Principi elektroforeze

Elektroforeza je metoda kojom se pomoću jednosmerne struje razdvajaju pojedine

komponente nekog složenog rastvora. Elektroforeza se najčešće koristi za analizu
belančevina i lipoproteina u serumu. Izvodi se na inertnim podlogama kao što su
celuloza-acetat, ili agar gel. Uzorak seruma se stavi na podlogu nakon čega se propušta
jednosmerna struja. Da bi se obezbedio protok struje upotrebljava se odgovarajući pufer
sa odrđenim pH vrenostima i odgovarajućom joskom jačinom. Zbog razlike u
naelektrisanju, pojedine frakcije seruma se kreću u električnom polju u različitom smeru i
različitim brzinama. Kada se protok struje isključi, razdvojene komponente se oboje što
omogućava određivanje koncentracija pojedinih serumskih komponenti odnsno vrši se
ocrtavanje grafikonana na kome se obično može videti 5 odvojenih pikova: albuminski,
α1-globulinski, α2- globulinski, β-globulinski i γ-globulinski. Ovo se naziva zonalna
elektroforeza.
Elektroforeza, kako samo ime nagovešta, radi na principu električnog polja u kojem se
molekul kreće kroz smešu i kraći fragmenti se kreću mnogo brže od dužih fragmenata, jer
je kraćim fragmentima lakše da se kreću kroz smešu. Smeše koje se koriste za pravljenje
mogu biti od različitog materijala, ali do sada se najbolje pokazala smeša, tj gel
napravljen od agaroze. Brzina kretanja fragmenata kroz gel zavisi od više faktora.
Koncentracija agaroze je jedan od faktora. Što je koncentracija viša, kretanje fragmenata,
pogotovo velikih fragmenata, je teža. Sam oblik fragmenata koji se kreće takođe ima
uticaj na brzinu. Na primer molekul može biti linearan, spiralno uvijen u krug ili linearan
sa manjim oštećenjima. Svaki od ovih oblika ima drugačiju brzinu kretanja: spiralno
uvijeni je najbrži, dok je linearni najsporiji. Prisustvo Etidijum Broma (EtBr) može da
uspori kretanje molekula jer EtBr ima tu osobinu da može da razreši molekul pri samom
kretanju. Takođe i napon (elektročno polje) koji se koristi ima uticaj na kretanje, na
primer najmanje moguće polje je oko 5-8 V/cm.
Kretanje čestica prilikom elektroforeze zavisi I od:gustine naelektrisanja, stepena
hidratacije, dimenzija, stepena disocijacije čestica i od uslova u kojima se elektroforeza
vrši: viskoziteta, pH, temperature i jonske jačine rastvora, kao i od električnog napona i
trajanja elektroforeze.
Podloga za elektroforezu ili gel-nosač treba da bude od materijala koji neće reagovati sa
uzorkom i na koji se molekuli koji se analiziraju neće adsorbovati. Ranije su se mnogo
koristile podloge od skroba i agara, a danas se koriste poliakrilamid i agaroza.
Mnogobrojne su prednosti poliakrilamida u odnosu na ostale podloge. Poliakrilamid je
hemijski inertan i stabilan u širokom opsegu fizičko-hemijskih uslova (stabilan je na
promene pH, temperature, nema apsorpciju u UV oblasti i nema pojave elektroosmoze).
Poliakrilamidni gel nastaje kopolimerizacijom akrilamida i bisakrilamida koji pravi
spojeve između lanaca poliakrilamida tako da se dobija mrežasta struktura. Katalizatori
polimerizacije su amonijumpersulfat (APS) i N,N,N’,N’-
tetrametilendiamin (TEMED).
Mogućnost menjanja veličine pora mrežaste strukture poliakrilamidnog gela,
promenom koncentracije akrilamida i bisakrilamida, predstavlja još jednu od prednosti
ovog gela-nosača. Ta osobina omogućava da se elektroforetski razdvoje molekuli širokog
opsega molekulskih težina. Zbog hemijske inertnosti poliakrilamida, moguće je dodatnim
tretmanima (upotrebom deterdženata) vršiti razdvajanje proteina samo na osnovu
molekulske težine (u prisustvu jonskog deterdženta natrijum dodecil sulfata (SDS-a)) ili
hidrofobnosti (u prisustvu nejonskog deterdženta Triton X-100).

