Paskaita PGR ir kiti NR amplifikacijos metodai

2011.05. 17 Julius Gagilas julius@fermentas.lt UAB Fermentas

Polymerase Chain Reaction PCR=PGR Polimerazs Grandinin Reakcija

Turinys - klausimai
DNR amplifikacija in vivo, in vitro PGR reakcija, ciklai, automatizavimas PGR reikalingi komponentai PGR klaidos, utertumas PGR produkt klonavimas PGR metodo variacijos

Tikro laiko PGR Karto starto PGR Kitos PGR varijacijos

PGR pritaikymas Kiti in vitro amplifikacijos metodai RCA besisukanio rato amplifikacija

DNR amplifikacija padauginamas DNR kiekis

In vivo Genas gali bti toksikas Reikia gryninti nuo genomins DNR ir vektoriaus

In vitro Daugumoje metod yra ribotas DNR ilgis 20-40kB Galima padauginti genomo, chromosomos, ar geno region

Amplifikacija in vitro
Amplifikacijos metodai Naudojama temperatra, C Amplifikacijos laipsnis 1012 1010

Taikinio Polimerazs grandinin reakcija (PGR) 50-98 ciklai amplifikacijos Nukleino rgi seka pagrsta 42 izoterminis metodai amplifikacija - Nucleic Acid Sequence-Based
Amplification (NASBA, 3SR)

Grandins nustmimo amplifikacija Strand Displacement Amplification (SDA)

37 izoterminis 30 izoterminis

107 109 n.d. 105 109

Besisukanio rato amplifikacija - Rolling

Circle Amplification (RCA)

Lamp loop mediated isothermal amplification 60-65

izoterminis 50-98 ciklai 37 izoterminis

Zond Ligazs grandinin reakcija (LGR) amplifikacijos Ligase Chain Reaction (LCR) metodai Q replikazs amplifikacija

Adaptuota i: Cantor, C.R., Smith, C.L., Genomics: The Science and Technology Behind the Human Genome Project, John Wiley & Sons,Inc, 98-130, 1999.

Amplifikacija in vitro DNR padauginama mgintuvlyje

Kleppe

Khorana

Pirm kart nukleorgi amplifikacija in vitro buvo aprayta 1971m.- tRNR geno sintez, panaudojant specifin pradmen. Amplifikacija nebuvo eksponentin. (Kleppe, K., Khorana, H.G., et al, Studies
on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases, J. Mol. Biol., 56 (2), 341-61, 1971.)

1983m Kary Mullis paskelb polimerazs grandinins reakcijos (PGR) idj. i idja buvo teorin iki 1985met, kol Saiki publikavo pirmj PGR pritaikym praktikoje. (Saiki, R.K., Enzymatic amplification of
beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230 (4732), 1350-4, 1985.)

Nuo to laiko atsirado daug alternatyvi nukleorgi amplifikacijos metod ir PGR tapo vienas svarbiausi metod molekulinje biologijoje.

PGR Istorija
1944m 12.28 Lenoir miestelyje (iaurs Karolina, JAV) gim Kary Mullis. Baigs Dordijos Technologijos Institut, ir taps PhD Kalifornijos Universitete, 1979m sidarbino Cetus korporacijoje.

46.58

K. Mullis, PGR iradjas. Tris kartus veds ir isiskyrs. Turi tris vaikus, neskaitant t, kurie gim jam dalyvaujant spermos donoro programoje.

1983m vien gegus penktadienio vakar vaindamas po Kalifornij su Jennifer Barnett su savo Honda Civic irado PGR

Cetus jam sumokjo $10,000. Cetus udirbo $300,000,000 pardav Roche.

Kodl PGR? K. Mullio komentaras.

1993m Nobelio premija

1993m Kary B. Mulis buvo apdovanotas Nobelio premija chemijos srityje u PGR metodo iradim.

If you get a good idea make sure you fully exploit it!

Istorija

PGR principas

DNR molekuli teorinis kiekis PGR metu

+
Cikl Vis DNR kopij Amplikon skaiius skaiius skaiius 1 2 3 5 10 15 20 25 30 2 4 8 32 1 024 32 768 1 048 576 33 554 432 1 073 741 824 0 0 2 22 1 004 32 738 1 048 536 33 554 382 1 073 741 764 Ilgesni DNR molekuli skaiius

2 4 6 10 20 30 40 50 60

2n

2n-2n

2n

PGR reakcijos etapai eksponentin amplifikacija

0000 000 0000 000 T eorinis 0000 000 Praktinis 0000 000 000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

PGR produkto kopij skaiius

1 2 4 8 16 32 64 128 2n

Cikl skaiius

K apie tai pasakyt K. Mullis?

PGR reakcijos etapai: denatracija

DNR denatruojama, kad bdama viengrand vliau

galt prisijungti pradmenis Denatracijos temperatra priklauso nuo DNR G+C sstato

PGR reakcijos etapai: denatracija

Jei G+C 55%, denatracijai naudojama 94-95C

temperatra

Pradin denatracija vykdoma 3-5 min., siekiant

pilnai denatruoti taikinio DNR. Vliau, kiekvieno ciklo metu, denatracijai utenka 30-45 sek. Archebakterij DNR polimerazs ir auktesns temperatros (iki 98 C), arba dedama pried (betaino, DMSO).

Jei G+C 55%, naudojamos termostabilesns

PGR reakcijos etapai: Pradmen prilydymas

Prilydymo temperatra yra 3-5 maesn u lydymosi temperatr. O kas yra lydymosi temperatra?

PGR reakcijos etapai: Pradmen prilydymas

Sugertis A260, o.v.

Dvigrand DNR

Viengrand DNR

Temperatra, C

Tm - Temperaturemelting

Pradmen dimerai

PGR reakcijos etapai: Pradmen prilydymas

Pradmenys turi bti specifiki DNR. Kuo ilgesnis pradmuo

tuo didesnis specifikumas. Paprastai naudojami 18-25nt ilgio oligonukleotidai, pradmen ilgis neturi skirtis daugiau nei 3nt Pradmen G+C sstatas 40-60% Pradmen lydymosi temperatros (Tm) apskaiiavimas

Kompiuterini program pagalba Wallace taisykl (12-20nt ilgio oligonukleotidams):

Bolton ir McCarthy taisykl (14-70nt ilgio pradmenims)

Prilydymo temperatra paprastai bna 3-5C maesn u

Tm
Pradmenys neturi bti komplementars patys sau (>3nt), 3

gale paprastai bna G arba C (bet ne GC ar CG)

PGR reakcijos etapai: Pradmen prilydymas

Pradmen prilydymo temperatra apskaiiuojama kompiuterini program pagalba, pvz.: Vector NTI. Galima naudotis interneto svetainse pateikiamomis pradmen Tm skaiiuoklmis, pvz.:

http://www.operon.com/oligos/toolkit.php http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

PGR reakcijos etapai: Polimerizacija (filmas)

PGR reakcijos etapai: Polimerizacija (filmas)

Atliekama Taq DNR pol optimalioje temperatroje: 72-78 C Taq DNR pol polimerizacijos greitis ~2000bp/min.

