời sống tế bào
 đó là bản chất của tất cả các tế bào động vật
bình thường.
 Harris và Watkins hợp nhất của các kỹ
thuật cho phép các tế bào có nguồn gốc
khác nhau được tổ hợp lại thành một sản
phẩm lai tạo.
Bước tiến trong nuôi cấy tế bào
79
 1970 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã phát triển mạnh.
 Khởi đầu dùng gen của vi khuẩn (E.coli) kỹ thuật tái tổ hợp đã cho phép
có thể sản xuất bất kỳ protein nào mong muốn, nhưng các protein từ
vi khuẩn thì không đáp ứng hết các yêu cầu hoạt động như protein ở
người.
 Kỹ thuật di truyền trên tế bào động vật đã phát triển và đáp ứng nhu
cầu phát triển hàng loạt dùng trong điệu trị bệnh cho người.
 1975, Kohler và Milstein đã tạo ra được một loại tế bào lai có khả
năng sản xuất liên tục các kháng thể đơn dòng,
 Dòng vô tính đơn có giá trị đặc biệt trong chuẩn đoán và điều trị do khả
năng gắn kết một cách chọn lọc với các chất.
 Hiện nay từ các tế bào lai đã sản xuất trên qui mô lớn tới hàng
kilogram
 Các sản phẩm có giá trị từ tế bào động vật hiện đang được sử
dụng là các vaccine vi khuẩn, kháng thể đơn dòng, tái tổ hợp
glycoprotein.
 Tế bào gốc ứng dụng trong kỹ thuật tái tạo 80
 Tách tế bào gốc, nuôi cấy thành công và ứng dụng trong y học
 Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam đã được khởi
động từ năm 1995, từ đó cho đến nay tại các cơ sở y tế những
thử nghiệm lâm sàng đầu tiên sử dụng MSCs - tế bào gốc trung
mô nuôi cấy từ mô mỡ tự thân, tủy xương và dây rốn trẻ sơ sinh
đã được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh như vết
loét khó lành, điều trị bệnh viêm khớp gối, bệnh phổi tắc nghẽn
mãn tính (COPD), chấn thương tuỷ sống.
 Đặc biệt hơn còn có bệnh tiểu đường tuýp 1, ghép tế bào gốc
tủy xương điều trị các bệnh nan y như bại não và tự kỷ, mang
lại hy vọng cho hàng trăm trẻ em mắc bệnh…
81
 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell- MSCs) là những
tế bào gốc trưởng thành đa năng, có khả năng tự tăng sinh và
biệt hóa thành các tế bào thuộc mô liên kết như mỡ, xương, sụn
và các loại tế bào khác như tế bào thần kinh, gan, tụy, thận...
 Ngoài khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau, MSCs
còn tiết ra các hoạt chất nuôi dưỡng tế bào, tái tạo mạch máu,
các yếu tố chống viêm, ngăn chặn sự chết tế bào.
 Ngoài ra, MSCs cũng được chứng minh có khả năng điều hòa
miễn dịch.
 Nhờ các đặc tính ưu việt trên, MSCs được ứng dụng nhiều trong
ghép đồng loài, hỗ trợ chống thải ghép, các bệnh tự miễn... và
trở thành một hiện tượng trong y học tái tạo.
ƯD gần đây nhất là ghép tim lợn cho ng, dùng TB gốc trong trẻ hoá da, tóc
82
Bảng 1: Các mốc phát triển trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào
1880 Roux duy trì tế bào phôi gà trong dung dịch muối
1890-1900 Harrison nuôi cấy tế bào thần kinh ếch bởi kỹ thuật giọt treo
1910 kỹ thuật vô trùng cho nuôi cấy tế bào thời gian dài; dùng trypsin trong kỹ
thuật cấy truyền để làm rời tế bào bám chặt mặt nền vật chứa đựng
1920-1940 Kháng sinh penicillin và streptomicin được thêm vào dịch môi trường
nuôi cấy. Earle phân lập nguyên bào sợi chuột L Enders nuôi poliovirus
trên tế bào người nuôi cấy
1950 Gey nuôi cấy tế bào Hela-tế bào ung thư cổ tử cung
Eagle phát triển môi trường nuôi cấy từ các chất hoá học
1960 Hayfick và Moorhead cho thấy tế bào người có sự kết thúc chu kỳ sống
Ham nuôi tế bào trong môi trường không huyết thanh –Harris và
Watkins làm hoà lẫn tế bào người và tế bào chuột
1970 Kohler và Milstein sản xuất antibody-secreting hybridoma. Sato phát
triển môi trường không huyết thanh từ hormones và yếu tố sinh trưởng
1980 Insulin cho người đã được sản xuất từ vi khuẩn bacteria. Các chất hoạt
hoá plasminogen mô tái tổ hợp (t-PA) được sản xuất từ tế bào động vật
1990 Nhân bản từ tế bào động thực vật (Cừu Doli)
83
Nay: lấy TBG từ nhau
thai, răng sữa của e
bé chiết, làm tăng
sinh TBG tiêm vào da
để trẻ hoá, căng da
B.2.Đại cương nuôi cấy tế bào
1. Các giai đoạn phát triển của tế bào
2. Tế bào nuôi cấy ban đầu - Primary cell
3. Nuôi cấy thứ cấp – cấy truyền
4. Sự đáp ứng tế bào với với môi trường nuôi cấy
5. Sự phụ thuộc vào bề mặt nuôi cấy
6. Các loại tế bào nuôi cấy
7. Bảo quản tế bào
8. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy tế
bào
9. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào
Các giai đoạn phát triển của tế bào
85
ĐẠI CƯƠNG TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO –
1.Các giai đoạn phát triển của tế bào
Giai đoạn tiềm ẩn (Phase lag)
 Phase lag: Phase đầu tiên của tế bào, trong đó mật độ tế bào
không tăng cao.
 Cần các yếu tố phát triển bắt buộc phải có trong môi trường
nhằm đạt được nồng độ tế bào mong muốn trước khi đạt đến sự
phát triển dày đặc của tế bào.
 Chiều dài của phase tuỳ thuộc: công thức của dịch môi trường
nuôi cấy, nồng độ ban đầu và trạng thái của tế bào.
 Phase lag có khuynh hướng kéo dài hơn khi mật độ nuôi cấy thấp, khi khả
năng sống sót của tế bào ấp thấp hoặc khi các lần cấy truyền bị hoãn
lại.
 Phase lag mất đi hoàn toàn: Khi mật độ tế bào tăng cao, khả năng sống sót
tốt và được nuôi cấy trong môi trường đầy đủ dinh dưỡng sau đó
Cấy truyền bị hoãn lại: khi Tb vào pha suy thoái mà k thay MT cấy truyền
ngay -> k duy trì được sự tăng sinh -> die 86
Giai đoạn phát triển: là giai đoạn tế bào tăng theo cấp số nhân
Nồng độ tế bào:
N= No x 2x. hoặc log 10 N = log 10 No + x.log 10 2
trong đó N= nồng độ tế bào cuối cùng của dung dịch cấy.
No = nồng độ tế bào lúc ban đầu,
x= số lượng chung của sự phát triển của tế bào.
– Mỗi tế bào trong dân số 105 / ml để tăng tới nồng độ 106
/ml thì phải sinh sản khoảng 3.32 lần
Thời gian cần cho số lượng tế bào có thể tăng gấp đôi :
Để nuôi cấy tế bào có nồng độ ban đầu từ 105/ml đạt tới 106/ml thời
gian trung bình là 0.904 ngày hoặc 22 h
−Thời gian để nhân đôi số lượng tế bào thường trong 1ml từ 15 tới
25h ở giai đoạn phát triển.
87
Điểm khác nhau giữa TB BT và
TB K ở Gđ này: TB k phát triển
nhanh và mạnh mẽ hơn TB
Bth rất là nhiều lần
The stationary phase-giai đoạn chờ: thời kỳ không có sự tăng trong
mật độ tế bào.
Tại thời điểm này, việc phát triển của tế bào bị giới hạn bởi một trong
những điều kiện sau :
 Chất dinh dưỡng có thể bị cạn kiệt ở mức độ không tiếp tục
cung cấp thêm cho tế bào phát triển nữa
 Sự tích lũy sản phẩm chuyển hóa của tế bào đạt tới mức làm
ức chế phát triển của tế bào.
 Tế bào đã mọc phủ hoàn toàn bề mặt vật đựng là chất nền. Sự
phát triển sẽ ngưng lại khi một lớp tế bào bao phủ bề mặt chất
nền, gọi là dầy đặc- confluent, hiện tượng này liên quan đến
tương tác giữa tế bào - tế bào
Trong thời kỳ chờ stationary phase, tế bào vẫn có thể đuợc chuyển hóa
ngay cả khi sự phát triển không xảy ra.
 Ví dụ, trong một vài trường hợp, sản phẩm chuyển hóa protein vẫn
tiết ra trong thời kỳ này.
Vẫn phải sống nhưng sẽ bị chậm lại
88
 Giai đoạn suy tàn : là sự chết của tế bào. Nồng độ của tế bào giảm khi
tế bào tiêu giảm, chuyển hóa trong nội bào được phóng thích trong môi
trường phát triển.
 Có hai cơ chế của sự chết của tế bào trong nuôi cấy: apoptosis và necrosis
 Apoptosis là cơ chế tế bào tự hủy được quan sát trong nuôi
cấy in vivo dưới các điều kiện vật lý thông thường.
 Men endonucleases đã được kích hoạt tách đôi ADN thành mảnh
khoảng 180 bp.
 Màng tế bào bị nhăn nheo với nhiều u nhỏ đặc trưng do sự co cụm tế
bào, ngưng tụ nhân và phân chia tế bào thành những mảnh riêng rẽ,
tế bào tự hủy.
 Cơ chế tự huỷ quan trọng trong thử nghiệm in vivo, trong sự
điều hoà sinh sản của một vài loại tế bào,
 ví dụ theo dõi kích thích miễn dịch của tế bào bạch huyết
lymphocytes
 Quá trình tự huỷ apoptosis có thể bắt đầu khi cạn kiệt dinh
dưỡng, nguyên nhân do tê ́ bào đi vào giai đoạn suy tàn
nhanh hơn với giai đoạn chờ
Trong DL có những chất kích hoạt apotosis, trên dòng TB ung thư thì quá trình này bị lãng quên đi
 Necrosis: Sự hoại tử- là cơ chế chết của tế bào từ
những thương tổn tế bào
 hoại tử không liên quan đến sự phân mảnh của quá trình tự
huỷ
 quá trình diễn tiến mất khả năng sống của tế bào hoại tử
trong nuôi cấy diễn ra chậm.
 sự hoại tử là quá trình thụ động thường xảy ra khi tế bào bị
tác động bất ngờ dẫn đến màng tế bào phồng lên rồi vỡ.
90
Còn gọi là chết theo lập trình
91
93
mô chứng thì sinh trưởng mạnh; đưa kl khi mô thử có số lượng TB thấp hon mô chứng. Thường thử trên TB ung thư
2.Nuôi cấy ban đầu - Tế bào từ mô-Primary cell

Sự nuôi cấy ban đầu được thành lập khi tế bào được lấy ra từ mảnh
mô động vật và được nuôi trong môi trường dinh dưỡng
Nguồn gốc: phát triển từ nuôi cấy mô khi Harrison và Carrel nuôi
mảnh mô trên bề mặt cứng (mảnh lam) có chứa các chất nuôi dưỡng.
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp nếu biết loại tế bào, hoặc khi là
tế bào đơn dòng đã được phân lập.
 Thực hiện phân lập: các mảnh mô sẽ được chia nhỏ bởi kẹp gắp
và kéo, sau đó dùng enzyme phân tách các tế bào thành các tế
bào riêng lẻ, rồi ly tâm với tốc độ chậm để tách các tế bào khỏi
môi trường nuôi cấy tế bào,
 Thời gian mà các tế bào sẽ tiếp xúc với enzyme phân tách nên
tối thiểu, tránh các màng tế bào có thể bị phá hủy.
Ly tâm tốc độ chậm, nếu nhanh sẽ làm vỡ MTB
Sau khi phân lập này xong có 2 hướng:

1. NC ngay trên dòng TB mới plap trong vòng 24h (ex vivo – tự phân lập để thử nghiệm) 94
2. tiếp tục nuôi cấy truyền để thu thập dữ liệu sinh khối -> hướng này chỉ dành cho các chuyên gia
PTN cho cấy truyền phải la phòng vô trùng, lắp hệ thống khí vào ra phải vô trùng luôn
3.Nuôi cấy thứ cấp – cấy truyền

 Kỹ thuật phân tách sử dụng tốt cho hầu hết các loại tế bào,
 Có thể một vài biến đổi trong qui trình chung cần thiết để nhận được tối đa
sinh khối đối với vài loại tế bào đặc biệt.
 Khó khăn chính và là lí do của sự thất bại:
 dân số tế bào dễ bị nhiễm bởi vi khuẩn và nấm, !!!!!
 Khắc phục: duy trì việc khử trùng trong suốt quá trình nuôi cấy
 Khi tế bào đã mọc trong môi trường nuôi cấy ban đầu, có thể nhân số
lượng tế bào bằng việc chia tế bào, ấp trong chai đựng khác với môi
trường nuôi cấy sạch đó là nuôi cấy thứ cấp - cấy truyền
 Thuật ngữ “dòng tế bào” được dùng cho dân số tế bào đã được tiếp
tục nuôi cấy phát triển qua rất nhiều lần cấy truyền.
95
4.Sự đáp ứng của tế bào với môi trường nuôi cấy
 Các tế bào khối u trong hầu hết các trường hợp là không biệt hóa
và có tính chất mọc- phát triển rất tốt.
 Một vài tế bào khối u biệt hóa bộc lộ các giá trị vượt trội mạnh mẽ
 Ví dụ khối u tế bào thần kinh mọc nhanh nên tế bào đó
có thể được dùng nghiên cứu khả năng đáp ứng với các yếu tố
thần kinh phát triển.
 Một vài đặc tính biệt hóa của tế bào bình thường biểu lộ vượt trội có
thể được duy trì trong nuôi cấy,
 Cho dù sự phát triển của hầu hết các tế bào biệt hóa là kém nhưng
các lần cấy truyền nuôi cấy tiếp theo sẽ duy trì các yếu tố vượt trội
này.
96
5.Sự phụ thuộc vào bề mặt nền chai nuôi cấy
 Tương tác của tế bào – tế bào:
 sự tiếp xúc giữa các tế bào giúp nối liền những chỗ hổng
 giúp chuyển hóa đồng bộ những tế bào biệt hóa trong dân số
tế bào
 đóng 1 phần vai trò trong việc dừng phát triển khi 1 dân số tế
bào đã phủ kín bề mặt cho sẵn(confluence) -> làm giảm hiệu
suất cấy truyền.
 Sự tương tác tế bào với bề mặt của các vật đựng:
 Collagen,lamimin, fibronectin là thành phần màng cơ bản
trong liên kết mô, có vai trò chính trong việc duy trì sự thu hút
của tế bào gan hepatocytes tăng cường bám dính vào bề
mặt vật chứa của tế bào.
 Khi bám dính, hình dạng các tế bào thay đổi
Hầu hết trong MT có tr.thái ban đầu trong môi trường lỏng là hình cầu, khi bám dính lên BM naò đó
sẽ thành hình thoi, trãi dài ra -> hình dạng th.đổi cho thấy được TB nó sống, còn die rồi k bám dính
được có hình cầu. 2 ngày thay môi trường đổ ra thì sẽ có TB hình cầu không bám dính => loại nó đi.
97
TB bám dính trên chất nền là TB sống, rửa sạch bằng hệ PPS => cho thuốc thử vào.
Sự phụ thuộc có việc bám dính đòi hỏi BM cứng
98
 Sự phụ thuộc vào lớp nền (giá đỡ) để mọc.
 Các tế bào đòi hỏi một nền cứng cho việc bám dính và phát triển. Để
có được sự phát triển tiếp tục cho đến khi tạo thành một lớp tế bào dày
đặc trên lớp nền thì tế bào cần có một nền cứng để bám dính trước
khi sự phát triển có thể xảy ra.
 Hiện nay phòng thí nghiệm có các dĩa petri, bình T-flask hoặc chai
Roux loại đặc biệt bằng nhựa hoặc thủy tinh để nuôi tế bào.
 Sự tác động qua lại giữa màng tế bào và mặt bằng bề mặt nền đã
được biết là do sự tương tác của lực hút tĩnh điện và lực
Vandervall.
 Sự bám dính của tế bào xảy ra do các cation hóa trị 2 thường dùng là
Ca2+ và các protein tính kiềm tạo lớp giữa nền cứng và bề mặt tế bào
để tăng cường sự bám dính.*
 Trong hầu hết các trường hợp, sự tương tác bề mặt tế bào được
cung cấp bởi các protein tạo lớp mỏng 2.5 nm trên bề mặt chất n9ề9n ưu
*Các chaitiên
lọ dùng
cho1 lần
sựthôi,
bámnếudính
dùng lại
tếnhiều
bào.lần thì qt rửa vệ sinh chai lọ sẽ làm mất lớp nền bám dính cho
TB. Khi huyết thanh glucose pro bao phủ toàn bộ BM TB thúc đẩy cho sự bám dính. Các yếu tố đk của TB phóng
thích vào MT tạo liên kết glucose – protein giữa bề mặt TB và nền cho việc bám dính đến 1 lúc nào đó cũng tới
 Sự liên kết bề mặt tế bào với chất nền là do có một lực của
protein hấp dẫn tế bào tới bề mặt chất nền và cuốn lại.
 Huyết thanh glycoprotein có thể dùng bao phủ bề mặt chất nền
thúc đẩy quá trình bám dính tế bào. Các yếu tố điều kiện được
phóng thích bởi tế bào vào trong môi trường và tạo liên
kết giữa glycoprotein bề mặt tế bào và bề mặt nền cho quá
trình bám dính.
 Mật độ của chất mang lực hút tĩnh điện trên bề mặt cứng
chất nền thì cũng tới hạn trong bám dính tối đa. Chất mang
điện tích âm có trong các đồ đựng thủy tinh sẽ được xử lý
bằng kiềm.
Trang thiết bị, hóa chất DM trong nuôi cấy TB là riêng biệt, không được đưa DM từ phân tích đưa vào.
100
Đặc điểm tế bào động vật
 Tính cơ học yếu
 Tăng trưởng và phân chia chậm
 Cơ chế kìm hãm ngược: ức chế tổng hợp và tiết ra ngoài
môi trường một số chất làm gia tăng nồng độ chất đó, ức
chế sự phát triển tế bào và làm chết tế bào => có giới hạn.
 Tính chất cần giá đỡ
 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình tạo tế bào lai
 Có thể được bảo quản lâu dài bằng pp lạnh sâu
 Các đặc tính khác: kém thích nghi, nhạy cảm với ion kim loại,
đa số cần huyết thanh, hormon để tăng trưởng.
101
6.Các loại tế bào động vật nuôi cấy
 Dùng 5 loại tế bào chủ yếu của mảnh mô:
 Tế bào biểu mô (epithelial tissue): lớp tế bào bao phủ cơ
quan và các khoang.
 Ví dụ như tế bào da, và các đường của các kênh thức ăn.
 tế bào biểu mô mọc tốt trong môi trường nuôi cấy như là một lớp
tế bào đơn và có tính chất gồ ghề bên ngoài => tăng bám dính
 Tế bào nguyên bào sợi (fibroblast): các mảnh mô được hình
thành từ một hợp chất chính bao gồm mạng sợi và các
xương sụn bên ngoài.
 Mảnh mô chứa các sợi là loại được sử dụng rất nhiều trong các
lab nuôi cấy mô.
 Tế bào hình cầu khi bám dính vào bề mặt của chai nuôi cấy
sẽ là hình thon dài nhọn 2 đầu.
 Tế bào sợi cơ có tính chất mọc tốt và hay được sử dụng trong việc
xây dựng dòng tế bào.
102
6.Các loại tế bào động vật nuôi cấy
 Tế bào cơ (muscle): là các ống nhỏ tạo ra từ các tế bào mầm, được
hợp nhất từ dạng hỗn hợp các nucleate là dạng chứa cấu trúc các
protein (actin và myosin).
 Các tế bào mầm là myoblasts là những tế bào có khả năng biệt hóa khác
nhau từ dạng myotube.
 Tế bào thần kinh (nervous tissue): là những neurone thần kinh chứa
những tính chất nhạy cảm, có thể thích ứng trong chuyển các xung
điện vào các tế bào nâng đỡ như tế bào galial.
 Neurone có khác biệt nhau rất lớn và chưa từng quan sát được sự phân
chia trong nuôi cấy.
 Một vài tinh chất tế bào thần kinh có thể quan sát được trong
neuroblastomas là loại tế bào ung thư đã bị di căn từ mô thần kinh và tế
bào đã trải qua sự phát triển trong môi trường nuôi cấy.
 Tế bào máu (blood) và dịch bạch huyết (lymphocytes) chứa 1 dãy
của tế bào trong dịch treo.
 Một vài những loại này sẽ tiếp tục phát triển trong dịch treo, những loại này
bao gồm lymphoblasts, là dịch bạch huyết và đã được dùng
trong nuôi cấy do kha ̉ năng tiết chất miễn dịch.
TB máu và dịch bạch huyết chứa trong dịch treo vì nó k có khả năng bám dính, nó chỉ lơ lửng trong đây
103
Trên các bình có các lỗ thông để TB Hô hấp. Cổ bình khi cho dịch
vào khá dễ nhiễm. DO: khi cho dịch vaò, nếu có tác động đến bình
(như lắc, ngã, đổ,..) dịch dính lên nắp thông này -> VK bám vào
đây, lọt qua nhiễm vào trong -> đổ thiết kế sang bình có cổ chết
lên trên giúp tăng thể tích bình, hạn chế dính vào nắp, có thêm
các ngã khác để thêm chất/ MT vào dich hoặc dễ lấy lớp
trên/dưới dịch ra (giống bình lắng gạn) nhưng bình này mắc hơn
104
Tế bào Hela
105
TB bắt đâu nuôi cấy -> có hinh cầu TB trong dịch treo: k có bám dính
106
107
Theo dõi mật độ sống của TB, nồng độ khác nhau tốc độ tăng trưởng khác nhau
=> biết GĐ phát triển của TB
108
Tủ ấp sau khi cấy TB
vào MT để duy trì
nồng độ TB, độ PH.
Máy này có 2 cửa, để
hạn chế xâm nhiễm.
Ng.tắc lúc làm: làm
trong im lặng, k nch
hay hát hò, ho và
phải đeo đầy đủ bảo
hộ
109
 Image of high
throughput cell
culture robot, 2007
cells are cultured in the incubator on the right

