Prezentacja ,,Biochemia medyczna”

Jan Erdman, Bartłomiej Stanula

METODY
DEZINTEGRACJI
KOMÓREK I TKANEK
O CO CHODZI?

Celem dezintegracji komórek jest wyodrębnienie zawartych wewnątrz

makromolekuł

Dezintegracja polega na rozbiciu barier zewnętrznych komórki, aby

wydobyć np. białko, jednocześnie zachowując jego właściwości
biologiczne

Przed dezintegracją kluczowe jest wprowadzenie komórek do buforu

stabilizującego istotny dla nas materiał, przed degradacją
METODY DEZINTEGRACJI

• METODY BIOLOGICZNE: • METODY CHEMICZNE:

• METODY FIZYCZNE:

⮚ Trawienie enzymatyczne ⮚ Liza alkaliczna

⮚ Liza detergentami
⮚ Homogenizacja

⮚ Młyn kulowy

⮚ Sonifikacja

⮚ Szok osmotyczny

⮚ Naprzemienne zamrażanie i
rozmrażanie

⮚ Rozcieranie

⮚ Prasa Frencha
METODY FIZYCZNE
1. Homogenizacja:
• Metoda stosowana do dezintegracji miękkich tkanek zwierzęcych. Homogenizator
Potter‑Elvenhejma najlepiej sprawdza się dla tkanek serca, wątroby czy mózgu, a
homogenizator Dounce'a z kolei dla komórek pochodzących z hodowli tkankowych.
• Wykonuje się ją w obniżonej temperaturze (pomiędzy 0-4°C).

• Wykonuje się ją po dodaniu inhibitorów proteaz, RNAz, czy też DNAz

METODY FIZYCZNE
2. Młyn kulowy:
• Dezintegracja mechaniczna za pomocą kulek
szklanych wytrząsanych w zawiesinie
komórek
• Młyny kulowe najlepiej sprawdzają się w
przypadku grzybów strzępkowych i drożdży
3. Sonifikacja:
• Dezintegracja mechaniczna za pomocą
fal dźwiękowych wysokiej częstotliwości
(ultradźwięki)
• najlepsze rezultaty daje w przypadku
bakterii i komórek zwierzęcych
• ilość komórek nie może przekroczyć 1 g
w pojedynczym cyklu
METODY FIZYCZNE
4. Szok osmotyczny:
• Dezintegracja mechaniczna poprzez zawieszenie
komórek w roztworze hipertonicznym, następnie ich
odwirowaniu i umieszczeniu w środowisku wodnym
co powoduje ich pęcznienie i wydzielanie na
zewnątrz wewnątrzkomórkowych białek
• Stosowana w komórkach pozbawionych ścian
komórkowych
5. Naprzemienne zamrażanie i
rozmrażanie:
• Dezintegracja mechaniczna ścian i błon
komórkowych na skutek powstających
wewnątrz komórki kryształów lodu
• Uwalnianie do 10% białek/cykl
• Dla białek odpornych na denaturację
METODY FIZYCZNE
6. Rozcieranie:
• Mechaniczna dezintegracja
ścian i błon komórkowych na
skutek ucierania komórek z
substancjami ściernymi
(piasek kwarcowy)
7. Prasa Frencha:
• Metoda polega na poddaniu
zawiesiny komórek
wysokiemu ciśnieniu i
gwałtownym uwolnieniu do
ciśnienia atmosferycznego w
specjalnym typie prasy
• Zmiana ciśnienia powoduje
rozpad komórek
• Używana jest najczęściej do
dezintegracji komórek
bakteryjnych i drożdżowych
METODY BIOLOGICZNE
1. Trawienie enzymatyczne:
• Degradacja ściany komórkowej
poprzez działanie enzymów:
lizozym (bakterie), glukanaza
(drożdże)
METODY CHEMICZNE
1. Liza alkaliczna:
• Chemiczna dezintegracja
ścian i błon komórkowych na
skutek działania roztworu
NaOH
2. Liza detergentami:
• Chemiczna dezintegracja błon
komórkowych
• na skutek działania detergentów (Triton
X-100, NP-40)
• Jej główną zaletą jest to, że może być
stosowana do uwalniania białek
błonowych ‑ ten rodzaj białek jest
najtrudniejszy do wyizolowania.
 Wirowanie
jako metoda frakcjonowania, wyodrębniania i określania masy
cząsteczkowej makromolekuł
 Wirowanie
● proces fizyczny służący do rozdzielenia
składników mieszaniny o różnej gęstości.
● wykorzystywane jest działanie siły
odśrodkowej, która wielokrotnie
przewyższa działanie sił grawitacyjnych.
● zwiększenie szybkości sedymentacji
● Sedymentacja - proces
opadania zawiesiny ciała
stałego w cieczy w wyniku
działania siły grawitacji
● prowadzi do rozdziału
substancji
niejednorodnych,
kryterium podziału jest
gęstość
Wirowanie różnicowe

● metoda służąca do oddzielania

organelli i innych cząstek
subkomórkowych na podstawie
ich szybkości sedymentacji.
● polega na stosowaniu coraz
większych prędkości wirówki, co
umożliwia kolejno osadzenie
coraz mniejszych cząsteczek.
● większe cząsteczki osadzają się
szybciej i przy mniejszych siłach
odśrodkowych
 Ultrawirowanie
● wirowanie przy bardzo wysokiej liczbie
obrotów
(> 10-15 tyś obrotów na minutę)
● Cel: oddzielenia bardzo drobnych cząstek
rozproszonych w cieczy o gęstości zasadniczo
równej
● Zastosowanie : frakcjonowaie mieszanin
polimerów organicznych (DNA, białka),
badania wirusów i komórek, odwirowywanie
trudno sedymentujących osadów,
frakcjonowanie i izolacja poszczególnych
organelli komórkowych np. chloroplastów Frakcje organellowe komórek roślinnych
rozdzielone przez ultrawirowanie w
gradiencie sacharozowym
 Wirowanie w gradiencie gęstości
● przemieszczaniu się cząstek pod wpływem siły
odśrodkowej w roztworze(np. polimeru) o wzrastającej
gęstości.
● stosuje się co najmniej jedną ciecz rozdzielającą
● Jeśli używa się tylko jednej cieczy - ciągły gradient gęstości
● Jeśli używa się więcej niż jednej cieczy - każda ciecz ma
inną gęstość.
● Ciecze te nakładają się na siebie, od najgęstszej na dole
do najmniej gęstej na górze.
● można izolować organella, białka, kwasy nukleinowe
● W procesie wirowania
następuje migracja
komórek w gradiencie
● gdy ich molekularna
gęstość jest
zrównoważona
gęstością separującego
roztworu dana grupa
komórek zajmuje
zwarte określone
miejsce.