Polimerizacija vykdoma 1min, kiekvienam 1000bp. Paskutinio ciklo metu danai naudojamas 3X ilgesnis polimerizacijos laikas, kad pilnai ubaigti DNR kopijas

Cikl skaiius: 25-30

Denatracija, 95C

Polimerizacija, 72C

Pradmen prilydymas, 50-60C

PGR naudojama ranga

Pipei antgaliai su Naudojami PGR ruoimui, apsaugai filtrais nuo paalins DNR patekimo i DNR mginio pipet ir atvirkiai i pipets PGR ar jos komponentus. PGR produkt analizei post-PGR etapuose gali bti naudojami paprasti pipei antgaliai.

PGR naudojama ranga

Plonasieniai 0,2; 0,5ml mgintuvliai

Naudojami plonasieniai polipropileno mgintuvliai. Plonos sienels utikrina geresn ilumos laidum, greiiau keiiasi reakcijos miinio temperatra. PGR atliekamas ploktelse, kai yra naudojami dideli mgini kiekiai. Jei atliekama tikro laiko PGR, ploktels udengiamos skaidria plvele, kuri netrukdyt fluorescencijos matavimams reakcijos miiniuose.

98, 384 ulinli ploktels

PGR naudojama ranga

Vienkartins pirtins PGR ruoimui geriau naudoti pirtines be talko, kuris pateks reakcij inhibuoja PGR. PGR produkt elektroforezinei analizei geriau naudoti nitrilines pirtines, kurios yra nelaidios etidio bromidui.

alt palaikantys stoveliaiSpecials stoveliai, ataldomi aldytuve, naudojami kambario temperatroje. Juose kambario temperatroje ruoiam PGR mgini temperatra gan ilg laik gali bti palaikoma ~2-8C. Tokioje temperatroje DNR polimerazs nra aktyvios ir taip ivengiama nespecifini pradmen pailginim.

PGR naudojami termocikleriai

Pirmosios PGR bdavo atliekamos naudojant tris termostatus

Ependorf Mastercycler

Applied Biosystems

Bio-Rad iCycler

Roche Lightcycler, amplifikacija vykdoma kapiliaruose

Applied Biosystems modelis

Mikrokapiliariniai ir lustiniai PGR renginiai, (deMello 2003, Schneegab 2001)

PGR gali bti atliekamas ploktelse su 1536 ulinliais. Toki ploktel robotai upildo per 15sek. (Moore 2005).

PGR reakcijos komponentai

Termostabili DNR polimeraz Pradmenys, komplementars taikinio DNR (Tiesioginis ir

Grtamasis) dNTP miinys Dvivaleni metal jonai (Mg2+) Buferin sistema (Tris-HCl, pH 8.3-9.5) DNR matrica Priedai

DNR polimerazs
Naudojamos termofilini ir hypertermofilini eubakterij ir

archebakterij DNR polimerazs

DNR polimerazs

1967.07.23. Yellowstone nacionalinis parkas, Grybo versm. I jos tekaniame upelyje paimtamame mginyje 1966.09.05 buvo rastos bakterijos, pavadintos Thermus aquaticus YT-1.

Taq DNR polimeraz

PGR pirmiausia buvo naudojama E. coli DNR polimerazs didysis domenas Klenovo fragmentas. Kiekvieno ciklo metu reikdavo dti viei porcij fermento, nes denatracijos metu DNR polimeraz denatruodavo. Su ia DNR polimeraze paprastai pavykdavo skmingai padauginti iki 400nt ilgio amplikonus.

Taq DNR polimeraz ilieka stabili denatracijos metu, todl PGR galima atlikti viename mgintuvlyje sudjus visus reikiamus reagentus. Svarbiausia PGR buvo galima automatizuoti. Taq DNR polimerazs panaudojimas padidino PGR specifikum, nes auktesnje temperatroje pradmenys hibridizuojasi ymiai specifikiau. Padidjo PGR ieiga, gaunama daugiau produkto ir su Taq DNR polimeraze galima amplifikuoti ymiai ilgesnius iki 10kb ilgio DNR fragmentus

Taq DNR polimeraz

Thermus aquaticus DNR polimeraz I

5-3 DNR polimeraz 5-3 egzonukleaz neturi 3-5 egzonukleazinio aktyvumo 3 gale jungia papildom A nukleotid klaidos 1.7 10-4-5 10-6 per nt, per cikl

PGR reakcijoje naudojama 0.5-2.5v (50l) t.y. ~2-10 1012 Taq DNR pol molekuli Labai termostabili: T1/2 (95C)~40min Aprayta 1988m, iki tol buvo naudojama DNR pol I (E.coli) ir kiekvieno ciklo metu reikdavo dti. 1989m Science urnalas paskelb met molekule.

PGR naudojam DNR polimerazi tipai

Eubakterij Archj

Thermus genties ir kit bakterij DNR Thermus aquaticus - Taq, polimerazs, priskiriamos DNR (Fermentas www.fermentas.c polimerazi A eimai. Dauguma j ); Thermus thermophilus neturi 3 egzonukleazinio aktyvumo Tth, Thermus flavus Tfl; (iskyrus Tma) ir pasiymi 5 Thermus filiformis Tfi, egzonukleaziniu aktyvumu. Thermotoga matitima - Tma ir kt.

Euryarchj DNR polimerazs, Pyrococcus furiosus Pfu; priskiriamos B eimai. Jos pasiymi (Fermentas www.fermentas.c 3 egzonukleaziniu aktyvumu ir 6); Pyrococcus kodakaraencis 10 kart didesniu sintezs tikslumu KOD, Pyrococcus woesei nei Taq, neturi 5 egzonukleazinio Pwo, Thermococcus litoralis aktyvumo ir yra jautrios uracilui Tli ir kt. esaniam DNR sudtyje.

PGR naudojam DNR polimerazi tipai

1. Miiniai su dUTPaze. dUTPaz suskaldo dUTP, susidarius dl auktoje temperatroje PGR metu vykstanio dCTP dezamininimo. Uracilas, esantis DNR, slopina archj DNR polimerazes. 2. Miiniai su praimaze. Praimaz padidina pradmens prilydymo specifikum DNR polimerazs su priedais

PfuUltra, PfuTurbo ir kt. Stratagene firmos DNR polimerazs su ArchaeMaxx faktoriumi ( www.stratagene.c ).

AccuPrimeTM Taq DNR polimeraz, (Invitrogen, www.invitrogen.c )

3. Miiniai su viengrand DNR Olszewski 2005 surianiu SSB baltymu sumaina pradmen dimer susidarymo tikimyb. 4. Miiniai su RecA baltymu padidina Shigemori 2005 pradmen specifikum, kuris svarbus multipleksinje PGR.