the culture plates delivered via a robotic arm into the side of the biohazard
hood. once inside the hood,
the computer-controlled robot can perform a variety of functions such as changing
medium, collecting samples and picking colonies.
medium and other liquids are pumped into the movable heads from the bags on the left.
this robot has been designed to facilitate the large-scale culture of embryonic
stem cells needed to determine the function of genes identified during the
human genome project."
110
111
6.1.TẾ BÀO BÌNH THƯỜNG DÙNG TRONG THỬ
NGHIỆM SINH HỌC
 Các tế bào bình thường gồm các tính chất:
 Bảo đảm 46 nhiễm sắc thể cho tế bào người. Tức là phải
không có sự phá hủy nhiễm sắc thể nào đã xảy ra.
 Phải có quá trình tự hủy - Sự kết thúc chu kỳ sống. Đó là
đặc tính rất đặc trưng của tế bào bình thường.
 Không có tế bào ác tính: các tế bào phải không bị ung
thư. Điều này phải được thể hiện bởi sự bất hoạt của tế
bào trong việc tạo dạng khối u khi tiêm vào chuột đã
được miễn dịch….
 Nuôi cấy tế bào được tách ra ban đầu thường chứa rất
nhiều loại tế bào với khả năng phát triển khác nhau trong môi
trường nuôi cấy.
 Cần phân lập tế bào đơn từ đám dân số tế bào đó.
Nuôi cấy tB BTH tốn nhiều time hơn TB K (3 ngày là OK) và đk nuôi cấy rất khó khăn
112
6.2.CHỌN LỌC LOẠI TẾ BÀO ĐẶC BIỆT TỪ TẾ
BÀO BÌNH THƯỜNG
 Có nhiều cách để chọn lọc tế bào đặc biệt:
 Quan sát tế bào mọc trong môi trường nuôi cấy, loại tế
bào nào mọc nhanh có thể cho thấy ưu thế vượt trội
trong môi trường dân số tế bào.
Ví dụ tế bào sợi fibroblast có thể mọc nhanh và vượt quá các
loại khác sau vài lần sinh sản.
 Kiểm soát sự hợp nhất của môi trường nuôi cấy.
Thêm vào các yếu tố đặc biệt, biết được các yếu tố ức chế sự
phát triển thì có thể cho phép chọn lọc sự phát triển của một vài
loại tế bào.
Lấy ra cái vượt trội để nuôi cấy

113
6.2.CHỌN LỌC LOẠI TẾ BÀO ĐẶC BIỆT TỪ
TẾ BÀO BÌNH THƯỜNG
 Chia tách các loại tế bào bởi tốc độ ly tâm khác nhau.
 Với tốc độ ly tâm khác nhau người ta có thể thu được
cắn tế bào có cùng kích cỡ và mật độ như nhau.
 Quá trình này còn được gọi là isopycnic
sedimentation.
 Tốc độ ly tâm có thể là khuôn mẫu dùng với các nguyên
liệu là chất không độc hại, có khối lượng phân tử cao.
 Đặc biệt phương pháp này được dùng có hiệu quả cao với
việc phân lập một vài loại tế bào trong môi trường nuôi cấy
vô khuẩn, ví dụ như việc phân lập
dịch bạch huyết tư ̀ máu
1 số PTN dùng pipet pasteur có đường kính khác nhau để lấy TB có kích thước khác nhau ra
114
6.3.CÁC LOẠI TẾ BÀO NUÔI CẤY BIỆT HOÁ
 Sự biệt hóa là một quá trình nơi đó tế bào thay đổi từ các
tính chất chung trở thành tế bào có tính chất đặc biệt.
 **Sự thay đổi xảy ra trong quá trình sống trong lúc phôi đang phát triển
hoặc vết thương đang lành vết loét và dẫn tới sự định dạng của tế bào
với các chức năng đặc biệt (khác biệt) như là tế bào neurone thần kinh
hoặc các tế bào cơ => tạo ra sự biệt hóa và chuyển đổi.
 Sự biệt hóa cũng liên kết với sự thay thế các tế bào bình thường
như là sự cần thiết trong máu.
 Những tiền chất tế bào không phân biệt của quá trình này được gọi
là tế bào mầm (tế bào gốc), có khả năng biệt hóa
 Có tài liệu phân biệt tế bào gốc (chuyển đổi thành các tế bào sinh dưỡng:
th1ầ1n5 kinh, máu, và tế bào mầm (biệt hóa cao thành tế bào tinh trùng, tế bào
trứng…)
Nhưng tính năng vượt trội vẫn được giữ trong các lần cấy chuyền
Nay: mẹ sinh con xong lưu trữ máu cuống rốn

6.3.CÁC LOẠI TẾ BÀO NUÔI CẤY BIỆT HOÁ
 Hiện tượng này là do các nguyên nhân như sau
 Việc chọn của các loại tế bào không chuyên biệt. Những
loại này gồm các tế bào biểu mô epithelial và tế bào
thượng bì thu nhận được từ mảnh mô không phát triển.
 Một vài hệ thống nuôi cấy có giá trị trong khảo sát về sự thay đổi
chuyển hóa liên quan tới quá trình biệt hóa, tuy nhiên để sự biệt
hóa phát triển được trong môi trường nuôi cấy là rất khó hoặc
có thể chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn. (vài tuần lễ).
Lướt 117
Sự biệt hoá của tế bào
118
6.4.TẾ BÀO CHUYỂN ĐỔI
 Là Tế bào động vật bình thường sau một thời gian sẽ ngưng phát triển,
 Một vài tế bào trong số đó đạt được khả năng phát triển tiếp tục và tạo dòng dân
số mới, được gọi là sự thành lập hoặc tiếp tục dòng tế bào.
 Các tế bào này đòi hỏi xuyên suốt một quá trình gọi là sự biến đổi mà nguyên
nhân do các tế bào mất nhạy cảm với các kích thích liên quan tới kiểm soát sự
phát triển.
 Tế bào chuyển đổi có thể làm mất tính phụ thuộc vào các bề mặt bám dính
và thường cho thấy những mảnh vỡ. Tình trạng này được mô tả như
aneupoidy, có nghĩa là có một sự thay đổi nhỏ từ trạng thái ban đầu của tế bào.
 Các tê ́ bào chuyển đổi co ́ khả năng phát triển được trong cácđiều kiện môi
trường đơn giản và không cần các yếu tố cho sự phát triển.
TB BTh thích nghi trong MT mà trước đó nó kém thích nghi -> bị biến đổi tệ hơn ban đầu
 Tế bào chuyển đổi ít đòi hỏi các yếu tố cho sự phát triển và
thường biểu lộ không có phase lag ngay cả khi ấp ở nồng
độ thấp tế bào.
 Khi cần ấp tế bào ở nồng độ thấp (cloning) sự phát triển tế
bào vẫn có thể bị tăng:
 chất kích thích / môi trường dinh dưỡng kích thích các
hoạt động chuyển hóa của tế bào giải phóng các yếu tố
phát triển vào trong môi trường
120
 Ung thư tế bào trong quá trình sống cũng là một quá trình chuyển đổi
không xác định, để chuyển đổi tế bào trong thí nghiệm in vitro.
 Không phải tất cả sự chuyển đổi đều là ác tính, vì trong động vật
đã xác định có đặc tính tạo khối u. Tất cả các tế bào ung thư đã
phân chia đều tiếp tục phát triển trong nuôi cấy.
 Ví dụ 2 loại: tế bào Hela là tế bào tách từ cổ tử cung bị ung thư và tế
bào Namalwa tách loại được từ tế bào bạch huyết. Những loại tế bào
này rất dễ dàng phát triển. Chúng rất khỏe mạnh biểu lộ đặc tính phát
triển rất tốt, có thể phát triển gấp đôi trong một thời gian ngắn và một
đặc tính khác là đòi hỏi rất ít các yếu tố cho sự phát triển.
K phải tất cả sự sưng viêm đều là xấu
121
 Tế bào có thể chuyển đổi trở nên bất tử bởi rất nhiều
kỹ thuật.
 dùng các gen đột biến (mutagen), các loài vi khuẩn hoặc các
gen ung thư (oncogenes).
 sự lai ghép bởi các retrovirus là phương pháp có hiệu quả
đặc biệt trong việc bất tử hóa tế bào. Những retrovirus sẽ
kích hoạt các gen gây ung thư là những nguyên nhân gây
chuyển đổi tế bào. Retrovirus hữu ích trong việc tái tổ hợp
ADN vào trong tế bào động vật.
 các tế bào cũng có thể tự chuyển đổi trong quá trình nuôi
cấy và có thể giải thích là do khuynh hướng riêng của mỗi
loại tế bào
122
6.5.THU NHẬN TẾ BÀO TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY
 Trong rất nhiều ứng dụng, dòng tế bào có thể thu nhận từ ngân hàng
các tế bào nuôi cấy nơi có lượng lớn dòng tế bào tốt đã được chọn lọc.
 Mẫu tế bào trong dịch treo 107 /ml, được bán dưới dạng đông lạnh
có thể vận chuyển với đá khô.
 Tại điểm đến, tế bào được xả đông và nuôi cấy ngay trong môi
trường nuôi hoặc tiếp tục được cất giữ trong dung dịch nitrogen lỏng.
Các điểm cần chú ý trong việc tiến hành như sau:
 Chú ý cất giữ bảo đảm an toàn dòng tế bào của cá nhân.
Giúp duy trì một dòng tế bào các tế bào quan trọng.
 Chú ý xét nghiệm sự lây nhiễm trong dòng tế bào
 Chú ý đến đặc tính của dòng tế bào. Giám sát tế bào bằng
cách phân tích men, karyotyping và dấu vân t1a2y3 trên AND
Một số dòng tế bào nuôi
Dòng tế c ấ y
N g uồ n gốc Loại tế bào Chú thích
bào
Tế bào tùy thuộc bề mặt nhưng có thể
BHK Baby hamster kidney Fibroblast nguyên được đưa vào dịch treo, dùng để sản
bào sợi xuất vaccine.
CHO Chinese hamster ovary Epithelial biểu mô Tế bào bám dính bề mặt hoặc trong
dịch treo, dùng trong kỹ thuật gen.
Tế bào chứa đột biến của SV40 virus,
COS African green monkey kidney Fibroblast dùng cho chuyển đổi của tái tổ hợp
gen.
Hela Human cervical carcinoma Epithelial Tế bào ung thư có đặc tính phát triển
nhanh phân lập những năm 1950
L Mouse connective tissue Fibroblast Nhiều kỹ thuật nuôi cấy tế bào phát
triển trên dòng tế bào ung thư.
L6 Rat skeletal muscle Myoblast Có thể dùng giải thích sự biệt hóa của
tế bào cơ.
Tế bào phụ thuộc bề mặt bám dính có
MDCK Madin darby canine kidney Epithelial tính chất phát triển tốt, dùng sản xuất
vaccine veterinary
Tế bào bình thường, dùng sản xuất
MRC-5 Humanembryonic lung Fibroblast
vaccine.
MPC-11 Phân chia từ tế bào khối u chuột, tiết

Mouse myeloma Lymphoblast chất miễn dịch. Dùng sản
Namalwa Human lymphona Lymphoblast xuất interferon.
NB41A3 Mouse neuro blastoma Neuronal Tế bào ung thư với tốc độ phát triển
nhanh.
Phát triển mạnh trong dịch treo, dùng
3T3 Mouse connective tissue Fibroblast nhiều trong phát triển kỹ thuật nuôi cấy
tế bào.
W138 Human embryonic lung Fibroblast Tế bào bình thường, dùng sản xuất
vaccine.
Vero African green monkey kidney Fibroblast Dùng đề duy trì dòng tế bà1o24bình
thường và sản xuất vaccine
7.BẢO QUẢN TẾ BÀO – rã đông tế bào
 Tế bào có thể được cất giữ trong khoảng thời gian lâu ở nhiệt độ
dưới O oC trong bình nitrogen, điều này cho phép cất giữ tế bào để duy
trì trong phòng thí nghiệm không có sẵn nguồn mô tế bào.
 Sự duy trì của một chai tế bào được cất giữ chống lại việc mất dòng
tế bào đó do sự lây nhiễm hoặc bởi sự thay đổi gen.*
 Để các tế bào lưu trữ được tiếp tục phát triển trong nuôi cấy, người
ta cũng cất giữ tế bào sau những lần cấy truyền đầu tiên nhờ vậy bất
kỳ sự thay đổi gen nào cũng có thể được giám sát. => gần như nguyên
thủy.
*Thường chia nhỏ thành các ống nhỏ để có hư ống TB này thì còn ổng tB khác
Những TB cấy truyền đầu tiên đều được lưu giữ lại & cấy xong đều lưu giữ lại để
xem sự khác biệt giữa những lần cấy vs lần đầu ntn
125
7. BẢO QUẢN TẾ BÀO – rã đông tế bào
 Để lưu trữ dòng tế bào có giá trị, tiến hành duy trì
trong hai loại ngân hàng tế bào: Ngân hàng chủ và
ngân hàng tế bào trong công việc.
 Ngân hàng chủ là cất giữ dạng tế bào của những lần cấy
truyền sớm nhất và thành lập ngay khi nhận được tế bào gốc
 Ngân hàng tế bào trong công việc là sự lưu giữ tế bào
đang phát triển sau một vài lần cấy truyền của một trong
những mẫu từ ngân hàng chủ.
 Mẫu vật tế bào được lấy từ ngân hàng công việc hay ngân
hàng chủ chỉ được quyền lấy khi tuyệt đối cần thiết.
 Khi lấy mẫu tế bào từ ngân hàng, dòng tế bào phải
được giám sát thật cẩn thận đảm bảo không bi ̣ lây nhiễm.
Nếu cần làm lại thì lấy trong NH lưu trữ
126
7.BẢO QUẢN TẾ BÀO- lưu trữ tế bào
 Cất giữ tế bào trong dung dịch treo với nồng độ 107/ml
tại môi trường đông lạnh trong một lọ chuyên biệt (cryovial).
 Trong lọ cất giữ tế bào có dịch môi trường cần cho sự phát triển,
hoặc huyết thanh với các chất bảo vệ như 10 % glycerol,
DMSO là các chất có thể bảo vệ tế bào khỏi bị phá vỡ trong
quá trình đông lạnh và quá trình rã đông tế bào.
 Tế bào được ổn định trong dung dịch nitrogen lỏng, ở -196 oC.
 Bắt buộc các phòng thí nghiệm tế bào phải có bình nitrogen
lỏng cho mục đích lưu trữ tế bào.
DMSO ở nồng độ vừa phải giúp làm lỏng MTB, nếu nồng độ cao quá làm cứng vỡ MTB ->
tuân thủ protocol, khi lấy ra phải rửa sạch
127
Tiến hành lưu trữ tế bào:
 Tách tế bào từ bình roux bằng trypsin
 Cho tế bào vào eppenddof
 Ly tâm 1000 vòng/phút
 Lấy cắn tế bào –trộn đều với PBS, ly tâm lần 2
 Thêm môi trường và cắn tế bào; Type nhẹ để trộn đều
 Chuyển hỗn dịch ra tube bảo quản, thêm DMSO, dán nhãn
 Cho tube tế bào vào hộp nhựa chuyên dụng, để nhiệt
độ lạnh -80 oC qua đêm Làm theo đúng quy trình để tránh Tb bị sốc nhiệt làm vỡ
 Chuyển các tube vào nitro lỏng. Ghi sổ vị trí cất giữ tế bào
trong bình nitơ
128
 Phương pháp lưu giữ đông lạnh và rã đông tế bào là rất
quan trọng cho việc duy trì khả năng sống của tế bào lưu trữ.
 Làm đông lạnh tế bào một cách từ từ, và rã đông thật
nhanh là yêu cầu đòi hỏi cho khả năng sống tối đa của tế
bào.
 Dịch treo tế bào có thể được đông lạnh bằng cách thay lọ
Criovial
đựng chứa dịch treo tế bào trong một hộp
polystyrene giữ ở nhiệt độ -80 oC 24 giờ. Điều đó bảo
đảm sự khởi đầu quá trình đông lạnh chỉ ở điều kiện
1oC /phút.
 Sau đó lọ đựng tế bào sẽ được chuyển trực tiếp vào
trong bình nitrogen lỏng. Nhựa chuyên dụng
 Đề̉ hồi phục tế bào, lọ đựng tế bào sẽ được chuyển ra
nhanh chóng khỏi môi trường nitrogen tới một
bê nước 37 oC.
129
7.Giải đông - Hoạt hóa tế bào
 Lấy tube tế bàotừ bình nitrogen lỏng cho
vào
waterbath 37 oC
 Chuẩn bị bình Roux bằng 10 ml môi
trường E’MEM, DEMEM đã được làm ấm 37 oC
 Thêm môi trường đã làm ấm, type nhẹ nhàng trộn đều tế bào
 Ly tâm 800 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch
 Cắn tế bào cho vào bình Roux
 Ủ tế bào trong tủ ấp ở 37 oC
 24 giờ sau thay môi trường mới
Thao tác nhẹ nhàng tránh vỡ TB
Khi hoạt hoá TB, trong dịch tế bào lưu trữ có DMSO cho nên khi hoạt hóa mặc dù đã rửa, đã
thử đã thay môi trường nhưng 24h sau bắt buộc thay môi trường mới để loại tiếp những gì
còn sót lại, làm sạch tiếp còn nếu đã nuôi cấy để TN thì 48-72h thì mới thay. Ở đây sau khi
hoạt hóa tế bào xong sau 24h phải loại tiếp DMSO? 130
8.ỨNG DỤNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
 Ứng dụng để khảo sát các tính chất vật lý hoặc sinh học của tế
bào. Ví dụ: các con đường chuyển hóa có thể được khảo sát bởi kích
hoạt phóng xạ gắn vào chất nền và sau đó xem xét các sản phẩm .
 Ứng dụng thử nghiệm các ảnh hưởng của các chất trên các loại tế
bào đặc biệt. Mỗi tế bào có thể có các cách chuyển hóa, các loại
hocmon, hoặc các yếu tố phát triển riêng biệt. Tương tự các chất có
tiềm lực độc hoặc đề kháng đột biến có thể được đánh giá trên tế bào
nuôi cấy.
 Dùng để sản xuất các mảnh mô nhân tạo bởi sự tổ hợp đặc biệt
các loại tế bào trong sự phát triển liên tục…. Điều này được xem là có
tiềm năng cho việc sản xuất các loại da nhân tạo cho việc trị bỏng.
 Tổng hợp các sản phẩm sinh học có giá trị, từ một lượng lớn tế
bào nuôi cấy. Khối sinh học rộng lớn của sản phẩm tế bào và bao gồm
các loại protein đặc biệt hoặc các vi khuẩn mà đòi hỏi các tế bào động
vật cho sự nhân giống.
131
9.ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY TẾ BÀO
 Trong tất cả các trường hợp khảo sát đều có thể dùng tế
bào nuôi cấy (tế bào gan) hoặc dùng mô động vật nuôi cấy
(chuột).
 Ngành Sinh hóa vẫn dùng gan như một nguồn tế bào cho
nghiên cứu men hoặc cho việc nghiên cứu chuyển hóa,
 Tại sao fải dùng tế bào động vật yêu cầu thời
gian khá dài trong sự chuẩn bị và đòi hỏi nhiều điều
kiện trang thiết bị đặc biệt?
132
9.ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY TẾ BÀO
 Thuận lợi
 tính ổn định và khả năng lặp lại của những kết quả có thể
thu nhận được từ việc dùng 1 lô của cùng một loại tế bào và tốt
nhất là dùng 1 dòng thuần chủng.
 có thể tiến hành phân tích sinh hoá tại nơi chính yếu có quan
hệ
tới 1 phần của chuyển hóa của một vài loại tế bào.
 trong tế bào nuôi cấy thuần chủng có thể chứa những dòng tế
bào có thể giám sát được về sinh hóa và đặc tính kiểu
gen*, nhưng lại rất khó cho trường hợp phân tích một mảnh mô
thuần chủng là mảnh mô có thể chứa nhiều loại tế bào khác
• Rấtnhau ở các
khó trong mứcphân
TH exvivo, độ phát triển
tích mẫu và khả
mô thuần năng
chủng, sống.
có nhiều loại TB khác nhau => tương tác,
• giữa các TB cũng khác, mức độ phát triển, khả năng sống cũng khác => ex vivo sai biệt hơn in vitro
• Dòng TB
133
9.ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
TẾ BÀO
 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào giúp nhận biết tốt hơn về ảnh
hưởng của các chất trên từng loại tế bào đặc thù như tế bào
gan.
 Các thử nghiệm độc tính trên tế bào nuôi cấy sẽ bớt đắt tiền
hơn so với thử nghiệm độc tính tiến hành trên thú vật.
 Với khả năng có một lượng lớn các tế bào nuôi cấy, có thể
tránh được sự lây nhiễm các vi khuẩn không mong muốn
hoặc các protein quan trọng khác.
 Nuôi cấy tế bào dễ dàng để có được một sinh khối tế bào có
đặc tính tốt hơn là dùng một mảnh mô động vật nghèo nàn.
Muốn thử nghiệm trên bn TB thì nuôi ra chứ không phải nuôi 1 lần 50 con choột rồi giết
134
9. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY TẾ BÀO Bất lợi này ít xra do đã khảo sát từ đầu
Bất lợi này ít xra do đã khảo sát từ đầu
 Bất lợi
 sau thời điểm tiếp tục mọc, tính chất các tế bào có thể thay
đổi và có thể sẽ khác nhiều so với các tế bào gốc từ động
vật.
 Tế bào có thể thích ứng với các điều kiện nuôi dưỡng khác
nhau. Sự thích ứng này liên quan đến những thay đổi
hoạt động của các men trong nội bào.
 Sự thích ứng nuôi cấy của các tế bào phát triển nhanh (là
những tế bào được chọn lọc) sẽ được duy trì trong dòng
tế bào.
135
9. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY TẾ BÀO
 Những thay đổi trong việc phát triển và trong các đặc tính
của một dòng tế bào là rắc rối thật sự trong việc dùng
tế bào nuôi cấy để nghiên cứu hành vi của tế bào trong
cơ thể sống.
 Sau một thời điểm nuôi cấy, tế bào có thể có những
dấu hiệu khác biệt rõ rệt so với những tế bào gốc và từ
những khác biệt này chúng trở nên biệt hoá cao hơn sau
nhiều lần nuôi cấy chọn lọc và khác xa so với những tế
bào gốc trong cơ thể sống là nơi cơ thể luôn phát triển
không ngừng,
 Từ đó đưa đến những khác biệt trong kết quả thử nghiệm
giữa in vitro và in vivo
Lưu ý: thử nghiệm trong thời gian ngắn sẽ ít gặp các bất lợi này
136
B. 2. KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO
1.Nuôi cấy sơ cấp:
 Là quá trình nuôi tế bào lấy trực tiếp từ mô trước lần cấy
truyền ban đầu
 Hỗn hợp các dòng tế bào khác nhau tách từ mô, có thể chứa
một số tế bào có tính năng vượt trội
 Loại bỏ các tế bào không quan tâm bằng nhiều cách như
dùng cơ học, dùng enzyme, hoặc bằng cách chọn lọc tế bào
có khả năng sống sót trong một số điều kiện nhất định trong
nuôi cấy.
137
Loại bỏ mỡ các chuyên gia thường làm hơn