Elektroforeza se može sprovoditi u tzv. kontinuiranom sistemu ili u diskontinuiranom

sistemu. U kontinuiranom sistemu se koristi isti pufer za sprovodenje elektroforeze i za
pripremu gela, a gel može biti jednolike koncentracije ili sa gradijentom koncentracije
poliakrilamida.
U diskontinuiranom sistemu pufer za provodenje elektroforeze se po sastavu i pH
vrednosti razlikuje od pufera u gelu. Osim toga gel se sastoji od dva dela - gela za
sabijanje i gela za razdvajanje - koji se razlikuju po stepenu umreženja i pH vrednosti.
Nakon završene elektroforeze proteinski fragmenti se u gelu mogu detektovati različitim
bojama (bojanje Coomassie bojom, bojanje srebrom) koje se vežu na proteine.

Elektroforeza se može koristiti za:

- analitičke svrhe - identifikacija proteina
- odredivanje molekulske mase proteina
- odredivanje broja podjedinica proteina
- odredivanje čistoce proteina
- preparativne, odnosno semipreparativne svrhe – izdvajanje određenog proteina iz
proteinske smese

U 2D elektroforezi proteini se međsobno razdvajaju prvo na osnovu naelektrisanja, a

zatim na osnovu mase. U prvom koraku proteini se kreću kroz gel sa kontinuiranim
gradijentom pH. Kada dostignu mesto na gelu (vrednost pH) na kome je njihovo ukupno
naelektrisanje jednako nuli, zaustavljaju se. Ta pH vrednost je njihova izoelektrična
tačka (pI). Ova metoda koja se naziva izoelektrično fokusiranje (IEF) može da razdvoji
proteine koji se razlikuju po samo jednoj jedinici naelektrisanja. U drugom
koraku proteini razdvojeni na IEF gelu razdvajaju se u drugoj dimenziji na
osnovu molekulske mase pomoću SDS-PAGE.