PGR naudojam DNR polimerazi tipai

Polimerazi miiniai

Taq DNR polimerazs ir archj DNR polimerazi, turini 3 egzonukleazin aktyvum, miiniai. ymiai efektyviau, nei vien su Taq DNR pol, vyksta ypa ilg DNR fragment amplifikacija. Taq DNR polimeraz negali pratsti pradmens po klaiding nukleotid jungimo. Naudojant polimerazi miin archj DNR polimerazs paalina klaidingus nukleotidus ir leidia Taq DNR polimerazei toliau amplifikuoti DNR.

Miiniai ilgai PGR (Fermentas, www.fermentas.com ); Miiniai tiksliai PGR (Fermentas, www.fermentas.com )

PGR naudojam DNR polimerazi tipai

Hibridins DNR polimerazs DNR polimerazs Pfx50TM DNR polimeraz Thermococcus sulietos su DNR zilligii sulieta su pagalbiniu baltymu (Invitrogen, surianiais baltymais. www.invitrogen.com ) Tai padidina DNR PhusionTM DNR polimeraz Pfu tipo DNR polimerazi polimeraz sulieta su Sulfolobus Solfataricus procesyvum ir Sso7d DNR surianiu baltymu (NEB, tikslum. Tikslumas ~50 www.neb.com; Finnzymes kart didesnis u Taq www.finnzymes.com) DNR pol, procesyvumas PfuUltra II fusion HS DNR polimeraz Pfu ~ 10 kart didesnis nei DNR polimeraz sulieta su DNR surianiu Pfu DNR pol. baltymu (Stratagene, www.stratagene.com) iProof DNR polimeraz - Pfu tipo DNR polimeraz sulieta su Sulfolobus Solfataricus Sso7d DNR surianiu baltymu (Bio-Rad www.bio-rad.com/ )

DNR polimerazs
DNR Polimeraz Thermus aquaticus, Taq Pyrococcus furiosus, Pfu Hibridins polimerazs (Phusion, iProof, PfuUltra II Fusion) 3-5 Savybs egzonukleaz

+ +

Eubakterin polimeraz, klaidos 1.7 10-4-5 10-6 per nt, per cikl; T1/2 (95C)~40min Termostabilesn nei Taq, archjin polimeraz, tikslumas didesnis u Taq 610 kart Didesnis procesyvumas u Pfu ~10kart, tikslumas didesnis u Taq ~50kart

DNR suriantis baltymas

DNR Polimeraz

DNR polimerazs

950 bp ilgio fragmento amplifikacijos efektyvumo priklausomyb nuo DNR polimerazs kiekio. A Taq DNR polimerazs, B Pfu DNR polimerazs skirtingi kiekiai 50l reakcijos tryje. M DNR ilgio standartas 100bp ladder plus (Fermentas).

Pradmenys
PGR naudojamas didelis pradmen perteklius, kad po denatracijos bt didesn tikimyb hibridizuotis pradmenims su taikiniu, o ne DNR grandinms tarpusavyje. Optimali pradmen koncentracija PGR yra 0,1-1,0M Usakomi i kompanij, gaminani pradmenis chemins sintezs bdu. Pagrindins kompanijos, i kuri perkami pradmenys yra Metabion ( www.metabion.com), MWG ( www.mwgdna.com)

Deoksiribonukleozidtrifosfatai (dNTP)
DNR statybin mediaga 200M kiekvieno nukleotido dATP, dTTP, dCTP ir dGTP koncentracija Kuo didesn nukleotid koncentracija, tuo efektyviau vyksta PGR, taiau maja polimerazi sintezs tikslumas dNTP yra pardavinjami kaip paruoti naudoti 2mM, 10mM, 25mM koncentracij tirpalai. iuose tirpaluose nukleotidai sumaiyti vienodais moliariniais santykiais

Dvivaleni metal jonai

Daugeliu atveju PGR su Taq DNR pol tinka 1,5mM MgCl2, o su Pfu DNR polimeraze 2,0mM MgSO4 koncentracijos

Buferin sistema
10 Taq DNR polimerazs buferiai Su KCl Su amonio sulfatu 10 Pfu DNR polimerazs buferis

100mM Tris-HCl 750mM Tris-HCl (pH 200mM Tris-HCl (pH 8,8; (pH 8.8; 25C), 8,8; 25C), 25C), 500mM KCl, 200mM (NH4)2SO4, 100mM (NH4)2SO4, 0,8% (v/v) 0,1% (v/v) Tween 20. 100mM KCl, Nonideto P40. 1% (v/v) Tritono X-100, 1mg/ml BSA ir 20mM MgSO4. PGR pagerinanios mediagos: Nejoniniai detergentai: Tritonas X-100, Nonidetas P-40 ir Tween 20 (0,05-0,1%), DNR polimeraz stabilizuojanios mediagos: betainas (1-3M), glicerolis (5-20%), BSA (0,01-0,1 mg/ml), elatina (0.1mg/ml). Tirpum didinantys reagentai: DMSO (1-10%), acetamidas (1 10%). Hidrofiliniai polimerai: polietilenglikolis (5-15% PEG).

Taikinio DNR
PGR naudojamos DNR kiekis priklauso nuo to, kokio dydio yra tiriamo objekto genomas. Nepriklausomai nuo genomo dydio, PGR yra svarbus pradinis taikinio molekuli skaiius, kuris paprastai bna 104-105. 50l reakcijoje naudojama: 0,1-1,0g mogaus genomins DNR (paprastai 0,1g pakanka); 0,01-1ng plazmidi ar fag DNR; 1-10ng bakterij (E. coli) ar mieli genomins DNR.

PGR atlikimas

PGR optimizavimas

Mg2+ jon koncentracija, pradmen prilydymo temperatra, polimerizacijos laikas (denatracijos, prilydymo laikai, DNR kiekis)

PGR problemos (1): Uterimas DNR

DNR i ankstesni PGR reakcij Dulks, plaukai, epitelis ir kt.