Các bước tiến hành:
 Thu nhận mô: vô khuẩn, loại bỏ mỡ, phần thừa phần màng gân
máu…
 Tách rời tế bào:
 cơ học
 Enzyme: pH trung tính hoặc kiềm
 trypsin (cần Ca2+), hoạt động vùng gốc serin, histidin…
 collagenase hoạt động vùng chuỗi xoắn (ít làm hư hại tế bào),
 elastase, pronase, dispase, chymotrypsine…
 Kết hợp cả hai
 Tách theo gradient tỉ trọng để thu dòng TB mong muốn
 Tách tế bào dùng marker bề mặt: dùng phân lập tế bào gốc bằng
cách gắn phân tử huỳnh quang vào receptor mang điện tích âm và
được thu nhận chọn lọc riêng
 Lọc ly tâm, bắt đầu nuôi cấy
Chọn PP tách rời TB tuỳ dòng mô và phù hợp vs miếng mô ptich
138
Sự ấp tế bào:
 ấp các tế bào trong dịch môi trường đã được tiệt trùng tại tủ ấp 37 oC và có
nồng độ CO2 là 5 % .
 Để có được tỉ số phát triển hợp lý, tế bào nên được gieo cấy ở nồng độ 104
-105 tế bào trong 1 ml dịch môi trường sẽ thu được khoảng 106 – 107 tế
bào /ml sau 3-4 ngày nuôi cấy.
 Tế bào sẽ bám dính vào giá đỡ nuôi cấy trong vài giờ ngay sau khi được
ấp.
 Quá trình bám dính là từ sự dát mỏng và trải dài ra của tế bào tới thành
dạng đặc tính của tế bào.
 Sự phát triển của tế bào sẽ ngừng khi thức ăn bị giới hạn, hoặc khi có
tích lũy chất thải độc hại thải ra trong quá trình chuyển hóa hoặc sự thiếu
thốn bề mặt phát triển.
 Nếu môi trường được thay thường xuyên sau mỗi 2 ngày, mật độ tối đa
của tế bào sẽ có thể cao hơn 106/ml.
139
2.Nuôi cấy thứ cấp – Cấy truyền
 Khi tế bào mọc phủ dầy đặc chai nuôi sẽ làm tế bào phát
triển chậm hoặc ngừng phát triển,
 Để tiếp tục một dòng nuôi cấy mới phải cấy tế bào vào trong môi trường
nuôi cấy sạch. Đó là môi trường nuôi cấy thứ cấp hoặc cấy truyền.
 Kết quả cấy truyền của các loại tế bào phụ thuộc
 bề mặt chất nền (cho nó rộng rãi hơn)
 phụ thuộc sự tách rời của các tế bào từ bề mặt nền (nếu tách rời không đủ
=> lấy ra thiếu)
 phụ thuộc việc cấy trở lại tế bào trong môi trường sạch được chứa
đựng trong một chai cấy mới.
 Việc cấy truyền để bảo đảm sẽ có được mật độ tế bào tiếp
tục phát triển trong một dòng nuôi cấy mới.
 Tế bào sẽ mất khả năng sống nếu b ị t h a y đổi hoặc ngừng
không cung cấp dịch môi trường nuôi cấy quá dài trước khi được cấy
truyền.
140
 Để tế bào có thể mọc được trong dịch treo, tế bào nuôi phải
được hòa loãng một nồng độ cao với môi trường nuôi cấy.
 Tỉ lệ hoà loãng từ 1:2 tới 1:10 v/v mới đủ nồng độ để đáp ứng cho
thí nghiệm và cũng để bảo đảm tế bào nuôi cấy mới sẽ ở trong
điều kiện tối ưu là 37 oC và pH 7.4 cho sự phát triển của tế bào
 Nếu tế bào quá dày đặc sẽ làm tăng nhiệt độ trong giếng nuôi và
trong tủ ấp, làm thay đổi pH môi trường.
141
 Qúa trình nuôi cấy cho số lần nuôi cấy truyền được kể từ khi
tế bào được nuôi cấy tới khi được thu nhận hoặc phân lập tế
bào.
 Quan hệ giữa số lượng lần cấy truyền và số lượng tế
bào tùy thuộc vào tỉ lệ tế bào được tách ra.
 Đơn giản nhất là trường hợp tế bào đã mọc dầy đặc và được
cấy truyền thành 2 dòng tế bào mới, đó là tỉ số tách ra làm 2,
trong trường hợp này, số lượng chung và số lần cấy truyền là
bằng nhau.
142
Trysinazing (tách tế bào khỏi giá đỡ)
 Tế bào bám dính được tách rời khỏi các bề mặt bởi q u á t r ì n h
trypsinazing, men proteolytic trypsinase được dùng để làm vỡ các
protein nối kết các tế bào vào bề mặt nuôi cấy,
 Trypsinase sẽ được thêm vào trong chai đựng tế bào đã được rửa sạch
môi trường trước đó trong một thời gian ngắn vừa đủ để làm bật tế bào
ra khỏi vị trí mặt nền nhưng không quá dài để có thể làm hại đến tế bào.
(<5ph)
 Sau đó ly tâm để tách riêng tế bào. Lúc này cho thêm dịch môi
trường vì sự dư thừa protein trong dịch môi trường sẽ đáp ứng việc
làm pha loãng và giảm tác dụng của trypsine.
 Nếu tế bào mọc được trong môi trường không có serum huyết thanh tức là
không có sự dư thừa protein trong dịch môi trường thì chất ức chế
trypsinase từ đậu nành có thể được dùng để bảo đảm khả năng ức chế trysin
không phá hủy tế bào do có protein trong đó.
TB sau khi tách xong, cho vào MT nuôi cấy mới sau vài ngày sẽ bám dính lại trên MT mới
143
Trysinazing (tách tế bào khỏi giá đỡ)
1.5ph khi tách = trypsinase

3ph mọc lại trong môi trường
143
học này, sẽ bị hỏi thi !!!!!
3.ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
 Nhiệt độ: Tốt nhất ở 37 oC,

 nếu ở nhiệt độ thấp hơn thì tỉ lệ mọc
sẽ bị giảm nhưng không bị hư hỏng ,
 ở nhiệt độ cao hơn tới 39-40 oC sẽ phá hủy tế bào.
 Nhiệt độ tủ phải không được thay đổi trong
tủ cấy trong suốt thời gian ấp.
Tủ cấy k đòi hỏi nhiệt độ phải đúng 37 như tủ ấp
144
 pH của môi trường nuôi cấy duy trì bằng hệ đệm CO2 là hệ đệm chính
trong tuần hoàn máu của sự sống. CO2 + H2O + HCO3 + H+; pKa của hệ
thống đệm này là 6.3, đủ nhưng không phải thực sự lý tưởng.
 Duy trì nuôi cấy ở pH 7.4 là pH tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Hệ
đệm trong môi trường lỏng tùy thuộc sự hiện diện của CO2 trong pha khí.
 Để kiểm soát pH, một khí quyển giàu CO2 sẽ được cung cấp trong tủ
nuôi cấy.
 Tùy loại tế bào có thể yêu cầu pH môi trường khác nhau.
 Nồng độ CO2 trong môi trường: nồng độ của bicarbonate trong dịch
môi trường (24 mM) duy trì một sự cân bằng CO2 tại áp suất trong pha
khí là 40 mmHg, tương ứng với 5 % CO2. Trong một vài công thức dịch
môi trường, nồng độ muối bicarbonate có thể cao hơn tới 48 mM. Lúc
đó cần đặt nồng độ CO2 bằng 10 % nhằm duy trì pH của tủ cấy.
Nồng độ CO2 nên khảo sát theo hướng dẫn protocol
145
Tủ ấp mở ra phải đóng lại ngay
 Ngay cả khi với hệ thống CO2 đã đặt, sự nuôi cấy vẫn phải
trải qua thay đổi pH trong suốt thời gian nuôi cấy.
 Trong giai đoạn sớm của nuôi cấy, sự tăng nhẹ pH có thể xảy ra là kết quả
của sự phân ly bicarbonate trong môi trường.
 Tuy nhiên khi tế bào phát triển và năng lượng chuyển hóa đã được xác
lập tốt, việc sản xuất acid lactic trong chuyển hoá sẽ gây ra thay đổi pH từ
từ.
 Sự tiến triển pH này trong nuôi cấy không nên vượt quá
khoảng pH từ 6.8 – 7.6 tốt nhất là 7,4 => tủ ấp mở ra phải đóng lại
ngay
 Sự thay đổi pH có thể theo dõi bằng màu sắc của phenol đỏ
thường xuyên hiện diện trong dịch môi trường nuôi cấy.
 Nếu pH thay đổi quá acid sẽ làm đổi màu của dịch môi trường sang vàng.
(thường là do nhiễm khuẩn) -> thường do nhiễm khuẩn or để dịch nuôi cấy
quá lâu (quá 2 ngày) chuyển màu vàng
 màu hồng nhạt do cạn chất dinh dưỡng khi để qua lâu không thay môi 146
trường (sau 2 ngày)
4.CÁC THÀNH PHẦN TRONG MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY
 Cacbohydrat-glucose được dùng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy để
cung cấp nguồn năng lượng, như một tiền chất (precursor) cho quá trình sinh
tổng hợp ribosome cần thiết cho sự tổng hợp acid nucleic.
 Cacbonhydrat cũng có thể thay thế bởi các đường khác như gluccose,
fructose..nhằm làm giảm phóng thích acid lactic góp phần ổn định pH của môi
trường nuôi cấy.
 Trong một số trường hợp không có glucose, tế bào cũng có thể sống sót sau một
thời gian nhất định.
 Amino acid ở nồng độ 0,1 – 0,2 mM là nguồn tiền chất tổng hợp protein.
Glutamin nồng độ cao trong môi trường sẽ hoạt động như tiền chất cho chu
trình acid tricarboxyclic (chu trình Kreb).
 Ammonia tạo ra trong quá trình chuyển hóa sẽ phá hủy glutamin và ức chế quá trình
phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy.
Lướt
147
NUÔI CẤY
 Muối là chất điện giải
 giúp cân bằng áp suất thẩm thấu tế bào
 cân bằng hiệu điện thế màng, giúp tế bào bám giá thể tốt hơn .
 Muối và glucose là tác nhân tác động vào áp suất thẩm
thấu của môi trường, tác động vào chức năng tế bào
 Nồng độ của dung dịch môi trường chuẩn khoảng 300
mOs/l và là nồng độ chung cho hầu hết các dòng tế bào.
 Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào bằng cách
thêm NaCl
Lướt
148
NUÔI CẤY
 Vitamin và hocmon hiện diện trong dịch môi trường ở nồng
độ thấp được dùng như một yếu tố đồng chuyển hóa.
 Trong các môi trường khác nhau có thể dùng những công
thức khác nhau tùy theo yêu cầu của các dòng tế bào
khác nhau về nguồn vitamin và hocmon.
 Đỏ phenol là chỉ thị theo dõi pH của môi trường nuôi cấy.
 Tại pH thấp, phenol đỏ (pH 7) chuyển màu vàng, hoặc
màu cam (pH 6,5).
 Nếu màu chuyển nhanh trong một đêm, từ đỏ sang vàng
thường là trường hợp môi trường đã bị nhiểm khuẩn.
Thiết lập MT gần giống với huyết tương để dễ nuôi cấy

149
4.CÁC THÀNH PHẦN BỔ SUNG TRONG MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY
 Huyết thanh được thêm vào với nồng độ 10% để thúc đẩy tế
bào phát triển.
 thường dùng Huyết thanh bò hay ngựa
 đặc biệt huyết thanh bê (fetal calf serum-FCS) có hiệu quả cao do chứa
đựng các yếu tố phát triển rất cao, tuy vậy FCS đắt tiền.
 các huyết thanh thường được lọc trước khi dùng.
Một vài trường hợp đòi hỏi những xử lý đặc biệt, nhưng đều qua
những bước như sau :
 Tiệt trùng bằng tia cực tím
 Kích hoạt ở nhiệt độ 56 oC trong 30 phút.
 Lắc với ethanol để loại bớt -golubin chứa trong serum. Giai đoạn này rất
quan trọng trong việc phân lập kháng thể đơn dòng do globulin trong serum có
thể gây trở ngại với dịch chiết hoặc xác định kháng thể.
 Thẩm thấu serum để loại phân tử lớn trong serum.
 Xử lý loại amino acid, hydratcarbon hoặc nucleotide chứa trong
serum.
150
NUÔI CẤY
Bất lợi khi dùng huyết thanh - serum
 Có những biến đổi hóa học không rõ giữa những lô thử nghiệm có
thể là kết quả trong sự thúc đẩy mâu thuẫn của huyết thanh.
 Huyết thanh rất đắt, FCS có thể chiếm 70 – 80% giá trị của một vài
loại công thức cho môi trường. Điều này cần phải xem xét đến khi
tiến hành các thử nghiệm lớn.
 Các protein chứa trong serum có thể tác động đến quá trình chiết xuất
và t i n h chế prootein tiết ra từ tế bào làm ảnh hưởng
đến việc đọc kết quả.Protein của huyết thanh còn sót lại -> nhuộm luôn -> sai KQ
151
NUÔI CẤY
 Kháng sinh được thêm vào trong môi trường dùng trong những
đợt nuôi cấy ngắn thời gian đề phòng lây nhiễm khuẩn.
 Nồng độ kháng sinh nên được dùng xác định theo kinh nghiệm mà
tại nồng độ đó chúng không gây độc tế bào.
 Thường dùng hỗn hợp kháng sinh: penicillin G 100 U/ml ức chế khuẩn
gram dương, streptomycin 50 mg/l ức chế khuẩn gram âm và dương,
amphotericin như yếu tố kháng nấm 25 mg/l
 Việc dùng kháng sinh cho các lần cấy truyền hoặc trong việc
cất giữ tế bào không được lạm dụng
 mức độ thấp của vi khuẩn hoặc nấm có thể bị che lấp và có thể
gây ra các rắc rối trong những ngày sau đó
 việc lạm dụng kháng sinh c ó t h ể g â y lờn thuốc và nhiễm
khuẩn chéo.
Nay cố găng k thêm KS vào MT

152
NUÔI CẤY
Các hocmon và các yếu tố phát triển.

 Các cơ chất, ví dụ như tế bào keratin, tế bào gan và tế bào
thần kinh được thêm vào dịch môi trường có thể duy trì tình trạng
biệt hóa của những loại tế bào đặc hiệu
Yếu tố hóa học:
 dung môi như DMSO c ó t h ể c h o phép duy trì trạng thái biệt
hóa bằng một hiệu ứng làm lỏng trên màng tế bào (dùng trong
lưu trữ tế bào) – không bị vỡ trong TH đông cứng do -196 oC nhưng
dư ra thì sẽ ảnh hưởng KQ, làm chết tế bào
Nồng độ DMSO cho phép trợ tan phải dưới 1% vì cho nhiều làm vỡ MTB
153
EMEM là MT cơ bản nhất hiện nay, còn DMEM là MT giàu chất dinh dg nhất hiện nay
4.CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Môi trường Chú thích
BME Eagle’s basal medium, được thiết kế cho tế bào L và Hela
EMEM Eagle’s minimal essential medium, dùng được cho rất
nhiều dòng tế bào (MT tối thiểu cơ bản nhất)
DMEM Dulbecco’s modification of Eagle’s medium, có x4 nồng độ
đậm đặc aminoacid và vitamin của BME (MT giàu yếu tố
phát triển, dinh dưỡng)
GMEM Glasgow’s modification of Eagle’s medium, có x2 nồng độ
đậm đặc aminoacid và vitamin của BME
RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institude medium, dùng cho tế bào
bạch huyết và hybridoma nuôi cấy
Leibovitz Dùng cho sự phát triển của nguyên bào sợi khi thiếu CO2
trong khí quyển.
Ham’s F-12 dùng được cho rất nhiều dòng tế bào
199 Môi trường đầy đủ không có huyết thanh 154
NUÔI CẤY
Amino acid mg/l Vitamins mg/l
L.arginine 21-1 D.biotin 1.0
L.cystine 12.0 D.Ca-pantothenate 1.0
L.glutamine 292 Choline Chloride 1.0
L.histidine HCl.H2O 10.5 Folic acid 1.0
L.isoleucine 26.2 I-inositol 1.8
L.lysine 36.5 Nicotinamide 1.0
L.methionine 7.5 Pyridoxal HCl 1.0
L.phenylalanine 16.5 Riboflavin 0.1
L.threonine 23.8 Thiamine HCl 1.0
L.tryptophan Lướt 4.0
L.tyrosine 18.1
L.valine 23.4
155
5.Kỹ thuật vô trùng khi nuôi cấy tế bào
 Dùng nhiệt ẩm >100 oC: Áp dụng cho dụng cụ thí nghiệm
 Nồi hấp autoclave
 Chiếu xa:̣
 tia UV 260 nm tác động cấu trúc DNA có thể gây đột biến tế
bào, chỉ dùng khử trùng không khí, trang thiết bị, bàn ghế trong
PTN…
 Tia gamma khử trùng hiệu quả với vật không chịu nhiệt
 Hóa chất: hiệu quả cao
 Cồn Đặc biệt là cồn 70 độ, cồn ưu tiên hơn formaldehyd
 Formaldehyde
 PP Lọc
 Bộ lọc vi khuẩn và nấm: lỗ lọc 0.2 micromet giữ vi khuẩn
(màng lọc milipore)
 Bộ lọc virus: lỗ lọc 0.1 micromet, 15 nanomet…
 Màng lọc HEPA (high effeciency particulate air filter): lọc vật
thể ≥ 0.3 µm kha ̉ năng lọc 99,97 %
156
6.Kiểm soát nhiễm
 Phát hiện nhiễm
 Môi trường đục
 Đổi màu môi trường đỏ sang vàng (trung tính sang acid)
 Có hình sợi, hình cầu hay tụm thành nùi, giống nấm mốc
 Mycoplasma phát triển chậm, làm thay đổi chức
năng và
chuyển hóa tế bào, gây sai hỏng NST…rất khó phát hiện
 Virus nội sinh
 Retrovirus ngoại sinh
 Nhiễm chéo dòng tế bào (35% trong PTN)
 Ngăn ngừa nhiễm: kỹ thuật vô trùng PTN
Là cách xử lý mẫu duy nhất vì k thể nào tách VSV ra được (bỏ mẫu)
 Loại bỏ nhiễm
Mycoplasma nguy hiểm nhất !!!! 157