Odvajanje prema naektrisanju

Rastvoreni proteini su polivalentni joni i njihova naelektrisanja potiču od karboksilnih
grupa u bočnim lancima glutaminske i asparaginske kiseline. Karboksilna grupa
terminalne aminokiseline lanca takođe donosi jedno negativno naelektrisanje.
Pozitivna naelektrisanja daju bočni lanci baznih aminokiselina kao što su arginin lizin i
histidin. Amino-terminalna grupa takođe daje pozitivno naelektrisanje ako nije
acetilovana ili nije piroglutaminska kiselina. Naelektrisanje ovih kiselih i baznih grupa
zavisi od pH vrednosti rastvora. Niske pH vrednosti suzbijaju disocijaciju kiselih grupa, a
pri visokim pH vrednostima bazne grupe su nenaelektrisane (histidinska grupa prva gubi
naelektrisanje). Kod određene pH vrednosti broj pozitivnih i broj negativnih
naelektrisanja je jednak i to se naziva izoelektrična tačka proteina.
Elektrofokusiranjem se razdvajaju proteini prema svojoj izoelektričnoj tački.
Veštački amfoliti stvaraju pH gradijent u električnom polju a proteinski molekul se kreće
u ovakvom pH gradijentu do mesta koje odgovara njegovoj izoelektričnoj tački.
On se više ne pokreće sa tog mesta jer je molekul nenaelektrisan (ima isti broj pozitivnih
I negativnih naelektrisanja) i na njega ne deluje električno polje. Upotrebom dobrih pH
gradijenata postiže se dobro odvajanje proteina uz istovremeno određivanje njihovih
izoelektričnih tačaka.
Kod određene pH vrednosti koja se dobije pomoću puferskog rastvora različiti proteini
imaju različit broj naelektrisanja.
Ukoliko se uspostavi električno polje, brzina putovanja naelektrisanog molekula proteina
zavisiće od jačine električnog polja. Ako u molekulu preovladava negativno
naelektrisanje onda on putuje prema anodi. Brzina kretanja proteina u određenom
električnom polju zavisi od zbira naelektrisanja kao i veličine i oblika molekula što
uslovljava jačinu trenja. Elektroforeza je veoma korisna metoda za odvajanje proteina, a
pored toga služi i za određivanje čistoće nekog proteinskog preparata.
Pretežno se upotrebljava za analitičke svrhe, ali se može iskoristiti i za preparativno
dobijanje različitih proteina. Danas se elektroforeza uglavnom izvodi na nosačima.
Osim folija celuloznog acetata, kao vrlo dobri nosači su se pokazali poliakrilamidni
gelovi.
Elektroforeza na poliamidakrilnom gelu je vertikalna elektroforeza. Poliamidakrilni gel
(PAGE) je baziran na ko - polimerizaciji akrilamida i bis - akrilamida. PAGE je jedna od
najboljih metoda koja se koristi za razdvajanje i vizuelizaciju nukleinskih kiselina.
Prednosti PAGE-a u odnosu na agarozni gel su: veća rezolucija (moguće je razdvojiti
molekule čija je razlika u dužini samo nekoliko baznih parova), visoka
čistoća uzorka i veća brzina izvođenja. Prilikom pripreme gela određuje se njegova
gustina, odnosno veličina pora (bunarića), od čije veličine zavisi razdvajanje molekula
DNK različitih dužina. Gušći gel bolje razdvaja bliske fragmente
male dužine, dok ređi gel služi za razdvajanje velikih fragmenata. Pripremljeni gel potapa
se u kadicu za elektroforezu u kojoj se nalazi odgovarajući pufer (provodnik). Uzorci koji
se analiziraju prvo se pomešaju sa puferom za nalivanje uzoraka (engl. loading buffer),
koji povećava gustinu uzorka (čime je omogućeno da uzorak padne na dno bunarića),
boje uzorak i omogućavaju praćenje elektroforeze. Posle toga uzorci se sipaju u bunariće
na gelu (1 bunarić = 1 uzorak) i uključuje se struja odgovarajućeg konstantnog
intenziteta. Pored uzoraka, nalivaju se i pozitivna i negativna kontrola i markeri u
posebne bunariće. Markeri (lenjiri) su isečene sekvence poznatih dužina. Poređenjem
brzine kretanja molekula koji ispitujemo sa brzinom kretanja molekula poznatih dužina,
elektroforezom procenjujemo veličinu ciljne sekvence koja je predmet identifikacije. Na
osnovu toga se može reći da li je ciljna sekvenca prisutna ili ne u ispitivanom uzorku. Po
završetku elektroforeze vrši se vizuelizacija razdvojenih fragmenata bojenjem gela
etidijum - bromidom ili srebro - nitratom. Etidijum - bromid je kancerogena supstanca
koja se interkalira izmđu delova molekula i koja fluorescira kada se stavi pod UV svetlo.
Etidijum - bromidni gel je najčešće upotrebljavan, ali nije trajan jer boja brzo izbledi,
tako da se mogu čuvati samo 1-2 dana. Za trajno čuvanje gela koristi se bojenje srebro –
nitratom, gde se fragmenti vizuelizuju kao tamne trake golim okom na gelu. Ovako
obojeni gel čuva se umotan u folije, zaštićeni od isušivanja u frižiderima na +4oC.
SDS-PAGE (sodijum dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforeza) je tehnika za
razdvajanje denaturisanih proteina prema njihovoj relativnoj molekulskoj masi. SDS je
jonski deterdžent koji se vezuje za proteine, pri čemu dolazi do narušavanja njihove
kvaternerne, tercijarne i sekundarne strukture. SDS je negativno naelektrisan, a broj
vezanih molekula SDS-a proporcionalan je Mw datog proteina. Na taj način se negativno
naelektrisani proteini kreću prema pozitivno naelektrisanoj elektrodi u električnom polju i
dolazi do razdvajanja proteina na osnovu molekulske mase.
Razdvajanje proteina jednodimenzionom SDS-PAGE u kontinuiranom puferskom
sistemu :
Priprema 10% separacionog poliakrilamidnog gela za elektroforezu:
8.2 ml dH2O (autoklavirana)
6.6 ml Acrylamide/Bis Acrylamide
5 ml 1.5M buffer Tris-HCl
0.2 ml 10% SDS
Neposredno pre razlivanja gela u smešu dodati 100μl 10% amonijum persulfata (20mg
APS/200μl ddH2O) i 10μl TEMED-a. Smešu lagano promešati i razliti gel do naznečene
linije, nakon čega treba postaviti češljiće i ostaviti gel da polimerizuje. Polimerizacija
traje 45min-1h, nakon čega se može pristupiti nanošenju uzoraka.
Acrylamide (C3H5NO)- polimerizacijom monomera akrilamida nastaju dugački lanci
polimera
BisAcrylamide (N,N’-MethylenebisAcrylamide)-kros linker, povezuje polimere
akrilamida
Ammonium persulfate (APS) i TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)-
inicijatori I katalizatori polimerizacije akrilamida
Priprema uzoraka za SDS-PAGE
Pomešati 1/5 l DTT (ditiotritol) i 4/5 l boje (SDS protein gel solution (2x))
Pomešati uzorke (lizati makrofaga iz peritoneuma) i gore navedenu smešu u odnosu 1:1
Kuvati 5 min
Centrifugirati 3 min /10000g
Nakon polimerizacije gelova lodirati pripremljene uzorke i ne zaboraviti marker
Elektroforeza će biti izvedena u Mini – PROTEAN 3 Cell (BIORAD), pri naponu od 200
V i trajanju od oko 35min.