Problemos sprendimas:
Reakcija ruoiama Laminariniuose boksuose, naudojami

pipei antgaliai su filtrais PGR reakcijos ruoiamos atskiruose izoliuotuose kambariuose, o amplifikuojama ir analizuojama kituose kambariuose. Reakcijos miinio apvitinimas UV, prie dedant DNR. Nelabai gerai, nes:
dNTP absorbuoja UV Taq DNR pol inaktyvuojama

Uracil DNR glikozilazs panaudojimas

U pradmenyse U amplikone

Uracil DNR glikozilaz (UNG, UDG)

Uracil DNR glikozilaz (UNG, UDG)

PGR problemos (2): Klaidos

Taq DNR pol neturi 3-5 egzonukleazinio aktyvumo Klaid danis 1.7 10-4-5 10-6 per nt, per cikl. Labiausiai

priklauso nuo:
dNTP koncentracijos DNR sekos Mg jon koncentracijos Ar PGR klaidos yra svarbu? Taip jei amplifikuotas genas yra klonuojamas Ne, jei amplifikuotas genas yra sekvenuojamas arba karpomas restrikcijos endonukleaze

1000bp fragmente po amplifikacijos su Taq DNR polimeraze gaunama 0.15-5 klaidingi nukleotidai

Problemos sprendimas:
Naudojamos DNR pol, turinios 3-5 egzonukleazin

aktyvum (Pfu DNR pol)

PGR produkt klonavimas

PGR metodo variacijos

Kiekybin PGR (Tikro laiko PGR quantitative, real time PCR) Ciklin sekoskaita - Cycle sequencing (linear amplification) Karto starto PGR - Hot start PCR Lizdin PGR - Nested PCR Ilga ir tiksli PGR - Long (and accurate) PCR Vienpus PGR - Single sided PCR AT-PGR (Atvirktin transkripcija)- RT-PCR Nutpimo PGR - Touch-down PCR Multipleksin PGR - Multiplex PCR Inversin PGR - Inverse PCR Imuno PGR (IPGR) klaidingoji PGR - epPGR

qPCR quantitative PCR kiekybin PGR kinetic PCR kinetin PGR Real-time PCR tikro laiko PGR
Matuojamas fluorescencijos intensyvumas po kiekvieno PGR

ciklo (t.y. real time). Fluorescencijos intensyvumas proporcingas amplifikuotos DNR kiekiui. Nustatoma KADA, o ne KIEK susidaro PGR produkto. Galima vertinti absoliut DNR kiek Galima vertinti santykin DNR kiek (gen raik)

Kas yra fluorescencija? Kas yra FRET?

Real time PCR frazs paiekos Pubmed publikacij duomen bazje rezultatai. Y ayje pavaizduota publikacij skaiius per atitinkamus metus.

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai vieianti mediaga suadinama viesos pagalba

Fosforas vyti ne dl fosforescencijos ar fluorescencijos

Kalcio fluoridas nefluorescuoja, fluorescuoja jame esanios priemaios. Fluoras taip pat neturi nieko bendro su fluorescencija, lot. fluere lengvai besilydantis fluoridai palengvindavo metal lydym.

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai vieianti mediaga suadinama viesos pagalba

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai vieianti mediaga suadinama viesos pagalba

Fluorescencija yra reikinys, kai molekul sugeria tam tikro ilgio elektromagnetines bangas, pereina nestabili suadint bsen ir ispinduliuoja maesns energijos ilgesnes elektromagnetines bangas. Molekuls, kurios sugeria vies, vadinamos chromoforais Molekuls, kurios sugeria ir ispinduliuoja vies, vadinamos fluorochromais, arba fluoroforais

FRET- Fluorescence Resonance Energy Transfer

DNR detekcijai kiekybinje PGR danai naudojamas FRET tarp 2 fluorofor arba tarp fluoroforo ir nefluorescuojanio slopintojo (quencher) esanio 10-100A atstumu

Didiausia FRET tikimyb esant tam tikram atstumui tarp donoro ir akceptoriaus

Spektrai turi persidengti

Kiekybin PGR
Matuojamas fluorescencijos intensyvumas po kiekvieno PGR

ciklo (t.y. real time). Fluorescencijos intensyvumas proporcingas amplifikuotos DNR kiekiui. KADA, o ne KIEK?

CT=Cq=Cp
TOP takeoff point
CT threshold cycle slenkstinis ciklas; Cycle of quantification; crossing point

Kiekybin PGR
Kuo daugiau yra DNR kopij, tuo CT maesnis

Rn- ratio normalized- santykin fluorescencija, normalizuojama prie bazin linij arba standartin fluorofuor (reference dye), daniausiai ROX (rodaminas X).
106 101 DNR kopij reakcij

Fluorescencija

M 1 1500 4 5 850
400 200 50 /bp

2 6

1,2,3 4 5 6

Ct

Slenkstin linija

NTC

Log10N

Cikl skaiius

Kiekybin PGR
Galutinio produkto kiekis gali varijuoti, taiau CT visada priklauso

nuo DNR matricos kiekio. Amplikon ilgis 100-250bp, kad bt juo didesnis efektyvumas

DNR nustatymo bdai

Su DNR susiriantys (interkaliuojantys) fluoroforai TaqMan zondai (Probes) Hibridizacijos zondai Plauk segtuko strukrros zondai, Molecular beacons MGB zondai Amplifluor pradmenys Scorpions (pradmenys) ir kiti

http://www.gene-quantification.info/

1. Su DNR susiriantys fluoroforai

Fluoroforai jungiasi su dvigrande DNR ir kelis imtus kart padidja j fluorescencijos intensyvumas. Kuo daugiau DNR, tuo didesn fluorescencija

1. Su DNR susiriantys fluoroforai

Fluoroforas Etidio bromidas (EtBr) Struktrin formul Literatra Higuchi 1993

Yo-Pro-1 (3imetil-2-[[1-[3-(trimetilamonio) propil]-1,4-dihidrochinolin-4iliden]metil] benzo-1,3-oksazolo dioksidas) SYBR Green I

Ishiguro 1995 Tseng 1997

Morrison 1998

BOXTO

Eriksson 2003; Lind 2006.

SYTO9 EvaGreen

n.d. n.d.

Monis 2005 Wang 2006 http://www.biotium.com/

1. Lydymosi kreiv

Problemos:
Detektuojami specifiniai ir nespecifiniai PGR produktai Kuo ilgesn DNR, tuo stipresnis signalas Reikalinga optimizacija, kad nesusidaryt pradmen dimerai ir kt. Didesns koncentracijos inhibuoja DNR polimeraz

1. Su DNR susiriantys fluoroforai: Kada jie naudojami?

1. Reakcijose, kai nereikia labai didelio specifikumo, koks gali bti pasiekiamas naudojant zondus. Naudojama, kai reikia detektuoti tkstanius molekuli. 2. Bendram tikro laiko PGR pradmen ir slyg optimizavimui prie pereinant prie zond. 3. Kai tikro laiko PGR sistema yra pilnai optimizuota: nesusidaro nei pradmen dimerai, nei nespecifiniai amplikonai.

