Univerztet u Beogradu

Mainski fakultet



SEMINARSKI RAD

Faktor koji utie na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi
kratkom talasnom duinom bliske infracrvene spektroskopije kod
odreivanja glikemijskog indeksa hrane



Predmet: Spektroskopija


2





3

Uvod
Razmatraju se pokuaji da se razviju neinvazivni senzori za odreivanje nivoa glukoze u krvi kao to su
bliska infracrvena spektroskopija (NIR), optika koherentna tomografija, fotoakusticna spektroskopija,
fotoakusticna spektroskopija i kolorimetri. Meu ovim tehnologijama, NIR spektroskopija je
najaktuelnija zato to NIR zraenje (700-1400 nm)
Osnovne studije o merenju koncentracije glukoze u vodenim i biolokim matricama, krvnom serumu,
krvnoj plazmi i punoj krvi su potvrdile pouzdanost NIR mikroskopije. Koriden je NiR kratke talasne
duzine od 700 do 1100 nm za merenje prodiranja spektra u prst. ....
Materijali i metode
Eksperimentalni opseg
Eksperimentalni rad ukljuuje dve faze. U prvoj fazi identifikuju se etri faktora koji utiu na
preciznost neinvazivnog merenja, a zatim se poreenjem u dve metode za svaki faktor utvruje se jedan
ogovarajudi. etri ispitivana faktora su zapravo podruja na telu izmerena NIR spektroskopijom pomodu
interaktivne sonde. U drugoj fazi istraivanje se zasniva na koridenju modela reenja za tumaenje
neivazivnog kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi i na proveri mogudnosti koridenja NIR
spektorskopije za merenje glukoze u krvi.
Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krvi
Da bi se razvio i uporedio kalibracioni model vri se test tolerancije na ugljene hidrate.
U pojedinanom testu ispituje se zdrava osoba, koja nije dijabetiar izgladnjivanjem preko nodi
najmanje 8 asova i unoenjem porcije hrane koja sadri 50 g ugljenih hidrata. NIR spektri i
koncentracije glukoze u krvi iz uboda prsta subjekta su mereni u intervalima od 10, 15 I 30
minuta u periodu od tri sata. Koncentracije edera u krvi u Eksperimentu 1 su izmerene pomodu
aparata Glucocard Diameter zbog njegove velike preciznosti. Komercijalno dostupan NIR
spektrofotometar, NIRSystems 650 opremljen interaktivnom sondom, je koriden za merenje
ljudskog tkiva. NIR sonda je postavljena vertikalno iznad oblasti koja se meri i NIR difuzne
refleksije spektra se skupljaju u talasnim duinama u oblasti od 700 do 1200 nm na intervalima
od 2 nm. Kao referentni material koristi se teflon. Pre akvizicije spectra temperatura merne
oblasti i sonde je uravnoteana na 31C dovoenjem u kontakt sa termostatikim
aluminijumskim blokom u periodu od oko 30 s. Uraeno je 50 skenova u trajanju od oko 25 s.
Podaci su analizirani pomodu programa The Unscrambler . Primenjuju se Savitzky
Golay polinomalna i parcijalna regresija. Uklanjaju se take izvan oblasti skeniranja zavisno od
Cook vrednosti distance za ta se obino koristi procena take podataka na najmanju regresiju
kvadrata. Kvalitet statistikog reima kalibracije koji se zasniva na testovima tolerancije je
dovedem u pitanje jer vremenski zavisna spektralna akvizicija moe dovesti do sluajne
4

vremenske kalibracije. Da bi se izbegao ovaj problem kalibracija setova uzoraka se uzima iz
nekoliko testova, zatim se validacijom procenjuju razvijeni kalibracioni modeli. Statistike
karakteristike skupova uzoraka za kalibraciju, prikazani su u Tabeli 1.

Slika 1. Glucocard Diameter i NIRSystems 650
Tabela 1. Statistike karakteristike skupova uzorka krvi za kalibraciju u prvoj fazi

Eksperiment 1. Oblast merenja NIR spektroskopijom
Kao potencijalne oblasti za NIR merenje porede se zglob i dlan ruke. Koristi se velika sonda koja
se prilikom spektralne akvizicije runo pridrava. Analiza glukoze u krvi vri se po zavretku akviczicije
spektra. Za etri dana prikupljeno je 40 skupova podataka za svaku oblast merenja.