6.Kiểm soát nhiễm
 Simulated phase contrast images of adherent 293 cells contaminated with E.
coli. The spaces between the adherent cells show tiny, shimmering
granules under low power microscopy, but the individual bacteria are not
easily distinguishable (panel A). Further magnification of the area
enclosed by the black square resolves the individual E. coli cells, which are
typically rod-shaped and are about 2 µm long and 0.5 µm in diameter. Each
side of the black square in panel A is 100 µm
Khoảng cách giữa các tế bào rất nhỏ, nếu nhiễm vi khuẩn sẽ lẫn trong
các khoảng cách tế bào và rất khó để phát hiện
158
159
Hình ảnh tế bào bị nhiễm
7. ĐỊNH TÍNH GIÁM SÁT DÒNG TẾ BÀO
 Sự cần thiết định tính giám sát dòng tế bào: Vì có nhiều
dòng tế bào khác nhau cùng được giữ trong cùng phòng thí
nghiệm, điều này rất nguy hiểm bởi nguy cơ lây nhiễm chéo.
 Năm 1960, khi thấy có nhiều dấu hiệu phân chia gen từ dòng
tế bào gốc Hela, phát hiện có rất nhiều biến đổi giữa các dòng tế
bào và tế bào Hela trong phòng thí nghiệm.
 Tế bào Hela phát triển rất nhanh, khả năng này hơn tất cả dòng tế
bào khác.
160
 Dòng tế bào được tiếp tục phát triển trong nuôi cấy có nhược
điểm là có thể biến đổi gen, phát sinh thông qua quá trình biến đổi bên
trong của gen của tế bào nuôi cấy bằng sự thay đổi hoặc lựa chọn áp
suất.
 Tế bào phát triển qua vài lần cấy truyền trong nuôi cấy có thể khác
những tế bào gốc ban đầu
 Do những lí do này, giám sát đều đặn những đặc tính của dòng tế
bào tiếp tục phát triển trong những khoảng thời gian nhất định là
quan trọng và cần thiết.
Lướt 161
7.GIÁM SÁT CÁC DÒNG TẾ BÀO NUÔI CẤY
Để giám sát định tính dòng tế bào nuôi, có nhiều cách.
Thông thường nhất là đếm
=> Đếm theo một thời gian đều đặn ít nhất 1 lần/ ngày
 Có hai cách đếm:

 Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hoặc dùng dòng điện.
=> cần lưu ý phải trộn đều lắc kỹ trước khi lấy mẫu đếm.
 Đếm gián tiếp: đo men trong quá trình chuyển hoá của tế
bào, đo lượng glucose, đo màu của sản phẩm kết hợp
protein, đo ty thể.v..v..
Đếm trực tiếp để theo dõi hằng ngày, đếm gián tiếp tính KQ mong muốn
162
Cách đếm trực tiếp :

 Đếm tế bào chết: dùng trypan blue, nhuộm màng tế bào của tế bào
không còn khả năng sống
 Phần trăm tế bào chết bằng số lượng của tế bào chết
trên tổng số tế bào.
 Đếm hạt nhân: Cho hỗn hợp acid citric và tím tinh thể vào sẽ làm tế
baò bị tiêu huỷ, phóng thích nhân v à n h â n sẽ bị nhuộm tím.
 Những trường hợp kỹ thuật làm không tốt sẽ cho kết qua cao
hơn kết quả thực sự (nồng độ TT, thời gian tiếp xúc TT…)
163
 Đếm bằng máy: dùng khi cần đếm nhanh một số lượng lớn
tế bào của hàng ngàn mẫu
 Lấy 0.5 ml thể tích dung dịch tế bào trong hệ đệm, đổ mạnh vào một cái
ống có lỗ đường kính là 70 m.
 Dòng chảy tế bào sẽ bị ngừng đột ngột giữa 2 dòng điện, 1
dòng bên ngoài và một dòng bên trong của ống.
 Quá trình này gây ra xung điện và được ghi nhận trên máy đếm
 Các tiểu phân nhỏ hơn tế bào bị đào thải, tiểu phân lớn hơn bị loại ra bởi
kích thước của đường kính lỗ trên ống.
 Thuận lợi của PP đếm trực tiếp: tốc độ phân tích đáp ứng việc
đếm hàng ngàn mẫu trong thời gian ngắn.
 Bất lợi của PP đếm trực tiếp : chỉ đếm được trong dịch treo, hậu
quả là các phần tế bào sống trong mẫu có thể không được xác định hết.
164
Cách đếm gián tiếp :

 Nguyên tắc chung: dùng máy đo màu đo các thành phần có
thể tạo màu trong tế bào,
 có rất nhiều pp thích hợp để đo hàng ngàn mẫu.
 Phương pháp có thể bị ảnh hưởng do các chất trong tế bào có
thể bị nhiều tác động phá hủy trong quá trình nuôi cấy tế bào.
 Ví dụ, các protein và men sẽ cao trong thời kỳ phát triển và
thấp trong thời kỳ flag và chờ.
165
 Phương pháp đếm tế bào gián tiếp:
 xác định protein,
 xác định thể men lysosome,
 xác định ty thể (mitochondrial),
 xác định DNA,
 xác định các chất,
 các enzyme tiết ra trong quá trình thử nghiệm,
 chuyển hóa của tế bào thông qua các phản ứng màu.
 Tùy từng trường hợp cụ thể dùng các thuốc nhuộm màu khác nhau
do cơ chế tạo màu của các chất với thuốc nhuộm cũng khác nhau.
 So sánh và đánh giá các thuốc nhuộm thường dùng để lựa chọn
thuốc nhuộm có thể dùng trong thí nghiệm cho hiệu qua ̉ cao va ̀
chính xác nhất.
166
Đây là PP thường dùng
Phương pháp đo màu các ty thể trong tế bào sống (pp MTT)
 Thuốc nhuộm tetrazolium, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl2,5
diphenyltetrazolium bromide cho sản phẩm màu dưới xúc tác của men
dehydrogenase và thể hiện màu tuyến tính với mức độ của ty thể hoạt
tính (mitochrondrial) trong tế bào.
 Màu thay đổi từ vàng tới xanh tỉ lệ với sự chuyển hóa của tế bào.
 cần xem xét sự biến đổi trong kết quả giữa các dòng tế bào
 một vài dòng tế bào cho kết quả thấp trong phương pháp này.
 Thuận tiện khi dùng nhiều mẫu và lặp lại nhiều lần,
 một vài máy đọc đa đĩa the reader multiplate có khả năng đo động học
trong quá trình phản ứng trong từng giếng của 1 đĩa có 96 giếng.
167
Chuẩn bị
 Muối MTT tetrazolium 5 mg/ml PBS, để trong tối ở 4 oC và lọc tiệt trùng.
 Trước khi dùng, hòa loãng với tỉ lệ 1 : 10 trong DMEM chứa 1%
FCS nhưng không có đỏ phenol.
 Tế bào được cấy trong dĩa cấy 96 giếng (100µl dịch treo tế
bào/giếng).
 Mật độ tế bào được đếm trước khi cấy để đảm bảo đủ số lượng cho tế
bào mọc theo cấp số nhân cho một thử nghiệm trong vòng 4 ngày, sẽ
tương ứng với đô ̣ hấp thu không qua ́ gia ́ tri ̣ 1.8
Lướt 168
Tiến hành
 100 µl môi trường nuôi cấy hoặc môi trường nuôi cấy có chứa thuốc thử
nghiệm được thêm vào trong các giếng.
 72h sau khi thêm thuốc, 0.1 µl MTT sẽ được thêm vào từng giếng (nồng
độ cuối cùng là 0.5 µg/ml) rồi đậy đĩa 96 giếng bằng giấy bạc, để trong tủ ấp
37 oC trong 3h,
 loại bỏ dịch môi trường trong dĩa 96 giếng, thêm 0.1 ml dung dịch 1N
HCl isopropanol (1 : 24, v/v) vào giếng để chiết và hòa tan formazan, các
tinh thể formazan.
 các tinh thể formazan hòa loãng với 150 µl DMSO chứa 0.5% FCS/giếng.
 Sau khi để 10 phút tại nhiệt độ phòng, lắc trước khi cho vào máy đọc Titertek
microplate reader tại bước sóng 570 nm.
 Thử nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
3l ở đây là 3l trên số dĩa thiết kế cho thử nghiệm

169
Đếm tế bào bằng pp đo màu xác định protein :
 Protein trong tế bào có thể biến đổi trong quá trình nuôi cấy thể hiện
bằng sự thay đổi kích cỡ của tế bào.
 Thông thường các hoạt động của men sẽ liên quan tới các protein trong tế
bào.
 Pp đo màu xác định protein nhạy nhất là pp của Lowry và Bradford.
 nhanh, nhạy, ít các yếu tố trở ngại
 sự tiêu hủy tế bào được tiến hành bằng cách hoà tế bào trong NaOH và thêm
thuốc thử xanh Coomassie để nhuộm protein của tế bào bị tiêu hủy.
 màu xanh sẽ xuất hiện trong vòng 10 phút
 đo UV và so sánh với protein của mẫu chứng.
170
Trong thời gian từ 1980 trở lại đây, người ta dùng pp SRB với nhiều ưu
điểm hơn phương pháp Bradford.
Sulforhodamin B assay (SRBa): đo protein trong tế bào.
 nhanh, nhạy và rẻ (không xài DMSO)
 thích hợp cho các mục đích ứng dụng trên một lượng mẫu lớn,
như trường hợp viện nghiên cứu bệnh ung thư từ phương
Đông (NCI).
 các thử nghiệm sàng lọc thuốc có tác dụng chống ung thư, là
những thử nghiệm có thể yêu cầu tới vài triệu giếng nuôi cấy
trong một năm.
171
Phương pháp SRB của Skehan (1980) thực hiện tương tự như
MTT,
 Giai đoạn cuối của việc ấp, tế bào sẽ được cố định protein với 50%
Trichloroacetic acid ở 4 oC, (50 µl/giếng, nồng độ cuối cùng là 10%)
trong 1h.
 Sau khi rửa với vòi nước, tế bào sẽ được nhuộm trong ít nhất 15
phút với 0,4% SRB, rồi hòa loãng với acid acetic 1%,
 Sau đó rửa nhiều lần với acid acetic 1% để loại bỏ các chất nhuộm
dư.
172
 Làm khô dĩa 96 giếng và các protein nhuộm sẽ được hòa trong 150 µl
10 mM/l Tribase.
 Mật độ tế bào quan sát bằng máy đọc tại bước sóng 510 hoặc 540
nm.
 Kêt quả của PP nhuộm SRB thay đổi theo thời gian cố định protein
trong TCA và nhạy với nồng độ huyết thanh.
 Cố định protein trong vài giờ sẽ làm tăng kết quả cao hơn. Nếu kéo dài thời
gian cố định trong TCA qua đêm, thì kết quả sẽ tăng gấp đôi.
 Nếu nồng độ huyết thanh FCS dùng là 10% thì kết quả đọc OD sẽ tăng gấp
đôi so với nồng độ 5% FCS. Dư sẽ ảnh hưởng KQ
Lưu ý: thời gian càng lâu độ nhạy của PP này càng tăng (qua đêm tăng gấp đôi)
173
SRB là thuốc nhuộm màu hồng gốc aminoxanthene có 2 nhóm sulfonic.
Ưu điểm của pp nhuộm SRB

 Màu của thuốc nhuộm phát triển nhanh ổn định và nhìn thấy được bằng
mắt thường.
 Đơn vị OD của phương pháp SRB có thể đo trên khoảng rộng, có tính tuyến
tính với tế bào, có thể quan sát được ở mật độ tế bào rất thấp (<2.000 tế
bào/giếng),
 MTT không có phản ứng khi đo ở nồng độ tế bào thấp, ở mật độ < 16.000
tế bào/giếng đã không có dấu hiệu khác với mẫu trắng.
 Khi để khô ngoài không khí, các mẫu có thể được cất giữ không hạn định
mà không bị hư hỏng.
 Phương pháp nhuộm SRB cho sản phẩm không dễ b ị h ư h ạ i nên
không cần thiết ngâm bảo quản mẫu.
174
Xem thêm ít sd

NR (Neutral red) assay:
 Cơ bản của pp này là tác dụng của đỏ trung tính nhuộm các tế bào
sống sót và sự tích lũy của chúng trong những tế bào sống không bị
tổn thương.
 Pp này được dùng rộng rãi trong nhiều lãnh vực để đáng giá tác dụng
độc trên tế bào.
 xác định protein của tế bào sau khi cấy tế bào, ấp tế bào với tác
nhân gây độc, rồi chiết chúng ra và nhuộm.
 Mới đây, vi phân đoạn tế bào gan S-9 đã được dùng để xác định tác
dụng độc tế bào do những yếu tố này cần trong chuyển hóa sinh học
tế bào.
 Chuẩn bị TT: 50 g NR /ml vào dịch môi trường nuôi cấy, ủ qua
đêm ở nhiệt độ 37 oC
 Ly tâm trước khi dùng để loại bỏ các tủa mịn của tinh thể thuốc
nhuộm
175
. Tiếnhành:
 Thêm vào từng giếng nhỏ của dĩa 96 giếng 0.2 ml dịch môi trường có
chứa 9x103 tế bào.
 Ủ dĩa 96 giếng trong 24h để đạt tới mật độ tế bào là 60-70 % mức độ
phủ dầy đặc trong mỗi giếng.
 Sau khi ủ 24h, loại bỏ dịch môi trường,
 Tùy lô chứng hay lô thử nghiệm, thêm vào mỗi giếng 0.2 ml medium có
chứa 50 g NR/ml đã chuẩn bị như trên,
 Các dĩa 96 giếng được đưa trở lại ủ trong 3h để nhuộm các lysosome
của tế bào sống không bị tổn thương,
 loại bỏ môi trường, rửa nhanh với hỗn hợp của 1% formaldehyde, 1%
CaCl2
 thêm 0.2 ml dung dịch 1% acid acetic, 50 % ethanol để chiết lấy sản
phẩm đã được nhuộm,
 Lắc tại nhiệt độ phòng trong 10 phút, đọc bằng máy với kính lọc 540
nm để đo độ hấp thu của các chất nhuộm chiết được.
 Các độ hấp thu đo được có liên quan tuyến tính với số lượng tế bào
sống
sót.
176
Xác định ADN:

 ADN chứa trong tế bào thể lưỡng bội là hằng số, mặc dù các biến
đổi có thể xảy ra như là một kết quả của sự sắp xếp tế bào thông
qua chu kỳ của tế bào.
 Tế bào trong pha đầu, G1 có thể lưỡng bội bình thường
chứa trong ADN là loại 6pg cho một tế bào.
 Đo ADN là phương pháp tốt nhất có thể dùng để đếm tế bào trong
một mảnh mô rắn.
 Phương pháp chung là hòa tế bào trong thuốc thử
diphenylamine là thuốc thử cho màu xanh với ADN.
177
 Đo DNA bằng pp đánh dấu với chất phát quang