Problemos:
Detektuojami specifiniai ir nespecifiniai PGR produktai Kuo ilgesn DNR, tuo stipresnis signalas Reikalinga optimizacija, kad nesusidaryt pradmen dimerai ir kt. Didesns koncentracijos inhibuoja DNR polimeraz

2. Hibridizacijos zondai (Hybprobes, Hybridization probes, kissing probes)

Su DNR hibridizuojami du oligonukleotidai, prie vieno i j yra prijungtas fluoroforas donoras (D), prie kito fluoroforas akceptorius (A). Kai ie oligonukleotidai atsiduria vienas alia kito hibridizuoti su taikinio DNR, vyksta FRET ir stebima akceptorinio fluoroforo A fluorescencija

3. 5 nukleazs zondai, TagMan zondai

Taq DNR polimerazs 5 egzonukleaz hidrolizuoja hibridizuot su taikinio DNR hibridizuot zond. Reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo fluorescencijos slopiklio (S), nebevyksta FRET ir stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija
3 gale yra fosfatas,

arba ddNMP kad nevykt polimerizacija ilgis 20-40nt Tm maiausiai 5 laipsniais didesn u pradmen Tm

3. 5 nukleazs zondai, TagMan zondai

TagMan pavadinimas kils nuo 1979m. japon sukurto kompiuterinio aidimo PacMan.

4. Plauk segtuko struktros oligo zondai, molekuliniai vyturliai (molecular beacons) Zondas hibridizuojasi su taikinio DNR. Hibridizacijos metu reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo fluorescencijos slopiklio (S), nebevyksta FRET ir stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija.

5. MGB (minor groove binder) Eclipse zondai Su mauoju DNR grioviu sveikaujanti mediaga (MGB), esanti zondo 5 gale, jungiasi su taikinio DNR, kuri komplementari zondui. Susijungus su DNR, zondas stabilizuojamas, reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo slopiklio (S) ir nebevyksta FRET. Stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija. (Afonina, 2002) http://www.epochbio.com/

5. Fluorescuojantis amplikonas, detekcijai naudojamas pradmuo 1. Saultekio pradmenys; Sunrise primers, Amplifluor hairpin primers.
Naudojamas pradmuo turintis plauk segtuko struktr. Po to, kai pradmuo jungiamas amplikon, sintetinant komplementari DNR grandin, plauk segtuko struktra yra iardoma ir reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo slopiklio (S). Reporterinio fluoroforo fluorescencijos intensyvumas atspindi amplikono kiek

5. Fluorescuojantis amplikonas 2. Skorpiono pradmenys

Skorpiono pradmenys turi DNR sintezs blokatori, todl komplementari grandin sintetinama tik iki blokatoriaus ir lieka isikis u blokatoriaus esantis pradmens fragmentas, kuris yra komplementarus alia esaniam amplikonui. vykus komplementari fragment hibridizacijai, stebima reporterinio fluoroforo (R) fluorescencija

Zondai ir fluorescuojantys pradmenys naudojami: 1. Jautriose tikro laiko PGR reakcijose, kai nustatoma imtai kopij DNR. 2. Aleli diskriminacijos kiekybinje PGR. 3. Multipleksinse reakcijose, kai tame paiame mgintuvlyje tiriama ir lyginama inomo (housekeeping) ir tiriamo gen raika. 4. Gen, kuri raika silpna, raikos tyrimams. 5. Ma patogen kieki nustatymui. 6. Tiksliam absoliutaus DNR kopij kiekio nustatymui, naudojantis standartine kreive. 7. Santykiniam kiekybiniam DNR kiekio vertinimui be standartins kreivs, sulyginus CT reikmes.

Kiekybins PGR efektyvumas

Kiekybins PGR efektyvumas

Tarkime (CTB - CTA) = 4. Vadinasi, B mginyje buvo 24= 16 kart maiau taikinio DNR. Tarkime, kad PGR efektyvumas buvo 90% ir jei mgini A ir B CT skyrsi 4 ciklais, tada (1+0.9)4=13. Taigi gauname, kad B mginyje taikinio DNR yra 13, o ne 16 kart maiau Kiekybins PGR efektyvumas apskaiiuojamas pagal tiess polinkio koeficient

Kiekybins PGR ranga

Kiekybins PGR ranga

Abi Prism 7000 optins sistemos veikimas: Volframo lempos viesa apvieia PGR ploktel ir suadina ten esanius fluoroforus, kurie pradeda fluorescuoti. Fluorescencijos viesa per veidrodius ir optinius filtrus patenka CCD (charged coupled device) kamer, kuri ufiksuoja fluorescencijos intensyvum. Duomenys apdorojami kompiuterine programa.

Kiekybin PGR

Kiekybin PGR

Karto starto PGR - Hot start PCR

Kuo yra auktesn temperatra, tuo geresnis partneris yra surandamas. Kambario temperatroje pradmen fragmentai, pvz.: j 3 galins dalys gali hibridizuotis su amplifikuojama DNR

Karto starto PGR - Hot start PCR

Hot start PCR karto starto PGR

Mechanins priemons

DNR polimeraz dedama PGR po DNR denatracijos. Reakcija pilstoma aldymo blokuose ir dedama kart termocikler. Naudojamas vakas (ampliwax), kuris lydosi 53-55C, kurio nors komponento

atskyrimui.
Modifikuojama DNR polimeraz

Naudojami MAK, inhibuojantys DNR pol aktyvum. Auktoje temperatroje

antiknai denatruojasi ir paleidia DNR polimeraz. Naudojama grtamai chemikai modifikuota DNR polimeraz. Polimeraz suriantys oligonukleotidai aptamerai. J. Mol. Biol. 264:268 1996. 1996. Naudojama mutantin DNR polimeraz, kuri emoje temperatroje maiau aktyvi.
Nucleic Acids Res., 31, 6139-6147, 2003.

Modifikuojami arba specialiai parenkami pradmenys

Pradmenys turintys plauk segtuko struktr. Nuc. Acids. Res. 28:94 2000. Naudojami pradmen dimerai. Biotechnol. Lett. 26:277 2004. Naudojami 3 gale blokuoti pradmenys ir tik auktoje temperatroje veikiantis tuos

blokus paalinantis fermentas Enzystart sistema

Modifikuojami Mg jonai

Naudojami isodinti Mg jonai, kurie auktoje temperatroje itirpsta.

167-171, 2002.

Mol. Cell. Probes, 16,

Hot start PCR karto starto PGR

Karto starto PGR su TrueStart DNR polimeraze (chemikai modifikuota) ir prastos PGR su paprasta Taq DNR polimeraze palyginimas. Amplifikuotas 2kb mogaus beta-globino geno fragmentas.

Atvirktins transkriptazs PGR RT-PGR (reverse transcription PCR)

Touchdown PCR nutpimo PGR

Keiiama pradmen lydymosi temperatra nuo ~3C didesns

u Tm iki paskaiiuotos:
skirtinguose mgintuvliuose skirting cikl metu Kai pradmenys parenkami pagal amino r. sek kai amplifikuojamos DNR vienos organizmo ries, naudojant

pradmenis parinktus kitos ries DNR. kai amplifikuojamos gen eimos ir kt.

Lizdin PGR - Nested PCR

Seminested PCR; Heminested PCR Pusiaulizdin PGR, kai antroje amplifikacijoje paliekamas vienas pradmuo tas pats i pirmosios amplifikacijos, ir pridedamas tik vienas naujas pradmuo.