Slika 2. Dva tipa interakcione sonde
5


Eksperiment 2. Veliina interaktivne sonde
Kod interaktivne metode dubina prodiranja zraenja moe se kontrolisati podeavanjem
rastojanja izmeu osvetljene stane i fiber-optickog snopa iluminatora. Porede se rezultati dobijeni iz
male i velike sonde to je prikazano na Slici 2. Spektri na dlanu ruke su izmereni kao i u prvoj
Eksperimentalnoj metodi i za 4 dana prikupljeno je 39 skupova podataka sa obe sonde.

Eksperiment 3. Postavljanje sonde
Sonda se mora pravilno podesiti da bi se postigla pravilna akvizicija spektra. Posebno, varijacije
pritiska u kontaktu i poloaju sonde utiu na rasipanje zraenja u tkivima to je rezultirano spektralnim
promenama kao to su pomeranje bazne linije i promene jaine apsorpcije. U ovom eksperimentu
porede se dve metode postavljanja sonde. U prvoj je sonda pridravana runo, u drugoj je fiksirana za
sto (Slika 3). Temperatura sonde odrava se na 31C pomodu digitalnog temperaturnog kontrolera.
Analiza glukoze u krvi vri se po zavretku akvizicije spektra. Prikupljeno je 37 skupova podataka
uzastopnog merenja za svaku od metoda, u trajanju od dva dana kod fiksirane sonde i etri dana kod
runog dranja sonde.

6


Eksperiment 4.Vremenska razlika izmeu spektralne akvizucije i analize nivoa glukoze u krvi
Tokom testa tolerancije koncentracija glukoze u krvi se brzo menjala. U preliminarnom
eksperimentu primedena je promena od 15 mg dL
-1
za 2 minuta. Vremenska razlika izmeu akvizicije
spektra i analize glukoze u krvi moe da izazove povedanje greke. U ovom eksperimentu porede se
sekvencijalne i simultane analize prolikom vremenske razlike izmedju akvizicije spektra i analize glukoze
u krvi iznosi priblino 30 s i manje od 1 s. Spektri dlana ruke su mereni velikom sondom fiksiranom za
sto. Prikupljeno je 62 skupova podata tokom sekvencijalnog merenja za dva dana, i isto toliko
simultanim merenjem u trajanju od 4 dana.

Druga faza: Istraivanje strukture kalibracije i mogudnost NIR merenja pomodu modela
reenja
Jednostavna priprema
Matrica uzorka sastoji se od glukoze i goveeg serumskog albumina (BSA) i homogenizovanog
mleka u 0,1 mol L
-1
fosfatnog bufera (ph 7,4). BSA je koriden za model proteina u krvi , a mleko za
rasipanje zraenja. U kratkotalasnij NIR regiji (700-1100 nm), signali glukoze su slabi, pa se zato povedva
duina optikog puta povedanjem rasipanja radijacije. Koriden je potpuni faktorski eksperimentalni
dizajn u razliitim koncentracijama ove dve komponente: faktora glukoze na 10 nivoa (1 mmol L
- 1
, 3
mmol L
- 1
, 5 mmolL
- 1
, 7 mmolL
- 1
, 9 mmolL
- 1
, 11 mmolL- 1 ,13 mmolL- 1 , 15 mmolL
- 1
, 17 mmolL
- 1

or 19 mmolL
- 1
), BSA na 4 nivoa ( 2 gdL
-1
, 3 gdL
-1
, 4 gdL
-1
, 5 gdL
-1
). Za glukozu 1 mmol L
-1
je jednak 18.0
mg dL
-1
. Ovi opsezi koncentracija pokrivaju nivoe koji se najede nalaze u humanim klinikim uzorcima.
Koncentracija mleka je konstantna. Imamo ukupno 40 uzoraka (10x4). Rastvori glukoze i BSA dobijeni su
razblaivajem istog reagensa sa fosfatnim puferom propremljenog sa vodom i preidenog pomodu
Milli- Q system-a
7