Xác định chất phát quang fluoresencent
 Hoechst 33258 hoặc DAPI là những loại chất phát quang
gắn kết được với ADN.
 Pp dùng m- diaminobenzoic acid (DABA) đánh giá
ADN thường sử dụng
 DABA-2HCl thuỷ giải ADN do sự hiện diện của HCl và thuỷ
giải cho các phản ứng tiếp theo khác giữa ADN và
deoxyribose tự do.
 Đo huỳnh quang kết quả của phản ứng giữa ADN và thuốc
thử để tính được mật độ tế bào trước và sau phản ứng.
178
Bovine Pulmonary Artery Cell Actin and Tubulin FITC-
TRITC Bandpass Emission (Dual Band Excitation)
Set
179
Xác định lactate dehydrogenase:
 Sự mất khả năng sống của tế bào biểu hiện khi màng tế bào đã bị hủy
hoại.
 Loại màng tế bào này cho phép các phân tử lớn có thể thẩm thấu
vào hoặc ra qua màng trong một cái bể chứa.
 Là nguyên tắc cơ bản khi dùng xanh trypan nhuộm tế bào, quan sát
với dụng cụ đếm xem tế bào sống hoặc chết
180
Pp đo LDH hoạt tính trong dịch môi trường nuôi cấy.
 Men hoạt tính LDH tăng cao khi bị thoát ra từ màng tế bào của những
tế bào không còn khả năng sống.
 Men hoạt tính sẽ đuợc đo bởi pp đo quang đơn giản dựa vào phản
ứng oxihoá của NADH trong sự hiện diện của pyruvate. Phản ứng
được quan sát bằng UV tại bước sóng 340 nm.
Pyruvate+ NADH + H+LDH _lactate + NAD+ Sự
hấp thu NADH tại bước sóng 340 nm
 Pp có thể xác định nhiều mẫu cùng một lúc, đặc biệt nếu có sẵn dĩa
nhiều giếng.
 Phải thận trọng khi đọc kết quả của pp này
 LDH chứa trong tế bào có thể có thay đổi trong quá trình tiến hành một lô
thử nghiệm.
 Sự mất khả năng sống của tế bào có thể khẩn cấp khi LDH hoạt tính
trong môi trường chiếm một phần ti ̉ lê ̣ của LDH toàn phần trong nuôi
cấy.
181
 Xác định Glucose: sự thay đổi glucose chứa trong
môi trường có thể dùng như một pp đo gián tiếp nồng
độ đậm đặc của tế bào.
 đo sản phẩm của acid lactic hoặc sự tiêu thụ oxygen.
 mật độ đậm đặc của tế bào tương quan với sự tiêu
thụ Oxigen hoặc sản xuất acid lactic.
 Mối tương quan này là hằng số cho một dòng tế bào
đặc biệt dưới những điều kiện đã được thiết lập sẵn.
 Khi dòng tế bào hoặc bất kỳ điều kiện nào khác bị
thay đổi, mối quan hệ giữa sự tiêu thụ hoặc dạng sản
phẩm cũng như số lượng tế bào cũng sẽ bị thay đổi.
182
VÍ DỤ 4: PP MỚI ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO GAN VÀ THỬ
NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO DÙNG LDL- UPTAKE ACTIVITY
CỦA TẾ BÀO GAN.[RYO SHOJI]
 Dùng LDL-uptake và đánh giá tác dụng chuyển hóa LDL của tế bào người.
 LDL là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào động vật, tỉ lệ
LDL uptake tăng cao, trị số trung bình và tỉ số của LDL uptake thay đổi khi tế
bào bị nhiễm độc được xem như là một chỉ dẫn cho tính độc tế bào gan khi
có ô nhiễm môi trường, khi đó hoạt tính của LDL uptake có thể tìm thấy rất
nhiều trong tế bào gan.
 Tế bào gan HepG2 có rất nhiều receptor trên màng tế bào của chúng được
dùng làm chất nền cho LDL
 Qui trình chuẩn bị FITC-labeled LDL theo pp của Weed et al. bằng cách dùng
FITC labelled kits. Kit này sẽ được làm sạch bằng sephadex G25M.
 Sự tương quan giữa nồng độ LDL và chất phát quang sẽ được ứng dụng
đánh giá kết quả cho pp này.
183
 Để phát hiện các tế bào LDL hoạt tính, 20 mg/ml của LDL cho vào FITC –
fluorescent isothiocyanate - thêm vào huyết thanh không dịch môi trường.
 Nuôi cấy tế bào: tế bào được nuôi cấy trong dĩa 96 giếng ở nồng độ ban đầu
105, nuôi cấy đạt mức độ mọc dày đặc khoảng 70 % trong môi trường nuôi
cấy không huyết thanh.
 24h truớc khi đo độ độc, tế bào được ủ cùng chât độc hoặc
nước trong mẫu chứng
 Cho gắn với chất LDL trong 4h đến 48h trong tủ cấy.
 Sau 48h, dịch môi trường nuôi cấy được loại bỏ, lớp tế bào được rửa 3 lần với
PBS để loại bỏ LDL tự do. Sau đó tế bào được ngâm trong NaOH 1N, màng
tế bào bị phá hủy… và LDL tích luỹ trong tế bào được phóng thích và hòa tan.
 Số trung bình của LDL uptake và LDL tích lũy trong tế bào sẽ được đo bởi khv
huỳnh quang.
184
PP ĐẾM TẾ BÀO SỐNG SÓT-AP ASSAY
 Dùng acid phosphatase (AP) đo sự phát triển của tế bào, vì pp
này có thể đếm được số lượng các tế bào còn sống nhanh và dễ
dàng.
 Tế bào sẽ được ủ trong dĩa 96 giếng và mật độ tế bào ban đầu
là 105 tế bào/cm2 trong dịch môi trường với 10 % FBS chứa
độc chất.
 Sau 2 h nuôi cấy loại bỏ dịch môi trường tế bào nuôi cấy sẽ
được rửa với 100l PBS/giếng và ngâm trong hệ đệm sodium
acetate pH 5.5 chứa 0.037 g/l p-nitrophenylphosphate và 1 giọt
triton X-100, sau 2h ủ tại 37 oC, đo độ hấp thu tại bước sóng 405
nm với máy đọc dĩa .
 Kết quả độ hấp thu sẽ tỉ lệ với số lượng tế bào sống sót sau thử
nghiệm.[Ryo Shoji]
185
ĐO QUANG:
 Đo khả năng sống của tế bào:
 Khả năng sống là đo tỉ lệ của tế bào sống trong nuôi cấy, được thể
hiện bởi khả năng của tế bào phân chia hoặc khả năng chuyển
hóa bình thường. Một vài pp đếm tế bào mô tả trên đây có thể đáp
ứng để đo khả năng sống của tế bào.
 Pp phổ biến nhất là nhuộm, ngoại trừ trường hợp nhuộm màng tế
bào bằng trypan blue là để xác định tế bào mất khả năng sống.
 Pp đo khả năng sống khác được dùng pp đánh giá chức năng tế
bào như pp Tetrazolium, SRB ...
186
 Pp mang năng lượng
 Pp chính xác nhất của tất cả các pp đo tế bào sống là pp đo cụm
tế bào, đo trực tiếp khả năng phát triển của tế bào. Pp cụm tế
bào mất thời gian, nhưng được dùng rộng rãi trong nghiên cứu
độc tính.
 Một số lượng tế bào ở nồng độ thấp đã bám dính và phát
triển trên bề mặt dĩa petri. Nếu nồng độ tế bào giữ ở mức độ
thấp, mỗi tế bào sẽ phân chia và mọc lên từng khóm hoặc
từng đám tế bào.
 Từ dạng này, xác định số lượng các khóm được đánh dấu
cho 100 tế bào x 100
 Các dòng tế bào được colony xử lý tế bào sẽ được so sánh với
mẫu chứng.
 Kết quả đánh giá bởi tỉ lệ giữa khóm tế bào được xử lý trên dĩa
petri với khóm tế bào không xử lý trên dĩa petri sẽ có được số
lượng các phân đoạn sống sót
187
CÁC THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO
 Karyotyping: pp này quan sát sự phân bố của nhiễm sắc thê. Tổ hợp
nhiễm sắc thể ̉ và có thể chỉ ra loài gốc của tế bào, dòng tế bào đã
được chuyển hóa hoặc bất kỳ nhiễm sắc thể nào đã bị phá hủy.
 Quan sát nhiễm sắc thể đơn trong quá trình gián phân.
 Xác định nhiễm sắc thể được hỗ trợ bởi kỹ thuật banding. Dùng
thuốc nhuộm dán vào nhiễm sắc thể. Phân tử phát triển với những
bands này liên quan đến vùng có mật độ nhiễm sắc thể cao.
 Một trong những pp thường dùng là Giemsa, ngâm
nucleoprotein trong trypsin, va Giemsa nhuộm sản phẩm tạo G band. Sản
phẩm sẽ được quan sát dưới đèn kính hiển vi và cho thấy các chi tiết…
Pp này dùng cho các chuyên gia

188
Các bước cho phân tích karyotype:
 Yêu cầu có tối đa tế bào phát triển đang trong thời kỳ gián phân
 Xử lý tế bào với việc ức chế sự phân bào thành thoi vô sắc với các chất như colchicine
để khoá tế bào tại thời điểm gián phân, tại thời điểm này xác định nhiễm sắc thể có
thể nhìn thấy trong nhân của tế bào
 Cho tế bào vào dung dịch hypotonic để đạt được tối đa sự phân chia giữa các
nhiễm sắc thể
 Xử lý tế bào với chất gắn kết như MeOH/aa 3:1 và làm khô trong lame
 Xử lý bằng trypsine 1% trong vài phút
 Nhiễm sắc thể đã bị nhuộm bằng thuốc nhuộm phù hợp hoặc với Giemsa hoặc
a.orcein
 Quan sát các nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi photomicrograph, có thể xác định được
nhiễm sắc thể đơn.
 Để chuẩn hóa 1 dòng tế bào, nhiễm sắc thể được đếm từ 100-200 cá thể tế bào
•Phương pháp này co ́ thê ̉ xác định nguồn gốc của tê ́ bào va ̀ xác định s ự phá hủy nhiễm
sắc thể.
189
Isozymes (Hoặc isoenzym)
 Isozyme là dạng cấu trúc khác của cùng một loại enzyme, có nhiệm
vụ xúc tác các phản ứng nhưng có cấu trúc protein khác được dùng
để xác định nguồn gốc của một vài loài ở mức độ cao
Labelled antibodies: một dòng tế bào có thể được xác định
bằng cách dùng nhãn phát quang kháng thể đặc biệt cho
kháng nguyên màng.
 Kháng thể, chuẩn bị bằng pp riêng, được tiếp hợp để
phù hợp với hợp chất phát quang như fluoresein.
 Sự tiếp hợp sẽ gắn một cách đặc biệt vào màng bên ngoài của
những tế bào đã được chọn và những tế bào này sẽ được nhận ra
bằng máy đọc huỳnh quang.
190
ADN fingerprinting: kỹ thuật này đã được biết trong khoa học
nhưng mới được ứng dụng trong khoa tế bào để chọn dòng tế bào chuẩn.
 Kết quả là từ những mảnh vỡ ngâm với endonucleases phân lập
các ADN bằng CE. Sau đó máy dò phóng xạ sẽ được dùng để lai
hoá các mảnh vỡ đặc biệt là những mảnh có thể phát sáng bởi
autoradiography.
 Máy dò phóng xạ sẽ phát hiện những mảnh đã được tiếp hợp với
các mini ADN. Những ADN này là chuỗi các nucleotide lặp lại
của rất nhiều độ dài khác nhau được tìm thấy trong hệ gen ADN.
 Một vài enzyme giới hạn có thể cắt ADN trong những mảnh nhỏ ADN
(ministellite). Mỗi mảnh có chiều dài và sự phân bố của những mảnh
ministellite đó là duy nhất, có tính đặc hiệu do đó chúng được dùng để
định tính xác định dòng tế bào.
191
C.2 THỬ NGHIỆM IN VITRO
Mô hình
Thử nghiệm tác dụng độc tính
tế bào
192
Kết quả sàng lọc sinh học in
vitro
Mô hình
Thử nghiệm độc tính trên tế bào
 Mục đích: khảo sát tác dụng sinh học

của các phân đoạn chiết và chất chiết tinh khiết
 Nguyên tắc: đánh giá khả năng gây độc

và
khả năng ức chế sự phát triển của mẫu thử
nghiệm trên 2 dòng tế bào HepG2 và Caco2.
 Đánh giá kết quả: xác định phần trăm ức chế
tế bào để đánh giá tác dụng ức chế sự phát
triển tế bào ung thư của các phân đoạn chiết và
chất chiết tinh khiết
193
Khảo sát sinh học
Sơ đồ chiết xuất Dược liệu
Pp chiết 1 Pp chiết 2 dm Pp chiết 3 Pp chiết 4

dm nước cồn 50 dm cồn 70 dm MeOH
Cao chiết 1 Cao chiết 2 Cao chiết 3 Cao chiết 4
Nguyên liệu
EtOH-
Cao chiết A (12 %) Bã dược liệu

EtOH – H2O
Cao chiết B ( 55 %) Cao chiết C (45 %)

Phần tan trong EtOH-H2O Phần không tan trong EtOH-H2
194
Khảo sát sinh học
Kiểm tra cao chiết

Chỉ cao chiết có tác dụng sinh học mới được tiếp tục khảo sát hóa
học
Khảo sát in vivo tác dụng hạ men gan
Thử tać dụng

Cao hạ men gan
Hieäu
chiết Caûm quan Định tính (mg/ml)
suaát
0,05 0,1
Alcaloid: (++)
12% từ Nâu đen đậm
A Flavonoid: (+) ++ +++
DL
Saponin: (++)
Vàng nâu trong Alcaloid: (+++)
B 55% vị đắng Flavonoid: (++) +++ +++
của A saponin: (+)
alcaloid: (-)
45%của
C Nâu đậm Flavonoid: (-) - +195
Chọn
A cao B tiếp tục khảo sát
saponin: (+++)
hóa học
vitro

 Chuẩn bị mẫu: nồng độ khởi đầu 1mg/ml
 Mẫu thử được hòa trong DMSO 1% và môi trường nuôi cấy để
đạt được nồng độ cuối cùng trong môi trường là 1 mg/ml.
 Từ mẫu thử ban đầu tiến hành thử ở các nồng độ 0,1;
0,05; 0,01; 0,005 mg/ml.
 Tế bào sẽ được nuôi cấy trong dung dịch mẫu thử trong 6 ngày.
 Làm song song lô chứng
 tế bào cũng được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
với 1 % DMSO nhưng không có chất thử nghiệm
 Cố định tế bào theo thiết kế thí nghiệm (phương pháp SRB).
 Đo tế bào trên máy đọc đĩa 96 giếng (UV max microtier plate reader)
197
Vật liệu thử nghiệm sinh học
 Thử nghiệm độc tính của dược liệu trên dòng tế bào
người bị ung thư:
 dòng tế bào Caco2 – human colonic
carcinoma cell line (Abcam) dòng TB K ở ng bị ruột kết
 Dòng tế bào HepG2 – human hepatocellular liver
carcinoma cell line (ATCC-Cat. No HB-80651)
198
Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm
 Nuôi cấy tế bào:
 Vật liệu thử nghiệm: Dòng tế bào HepG2 và Caco2 được
dùng làm dòng tế bào chính trong thử nghiệm.
 Rã đông tế bào:
199
Điều kiện nuôi cấy
 Tế bào HepG2 và Caco2 được cấy trong chai nhựa T-75, nuôi
trong tủ cấy tại 37oC với 5% CO2 để đạt tới mật độ 1x 106 tế bào
trong 1 ml môi trường nuôi cấy MEME và DMEM (chứa 10%
FBS, 0,1% gentamicine, 1% L- 1% các aminoacid
glutamin,
không thiết yếu).
Khi dịch
  tế bào
môiđạt mật chứa
trường độ đủtếcho
bàothử nghiệm
được cấy vào các giếng thử
 tiến hành thử nghiệm đôc̣ ̣ tính tế bào bằng cách thêm các dung
dịch mẫu thử nghiệm vào giếng nuôi tế bào theo đúng từng thiết
kế thí nghiệm,
 thêm dịch môi trường vừa đủ thể tích yêu cầu.
200
Điều kiện nuôi cấy
 Sau 24, 48, 72, 96 giờ…, tế bào nuôi cấy trong các
khay thử sẽ được cố định bằng cách thêm 50 ml
trichloroacetic acid 40% vào khay thử tế bào nuôi cấy,
để trong 1 giờ ở 4 oC. Sau đó rửa 5 lần với nước, làm
khô ở nhiệt độ phòng (25 oC).
 Đánh giá kết quả bằng cách nhuộm protein của tế bào
còn sống sót sau thử nghiệm theo phương pháp
nhuộm protein bằng thuốc nhuộm Sulforhodamine B
(theo phương pháp SRB) đã mô tả trong tài liệu của
Philipe Skehan [88].
201
Phương pháp thử
Tóm tắt phương pháp SRB như sau:
− thêm thuốc thử SRB vào mỗi giếng
thử (100 ml/giếng), để yên trong 30 phút
rửa với dung dịch acid acetic 1% để
− loại bỏ thuốc thử dư
làm khô qua đêm ở nhiệt độ phòng
− Thêm 50 ml Tris-base 10 mM/
− giếng, đợi 10 phút
đo mật độ tế bào (OD) bằng máy
UV max microtier plate reader tại bước sóng 515 nm
−
Tính phần trăm ức chế của các mẫu
−
202
Thiết kế thí nghiệm
 Thí nghiệm 1- mô hình 2: Khảo sát tác dụng độc tế bào của dịch
chiết dược liệu
 Mục đích đánh giá mức độ độc đối với tế bào của dịch chiết dược liệu
trên hai dòng tế bào ung thư gan HepG2 và ruột Caco2.
 Ngày 0 tế bào được nuôi trong chai nhựa T-75 chứa 50 ml
dịch môi
trường.
 Ngày 1 dịch chứa tế bào (có mật độ1x106/microlit) được cấy vào các
giếng của khay thử. Tiếp theo đó, các mẫu thử nghiệm ở các nồng độ
khác nhau sẽ được thêm vào các giếng theo từng hàng, hoặc cột trên
khay thử (tùy theo thiết kế riêng cho từng thử nghiệm), thêm môi
trường vừa đủ 0,250 ml/ giếng để có được nồng độ chất thử cuối cùng
trong môi trường là 0,1 mg/ml ; 0, 05 mg/ml ; 0,01 mg/ml và 0,005
mg/ml với mật độ tế bào là 1x106/ giếng. Tất cả các khay thử chứa tế
bào được nuôi ấp trong tủ ấp ở nhiệt độ 37 oC, 5% CO2. 203
 Ở ngày thứ 2, thứ 3, thứ 4, thứ 5 sau khi cho mẫu thử (sau 24 ,
48, 72, 96 giờ...), các khay thử lần lượt được đem cố định tế bào
rồi làm khô ở nhiệt độ phòng..
 Khay thử thứ nhất có mẫu thử là T1 (sau 24 giờ), khay thử thứ 2
có mẫu thử T2 (sau 48 giờ), T3 (72 giờ), T4 (96 giờ)....
 Một khay chứa tế bào sẽ không thêm mẫu thử dùng làm mẫu
chứng được gọi là khay thử To, cũng được mang đi cố định tế
bào ở ngày thứ 2.
 Khi tất cả các khay đã được cố định tế bào, tế bào còn sống
trong các giếng thử sẽ được nhuộm và đo mật đô ̣ tê ́ bào
theo phương pháp SRB đa ̃ nêu trên.
204
 Thí nghiệm 2 – mô hình 2: Khảo sát mức độ độc tế bào
của các phân đoạn chiết tách từ cao toàn phần
 Mục đích đánh giá mức độ độc tế bào của các phân đoạn
chiết và hợp chất chiết tách từ cao chiết toàn phần Diệp hạ
châu đắng, tiến hành tương tự các bước như thử nghiệm 1
nhưng với mẫu thử là các phân đoạn chiết tách từ dược liệu
(sơ đồ chiết tách 3-3).
 Trong tất cả các thí nghiệm trên, mỗi nồng độ, mỗi mẫu thử
đều được thực hiện trong 6 đến 10 giếng cho một thử nghiệm,
và được lặp lại 6 lần.
205
Bố trí thí nghiệm: Trên 1 khay 96 giếng gồm: 7 mẫu thử
nghiệm + 1 mẫu chứng trắng+1 mẫu chứng chuẩn
– mỗi mẫu thử ở 5 nồng độ: 0.1; 0.05; 0.01; 0.005;
mg/ml;
Nồng DMSO +
độ chất 1 2 3 4 5 6 7
m.trườn
thử 8 9 g
0.100 Mẫu cho nồng độ theo
hàng, cột giữa 5-6 là
g/m
mẫu chứng DMSO, có
l thể cho 2 hàng chứng
Đốm hồng thể hiện tác
0.050 dụng
g/ml
0.005
g/ml
0.01
g/ml
2
206
Bố trí thí nghiệm
Tế bào nuôi cấy ngày thứ Tế bào nuôi cấy ngày thứ
6 3
5 2
4 1
207
vitro
Đánh giá kết quả
 Phần trăm ức chế sự phát triển tế bào (% inhibition) của mẫu
thử : (ODc – ODt / ODc) x 100
 (OD = Optical Density)
 Odc là mật độ tế bào sống sót đo được của mẫu chứng
 Odt là mật độ tế bào sống sót đo được của mẫu thử
 Đánh giá kết quả:
 40-60% tác dụng ức chế trung bình
 60 -80% tác dụng mạnh
 >80% tác dụng rất mạnh
208
vitro
% ức chế tế bào HepG2 của cao chiết

và phân đoạn chiết
0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 0,01 mg/ml
BPa (%) 98 40 24
BPu (%) 72 21 < 10
BPsp (%) 52 <10 <10
B1.1 (%) <10 <10 <10
B1.2 (%) 69 30 <10
B1.3 (%) 62 59 39
B1.4 (%) 64 <10 <10
B1.5 (%) 61 <10 <10
B2.1 (%) 81 53 <10
Cao chiết Phyllanthus: Hoạt tính trên HepG2 ở mức độ trung bình (0,1 mg/ml).
Cao alcaloid toàn phần (B2.1) va ̀B1.3: tác dụng ro ̃ hơn ơ ̉ nồng đô ̣ 0.05
mg/ml
209
vitro
Thí nghiệm 1: Tác dụng độc trên dòng
tế bào Caco2 của cao B các loài
% ức chế của cao chiết dược liệu
Noàng BPa % BPu% BPsp%

ñoä
0,005 37,15
% öùc cheá cao chiet Phyllanthustreân doøng teá bao
Caco2
90
80 BPa
BPu
70
BPsp
60
50
%
40
30
20
10
0
0.1 0.05noàng ñoä maãu0.01
0.005
Cao chiết B của các Phyllanthus thể hiện tính độc trên dòng tế bào Caco2 rõ hơn
Cao chiết B của P. sp có tác dụng độc tế bào vượt trội, đều và mạnh
247
Thí nghiệm 1: Tác dụng độc trên tế bào vitro
của bộ phận dùng Diệp hạ châu đắng
% ức chế tế bào của bộ phận dùng
noàng ñoä LPa TPa LPu TPu LPsp TPsp
0,005 90,4 94,94 88,39 92,25 95,76 91,75
% öùc cheá cuûa laù Phyllanthus treân doøng teá baøo

% öùc cheá cuûaPthhyalânlanthturseân doøng
99 teá baøo Caco2 100 Caco2
LPa Thân TPa có tác dụng vượt
98 TPa 98
97 TPu 96
LPu
trội so với lá .
96 LPsp
95 TPsp 94
Ở nồng độ 0.005 vẫn tác
%
94 % 92
93
92 90 dụng ức chế > 90% tế bào
91 88
90 86
0.1 0.005
0.0n5oàng ñoä 0.1 0.05noàng ñoä ma0ãu.01 0.005
0m.0aã1u
Thử nghiệm 2: Tác dụng độc tế bào của các phân đoạn tách từ cao B
% öùc cheá cuûa caùc phaânPñhoyalïnlanthuasmrus
Nồng độ B1.1 B1.2 B1.3 B1.4 B1.5 100 treân Caco2
90 B1.1
mg/ml 80
B1.2
B1.3
70
0,05 59,50 66,50 70,30 32,40 31,90 %
60
B1.4
B1.5
50
Các phân đoạn của cao chiết B có tác 40
30
dụng độc tế bào. 20
10
Phân đoạn B1.2; B1.3 có tác dụng rõ rệt 0
0.1 0.05 noàng ñoä maãu 0.01 0.005
248
vitro
Thử nghiệm 3:
Tác dụng độc tế bào của alcaloid chiết từ P. amarus
Noàng ñoä B2.1 Pa1 Pa2
0.005 51,53 30,00 17,37
% öùc cheá cuûa alkaloid treân doøng teá
70 baøo Caco2
B2.1
60
Pa1
50
Pa2  Alcaloid toàn phần
40
có tính độc tế bào
%
30
20  Pa1 tác dụng rõ
10 hơn Pa2
0
0.1 0.05noàng ñoä 0.005
maãu0.01
Phần mới của đề tài:
Chưa thấy tài liệu nào báo cáo về tác dụng độc tế bào của alcaloid
nirurine và epibubbialine trong Phyllanthus.
249
Khay nuôi cấy tế bào Caco2 vitro
ngày thứ 3 sau khi cho mẫu
Nồng độ
chất thử 1 2 3 4 5 DMSO + 6 7 8 9
m.trườn
0.100 g
g/ml
0.050
g/ml
0.01
g/ml
0.005
g/ml
213
vitro
Tóm tắt kết quả thử nghiệm tác dụng sinh học
 P. amarus Schum. & Thonn. có tác dụng hạ men gan vượt trội hơn P.urinaria L..
 Thị trường thường không phân biệt các loài Diệp hạ châu khi sử dụng làm
thuốc
 Có nơi chọn lọc loài P. urinaria L. để làm thuốc trị viêm gan
 P. amarus Schum & Thonn. là loài trên thế giới dùng phổ biến (Ấn Độ,
Brazil) và đã được chứng minh bằng các khảo sát khoa học.
 Thân P. amarus Schum & Thonn. có tác dụng vượt trội hơn lá.
 Một số nơi sử dụng Diệp hạ châu làm thuốc chỉ sử dụng lá.
• 214
• Kết quả này góp phần vào việc nâng cao hiệu quả trong sử dụng
•

Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng sinh học
Xác định cơ chế độc tính tế

bào Xử lý tế bào
37 oC, 5% CO2
Cấy chuyển, thu tế bào
MT DMEM, 10% FCS, 2 mM

L-glutamin, 100 IU/ml penicilin,
100 µg/ml streptomycin
Chia ra các đĩa 6, 96 giếng
18
Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng sinh học
1. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của 09 cao xử lý trong 72 giờ
Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT
2. Khảo sát cơ chế tác động gây hoại tử tế bào
Xác định hoạt tính enzyme LDH
3. Khảo sát cơ chế tác động gây hoạt hóa quá trình apoptosis
Nhuộm AO/EB (acridin orange/ethidium bromid)
Điện di ADN phân mảnh
Định lượng ADN phân mảnh
Khảo sát khả năng hoạt hóa enzym caspase 3
19
Kết quả
Khảo sát hoạt tính độc tế bào
Xác định giá trị IC50
Kết quả: Cao cloroform, EtOAc từ thân cho tác dụng độc tế
bào mạnh nhất IC50 = 22,52 và 35,4 g/ml
200 170,71
148,63
150
IC50 (µg/ml)
100 72,87
59,59
40,03 35,40
31,09 34,79
50
22,52
0
Rễ Thân Lá
Cloroform Ethy acetat Nước
24
Kết quả
Khảo sát cơ chế gây hoại tử tế bào
Hoạt tính enzyme LDH giải phóng vào môi trường
Hoạt tính LDH trung bình % so với

Mẫu thử Nồng độ (µg/ml)
(mU/ml) ± SD (n = 3) mẫu chứng
100 682,8 ± 60,9** 470,9

Cloroform 50 465,0 ± 66,6** 320,7
25 471,6 ± 54,3** 325,2

Thân
100 662,4 ± 21,6** 456,8
Ethyl acetat 50 448,4 ± 31,7** 309,2
25 346,5 ± 39,9* 239,0
Paclitaxel 1 mM 376,3 ± 31,9** 259,5

Mẫu chứng
1% 145,0 ± 15,8
(DMSO)
Cao cloroform, EtOAc từ thân đều gây giải phóng LDH
25
Kết quả
Khảo sát cơ chế gây hoại tử tế bào
Hoạt tính enzyme LDH giải phóng vào môi trường
800,00
470,9
456,8
Cách tính: loại trừ DMSO 1% ra để so vs các Kq
600,00
Hoạt tính LDH (mU/mL)
320,7 309,2
325,2
259,5
400,00 239,0
200,00
0,00
Thân/Cloroform Thân/EA DMSO 1% Paclitaxel 1 µM
100µg/ml 25µg/ml
50µg/ml
Thân cho tác dụng gây hoại tử mạnh nhất
26
Kết quả
Khảo sát cơ chế gây hoạt hóa apoptosis
Hình thái tế bào quan sát dưới KHV
Mẫu chứng Mẫu paclitaxel Mẫu thử
Tế bào co lại thành hình đa giác, ít bám bề mặt
Chọn thời gian xử lý 24h
27
Kết quả
Nhuộm AO/EB
Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 50 µg/ml
AO nhuộm tế bào sống, chết

EB chỉ nhuộm tế bào tổn thương
màng TB sống: xanh lá
Apoptosis non: nhân xanh sáng, bóng màng
Apoptosis già: cam, ADN phân mảnh
DMSO 1% Paclitaxel
Cao cloroform thân:

Nồng độ 50 µg/ml: apoptosis non
Nồng độ 100 µg/ml: apoptosis già
28
Khảo sát cơ chế gây hoạt hóa apoptosis Kết
Điện di ADN phân mảnh
quả
2072 bp
600 bp
100 bp
Cao cloroform và EtOAc từ thân:

Xuất hiện các đoạn AND phân mảnh tập trung ở đoạn 100 – 600 bp
29
Kết quả
Tỉ lệ ADN phân mảnh % so với

Mẫu thử Nồng độ (µg/ml)
(%) ± SD (n = 3) mẫu chứng
75 39,6 ± 4,3** 465,0

Cloroform 50 32,1 ± 0,8** 376,9
25 23,4 ± 5,5* 275,2

Thân
75 25,1 ± 8,9* 295,0
Ethylacetat 50 19,0 ± 6,8 223,1
25 17,2 ± 9,3 202,2
Paclitaxel 5 µM 33,1 ± 5,2** 388,4
Mẫu chứng (DMSO 1%) 8,5 ± 3,1
30
Kết quả
50,00
465,0
40,00
Tỉ lệ ADN phân mảnh (%)
376,9 388,4
30,00 295,0
275,2
223,1
20,00 202,2
10,00
0,00
Thân/Cloroform Thân/EA Paclitaxel 5 µM
DMSO 1%
75µg/ml 50µg/ml 25µg/ml
Cao cloroform và EtOAc từ thân: làm tăng tỷ lệ AND phân mảnh
Cao cloroform từ thân: tỷ lệ ADN phân mảnh tăng khoảng 4,5 lần so
với mẫu chứng
31
Kết quả
Khảo sát hoạt tính caspase 3 thể hiện qua nồng độ pNA tạo thành
Nồng độ pNA (µM) ± SD (n Tỷ lệ % so với

Mẫu thử Nồng độ (µg/ml)
= 3) mẫu chứng
75 22,3 ± 0,4** 359,3
Cloroform 50 15,3 ± 1,8* 247,2
25 7,4 ± 0,5 119,4
Thân
75 9,0 ± 1,2* 145,8
Ethyl acetat 50 8,2 ± 1,0* 132,0
25 6,4 ± 0,9 103,2
Paclitaxel 5 mM 18,6 ± 1,0** 229,4
Mẫu chứng (DMSO 1%) 6,2 ± 0,2
32
Kết quả
Khảo sát hoạt tính caspase 3 thể hiện qua nồng độ pNA tạo thành
25,0
359,3
229,4
20,0
247,2
Nồng độ pNA (µM)
15,0
145,8
119,4 132,0
10,0
103,2
5,0
0,0
Thân/Cloroform Thân/EA Paclitaxel 5 µM
DMSO 1%
75µg/ml 50µg/ml 25µg/ml
Cao cloroform và EtOAc từ thân: làm tăng hoạt tính caspase 3
Cao cloroform từ thân cho tác dụng tốt nhất gấp 3,5 lần so với
chứng
33
Kết quả
Paclitaxel
Hoại tử* Hoạt hóa apoptosis**
*Calaf G.M (2018), "Curcumin and paclitaxel induce cell death in breast cancer cell lines", Oncology reports, 40 (4), pp.2381-2388.
**Choi (2012), "Taxol-induced growth arrest and apoptosis is associated with the upregulation of the Cdk inhibitor, p21WAF1/CIP1, in
human breast cancer cells", Oncology reports, 28 (6), pp.2163-2169.
*, **Flores M.L (2012), "Paclitaxel sensitivity of breast cancer cells requires efficient mitotic arrest and disruption of Bcl-xL/Bak
interaction", Breast cancer research and treatment, 133 (3), pp.917-928.
34
Kết quả
Cao cloroform, EtOAc từ thân
Hoại tử Hoạt hóa apoptosis

Giải phóng LDH Bóng màng, cô đặc NST, phân
mảnh ADN, hoạt tính caspase 3
35
Kết quả
Cao MeOH
Ức chế tăng sinh gốc Hoạt hóa apoptosis

tự do
Park (2014), "Methanol extract of Flacourtia indica aerial parts induces apoptosis via generation of ROS and
activation of caspases in human colon cancer HCT116 cells", Asian Pac J Cancer Prev, 15(17), pp.7291-
7296.
36
SÀNG LỌC IN VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ
α– GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY
THUỘC HỌ DÂU TẰM (MORACEAE)
ĐẶT VẤN ĐỀ
347 TRIỆU NGƯỜI MẮC BỆNH
3,4 TRIỆU NGƯỜI CHẾT (2004)
VIỆT NAM: 1,65 TRIỆU NGƯỜI MẮC BỆNH

ĐÁI THÁO ĐƯỜNG (2010)
231
ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE
(Acarbose, Voglobose, Miglitol)
BIGUANID MEGLITINIDE
(Metformin) (Nateglitinide,Repaglinide)
THUỐC ĐIỀU TRỊ

ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
ỨC CHẾ DPP-4
SULFUNYLURE (Sitagliptin, Vildagliptin...)
Glibenclamid (Gliglazid, …)
THIAZOLIDINEDIONE
Pioglitazone INSULIN
232
Cinnamonum sp. Lauraceae
Ficus bengalensis
Zingiber officinale
Zingiberaceae
Vaccinium myrtillus Euricaceae
Morus alba
Artocarpus heterophyllus Trigonella foenum-graec2u3m3

Fabaceae Artocarpus alitis
Cinnamonum sp. Zingiber officinale
Lauraceae Zingiberaceae Ficus bengalensis
Vaccinium myrtillus
Ficus hispida Euricaceae
Momordica charantia
Cucurbitaceae
Artocarpus heterophyllus
Morus alba
Trigonella foenum-graecum
Aloe vera Liliaceae Fabaceae
234 Artocarpus alitis
Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase của một số cây thuộc
họ Moraceae .
MỤC TIÊU:
- Tìm kiếm nguồn dược liệu thay thế thuốc tổng hợp ít tác dụng phụ, tăng
hiệu quả điều trị …
- Xác định được các cây thuộc họ Moraceae có tác dụng ức chế enzyme
α-glucosidase.
- Xác định các bộ phận dùng, cao chiết, phân đoạn chiết, chất tinh
khiết có tác dụng.
235
Tổng quan
Mô hình in vitro
Nguyên tắc chung:
- Para nitrophenyl – α- D – glucoside (PNPG) sẽ bị α-glucosidase thủy phân
cho ra p-nitrophenol (PNP) và glucose.
- PNP sinh ra có màu vàng và được đo độ hấp thu quang tại bước sóng 415
nm.
- Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế α-glucosidase thì hàm lượng PNP tạo
thành sẽ giảm, màu vàng nhạt dần.
- Xây dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác
định chỉ số IC50.
MẪU THỬ
α- Glucosidase
PNPG α-2D3-6glucose PNP (màu vàng)

Tổng quan
Tham khảo hơn 50 tài liệu từ những năm 90 cho tới nay sử dụng cùng
phương pháp với một số điều chỉnh để cho kết quả chính xác, độ lặp lại
cao hơn, tiết kiệm thời gian, chi phí
Các bước tiến hành cơ bản:
- Enzyme + mẫu thử (ủ ở nhiệt độ 37 oC, 5’-60’ để phản ứng xảy ra).
- Thêm PNPG vào (ủ ở nhiệt độ 37 oC, 5’-30’ để phản ứng xảy ra.)
- Hỗn hợp được đo cường độ hấp thụ tại bước sóng 415 nm.
237
Tổng quan
So sánh các phương pháp:

- Nguồn enzym: nấm men, bột ruột chuột.
- Lượng mẫu sử dụng ít hơn.
- Thời gian: thay đổi tùy theo mỗi nghiên cứu.
- Sử dụng đĩa 96 giếng thay cho đo trong curvet.
- Sử dụng hoặc không sử dụng chất chặn phản ứng (Tris
HCl, NaOH hoặc Na2CO3 ).
Kết luận: quy trình nghiên cứu của Wang Z.W. và cs., (2013) được chọn
để tham khảo xây dựng quy trình sàng lọc tác dụng ức chế α -
glucosidase.
238
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
Phương pháp nghiên cứu
1. Đối tượng nghiên cứu:

1. Nguyên liệu:
- 21 mẫu dược liệu thuộc họ Moraceae được thu hái tại Kiên Giang,
Đồng Tháp, thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương, Bình Phước, Lâm
Đồng, Bình Định, Phú Thọ.
- Bộ phận dùng: rễ, thân, lá (tùy điều kiện thu hái).
- Mẫu được chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần: CHCl3, EtOH,
H2O. Loại dung môi để thu được cao toàn phần.
- Mẫu cao phân đoạn của dược liệu có tác dụng ức chế enzym mạnh
nhất để thử nghiệm.
240
2.1.2 Dung môi, hóa chất:

- Enzym Yeast’s α-glucosidase (Sigma).
- p-nitrophenyl α-D-glucoside (PNPG) (Sigma).
- Muối Posstasium monophosphat, muối posstasium diphosphat (Sigma).
- Dimethyl sulfoxide (DMSO) dược dụng, nước khử ion.
- Các dung môi hóa chất khác.
2.1.3. Dụng cụ thí nghiệm:
- Máy siêu âm Sonnorex.
- Máy lắc rung (vortex).
- Máy Elisa iMarkTM Micro plate Absorbance Reader (BIO-RAD) . đo độ hấp
thu sử dụng ở bước sóng 415 nm.
- Máy HPLC-PDA 2695 (Waters), tại Labo hóa hợp chất tự nhiên,khoa Dược
Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
- Dĩa 96 giếng, máy đo pH eco Testr pH2.
- Một số thiết bị khác hay sử dụng trong phòng thí nghiệm.
241
2.2.1. Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ Moraceae:
Chuẩn bị mẫu nghiên cứu:
- Dược liệu được xay nhỏ thành bột qua rây 2 mm, khối lượng
20 g, được chiết trên bếp cách thủy với dung môi có độ
phân cực tăng dần cloroform, ethanol, nước qua hệ thống
hồi lưu. Chiết kiệt với từng dung môi. Loại dung môi, thu
được các mẫu nghiên cứu.
- Cao toàn phần của mẫu thử được hòa tan trong dung môi
DMSO (tỷ lệ sử dụng DMSO sẽ được khảo sát).
- Nồng độ mẫu thử ban đầu trong mỗi giếng là 1mg/ml.
242
Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ
Moraceae:
Pha hóa chất:

- Pha dung dịch đệm kali phosphat 50 mM, pH 6.8.
- Pha enzym α-glucosidase (0.1 U/ml) trong dung
dịch đệm kali phosphat 50 mM, pH 6.8.
- Pha chất nền p-nitrophenyl α-D-glucoside (PNPG)
(0.1 mM) trong dung dịch đệm kali phosphat 50
mM, pH 6.8.
Nồng độ các chất, mẫu thử là nồng độ cuối cùng
trong giếng
243
2.2.1. Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ Moraceae:
Thiết kế thí nghiệm:
- Thí nghiệm 1: Khảo sát dung môi hòa tan mẫu DMSO,
MeOH, MeOH + DMSO
 Mục đích: Tìm được dung môi thích hợp hòa tan mẫu
hoàn toàn, không hoặc ít ức chế enzym thử nghiệm.
 Tiến hành: Thay thế mẫu thử bằng dung môi lần lượt là
DMSO, MeOH, dung dịch đệm với nồng độ 100%. Sau đó
tiến hành theo quy trình chung khi sử dụng sàng lọc mẫu
cao.
 Sau khi thử nghiệm, xác định được dung môi
nào thích
hợp để sử dụng hòa tan mẫu trong quá trình thử sàng lọc.
244
Thiết kế thí nghiệm:
- Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ dung môi hòa tan mẫu.
 Mục đích: Tìm tỷ lệ dung môi thích hợp để hòa tan mẫu
thử.
 Tiến hành: Thử thay đổi tỷ lệ dung môi 10%, 25%,
50% và 100% khảo sát độ tan của mẫu trong mỗi
nồng độ khác nhau của dung môi. Dung môi được
pha loãng với tỷ lệ như trên với đệm phosphat.
 Xác định được tỷ lệ dung môi thích hợp để hòa tan mẫu
hoàn toàn, chuẩn bị cho quá trình sàng lọc và thử
nghiệm.
245
- Thí nghiệm 3: Khảo sát động học của enzym α-
glucosidase và chất nền PNPG.
 Mục đích: Xác định thời gian kết thúc phản ứng giữa
enzym α-glucosidase và PNPG.
 Tiến hành: Chuẩn bị mẫu đo và bắt đầu đo từ khi cho chất
nền PNPG vào, cách 2 phút tiến hành đo lại cho tới khi thấy
độ hấp thu không thay đổi.
 Thời gian kết thúc phản ứng được xác định để đồng
nhất thời gian phản ứng của các mẫu thử với
enzym α-glucosidase.
246
- Thí nghiệm 4: Sàng lọc dò tìm liều tối thiểu có tác dụng ức chế trên 80%
của các cao chiết.
- Mục đích: Tìm nồng độ thấp nhất của các mẫu cao chiết toàn phần
có tác dụng ức chế cao trên 80%.
- Tiến hành:
 Giai đoạn 1: sàng lọc mẫu thử (1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25
mg/ml). Chọn các mẫu cao có kết quả ức chế trên 90% , tiến
hành giai đoạn 2.
 Giai đoạn 2: tiến hành thử nghiệm các mẫu chọn từ giai đoạn 1
(0.125 mg/ml). Chọn các mẫu cao có kết quả ức chế trên 80% ,
tiến hành giai đoạn 3.
 Giai đoạn 3: tiến hành thử nghiệm các mẫu chọn được từ giai
đoạn 2 (0.125 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.025 mg/ml, 0.01 mg/ml).
Chọn mẫu cao có kết quả ức chế cao nhất ở nồng độ thấp nhất
để tiến hành lắc phân bố, tìm IC50 của các phân đoạn nhỏ hơn
nếu có thể tách tiếp.
247
1. Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ Moraceae:

Thí nghiệm 5: Tìm IC50 của các phân đoạn của mẫu cao có tác
dụng ức chế α-glucosidase mạnh nhất đã chọn được từ thí
nghiệm 4
 Mục đích: Đánh giá phân đoạn của cao chiết được lựa chọn
từ thí nghiệm 5 có tác dụng ức chế mạnh nhất để lên cột phân
lập chất tinh khiết
 Tiến hành: Tiến hành đo ở 6 nồng độ để tìm IC50 của các
phân đoạn cao, tiến hành đo tương tự thí nghiệm 4.
248
Bố trí thí nghiệm:

Thi ́ nghiệm 1: Dĩa 96 giếng có các mẫu: Mẫu trắng (Mtr), mẫu chứng (MCh),
mẫu chứng trắng (MCt), mẫu thử (MTh). Mỗi mẫu thử trong 6 giếng, lấy giá trị
trung bình.
249
Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 2: Tiến hành thử nghiệm với nồng độ dung môi lần lượt là 10%,
25%, 50%, 75%, 100% và nồng độ mẫu thử
1 mg/ml, 0.5 mg/ml.
Nồng độ
dung môi
10% 25% 50% 75% 100%
Nồng độ
mẫu thử
1 mg/ml - - + ++ +++
0.5 mg/ml - + ++ ++ +++
250

Thi ́ nghiệm 3: Mẫu chứng được đo trong 12 giếng, cách 2 phút tiến
hành đo 1 lần từ khi cho PNPG vào phản ứng. Đo đến khi thấy độ
hấp thu không thay đổi.
251

Thi ́ nghiệm 4: Dĩa 96 giếng có các mẫu: Mẫu trắng (Mtr), mẫu chứng (MCh),
mẫu
chứng trắng (MCt), mẫu thử (MTh). Mỗi mẫu thử trong 6 giếng, lấy giá trị trung bình.
Mỗi dĩa thử ở cùng một nồng độ, sàng lọc lần lượt các mẫu ở nồng độ 1mg/ml, 0.5
mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.025 mg/ml, 0.01 mg/ml.
252
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 5: Dĩa 96 giếng có các mẫu: Mẫu trắng (Mtr), mẫu chứng
(MCh), mẫu chứng trắng (MCt), mẫu thử (MTh). Mỗi mẫu thử trong 6
giếng, lấy giá trị trung bình.
Mỗi nồng độ cùng một mẫu thử ba lần. Nồng độ ký hiệu a, b, c… Mỗi lần
thử ký hiệu a, a’, a”.
253
2.2.1. Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ
Moraceae:
• Bước 1: mỗi giếng thử nghiệm: 10 µl enzyme