Ilga ir tiksli PGR. Long (and accurate) PCR (LA-PCR)

Ilgos DNR sunkiau denatruojamos - pridedama denatrant, pvz.

DMSO (dimetilsulfoksido). Gali vykti DNR depurinizacija padidinamas pH Prailginamas polimerizacijos laikas Naudojami DNR polimerazi miiniai Taq DNR pol + 3-5 egzonukleazin aktyvum turinti DNR polimeraz (Pfu- Pyrococcus furiosus) Vykdoma 20-40kB DNR amplifikacija

Ilga ir tiksli PGR. Long (and accurate) PCR (LA-PCR)

Efektyviau vyksta trump amplikon padauginimas

Inversin PGR - Inverse PCR

Multiplex PCR multipleksin PGR

Kai naudojamos 2 ir daugiau pradmen por

Multipleksinis PGR su Accuprime DNR polimeraze (Taq DNR pol ir praimazs miinys) NATURE|VOL 435 | 12 MAY 2005

Imuno PGR (IPGR)

Baltym detekcija PGR pagalba, pirm kart publikuota 1992m.
Science. 1992 Oct 2;258(5079):120-2

Naudojami Antikn DNR konjugatai Naudojama klinikinje diagnostikoje, imunologijoje

tumor necrosis factor

TRENDS in Biotechnology Vol.23 No.4, 208-216, April 2005 | Genome Technology, September 2007

Skaitmenin PGR (digital, dPCR)

Reakcijos miinys padalintas daugyb ma reakcij 1 DNR

molekul vienoje reakcijoje Kiekvienos maos reakcijos rezultatas 0 arba 1 Kiekvienoje maoje reakcijoje nustatoma ar susidar produktas

Skaitmenin PGR (digital, dPCR)

Reakcij galima dalinti 96, 384 ulinlius Fluidigm technologija QuantaLife technologija amplifikacija emulsijose

Skaitmenin PGR (digital, dPCR)

Kitos PGR
Greitoji PGR (angl. fast PCR) atliekama pakeitus PGR cikl

parametrus. Yra nustatomas nulinis denatracijos laikas, o prilydymas ir polimerizacija atliekama trumpesn laik. Visiems etapams vykti utenka laiko, kol termocikleryje keiiama temperatra, esant optimizuotoms PGR slygoms (GeneJET Fast PCR sistema: www.fermentas.com/catalog/pcr/ge ). Lyginant su tradicine PGR, greitoji PGR utrunka kelis kartus trumpiau.

Klaidingoji PGR (angl. epPCR error prone PCR) naudojama atsitiktinei mutagenezei. Naudojamos PGR slygos (Mn2+ jonai vietoj Mg2+; nenatrals nukleotidai: dPTP, 8-oxo-dGTP, specialios DNR polimerazs), kuriomis DNR polimerazs daro daug sintezs klaid. Klaidingoji PGR naudojama evoliucijos in vitro eksperimentuose.

PGR su degeneruotais pradmenimis

Degeneruoti pradmenys. Kas jie tokie? Pradmenys, kurie keliose vietose turi galimyb hibridizuotis su vairiomis sekomis taikinio DNR sekoje. pvz: 5-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3 Y = pYrimidines = C / T (degeneracija = 2X) R = puRines = A / G (degeneracija = 2X) I = Inosine = C / G / A / T N = Nucleotide = C / G / A / T (degeneracija = 4X) Kam... Naudojami degeneruoti pradmenys? Konservuot organizmo genomo geno ar gen sek amplifikacijai (vejojimui) Kai norima amplifikuoti baltymo gen pagal nusekvenuotas kelias amino rgtis.

PGR pritaikymas
1. Specifini sek padauginimui ar nustatymui. 2. Neinom sek analizei: padauginimui ir sekoskaitai. 3. Dirbtini DNR sek surinkimui gen sintezei. 4. Takinei ir atsitiktinei mutagenezms. 5. REazi taikini, starto, stop kodon vedimui konstruojant DNR sekas. 6. Klon analizei kolonij PGR. 7. Gen raikos analizei informacins RNR amplifikacija AT-PGR bdu. 8. Nukleorgi kopij skaiiaus nustatymui kiekybin PGR. 9. Specifini baltym nustatymui imuno PGR

Kuris i tariamj nusikaltlis?

PGR pritaikymas
Kuris vaiko (V) tvas tikras T1 ar T2?

Quantifying viruses Pathogen detection Gene expression Drug therapy DNA damage Immune response Genotyping

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: Besisukanio rato amplifikacija Roling circle amplification

(templiphi animacija)

RCA pirm kart buvo aprayta 1995m. (Fire, A, Xu, S-Q, Rolling replication of
short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645, 1995)

RCA atlikti nereikia specialios aparatros temperatrai kaitalioti, kaip tai yra btina PGR atveju. RCA idja paremta apskritimo pagrindine apvalumo savybe. RCA idja yra ireikta kai kuri meninink darbuose. Salvadoro Dali ir Maurito Kornelio Eshero pieiniuose yra RCA metodo iliustracij.

Eschers Ascending and Descending, 1960

Maurits Cornelis Escher or Mauk (1898-1972) is one of the world's most famous graphic artists from the Netherlands.

The closed staircase going on endlessly up or down, depending on a viewpoint. Starting at some place on these stairs, one will interminably turn around similar to the RCA performing enzyme that reads a circle of DNA over and over again

Eschers Mbius Strip II, 1963

Maurits Cornelis Escher or Mauk (1898-1972) is one of the world's most famous graphic artists from the Netherlands. The Mbius loop was discovered in 1858 by August Ferdinand Mbius, a German mathematician and astronomer. Dutch artist M. C. Escher, produced a series of drawings based on the Mbius strip, one of which portrays ants crawling over the folded and twisted trip of paper. Ants acts like DNA polymerase in rolling circle amplification moving always in one direction.

Dalis Exploding Raphaelesque Head, 1951

Salvador Dali (190489) Spanish painter, sculptor, graphic artist, and designer

The picture portrays a hollow spherical object resembling a female head that blows up into the numberless similar fragments rotating around some central point. These fragments are analogous to the RCA products consisting of multiply repeated DNA sequences

Besisukanio rato amplifikacijos bdai

Naudojant vien pradmen, arba linijin RCA. Monotonikai
sintetinama ratu ilga pasikartojanti viengrands DNR seka. Palaipsniui kaupiasi RCA produktai.

hiperakota, ramifikacija, arba kaskadin RCA (Demidov, V., Rolling circle

amplification in DNA diagnostics: the power of simplicity, Expert Rev., Mol., Diagn., 2 (6), 89-95, 2002).

Naudojant du pradmenis, arba geometrin, taip pat vadinama

nustmimo amplifikacija - MDA (multiple displacement amplification), kuri yra naudojama efektyviai viso genomo amplifikacijai - WGA (whole genome amplification). (Dean, F.B., et al.,
Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002).

