REIKALAVIMAI VEKTORIAMS VEKTORIŲ KLASIFIKACIJA

Stabilus ląstelėje Pagal panaudojimo sritį: Bendros paskirties

Markeris (klonavimui), genų ekspresijai (iRNR arba
Restriktazių takinius baltymų sintezei), specializuoti vektoriai
Stiprūs promautoriai, terminatoriai (sekvenavimui, mutagenezei).
Signalinių molekulių atpažinimas, sekrecijai Pagal kilmę: Plazmidiniai, fago pagrindu,
Rekombinantinė DNR hibridiniai (turintys fago ir plazmidės sekas).
Pagal struktūrą: Linijiniai, žiediniai.
Pagal pasilaikymą ląstelėje: Autonomiškai
besireplikuojantys, integratyvūs (replikuojasi
chromosomoje).
Pagal molekulių kiekį ląstelėje: Mažakopijiniai,
daugiakopijiniai.
Pagal replikatorių kiekį: Monoreplikaciniai,
bireplikaciniai (keliuose organizmuose
replikuojasi).
Vektoriai

1. PROKARIOTŲ VEKTORIAI
1. Bakterijų plazmidžių pagrindu
PLAZMIDŽIŲ SAVYBĖS
Nuo kelių iki kelių šimtų kilobazių dydžio
Žiedinės struktūros
Plazmidėse randamos struktūros, kurios užtikrina replikaciją, pastovaus kopijų skaičiaus palaikymą
Replikuojasi autonomiškai (mechanizmas panašus į chromosomų)
Viena ORI sritis
ROP kontroliuoja kopijų skaičių
Neša nuo vieno iki kelių genų (pvz., nuo antibiotikų tetraciklino, ampicilino)
Kryptinės, kurios neturi fenotipo
Replikatorius – DNR atkarpa apsprendžia DNR replikacijos iniciacija. Negalima dviejų tokių plazmidžių
įvesti nes išsidarkys replikatorius, dėl homologinės rekombinacijos.

PLAZMIDŽIŲ SKIRSTYMAS
Pagal šeimininkus: Siauro šeimininkų rato, plataus šeimininkų rato
Pagal funkcijas: F – fertilumo (dalyvauja konjugacijoje), R – rezistentiškumo (atsparus antibiotikams)
Col – kolicininės plazmidės, koduojančios kitas bakterijas žudančius baltymus bakteriocinus,
Degradacinės plazmidės D – sugeba ardyti tolueną, salicilo rūgštį ir t.t. Virulentinės V – paverčia
bakterijas patogeniškomis.
Pagal kopijų skaičių ląstelėje: Didelio (randama virš 100 kopijų ląstelėje), vidutinio (nuo 5 iki 50
kopijų), mažo kopijų skaičiaus (viena ar kelios kopijos ląstelėje)
Daugiakopijinės plazmidės mažos, o mažakopijinėss didelės. Mažakopijinių pazmidžių reguliacija labai
griežta. Suderinta jų dalijimasis su chromosomomis šeimininko.
Plazmidės gali būti suderinamos ir ne. Jei nesuderinamos, tai jos negali būti viename organizme ir
 funkcionuoti. Jei suderinamos tai gali būti vienoje ląstelėje.

PLAZMIDŽIŲ-VEKTORIŲ SAVYBĖS
Privalumai: Nedidelės, todėl stabilios. Genai, Trūkumai: Mažas dydis sudaro problemų, nes
kurie leidžia treonsformantams būti atspariems trūksta unikalių restriktazių atpažinimo taikinių,
antibiotikams, todėl galima atrinkti reikia įvesti polilinkerines sekas, o dėl to kyla
transformantus. Paprasti restrikciniai žemėlapiai, sunkumų.
lengva dirbti. Pagrinde yra daugiakopijinės, mažos
plazmidės.

PLAZMIDINIAI VEKTORIAI
Tinkamiausio vektoriaus pasirinkimas Siauros specializacijos vektoriai (vienai funkcijai atlikti), kitai jau
netinkami. Svarbu žinoti tikslą ir išsirinkti vektorių.
Pagal ekspermentą parenkami vektoriai:
Klonavimo
Didelių fragmentų klonavimo
Viengrandės DNR gavimo
genų raiškos (afininio gryninimo, inkaro prikabinimu)
Daugelis vektorių unikalūs. Klonavimo vektoriai sukonstruoti, kad galėtum gauti viengrandę ssDNR