Akvizicija spektra
Zabeleen je spektar modela reenja u reimu prolaska pomodu epruveta, slino kao u
prethodnom eksperimentu sa mlekom. Za NIR spektrofotometar koriden je NIR System s6500.
Debljina stakla epruvete iznosi 1,2 mm, a unutranji prenik 17,6 mm. Kao referentni materijal
koridene su aluminiju keramike ploe debljine 3 mm. Pre akvizicije spektra temperatura uzorka je
kontrolisana pomou evilibrium epruveta.
Analiza podataka
Skup kalibracija sastoji se od 40 uzoraka, svaki sa razliitom koncentracijom glukoze i
koncentracije BSA. Podaci su analizirani pomodu Unsclamber programa. Primenjeni su Savitzky-Golay
drugi izvod i PLS regresija.
Rezuktati i diskusije
Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krvi

Slika 3. NIR spektar dlana ruke izmeren pod optimalnim uslovima, (a) original spektar i (b)drugi izvod
spektra
8

Na slici 3 (a) prikazan je tipian NIR spektar pod optimalnim uslovima. U drugom izvodu spektra (b)
apsorpcija uoena na 760 i 964 nm pripisuju se dioksigenovanom hemoglobinu i vodi.
...........
Rezultati PLS regresije za svaki eksperiment prikatzani su u Tabeli 2. U pogledu merenja NIR
spektroskopije uoeno je da je dlan ruke daje bolje rezultate od zgloba. Struktura svake oblasti, posebno
stanje krvnih sudova utie na rezultate. Koa dlana dobija krv iz mree arterija iz malog prsta i
hipotenara. Ova bogata vaskularna mrea rezultira homogenizacijom informacija iz ove oblasti. U
sluaju zgloba, meutim, prisustvo vidljivih vena preko koe moe izazvati varijacije spektra ukoliko se
merna povrina blago pomera.

Tabela 2. Parcijalna kalibracija najmanjih kvadrata i provera rezultata kod neinvazivne analize glukoze u
krvi
to se tie veliine interakcione sonde, utveno je da je veda sonda vie odgovara za neinvazivna
merenja jer je potrebna veda duina optikog puta za mrenje slabih signala iz glukoze. Zakljuuje se i da
se stabilniji spektri dobijaju prilikom fisirane sonde za sto nego kod runog pridavanja.
to se tie akvizicije spektra i vremenske razlike izmeu akvizicije i analize glukoze u krvi, spektralna
akvizicija mora da se obavlja gotovo istovremeno da bi se dobile ispravne vrednosti.
Najbolji PLS model pokazuje koeficijent viestruke determinacije [R
2
]od 0,85 i standardnu greku za
unakrsnu proveru 9,7 mgdL
-1
. Unakrsna provera merenja NIR spektorskopijom prikazana je na Slici 4.
pomodu takastog dijagrama. Tanost ovog modela je izutzetna u poreenju sa prethodnim
istraivanjima kao to su merenja na prstu i podlaktici. Jedan od razloga za poboljanu tanost jeste veda
duina optike putanje. Merenja na dlanu velikom interakcionom sondom obezbeuju duu optiku
putanju, za razliku od merenja prsta. U ovom istraivanju najvanije pitanje je zapravo da li NIR
spektroskopija moe izmeriti nivo glukoze u krvi reda 0,01 % [10 mgi L
-1
]. Da bi se odgovorilo na ovo
pitanje, vre se eksperimenti o kojima se daljem tekstu raspravlja.
9



Slika 4.Takasti dijagram unakrsne provere kod merenja glukoze u krvi NIR spektroskopijom

Druga faza: Istraivanje strukture kalibracije i mogudnost NIR merenja pomodu modela
reenja
Tabela 3. prikazuje rezultate PLS kalibracije glukoze u rastvoru. Kalibracioni model koji smo razvili moe
se uspeno koristiti za koncentraciju odreivanja glukoze. Da bi smo ispitali da li model kalibracije zaista
koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze u krvi ispitali smo takaste dijagrame
koeficijenta regresije. Koeficijenti regresije su procenjeni pomodu PLS regresije i oni se najede koriste
za identifikaciju apsorpcionih traka, ili talasnih duina koje imaju znaajan doprinos.