Naudojant atsitiktins sekos pradmenis, arba daugybinio

Besisukanio Rato Amplifikacija

Reakcija prasideda ant viengrands iedins DNR, arba dvigrands denatruotos DNR. Atsitiktins sekos pradmenys prilimpa ant viengrands DNR. phi29 DNR polimeraz prisijungia ir pratsia pradmenis

Besisukanio Rato Amplifikacija

Reakcija prasideda ant viengrands iedins DNR, arba dvigrands denatruotos DNR. Atsitiktins sekos pradmenys prilimpa ant viengrands DNR. phi29 DNR polimeraz prisijungia ir pratsia pradmenis

Besisukanio Rato Amplifikacija

Reakcija prasideda ant viengrands iedins DNR, arba dvigrands denatruotos DNR. Atsitiktins sekos pradmenys prilimpa ant viengrands DNR. phi29 DNR polimeraz prisijungia ir pratsia pradmenis

Besisukanio Rato Amplifikacija

phi 29 DNR polimeraz yra unikali, ji labai efektyviai ima nustminti DNR, kai pasiekia anksiau susintetint DNR grandin.

Besisukanio Rato Amplifikacija

phi 29 DNR polimeraz yra unikali, ji labai efektyviai ima nustminti DNR, kai pasiekia anksiau susintetint DNR grandin. Nustumtos DNR grandins yra viengrands ir prie j gali jungtis pradmenys, kuriuos pratsia Phi29 DNR polimeraz.

Besisukanio Rato Amplifikacija

phi 29 DNR polimeraz yra unikali, ji labai efektyviai ima nustminti DNR, kai pasiekia anksiau susintetint DNR grandin. Nustumtos DNR grandins yra viengrands ir prie j gali jungtis pradmenys, kuriuos pratsia Phi29 DNR polimeraz.

Besisukanio Rato Amplifikacija

phi 29 DNR polimeraz yra unikali, ji labai efektyviai ima nustminti DNR, kai pasiekia anksiau susintetint DNR grandin. Nustumtos DNR grandins yra viengrands ir prie j gali jungtis pradmenys, kuriuos pratsia Phi29 DNR polimeraz.

Besisukanio Rato Amplifikacija

pakartoti phi 29 DNR polimeraz yra unikali, ji labai efektyviai ima nustminti DNR, kai pasiekia anksiau susintetint DNR grandin. Nustumtos DNR grandins yra viengrands ir prie j gali jungtis pradmenys, kuriuos pratsia Phi29 DNR polimeraz.

Besisukanio Rato Amplifikacija

vairios DNR polimerazs, skaitant ir termofilines gali vykdyti RCA:
Phi 29 DNR polimeraz Sequenase (GE Healthcare [Amersham Biosciences]) modifikuota bakteriofago T7 DNR polimeraz. Klenow DNR polimeraz (DNR polimerazs I didysis fragmentas. Vent exo- DNR polimeraz mutantin Thermococcus litoralis DNR polimeraz. Bst DNR polimerazs didysis fragmentas i Bacillus stearothermophilus.

Efektyviausia RCA yra phi 29 DNR polimeraz didiausias procesyvumas didiausias DNR grandins nustmimo aktyvumas i vis inom DNR polimerazi. labai tiksli, klaid danis 3-5x10-6, ymiai maesnis nei Taq DNR polimerazs. (Esteban, J.A., et al, Fidelity of phi29 DNA polymerase, J.
Biol. Chem., 268 (4), 2719-2726, 1993).

phi29 DNR Polimeraz

phi29 DNR Polimeraz tai B eimos DNR polimeraz, turinti labai procesyv DNR polimerazin aktyvum, grandins nustmimo aktyvum ir 3 egzonukleazin aktyvum (1-3).

Bacillus subtilis phage 29

References:
1. Blanco, L., Salas, M., Characterization and purification of a phage phi29 - encoded DNA polymerase required for the initiation of replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984. 2. Blanco, L., et al., Highly efficient DNA synthesis by the phage phi29 DNA Polymerase, Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol.Chem., 264, 8935-8940, 1989. 3. Garmendia, C., et al., The bacteriophage phi29 DNA Polymerase, a Proofreading enzyme, J. Biol.Chem., 267, 2594-2599, 1992.

Besisukanio Rato Amplifikacija, RCA apibendrinimas

Tai naujas iedins DNR ir ilgos linijins DNR , pvz genomins DNR, BAC, in vitro amplifikacijos metodas. Amplifikuojamos DNR ilgis yra neribotas. Izoterminis metodas, nereikia termociklerio Vienodai efektyviai amplifikuoja vairias sekas ir prisintetinama mikrogramai DNR

Amplifikuota laios DNR

RCA paprastai nereikalauja jokios optimizacijos, nesudtingas atlikimo protokolas.

Besisukanio Rato Amplifikacija, taikymas

Nustatymo riba 10 fM (t.y. 6 amol 600 l mginyje)

Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 3268 3272

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: izotermin sekos savireplikacija, NASBA

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: amplifikacija grandins pakeitimu, SDA

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: ligazs grandinin reakcija

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: Q beta replikacija

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: Naudojant nikaz

Kiti in vitro amplifikacijos bdai: LAMP

LAMP (Loop- mediated isothermal amplification)- tai

metodas leidiantis, panaudojant dvi arba tris specialiai parinkt pradmen poras, specifikai amplifikuoti norim DNR sek izoterminmis slygomis. Metodas pagrstas auto- cikline grandins nustmimo DNR sinteze (auto- cycling strand displacement DNA synthesis), kur naudojamos termofilins (Bst, Bsm) DNR polimerazs, pasiyminios grandins nustmimo aktyvumu ir specials pradmenys: du vidiniai (FIP ir BIP) ir du ioriniai (F3 ir B3)1 LAMP amplifikacija naudojama klinikinje diagnostikoje virus, bei bakterij nustatymui