KLONAVIMO VEKTORIAI
Klonavimo vektoriai naudojami:
siekiant atrinkti ir padauginti norimą DNR fragmentą
atlikti tam tikras manipuliacijas su klonuota DNR: delecinę analizę, nukleotidinės sekos nustatymą,
perklonavimą, mutagenezę. Šiuose vektoriuose dažniausiai aptinkamos trijų rūšių sekos elementai:
replikatorius, selektyvus genetinis žymuo ir polilinkeris.
Renkantis klonavimo vektorių svarbu atsižvelgti: dydis, kopijų skaičius, selektyvus genetinis žymuo,
nesuderinamumo grupė.
Daugiakopijiniai klonavimo vektoriai naudojami, kai siekiama gauti didelius plazmidinės DNR kiekius
(pvz., pUC). Klonuotų genų raiškos lygis tiesiogiai susijęs su šių genų kopijų skaičiumi, todėl didėjant
plazmidės kopijų skaičiui didėja ir šioje plazmidėje esančio geno raiškos lygis.
Klonuojant toksiškus genus rekomenduojama pasirinkti vidutinio kopijų skaičiaus plazmides (pvz.
pACYC184, pACYC177, pBR322). Paprastai klonavimo vektoriams būdingi daug restrikcijos
endonukleazių atpažinimo sekų turintys polilinkeriai. Tai leidžia su klonuota DNR atlikti įvairias
manipuliacijas: perklonavimą į kitus vektorius, delecijų konstravimą.
PLAZMIDŽIŲ PAGRINDU SUKONSTRUOTI VEKTORIAI

Dažniausiai naudojama gamtoje autonomiškai besireplikuojančios sistemos – plazmidės (ColE1, pSC101).

pSC101 plazmidės: ColE1 vektorius: pBR322 vektorius: pUC:

9,1 kb. Daugiakopijinė – 100- ColE1 plazmidės Vektoriai pUC18, pUC19,
Turi atsparumo 200 kopijų replikoną, pagamintas pUC57 naudojami.
tetraciklinui geną. (inkubuojant su vektorius – pBR322. Atsparūs ampicilinui.
Mažakopijinė, 10-20 chloramfenikolu, Vektoriaus dydis 4300 Ori.
kopijų. spektinomicinu kopijų bp. Restriktazių taikinius.
Naudojama genų skaičius siekia 3000). Atsparus ampicilinui ir Promotorių, kuris gali
 klonavimui, kai Iš 1 litro kultūros tetraciklinui. būti indukuojamas.
produkto didelis kiekis išskiriama 1mg Ori sritį (replikacijos Daugiakopijinė, gali
sutrikdo ląstelės plazmidinės DNR. pradžios tašką, kur siekti kopijų skaičius 500.
metabolizmą. Klonavimas vyksta per jungiasi DNR Pagal lac operną galima
EcoRI taikinį, kuris yra polimerazė). atrinkti transformanus.
cea gene. Pažeidus Restriktazių skėlimo
vientisumą, vykdoma taikinius.
atranka pagal Kopijų skaičius apie 20.
kolicinui. Plazmidės Gana stabili (iki 30
pagrindu generacijų išlaiko
Kanamicino, sukonstruotas plazmidę ląstelėje).
ampicilino, LacZ vektorius pBR322. Naudojami genų
ekspresijai, baltymų
Ampicilino, LacZ
sekrecijai, reguliacinių
signalų identifikavimui.

Ampicilino, tetraciklino

Transformantų atrinkimas:

Nepažeistas (alfa-peptidas, kuriame nėra įterpta
papildomo DNR fragmento) skaldo X-gal dažą.
Ląstelės nusidažo mėlyna spalva (α-
komplementacija vadinama).
Įterpus į alfa-peptidą DNR fragmentą, peptido
vientisumas pažeidžiamas ir
nebekomplementuoja. Nustoja vykti beta-
galaktozidazės sintezė, H-gal neskaldomas,
transformantų kolonijos baltos spalvos.

Teigiamos atrankos vektoriai:

Leidžia tiesiogiai atrinkti ląsteles su rekombinantinėmis plazmidėmis, o ląstelės, į kurias pateko pradinis
teigiamos atrankos vektorius, žūva.
 2. Lambda bakteriofago (λ) pagrindu
Lambda bakteriofagas vystymosi keliai:
Lizuojantis po įsibrovimo į ląsteles bakteriofagas Lizogeninis bakteriofago genetinė informacija
replikuojasi, suformuoja reikalinus komponentus integruojama į bakterijų genomą ir replikuojasi
ląstelėje ir išeidamas sulizuoja bakteriją. kartu. Esant palankioms sąlygoms pasiima įterptą
informaciją iš genomo ir iššoka, vėliau pati
replikuojasi ir formuoja bakteriofagą.

BAKTERIOFAGO PASIRINKIMAS VEKTORIŲ KONSTRAVIMUI

Panaudoti didelius bakteriofagus (48502bp) vektorių konstravimui.
Lizogeniniai bakteriofagai iššoka iš chromosomos ir įjungia att sekas.
Įjungia iki 2,5 kb DNR, kurie pasitarnauja svetimų genų pernešimui.
Ne visas bakteriofago genomas reikalingas vystymuisi, galima pakeisti svetimais genais.

FAGŲ-VEKTORIŲ PRIVALUMAI

Sugeba in vivo supakuoti rekDNR į galvutes virusų.