Table 3.
10

Slika 5.(a) Pokazuje poreenja izmeu prvog izvoda glukoze u prahu i hidratizovane glukoze izraunate
oduzimanjem spektra vode iz spekra vodenog rastvora glukoze. Pik dobijen na 920 nm, dodeljen CH
vibracijama, posmatran je u spektru obe glukoze (praha i hidrata). Pik na 928 nm za hidratizovanu
glukozu je verovatno vezan za OH vibraciju atoma vodonika. Slika 5 (b) prikazuje dijagram koeficijenta
regresije za kalibracioni model. Pikovi uoeni na 922 nm i 990 nm poklapaju se sa apsorpcionim trakama
hidratizovane glukoze. Apsorpcione trake na 920 nm su koridene za odreivanje koncentracije glukoze
u plazmi goveda i u odreivanju materija vezanih za ugljene hidrate u hrani kao to su suve materije luka
i edera sadranog u breskvi i pomorandi. Standardne greke predvianja (SEP) sugeriu da je NIR
spektroskopija sposobna za odreivanje glukoze u krvi red 0,001 %.
Slika 6 prikazuje koeficijent regresije neinvazivnog PLS kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi
istraivanja. Pikovi posmatrani na 918 nm i 984 nm se poklapaju otprilike sa onima iz modela reenja i
odnose se na CH i OH vibracije hidratizovane glukoze. Stoga je potvreno da neinvazivna kalibracija
modela sadri informacije o apsorpciji glukoze. Pik koji se pojavljuje na 746 nm moe se odnositi na
stanje oksidacije hemoglobina. U ovom talasnom regionu, oksi i deoksihemoglobina pokazuje razliita
svojstva apsorpcije. I to nam govori da se stanje oksidacije hemoglobina odnosui na koncentraciju
glikoze u krvi. Kada se talasna duina regiona izmeu 700 nm i 800 nm ukloni ne mogu se dobiti dobri
rezutati, stoga je 746 nm talsne duine takoe vano za kalibracioni model koji mo razvili. Naravno
dobrar kalibracioni model se ne moe dobiti iskljuivo pomodu talsnog regiona duine 746 nm. Iako ovaj
model kalibracija pokazuje veliku preciznost pokazuje i velika odstupanja kada se primenjuje razliitim
danima jer model nije globalan. Male varijacije u uslovima merenja kao to su pomeranje prilikom
pritiska sondom i drugi faktori povedavaju predvienu greku. Nije lako odrati ove faktore konstantnim
n bilo kojoj lokaciji u bilo koje vreme. Kod odreivanja glikemijskog indeksa ih je manje teko odrati
konstantnim jer je mogude postaviti dlan ruke tako da se ne pomera tokom testa tolerancije i zahteva
samo vrednosti na osnovnim linijama, stoga je lakse primeniti ovaj postupak kod ovog odreivanja
glikemijskog faktora.
11






12














13



Zakljuak

Faktori koji utiu na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi su identifikovani i ispitani u
odreenim odgovarajudim uslovima za analizu. Najbolji PLS model je dobijen skupljanjem spektra sa
dlana ruke velikom interakcionom sondom fiksiranom za sto i pomodu bliske simultane akvizicije spektra
i analizom glukoze u krvi. Potvrdili smo da na kalibraconi model neinvazivne kratkotalasne duine NIR
spektroskopije koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze. Preciznost najboljeg modela je
kliniki prihvatljiva. Merenja na dlanu ruke se relativno lako obavljaju i imaju prednosti u praktinoj
primeni. Takoe je neophodno da s ekoristi velika interakciona sonda. Lake je primeniti ovaj metod za
odreivanje glikemijskog indeksa, nego klinikog pradenja jer je lake odrati konstante vrednosti
faktora koji utiu na neinvazivne metode merenja . u bliskoj bududnosti, nadamo se odreivanju
glikemijskoh indeksa u u hrani, predstavljenom metodom.