LAMP

100x skiesta DNR

1000x skiesta DNR 10000x skiesta DNR

Vizuali detekcija

Vaizdas apvietus UV - Neigiama kontrol, + vykusi LAMP amplifikacija

+ Vaizdas dienos viesoje

Literatra (1)
Afonina, I.A., et al, Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence, Biotechniques, 32, 940-949, 2002. Ausubel, F.M., et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, NY, 15.1-15.7, 2005. Bagasra, O., Hansen, J., In situ PCR techniques, John Wiley & Sons, Inc., 1-142p, 1997. Barnes, W.M. an dRowlyk, K.R., Magnesium precipitate hot start method for PCR, Mol. Cell. Probes, 16, 167-171, 2002. Bartlett, J.M.S., and Stirling, D., Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003. Blanco, L. and Salas, M., Characterization and purification of a phage phi29 - encoded DNA polymerase required for the initiation of replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984. Blanco, L., et al., Highly efficient DNA synthesis by the phage phi29 DNA Polymerase, Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol. Chem., 264, 8935-8940, 1989. Bowien, B., Durre, P., Nucleic acids isolation methods, American Scientific Publishers, 1-184p, 2003. Brock, T. D., The road to Yellowstone - and beyond, Annu. Rev. Microbiol., 49: 1-28, 1995. Brock, T.D., The value of basic research: discovery of Thermus aquaticus and other extreme thermophiles, Genetics, 146, 1207-1210, 1997. Bush, C.E., et al, Detection of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma samples in high risk pediatric patients by using the self-sustained sequence replication reaction, J. Clin. Microbiol., 30, 281-286, 1992. Cantor, C.R., Smith, C.L., Genomics: The Science and Technology Behind the Human Genome Project, John Wiley & Sons, Inc, 98130, 1999. Dang, C., et al, Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR, J. Mol. Biol., 264, 2, 268-278, 1996. Dean, F.B., et al., Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002. deMello, A.J., DNA amplification moves on, Nature, 422, 28-29, 2003. Demidov, V., Rolling circle amplification in DNA diagnostics: the power of simplicity, Expert Rev., Mol., Diagn., 2 (6), 89-95, 2002. Eriksson, M., et al, Groove-binding unsymmetrical cyanine dyes for staining of DNA: dissociation rates in free solution and electrophoresis gels, Nucleic Acids Res., 31, 21, 6235-6242, 2003. Esteban, J.A., et al, Fidelity of phi29 DNA polymerase, J. Biol. Chem., 268 (4), 2719-2726, 1993. Fire, A, Xu, S-Q, Rolling replication of short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645, 1995. Garmendia, C., et al., The bacteriophage phi29 DNA polymerase, a proofreading enzyme, J. Biol. Chem., 267, 2594-2599, 1992. Gosden, J.R., PRINS and in situ PCR protocols, Methods in molecular biology, 71, Humana Press Inc., 1-180p., 1996. Guatelli, J.C., et al, Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled after retroviral replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1874-1878, 1990.

Literatra (2)
Guyer, R.L. and Koshland Jr, D.E., The molecule of the year, Science, 246, 1543-1546, 1989. Higuchi, R., et al, Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions, Bio/Technology, 11, 1026-1030, 1993. Ishiguro, T., et al, Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercaler, Anal. Biochem., 229, 207-213, 1995. K. Mullis Biographical essay. Kabolev, O.K., et al, PCR hot start primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure), Nucleic Acids Res., 28, 21, e94, 2000. Kermekchiev, M.B., et al, Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR, Nucleic Acids Res., 31, 61396147, 2003. Kleppe, K., Khorana, H.G., et al, Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases, J. Mol. Biol., 56 (2), 341-61, 1971. Kong, D., et al, PCR hot-start using duplex primers, Biotechnol. Lett., 26, 4, 277-280, 2004. Kubista, M., The real-time polymerase chain reaction, Mol. Aspects Med., 27, 95-125, 2006. Lind, K., et al, Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis, Biotechniques, 40, 315-319, 2006.

Literatra (3)
Mackay, I.M., et al, Real-time PCR in virology. Survey and summary, Nucleic Acids Res., 30, 6, 1292-1305, 2002. Marras, S.A.E., et al, Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes, Clin. Chim. Acta, 363, 4860, 2006. Monis, P.T., et al, Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis, Anal. Biochem., 340, 24-34, 2005. Moore, P., PCR: replicating success, Nature, 435, 235-238, 2005. Morrison, T.M., et al, Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification, Biotechniques, 24, 954962, 1998. Mullis, K.B., The unusual origin of the polymerase chain reaction, Sci. Am., 262, 56, 36-43, 1990. Niemeyer, C.M., et al, Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification, Trends Biotechnol., 23, 4, 208-216, 2005. Nolan, T., et al, Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nature Protocols, 1, 3, 1559-1582, 2006. Ochman H., et al, Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction, Genetics, 120, 621-623, 1988. Olszewski, M., et al, Application of SSB like protein from Thermus aquaticus in multiplex PCR of human Y-STR markers identification, Mol. Cell. Probes, 19, 203-205, 2005. Ranasinghe, R.T. and Brown, T., Fluorescence based strategies for genetic analysis, Chem. Commun., 5487-5502, 2005. Saiki, R.K., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anaemia, Science, 230 (4732), 1350-4, 1985. Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular cloning: a laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, v2, Chapter 8, 2001. Schneegab, I. and Kohler, J.M., Flow-through polymerase chain reactions in chip thermocyclers, Reviews in molecular biotechnology, 82, 101-121, 2001. Shigemori, Y., et al, Multiplex PCR: use of heat-stable Thermus thermophilus RecA protein to minimize non-specific PCR products, Nucleic Acids Res., 33, 14, e126, 2005. Stahlberg, A., et al,. Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clin. Chem., 50, 3, 509515, 2004. Tseng, S.Y., et al, A homogeneous fluorescence polymerase chain reaction assay to identify Salmonella, Anal. Biochem., 245, 207-212, 1997. Valasek, M.A. and Repa, J.J., The power of real-time PCR, Adv. Physiol. Educ., 29, 151-159, 2005. Vincent, M, et al, Helices-dependent isothermal DNA amplification, EMBO reports, 5, 795-800, 2004. Walker, G.T., et al, Isothermal in vitro amplification of DNA by restriction enzyme/DNA polymerase system, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392396, 1992. Walker, N.J., A technique whose time has come, Science, 296, 557-559, 2002. Wallace, R.B., et al, Hybridization of synthetic oligoribonucleotides to phi X174 DNA: the effect of single base mismatch, Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557, 1979. Wang, W., et al, DNA quantification using EvaGreen and real-time PCR instrument, Anal. Biochem., 356, 303-305, 2006. Wilhelm, J. and Pingoud, A., Real-time polymerase chain reaction, ChemBioChem, 4, 1120-1128 2003. Wu, D.Y. and Wallace, R.B., The ligation amplification reaction (LAR) amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation, Genomics, 4, 560-569, 1989. Wu, D.Y., et al, The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity an efficiency of amplification by polymerase chain reaction, DNA Cell Biol. 10, 233-238, 1991. Zaccolo et al, An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues, J. Mol. Biol. 255, 589-603, 1996.

I Nature methods, v2, No4, 2005, 305-312

PAPILDOMA INFORMACIJA

The PCR Song by Scientists for Better PCR There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. (Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases too. Denaturing, annealing, and extending, Well its amazing what heating and cooling and heating will do. [Chorus] PCR when you need to detect mutation (detect mutation) PCR when you need to recombine (recombine) PCR when you need to find out who the daddy is (whos your daddy?) PCR when you need to solve a crime (solve a crime) [x2]

PAPILDOMA INFORMACIJA

PAPILDOMA INFORMACIJA