(1 U/ml), 10 µl mẫu thử (1 mg/ml), 150 µl
đệm phosphate (50 mM).
• Bước 2: Ủ (37 oC, 60 phút ) để sự ức chế
(nếu có) xảy ra hoàn toàn.
• Bước 3: Thêm 30 µl PNPG.
Các bước tiến • Bước 4: Ủ (37 oC, 30 phút) để chất nền phản
hành ứng với lượng enzyme α-glucosidase còn
lại.
• Bước 5: Đo ở bước sóng 415nm. Mỗi thí
nghiệm lặp lại 3 lần.
• Tính phần trăm ức chế của các mẫu
• Làm song song mẫu trắng, mẫu chứng
trắng, mẫu chứng dương.
254
Đánh giá kết quả

Mẫu thử PNPG Enzym Đệm
+ + +
A mẫu chứng trắng
+ +
Amẫu trắng
+ + +
Amẫu chứng
+ + +
A mẫu thử
% Ức chế α-glucosidase = 100 – (1- 𝐴 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử − 𝐴 𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔 )

𝐴 𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 − 𝐴 𝑚ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔
255
Đánh gia ́ kết quả:

 40 - 60% tác dụng ức chế trung bình
 60 - 80% tác dụng ức chế mạnh
 >80% tác dụng ức chế rất mạnh
Lựa chọn những mẫu cao chiết toàn phần, phân đoạn chiết và
chất chiết của dược liệu có tác dụng ức chế α-glucosidase ≥ 80%.
IC50 : Excel, Sigma Plot 10.0
256
2.2.2. Khảo sát thành phần hóa thực vật của mẫu dược liệu
theo định hướng kết quả sàng lọc có tác dụng cao nhất:
 Xác định mẫu

 Khảo sát thành phần hóa học
 Chiết xuất cao toàn phần
 Tách phân đoạn
 Phân lập chất tinh khiết theo định hướng của kết quả sàng lọc trên phân
đoạn của dược liệu có tác dụng ức chế α- glucosidase:
 Tinh chế sản phẩm bằng các phương pháp khác nhau
257
KẾT QUẢ
Kết quả
3.1. Chuẩn bị mẫu thử

 Từ 60 bộ phận dùng của 21 dược liệu, thu được 180 cao chiết đến
cắn khô.
 Cao chiết được bảo quản trong lọ màu, miệng rộng, lưu trữ trong tu
lạnh với nhiệt độ mát 12 – 15 oC để ổn định tính chất của các mẫu
cao, có thể sử dụng thí nghiệm trong thời gian dài.
259
Kết quả
3.1. Sàng lọc tác dụng sinh học các mẫu cao họ
Moraceae
 Thí nghiệm 1: Khảo sát dung môi hoa tan mẫu, DMSO,
MeOH và MeOH:DMSO (1:1)
Phần trăm ức chế α-glucosidase (%)
Nồng độ DMSO DMSO MeOH MeOH: DMSO
mẫu thử (Sigma) (Merk) (Merk) (1:1)
100% 8.23% 9.39% 58.84% 65.01%
Kết quả: chọn dung môi DMSO (Merck hoặc Sigma) để hòa tan
mẫu
260
Kết quả
Moraceae
 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ dung môi hòa tan mẫu.
Nồng độ
dung môi
10% 25% 50% 75% 100%
Nồng độ
mẫu thử
1 mg/ml - - + ++ +++
0,5 mg/ml - - ++ +++ +++
Kết quả: chọn nồng độ DMSO (100%) để hòa tan mẫu thử hoàn
toàn.
261
Kết quả
Moraceae
 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học phản ứng của enzym
α- glucosidase và chất nền PNPG.
Kết quả: Chọn thời gian bắt đầu đo là phút thứ 30 sau khi cho PNPG vào
giếng thử.
262
Kết quả
Moraceae
Thí nghiệm 4: Sàng lọc dò tìm mẫu cao dược liệu có tác dụng ức chế trên 80% ở
nồng độ khảo sát thấp nhất.
Giai đoạn 1: sàng lọc mẫu 180 cao ở 3 nồng đô
1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml. Chọn các mẫu cao ức chế trên 90% để
Ức chế
80 tiến hành giai đoạn 2. Số lượng mẫu
70
60
Ức chê
50 >70%
40
75
Ức chê
30 >80%
Ức chê
45
20 24 >90%
10
16
0
263
Kết quả
STT Mẫu thử % Ức chế α – Glucosidase
1 FaLH2 (90.68% ± 0.008)
2 FaTH3 (91.64% ± 0.003
3 FaRB2 (96.56% ± 0.020)
4 FaRB3 (97.87% ± 0.004)
5 FaTBD1 (98.42% ± 0.006)
6 FaTBD2 (96.32% ± 0.009)
7 FheT1 (94.19% ± 0.049)
8 FraL3 (94.46% ± 0.001)
9 MaRH1 (97.00% ± 0.045)
10 MaTK2 (90.20% ± 0.017)
11 MaLB2 (96.50% ± 0.045)
12 MaLB3 (93.20% ± 0.010)
13 AaR3 (92.20 %± 0.006)
14 AhT1 (94.00 %± 0.031)
15 AhT2 (91.40 %± 0.014)
16
Bảng AiL3
kết quả tác dụng ức ch2ế6α4 -(97.94 %± 0.013)
glucosidase trên
90%
Kết quả
Thí nghiệm 4: Sàng lọc dò tìm mẫu cao dược liệu có tác
dụng ức chế trên 80% ở nồng độ khảo sát thấp nhất.
Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm trên 16 mẫu đã chọn
từ
giai đoạn 1 ở nồng độ 0.125 mg/ml.
% Ức chế α – Glucosidase
MẪU
0.25 mg/ml 0.125 mg/ml
FaLH2 90.68 ± 0.008 85.90 ± 0.016

FaTBD2 96.32 ± 0.009 91.69 ± 0.006
MaLB2 96.50± 0.045 86.67 ± 0.008
MaLB3 93.20 ± 0.010 88.52 ± 0.010
AhT2 91.40 ± 0.014 91.07 ± 0.007
AiL3 97.94 ± 0.013 98.72 ± 0.003
Kết quả: Chọn các mẫu cao ức chế
265 trên 80% để tiến hành giai đoạn
Kết quả
Thí nghiệm 4: Sàng lọc dò tìm mẫu cao dược liệu có tác dụng ức
chế trên 80% ở nồng độ khảo sát thấp nhất.
Nồng đôṆ 0ồ..n015g25mđmộg/gm0/.ml01l
092%
0.0251m00g%/m1l,000.%01
100%
0 9 2%
92
9009%0% 0 088% 086%090% 088%
m 9 0
0g9/2m%l. 80%
90% % 082% 086% 088
% %086%
80% 083% mg/ml0 83%
074% %
80% 70%
% Giai đoạn
70% hành thử nNghồinệgmđởộ n0ồ.0n2062%
3: tiến092% g5 đmộ091%
g0/.m12l 5
70%
% Ức chế
60% 062%
% Ức chế
mg/ml, 0.05
60% mg/ml,
50% 099%
% 60% 089%
50% 50% 40% 087%
%
40%086 40% 30%
% 30% 30% 20%
20%
20% 10%
10% 0%
% 0% 10%
FaLH2 FaTBD2 MaLB2 MaLB3 AhT2 AiL3
0 %FaLH 2
AhT2 AiL3
FaTBD2 MaLB2 Mẫu
% Kết uả: n Vả ur ại ơng,
th MửuaLthử
Mẫ2 6 ngBh3iệm
q
có tác dụng
FaLH2 ức chế
FaTBD2
chFaọLH2mẫuFathTBâDn2 91.95%M ±
MaLB2
M0.012
(F
6 a ẫ Lic(0.01
u u mg/ml)
BMaLB3
2thsử an MghaAhT2
icLiệuBm3l AiL3
nghiệ m
Kết quả
 Thí nghiệm 5: Sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase của
các phân đoạn đơn giản hơn từ dược liệu đã chọn . Tìm
IC50 của các phân đoạn.
 Cao phân đoạn EtOAc:
IC50 = 0.46 μg/ml
267
Kết quả
 Cao phân đoạn EtOAc:
Kết quả: y = yo + a.lnǀxǀ +b.lnǀxǀ2 + c.lnǀxǀ3 => IC50 = 0.1623 μg/ml

(Sigma268 Plot)
Kết quả
 Cao phân đoạn CHCl3
269
Kết quả
 Cao phân đoạn MeOH
270
21 MẪU DƯỢC LIỆU Kết quả
60 BỘ PHẬN DÙNG
Chiết với
ba dung
môi
CHCl3,
EtOH,
H 2O
180 MẪU CAO CHIẾT

75 MẪU 47 MẪU 24 MẪU 16 MẪU
Thử hoạt tính ức chế α-glucosidase
ỨC CHẾ > 60% ỨC CHẾ > 70% nồng độỨC CHẾ
0.25 > 80%
mg/ml ỨC CHẾ > 90%

nồng độ 0.125 mg/ml
6 MẪU 13 MẪU
ỨC CHẾ > 80% ỨC CHẾ > 60%

nồng độ 0.01 mg/ml
MẪ
U
FAT
BD2
( 91.
95±
0.01
CAO PHÂN ĐOẠN CHCl3 CAO PHÂN
2) ĐOẠN EtOAc CAO PHÂN ĐOẠN MeOH
271
IC50 = 2.635 µg/ml Tìm
IC50 = 0.162 IC50 các phân đoạn lắc phân bố
µg/ml IC50với=dung môi
4.2 µg/ml
CHCl3, EtOAC, MeOH
THỬ NGHIỆM EX VIVO
272
THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH BẢO
VỆ GAN EX VIVO
CỦA CAO CHIẾT DIẾP
CÁ
HOUTTUYNIA CORDATA
Nguyễn Thị Phương Hạnh1, Võ Văn Giàu1, Huỳnh Ngọc

Thụy2, 1 ĐH Tôn Đức Thắng; 2 ĐH Y Dược TP.HCM; BM. Dược liệu;
Email
huynhthuyth@gmail.com
273
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
 Type I collagenase (Gibco)
 dimethyl sulfoxide (DMSO)
 trypan blue (Merck)
 Phosphate Buffered Saline (PBS; Oxoid)
 Albumin huyết thanh bò,
 Môi trường Eagle's minimal essential medium
(E’MEM)
 Huyết thanh bào thai bò,
 dexamethasone, insulin (Sigma).
 Kit thử alanine aminotransferase (ALT) của
Diagnosticum Zrt.
 Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho thí
nghiệm
tích. phân 274
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
 Sàng lọc tác dụng làm hạ men gan, bảo vệ tế bào gan sẽ được
triển khai trên dòng tế bào gan chuột tách ra và nuôi cấy theo
phương pháp Kiso (2) sau đó bị gây độc bằng CCl4.
 CCl4 là một chất độc được sử dụng phổ biến trong mô hình thử
nghiệm gây tổn thương gan in vitro và in vivo.
 Chất này gây nên sự xơ hóa gan và làm thay đổi các chỉ số
sinh hóa của gan với các triệu chứng tương tự với viêm gan
do virút cấp tính(3,4).
 Khi tế bào bị tổn thương các enzym transaminsase như ALT,
AST tiết ra môi trường làm cho hoạt độ ALT đo được trong môi
trường tăng.
 Đánh giá mức độ thương tổn tế bào gan và đánh giá hoạt tính
bảo vệ gan của cao chiết ở các nồng độ khác nhau qua kết quả
đo hoạt lực men gan.
275
Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm- phương pháp
tiến hành
quá trình phân lập tế bào gan chuột nhắt trắng
a b c
Chuột khi đạt đến trọng lượng yêu cầu (20 – 25g) sẽ được gây
mê bằng ether và mở ổ bụng để bộc lộ các cơ quan bên trong,
các cơ quan của hệ tiêu hóa như dạ dày, ruột được kéo sang
một bên để có thể quan sát tĩnh mạch cửa gan.
276
tiến hành
quá trình phân lập tế bào gan chuột nhắt
trắng
d e
f
Dùng kim cong có chỉ luồn qua tĩnh mạch chủ và cột cố định tĩnh
mạch chủ phía trên ngực. Cắt tĩnh mạch chủ dưới tại vị trí tĩnh
mạch dưới thận để tạo đường thoát dịch cho việc bơm rửa gan.
277
tiến hành
trắng
g h i
Đâm kim luồn vào trong tĩnh mạch cửa gan, dùng chỉ cột cố định
ống luồn với tĩnh mạch cửa.
Bơm PBS vào ống luồn tĩnh mạch để rửa gan. Rửa cho đến khi
gan chuyển sang màu vàng nhạt hoặc cho đến khi dung dịch PBS
chảy ra từ tĩnh mạch thân dưới không còn màu đỏ.
278
tiến hành
trắng
j l
k
Gan sau khi được rửa sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được giữ
trong dung dịch PBS có chứa kháng sinh rồi nhanh chóng chuyển
vào tủ cấy vô trùng. Tại đây gan sẽ được rửa lại bằng PBS không có
chứa kháng sinh.
Gan được ngâm ngập trong dung dịch collagenase 0,075%, lắc 100
vòng/phút bằng máy lắc trong 5 phút ở 37oC.
279
Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm- phương pháp
tiến hành
280
Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm- phương pháp tiến
hành
 Dùng 2 kẹp nhẹ nhàng vuốt từng lá gan phân tán các tế bào
(luôn luôn giữ các lá gan chìm trong dung dịch collagenase
0,075%). Kết quả đạt được sau quá trình này là tạo hỗn dịch
trắng đục.
 Hỗn dịch này được tiếp tục lắc trong 10 phút (100 vòng/phút) ở
37 oC trong dung dịch collagenase. Cốc đựng hỗn dịch được để
tủ lạnh 15 phút. Lọc qua gạc-cotton vô trùng. Sau đó thu lấy dịch
chứa tế bào đơn, ly tâm 1500 vòng/phút trong 15 phút ở 37 oC.
Thu lấy cặn tế bào.
 Rửa cặn tế bào bằng dung dịch PBS không có chứa kháng sinh
để loại bỏ collagenase. Ly tâm 1500 vòng/phút trong 15 phút ở
37 oC thu lấy cặn tế bào. Quá trình này lặp lại từ 3 – 5 lần nếu
còn hồng cầu.(Rửa – lọc – ly tâm)
 Xác định mật độ tế bào và tỷ lệ sống chết bằng cách nhuộm tế
bào chết bằng trypan blue 0.4%. Sau khi nhuộm tế bào bằng
trypan blue, đếm tế bào chết, ghi nhận tế bào sống trên buồng
đếm Neubauer.
281
Nhận xét:
 Qui trình thực hiện đơn giản, kinh phí thấp nhất
 Cả buồng gan đều được rửa sạch hồng cầu và bạc
trắng, không như phương pháp mà tài liệu đưa ra chỉ
thực hiện rửa được 1 lá gan lớn.
 Thời gian thực hiện nhanh 10 – 15 phút nên hạn chế
được sự tổn thương các tế bào gan.
 Việc tách và nuôi tế bào sau đó có thành công hay
không phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn rửa và phân
lập gan.
282
Quá trình phân lập tế bào gan chuột nhắt
trắng
 Huyền phù tế bào trong môi trường nuôi E’MEM có bổ
sung 10% huyết thanh bê, 1% DMSO. gentamicin (50
µg/L) rồi chia đều vào các ống (vial) 0,5 ml
 Ủ tế bào trong tủ ủ ở điều kiện 37oC, 5% CO2/95% O2

trong 2 giờ để tế bào phục hồi sau quá trình tách.
 Tế bào tách được sẽ được sử dụng nghiên cứu theo
các hướng khác nhau
283
Thiết kế thử nghiệm
Khảo sát nồng độ CCl4 và thời gian ủ tế bào thích hợp
 Tiến hành thăm dò nồng độ CCl4 tối thiểu có thể dùng gây độc tế
bào, phóng thích enzym gan đủ để khảo sát sự thay đổi của
enzym trong quá trình thử nghiệm.
 Pha CCl4 với 1% DMSO và nước cất để có dãy nồng độ CCl4
1,0%; 1,5% và 2,0%.
 Chọn nồng độ CCl4 thích hợp để sử dụng cho thử nghiệm.
 Thăm dò thời gian ủ tế bào với CCl4 thích hợp, dò tìm thời điểm
hoạt độ men gan tăng cao nhất bằng cách tiến hành ủ tế bào
trong thời gian 90 phút, trong thời gian ủ, cứ mỗi 15 phút hút dịch
nuôi cấy đi đo hoạt lực enzym ALT trên tất cả mẫu. Chọn thời
điểm mà hoạt lực enzym cao nhất để làm thí nghiệm.
284
trắng
285
trắng
Tế bào gan đơn (x40) Tế bào gan chết (x40)
286
Kết quả thí
nghiệm
Số tế
Lần thực hiện Mật độ tế
bào Tỷ lệ (%)
bào (tế
sống
bào/ml)
(tế bào/ml)
Lần 1 79,7.105 77,8.105 97.6
Lần 2 88,1.105 83,6.105 94.9
Lần 3 59,3.105 54,6.105 92.1
Trung bình 75,7.105 71,9.105 94.8
324
Biểu diễn nồng độ CCl4 và thời gian ủ đến sự tăng
men gan của tế bào
Chọn nồng độ gây độc của CCl4 là 1,5% và thời gian gây độc tế bào là
45’ làm thông số để thực hiện thí nghiệm sàng lọc tác dụng bảo vệ
gan
trên mô hình ex vivo
325
Chuẩn bị mẫu thử
 Cây diếp cá được thu mua ở Bình dương, thành phố Hồ Chí
Minh.
 Bộ phận dùng là phần trên mặt đất. Mẫu được xác định bằng
việc khảo sát đặc điểm hình thái thực vật học dựa trên quan
sát cây tươi.
 Dược liệu được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khô, xay
nhỏ làm nguyên liệu cho chiết xuất.
 Chuột nhắt trắng (chủng Swiss albino) 20 – 25 g Viện Vacxin
và sinh phẩm Y tế Nha Trang, được nuôi tại phòng thí
nghiệm Dược lý – Khoa Dược – trường ĐH Y Dược TP. HCM
289
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
 Chuẩn bị mẫu thử: 50 g dược liệu ngâm trong

dichloromethan 24 tiếng sau đó đun hồi lưu cách thủy ở
nhiệt độ 40 oC trong 3 giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến khi giọt
dịch chiết không để lại cắn. Gộp các dịch chiết, thu hồi dung
môi để thu cao dichloromethan.
 Bã dược liệu được loại sạch dung môi và tiếp tục chiết bằng
cách đun hồi lưu cách thủy bã dược liệu với dung môi
methanol ở 60 oC trong 3 giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến khi
giọt dịch chiết không để lại cắn, gộp các dịch chiết, thu hồi
dung môi để thu được cao methanol.
290
Thiết kế thí
nghiệm
 Thử nghiệm sàng lọc tác dụng làm hạ men gan của cao chiết diếp cá
trên mô hình tế bào gan chuột nhiễm độc CCl4:
 Tế bào gan chuột sau khi tách được ủ phục hồi trong 2h ở điều kiện nêu
trên,
 Tiến hành gây độc tế bào bằng CCl4
 Bổ sung cao chiết diếp cá (mẫu thử) vào các ống đựng tế bào sao
cho nồng độ cuối cùng của mẫu thử trong ống đựng tế bào đạt các
nồng độ mong muốn khác nhau để kiểm tra hoạt độ men gan ALT.
 Tiến hành song song các thử nghiệm là mẫu chứng trắng không gây
độc và mẫu gây độc nhưng không dùng thuốc thử nghiệm để đánh giá
so sánh kết quả.
 Các thử nghiệm được lặp lại nhiều lần (N=10) với n =6 cho mỗi lần thử
nghiệm. (N=số lần sử dụng chuột tách tế bào gan; n=số ống tế bào sử
dụng cho mỗi mẫu)
 Đánh giá kết quả: đo hoạt tính của men gan ALT theo hướng dẫn cách
đo của nhà sản xuất (Diagnosticum). Kết quả được đánh giá theo
chương trình phân tích thống kê dữ liệu của phần mềm Exel.
291
Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của cao chiết cây diếp cá ở các nồng
độ khác nhau
kết quả hoạt độ
Kết quả
men gan
Kết quả hoạt tính bảo vệ gan của mg/ml so với lô độc
UI/l
700 cao chiết H.cordata
650 tăng 14,67 l
Lô độc 644 ± 23
600 so voi trắng
Lô chứng trắng: tế bào chưa bị nhiễm
550 độc; Lô chứng
500 361.6 UI -
450
Lô chứng độc: tế bào bị gây độc bởi
CCl4;
trắng
400 Lô 1,2,3,4: lô thử nghiệm có dùng Lô thử giảm 2,9 lần
220,6 ± 19
UI/l
350 thuốc sau khi gây độc thứ tự ở các