Sastav pufera za elektroforezu:

ERB (electrode running buffer) 10x koncentrovani
30.3 g Tris base
144 g glicina
10 g SDS
rastvoriti u 1l autoklavirane dH2O
Radni pufer je 1x koncentrovan ERB (100ml 10xERB+900 ml autoklavirane dH2O
Sastav pufera za transfer:
(transfer buffer-TB)
TB 10x koncentrovani
18.125 g Tris base
90 g Glicin
na 1l dH2O
Radni pufer TB 1x
80 ml TB 10x
720 ml dH2O (autoklavirana)
200 ml metanol
Sastav pufera za bojenje gelova
(Coomassie gel stain 0.1%)
1 g Coomassie gel stain blue R-250 rastvoriti u:
450 ml metanola
450 ml autoklavirane dH2O
100 ml koncentrovane glacijalne sirćetne kiseline
Sastav pufera za obezbojavanje gelova
100 ml metanola
800 ml autoklavirane dH2O
100 ml koncentrovane glacijalne sirćetne kiseline.

SDS se vezuje za gotovo sve proteine u konstantnom odnosu (1,4g SDS na 1g proteina,
tj. jedan molekul SDS-a na dve aminokiseline). Naelektrisanje proteina u tom kompleksu
postaje maskirano negativnim naelektrisanjem SDS-a i u električnom polju se kreće ka
pozitivnoj elektrodi (anodi). Taj kompleks je štapičasta čestica, čija dužina zavisi od
molekulske mase (M) proteina. Pošto je gustina naelektrisanja jednaka za sve molekule
za koje je vezan SDS, pokretljivost štapičaste čestice zavisiće samo od molekulske mase
proteina.
SDS-PAGE ne može da razdvoji proteine sa malim razlikama u molekulskoj masi, već se
za razdvajanje ovakvih proteina mora primeniti neka druga fizička karakteristika.
Najčešće se koristi razlika u naelektrisanju koje potiče od kiselih i baznih ostataka
aminokiselina u proteinu.

Diskontinuirana elektroforeza bitno poboljšava razlučivanje SDS-PAGE.

Agarozni gelovi imaju manju rezoluciju u odnosu na PAGE gelove, ali se na njima mogu
analizirati molekuli širokog opsega veličina.

Imunoelektroforeza je kombinacija elektroforeze i imunodifuzije na gelu.

Predstavlja kombinaciju electroforteze serumskih proteina sa imunometrijskom
detekcijom: electroforezom se obezbeđuje separacija a imunoprecipitacija obezbeđuje
detekciju. Pouzdan je i tačan metod za detekciju strukturnih abnormalnosti i poremećaja
u koncentraciji proteina. Najčešće se primenjuje u dijagnozi monoklonalnih amopatija.
Najvažnija primena u ispitivanju urina je dokazivanje Bence Jones proteina. (kapa ili
lambda laki lanci).