Klonuoja toksiškus produktus ląstelei
Išskiriama rekDNR gryname pavidale

KLONAVIMAS LAMBDA VEKTORIUOSE

DNR suskaldoma restriktaze

Išgryninami pečiai dešinysis ir kairysis
Sumaišoma su klonuojamu DNR fragmentu
Suliguotas DNR mišinys paveikiamas bakteriofago pakavimo mišiniu in vitro

3. Hibridiniai vektoriai;

1. Fagemidės; 2. Kosmidės; 3. Fosmidės

Fagemidės KOSMIDĖS Fosmidės

Fagemidės – plazmidiniai Kosmidės – plazmidės, turinčios Fosmidės – vektoriai, kuriuose

vektoriai, kurie turi fagų ori seką
ir viengrandžių bakteriofagų
tarpgeninę sritį.
Šią sritį atpažįsta bakteriofago
koduojami baltymai ir inicijuoja
viengrandės DNR sintezę ir
pakavimą į bakteriofago daleles.
Klonuojamas fragmentas
gaunamas formose viengrandė
arba dvigrandė.
lambda bakteriofago pakavimo
sistemą.
Vidutinio arba didelio kopijų
skaičiaus.
Leidžia supakuoti iki 36-52 kb.
Klonavimo schema: 1.
Plazmidinį vektorių įvedame cos
seką; 2. Liguojamas DNR
fragmentas; 3. Pakavimo
mišinys naudojamas; 4.
daugiakopijinis pMB1
replikatorius pakeistas
mažakopijiniu F plazmidės
replikatoriumi. Mažas kopijų
skaičius (1-2 kopijos ląstelėje)
bet stabilios.
Bac vektoriai yra gana stabilūs ir
gali talpinti labai didelius (iki 1.2
Mb) DNR fragmentus. Sunku
gauti ilgus fragmentus, nes
 Koduojama iki 10kb fragmentų.
Naudojamos DNR sekos
nustatymui, specifinei
mutagenezei.
Atsparumo ampicilinui geną bla,
pMB1 replikatorių bei f1 fago
intergeninę sritį (IG).
Bakteriofagų mišiniu užkrėsime chromosominė DNR yra labai
bakterijas; 5. Bakteriofagai jautri mechaniniam poveikiui.
perkelia DNR į bakterijas; 6.
Patekusi į bakterijų ląstelę DNR
dėka lipnių cos galų ciklizuosis ir
automatiškai replikuosis.

PROKARIOTŲ RAIŠKOS VEKTORIAI

50% visų ląstelėje susintetintų baltymų galima gauti.

Išbalansuoja ląstelės augimo procesus.
Baltymų sintezė būtų griežtai kontroliuojama.

EFEKTYVIAI EKSPRESIJAI REIKALINGI KOMPONENTAI

Griežtai reguliuojamas promotorius

Efektyvus terminatorius
Polilinkeris
Struktūriniai genai sujungti su inkarinėmis sekomis
RAIŠKOS VEKTORIŲ PROMOTORIAI
Panaudojami stiprūs ir griežtai reguliuojami promotoriai:
Promotorius Induktorius
LacUV5 IPTG
Trp IPTG
araBAD arabinozė
Lac-ara
T7 BAKTERIOFAGO TRANSKRIPCIJOS SISTEMA

Labai efektyvi T7 bakteriofago transkripcijos sistema: ekspresijos sistemą sudaro du vektoriai – viename
daugiakopijiniame prie T7 promotoriaus prijungiamas tikslinis genas bei patalpinamas represoriaus
genas, kitame mažakopijiniame prie indukuojamo lacUV5 promotoriaus prijungiamas T7 RNR
polimerazės genas. Represoriaus perteklius neleidžia sintetinti RNR polimerazę iki indukcijos pradžios;
indukavus T7 RNR polimerazę, ji suranda T7 promotorių ir pradeda tikslinio geno transkripciją. Galima
gauti norimo baltymo iki 50% nuo visų E. coli ląstelės baltymų kiekio.

EUKARIOTŲ VEKTORIAI
Saccharomyces cerevisiae VEKTORIAI

OBJEKTO PATRAUKLUMAS

1. Gerai ištirtas eukariotas.

2. Pigiose terpėse, išskiriamas didelis kiekis.

3. Genomas genų bibliotekose prieinamas.

4. Sekrecijos sistema naudojama baltymams.

5. Eukariotams bendros savybės būdingos.

MIELIŲ VEKTORIŲ SANDARA

Bifunkciniai, nes gali replikuotis bakterijose ir mielėse.

Bakterinė dalis, ORI, atsparumo antibiotikui (Am, Kn, Tet ir t. t), leidžia atrinkti transformantus.

Mielinės turi genus, reikalingus transformantų atrankai mielėse, replikaciją ir pasiskirstymą

užtikrinančias sekas, transkripcijos promotorius ir terminatorius.

Mielių transformantų atranka: Vektorių stabilumo užtikrinimas:

Eukariotiniai mikroorganizmai atsparūs Įvedus į vektorių chromosomines ar 2μm

antibiotikams.
Mielių markeriai chromosominiai aminorūgščių ir
nukleotidų metabolizmo genai (LEU2, URA3,
LYS2, TRP1, ADE2).
Cheminiai junginiai G418 (geneticinas), atrankai.
plazmidės autonomiškai besireplikuojančias ars
sekas.
Didžiausias įvestos į mieles genų sekos stabilumas
pasiekiamas integruojant visą plazmidę į
chromosomą homologinės rekombinacijos būdu.