10,05 so với độc
300 nồng độ 0,05; 0,1; 0,25 và 0,5
250 mg/ml Giảm 4,7 lần
Lô thử 2 0,1 136.6 ± 15
200 so với độc
150
100 Lô thử 3
127.4 ± 18 Giảm 5 lần
50 0,25
so với độc
0
Lô trắng Lô độc Lô thử 1 Lô thử 2 Lô thử 3 Lô thử
4
Từ các kết quả thu được trong thử nghiệm này có thể kết luận là
cây diếp cá có tác dụng hạ men gan theo kết quả thử nghiệm ex
vivo
292
THỬ NGHIỆM IN VIVO
293
 Thử nghiệm tác dụng của dược liệu làm
giảm enzyme gan trên gan chuột bị gây
độc: Chuột nhắt trắng đực, cân nặng
khoảng 20 - 25 g, được cung cấp bởi Viện
Pasteur-TP. HCM, nuôi bằng thực phẩm
viên do Viện Pasteur cung cấp và được ăn
uống bình thường. Cho chuột nhịn đói 18
giờ trước khi thử nghiệm.
294
Hoá chất dùng trong nuôi cấy tế bào
 Dulbecco’s modified Eagles’s medium (DMEM);
 Minium Essential Medium Eagle (MEME);
 dung dịch 2 mM L-glutamine;
 dung dịch 0,1 mM non-essential aminoacid;
 dung dịch 10% FBS;
 dung dịch 0,1% gentamicine; (Sigma-Aldrich);
 trichloroacetic acid (TCA);
 dung dịch phosphat buffer saline (PBS); dung dịch acid acetic
1%;
 dung dịch Tris-base 10 mM;
 Sulphorhodamin B (SRB),
 Dimethylsulfoxyde - (DMSO -Sigma).
295
Trang thiết bị dùng trong khảo sát sinh học
 Máy đo quang phổ tử ngoại UV-1700 Pharma Spec.
(Shimadzu- Nhật)
 Máy đo quang phổ tử ngoại UV-vis RA – XT Technicon (Bayer)
 Máy đo quang phổ tử ngoại UV max microtier plate reader
(Molecular devices, Menlo Park, CA) Phòng Nuôi cấy tế bào, King’s
College, Univ. of London, UK
 Kính hiển vi quang học Olympus CH-20 (Nhật)
 Micropipet 1 ml; 0.1 ml- multipipet 10-100 ml.
 Hộp nhựa T-25; T-75; tiệt trùng dùng một lần để nuôi cấy tế bào.
 Khay thử Costar USA 15x8x1 cm có 96 giếng nhỏ, đường

kính lỗ 0,8 cm thể tích tối đa là 0,3 ml.
 Máy ly tâm Biofuge Pico (Heraeus)
 Bể siêu âm Sonorex-Super RK 1028 H (B DNAelin)
 Tủ cấy UniMat-BS; Tủ ấp có máy lắc Leec Compact
incubator Phòng nuôi cấy tế bào, King’s College, Univ. of London,
UK.
296
Khảo sát về tác dụng sinh học
Mục đích: 2 mô hình thử nghiệm sinh học được sử dụng lần lượt
trong suốt quá trình nghiên cứu của đề tài với mục đích.
Dùng các kết quả thử nghiệm sinh học để định hướng hướng dẫn
cho việc chiết tách các phân đoạn có tác dụng, các chất tinh khiết từ
cao chiết toàn phần của dược liệu. (mô hình thử tác dụng hạ
enzyme gan trên gan chuột bị nhiễm độc – mô hình 1).
Đánh giá định tính tác dụng sinh học các phân đoạn chiết và các
hợp chất tinh khiết được chiết tách từ các phân đoạn. (mô hình thử
tác dụng độc trên 2 dòng tế bào ung thư HepG2 và Caco2 – mô
hình 2).
297
Kết quả khảo sát sinh học
THỬ NGHIỆM IN VIVO
Thử độc tính cấp LD50

Kiểm tra độc tính của cao chiết
298
Kết quả khảo sát sinh học
Nguyên tắc chung xác định LD50
 Xác định LD50 là tìm liều gây chết 50% số thú vật thí nghiệm
 Con vật được chia thành nhiều nhóm tương tự nhau về
trọng lượng, giới tính
 Mỗi nhóm dùng 1 liều (theo kg thể trọng), các nhóm

khác
nhau dùng liều khác nhau
 Đánh giá theo nguyên tắc “ chết hay sống” ở mỗi

nhóm
299
Điều kiện trong thử xác định LD50
Theo “ Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc” Đỗ Trung Đàm
“Tiến hành trên 2 loại động vật thí nghiệm, một loài gậm nhấm, một
loài không phải gậm nhấm, tuy nhiên do điều kiện thường thử trên
chuột nhắt trắng hoặc trên chuột cống trắng”
“Có thể dùng uống, tiêm bắp, tiêm dưới da, tiêm trong màng bụng,
tiêm tĩnh mạch – tốt nhất là dùng đường dự định sẽ dùng cho
người sau này”
Luận án chọn cách dùng uống
Số chuột thử thăm dò: từng 2 con một cho đến khi có 1 chết một
sống thì thử lại trên số chuột lớn hơn.
Số lần dùng thuốc: thử độc tính cấp về nguyên tắc chỉ dùng thuốc
1 lần
Thời gian quan sát: liên tục trong 24, 36, 48, 72, 96 giờ 300
Kết quả thử độc tính cấp
Pp thử: Theo Đỗ Trung Đàm
Mẫu thử: cao chiết Diệp hạ châu đắng

Lô T1.1: liều dùng cao gấp 2 lần so với liều lý thuyết
0.096 g cao/1000 g chuột x 2
Lô T1.2: dùng liều x 100 lần so với liều tinh toán ban đầu
0.096 g cao/1000 g chuột x 100
Kết quả thăm dò ở liều cao vẫn không có chuột chết
Thử trên liều tối đa có thể thử
Chuột dùng trong thử nghiệm sau cùng: (n=6 chuột/ lô x 3 lô ) x lặp lại
5 lần thử
Bảng minh hoạ kết quả thử nghiệm trong các lần thử
Số chuột Loài Kết quả khảo sát
chứng To 30 Đực Không có con chết
Thử T1 30 Đực Không có con chết
Thử T2 30 Đực Không có con chết
Không tìm thấy liều LD50 301

Mô hình
Thử nghiệm tác dụng làm hạ men gan
302
Nguyên tắc thử tác dụng làm hạ men gan trên
gan chuột bị gây độc
 Gây độc chuột bằng dung dịch CCl4
(đường uống)
 Xác định thời điểm men gan (ALT, AST) tăng cao
nhất sau khi gây độc
 Cho chuột dùng cao chiết thử nghiệm ngay 1 giờ

sau khi gây độc trên gan
 Tiến hànhđo men gan ở thời điểm mà

men gan tăng cao nhất sau khi gây độc.
 Đánh giá mức độ hạ men gan của cao chiết thử
nghiệm để sơ bộ kết luận về tác dụng trên gan
của dược liệu.
303

Thử nghiệm 1: xác định nồng độ men gan sau khi gây
độc bằng CCl4 trên gan chuột theo thời gian
Thí nghiệm 2: So sánh tác dụng làm hạ men gan
của các cao chiết khác nhau từ dược liệu khảo sát
– Lô To, Tđ, T1, T2, T3, T4
Thí nghiệm 3: Thăm dò tác dụng bảo vệ hoặc phục hồi
chức năng gan của cao thử nghiệm – Lô To, Tđ, T3,
T’3
304
Bố trí phân lô thí nghiệm

Dùng chuột nhắt trắng, đực, mỗi lô ít nhất 6 con. Các thử nghiệm lặp lại
6 lần
Lô To chứng trắng chuột nuôi trong điều kiện bình thường
Lô Tđ: chứng độc chuột được gây độc nhưng không dùng thuốc
Lô T*: chứng mẫu thử - chuột dùng mẫu thử nhưng không gây độc
Lô T lô thử - các lô dùng thuốc thử nghiệm có gây độc, đánh
số tuỳ theo mẫu thử nghiệm khác nhau (T1-T5)
24 giờ sau khi gây độc trên gan, máu chuột sẽ được lấy hòa trong dd
EDTA (1:4), ly tâm lấy huyết tương đo UV λ = 340 nm để xác định
nồng độ men AST, ALT (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Các số liệu thu được sẽ được xử lý thống kê với phần mềm Excel.
Với lô có n = 6
305
Kết quả thí nghiệm 1:

KS hoạt độ AST theo thời gian sau khi gây độc trên gan bằng CCl4
Mục đích:
•Theo các TLTK, thời điểm lấy máu đo men gan là 24 giờ sau khi gây độc bằng CCl4
•Để đánh giá sự tương thích của phương pháp trong điều kiện tiến hành thí nghiệm,
chúng tôi tiến hành khảo sát lại thời điểm men gan chuột tăng cao nhất
Thời điểm: 6, 12,18, 24 và 48 giờ sau khi cho chuột uống CCl4
Cách tiến hành:

• thoa cồn sát trùng
• vuốt đuôi chuột xuống nhiều lần, chích kim tiêm vào tĩnh mạch chuột rồi rút kim tiêm
• Vuốt đuôi chuột để có 1 giọt máu lớn
• dùng mao quản chia vạch hút lấy máu chuột cho vừa đủ định lượng (0.05 ml)
• Hòa trong 0, 2ml EDTA (tỉ lệ 1:4)
Đo enzym AST: Đo theo qui trình hướng dẫn đính kèm của hãng sx bộ thuốc thử
•Ly tâm lấy huyết tương (plasma EDTA)
•Hút 0,1 ml mẫu vào 1 ml thuốc thử đã chuẩn bị sẵn, ủ 1 phút 37 oC
• λ 340 nm
306
Kết quả thí nghiệm 1

Khảo sát tác động gây độc trên gan của CCl4 theo thời gian
Tại thời điểm 24 giờ sau khi gây độc bằng CCl4 men gan (AST) chuột tăng cao
nhất
Kết quả hoàn toàn phù hợp theo TLTK:, thời điểm đo máu sẽ được lựa chọn dựa
theo TLTK và kh ô tính toán số liệu
nG giô 0 6
ốn g cho t hử
1 2 1 8
hi ệ m ày
2 4 48
ø th kê ng n
T 3.567 5.792 17.39 35.95 74.45 5.675
C 3.234 3.012 3.667 3.606 3.465 3.572
80
70
T: thử;
60 T
50 C C:
40
chứng
30
20
10
0
0 6 12 18 24 48
Kết luận: Tiến hành đo men gan vào thời điểm 24 giờ sau khi
gây độc trên gan 307
Kết quả thí nghiệm 2: Kết quả khảo sát sinh học
So sánh tác dụng hạ men gan của các cao chiết thử nghiệm.
Tỉ lệ giảm TđT1 TđT2 Tđ/T3 Tđ/T4 K e át qua û thö û ta ùc duïng ha me n ga n cuûa ca ùc cao
1,61 chie át tö ø
AST 1,44 1,29 2,35 500

450
Phyllanthus amarus
AST
400
350 ALT
ALT 2,68 2,27 3,29 2,11 300
250
U
200
I
Tđ lô chứng độc, Tc lô chứng trắng, T1:lô dùng 150
100
cao chiết 1, T2:lô dùng cao chiết 2, T3:lô dùng 50
0
cao chiết 3, T4:lô dùng cao chiết 4 To Tñ T1 m a ãu T2 T3 T4
 P. amarus Schum. & Thonn. có tác dụng làm hạ men trong
gan sau khi gây độc gan bằng CCl4;; Cao chiết 3 làm hạ
men gan tốt nhất.
Kết quả k hả o sát tác dụng hạ m e n g a n c ủa c á c bộ phậ n dùng
Kết quả thí nghiệm 2: (tt) So sánh tác dụng hạ 500
450
AST
men gan của các bộ phận dùng P.amarus

400 A LT
350
300
UI
250
Tỉ lệ giảm Tđ / LPa Tđ /TPa Tđ/RPa 200

150
100
AST 1,29 1,59 0,78 50

0
m ẫ u
ALT 3,10 8,50 4,72
To Tñ L - Pa T- Pa R-Pa
Tđ: lô chứng độc, Tc lô chứng trắng, LPa:lô

dùng cao chiết lá Pa TPa:lô dùng cao chiết
Thân P. amarus Schum. et Thonn. có thân Pa RPa:lô dùng cao chiết rễ
tác dụng rõ P3a08
Kết quả thí nghiệm 2: (tt) Kết quả khảo sát sinh học
So sánh tác dụng của cao chiết P. amarus và P. urinaria
L.
Tỉ lệ giảm
24h Tđ/TpPa Tđ/TpP.u 500
450
AST
400
ALT
350
AST 2,16 1,44 300

250
200
ALT 9,90 1,55 150

100
•P. amarus (Pa-Diệp hạ châu đắng) có tác 50

0
Tp-Pa
dụng làm hạ men gan chuột thử nghiệm
mKếạtnhquhảơnthíPn. ugrhiniệamria3L: .th(Pă.mu )dò tác dụng
phục hồi và bảo vệ gan K eát quaû khaûo saùt taùc duïng phuïc hoài vaø baûo veä gan
Tỉ lệ giảm Tđ/T3 Tđ/T’3 To : lô chứng trắng 600

cuûa cao chiieát
P.amarus
Tđ: lô chứng độc;
500
T3 : thử phục hồi;
AST 1,19 6,34 AST
T’3: thử bảo vệ gan;
400
UI
ALT
ALT 1,97 22,12 T*3 : lô chứng thuốc 300
200
100
Cây Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan r ất rõ. 0
To T m a uã T3 T'3 T*3
Thử nghiệm trên tác dụng phục hồi tuy có nhưng không rõ bằng tác
dụng bảo vệ, tuy nhiên những thương tổn tế bào của lô thử có uống
thuốc cho thấy tế bào phục hồi nhanh hơn so với lô chứng độc
346
Nghiên cứu thuốc trị Parkinson
 Dopamine dẫn truyền các tín hiệu điều kiển chuyển động trong tế bào
thần kinh não.
 Khi bị Parkinson, bệnh nhân bắt đầu bị run,gặp rắc rối trong chuyển
động và các sự cố khác.
 Nguyên nhân do ty thể trong các tế bào thần kinh tạo ra dopamine đã
bị tổn thương, các tế bào não sản xuất dopamine sẽ chết, và gây ra
bệnh Parkinson
 Điều này làm suy yếu khả năng của ty thể lưu thông quanh tế bào khi
chúng bình thường. Kết quả sợi trục thần kinh (axon) mà các tế bào
thần kinh sử dụng để gởi tín hiệu bị yếu đi. Một vài ngày sau đó, tế
bào hay một phần bộ phận của tế bào cũng chết.
347
 “Các nghiên cứu phương pháp điều trị Parkinson tập
trung vào cứu các tế bào thần kinh tạo dopamin.
 Nhưng kết quả cho thấy việc giữ các sợi trục
thần kinh axon khỏe mạnh cũng rất cần thiết”
Karen O''Malley, trường Đại học Y khoa Washington ở
St Louis.
311
Cách tiếp cận đặc biệt
Nghiên cứu thuốc trị Parkinson

 “Khi các trục thần kinh axon chết, dopamine không còn đến được các tế
bào thần kinh khi có nhu cầu. Tế bào ít kết nối với các tế bào khác
(những tế bào mà tế bào thần kinh phải kết nối để tồn tại).”
 So sánh hệ thống trục axon như việc vận chuyển vật tư cho tuyến
đường sắt. Ty thể là một phần hàng hóa của đường sắt. Chúng cung
cấp năng lượng cho phép các trục axon làm công việc của mình.
 O'Malley đã cho vào các tế bào thần kinh chuột nuôi cấy một chất độc
gọi là MPP + gây ra các triệu chứng như Parkinson.
 Độc tố này làm ngừng chuyển động của ty thể trong axon trong 30 phút.
Đưởng sắt vẫn hoạt động, vận chuyển hàng hóa đến cuối axon. Nhưng
hầu như ty thể ngừng di chuyển.
 Các nhà khoa học sàng lọc một số hợp chất để xem chúng có thể ngăn
chặn các tác hại của MPP. Họ phát hiện ra rằng chỉ có 2 chất chống oxi
hóa, glutathione và N-acetyl cysteine hoạt động ngăn chặn hiệu quả.
 N-acetyl cysteine đã được chứng minh có hiệu quả trong mô hình động
vật mắc bệnh Parkinson và được sử dụng như là một phương pháp
điều trị cho các chứng rối loạn khác của bệnh nhân.
 Nghiên cứu đã được công bố trên Tạp chí Neuroscience.
312
Máy phân tích PCA
313
Tách tế bào não giữa của bào thai
chuột 2 tuần tuổi
314
Tách tế bào não giữa của bào thai chuột 2 tuần
tuổi
315
Tế bào thần kinh sinh dopamin
Parkinson: bệnh thoái hóa hệ thần kinh
trung ương do mất mát hoặc thiếu hụt
các tế bào thần kinh sinh dopamine
hay neuron sinh dopamine.
317
dopamine: là hoóc-môn và chất dẫn truyền thần kinh xuất hiện
phổ biến ở động vật, bao gồm cả động vật có xương sống lẫn
không xương sống. cấu trúc hóa học là một phenethylamine.
thể vân (striatum): vùng não tiết ra chất dẫn truyền thần kinh
dopamine.
Tyrosine hydroxylase
ICC-primary antibody
318

Các Phương Pháp Sàng Lọc Tác Dụng Sinh Học Từ Dược Liệu

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Các Phương Pháp Sàng Lọc Tác Dụng Sinh Học Từ Dược Liệu

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ĐẠI HỌC Y DƯỢC – THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ

MÔN DƯỢC LIỆU - KHOA DƯỢC

Các phương pháp sàng lọc tác

Thực hiện nhanh, ít tốn thời gian

Rồi xin giấy phép, đăng kí thuốc

Trừ trường hợp khẩn cấp và đặc

Khám phá/tìm được đích tác

Tìm hiểu các cây thuốc ở các vùng khác nhau

 Pha loãng mẫu

 Lưu trữ mẫu

Chuẩn bị mẫu

 Pha mẫu trong hệ đệm, chất trợ tan

Đối tượng thử • suốt

Sàng lọc in vitro tác dụng của dược liệu

Loại dung môi HỌC

Cao cồn Bã dược liệu

Loại dung môi DC nước k thể lắc pbo tr.tiếp vs

Cao chiết toàn phần Sàng lọc sinh học

Chiết tách Phân bố lỏng - lỏng

Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3

Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3

Phân đoạn 2a Phân đoạn 2b Phân đoạn 2c

Phân đoạn 2b1 Phân đoạn 2b2 Phân đoạn 2b3

Chất A Phân đoạn 2b2a Chất B

2. Tế bào tách từ các cơ

3. Dòng tế bào – cell

3.Phương pháp thử - Method

In vitro: Dùng các phản ứng hóa học, sinh

Các khảo sát sử dụng:

3.Phương pháp thử – in vitro

- Số lượng mẫu thử lớn:

- Tạo ra sự t h a y đổi không ngừng cho nghiên cứu

3.Phương pháp thử- in vitro

Do thử được tới mức độ

Do các điều kiện thử nghiệm in vitro có

Dẫn tới những sai biệt trong kết

3.Phương pháp thử- in vitro Sai biệt do khách

Trong sinh hóa, các

3.Phương pháp thử – ex vivo

ex vivo được thử nghiệm với mảnh mô, những cơ quan,

Qui trình thử ex vivo

Tế bào Một vài môi

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY (trong thử tế bào)

Tùy mục đích thí nghiệm, số lô chia khác nhau.

Cơ bản chia 4 lô như sau

 Theo cách tính của phương pháp thử đã chọn

Tính theo % chỉ cho đánh giá sơ bộ do có biên độ sai số lớn

• Pp ORAC (oxygen radical

• Pp FRAP (Ferric ion Reducing

R-O-O-R Homolytic: phân chia thành các nhóm giống

9.2 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential)

9.4 Phương pháp đo MDA

9.Một số phương pháp sàng lọc sinh học thường

 MDA phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở 90 oC trong môi

 đo phổ hấp thu ở bước sóng 532 nm

9.6 Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase

Thứ tự tiến hành:

3. M ư ć độ ức chế của mẫu sẽ thể hiện qua

 Mô hình thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế enzym

2. Lô chứng bệnh gây bệnh nhưng không điều trị,

9.7 Phương pháp phân tích FRAP

Nguyên tắc: Fe (III) –TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) bị khử thành p h ư ć Fe (II)

Sản phẩm màu xanh dương