5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS.

TRANSKRIPCIJOS KODAS

III DALIS 5. Funkcin genomo sandara ir gen raikos valdymas. Transkripcijos kodas
PAGRINDINS SVOKOS odynlis Operonas sutelkt vienoje vietoje struktrini gen grup, kuri turi bendras valdymo sekas ir nuo kuri nuraoma viena bendra pre-RNR. Regulonas retokai vartojamas terminas apibdinti prieing operonui gen valdymo bd: genai isibarst po chromosomas, bet turi tapaius cis elementus ir valdomi t pai transkripcijos veiksni. cis-veiksnys (elementas) DNR nukleotid seka, kuri valdo geno raik tik bdama cis padtyje (toje paioje chromosomoje). trans-veiksnys (baltymas, RNR) difuzinis veiksnys, kuris reguliuoja geno veikl, j koduojantis genas nesusietas su cis padtimi, gali bti bet kurioje chromosomoje. Transkripcijos veiksnys baltymas, kuris reguliuoja geno raik, atpaindamas ir jungdamasis su savitais cis elementais. Promotorius reguliacin geno dalis, nuo kurios priklauso, kada, kuriose lstelse ir kuriomis aplinkybmis veikti genui, pagrindin cis element susitelkimo vieta. promotoriaus erdis (iki 50100 bp nuo transkripcijos starto vietos +1) sritis, prie kurios jungiasi transkripcijos pradios kompleksas ir per j RNR polimeraz. savitas promotorius bdingas inomiems genams, lstelms, audiniams ir pan. Konstitucinis genas pastoviai veikia visose augalo lstelse. Adaptacinis genas jo raik suadina vairs vidiniai ir iors veiksniai. Savitas audiniams jis pasireikia tik tam tikrose lstelse, augalo audiniuose: organ tapatumo genas lemiantis organo raid; pagrindinis kontrols (master) genas kontroliuoja dideles gen grupes; miR genas koduoja mikro RNR (miRNR), kurios kaip ir transkripcijos veiksniai valdo genus, bet po geno transkripcijos. Reporteris genas, kurio koduojam produkt lengva aptikti lstelje; paprastai jo koduojanti dalis prijungiama prie savito promotoriaus, taip nustatoma geno raikos vieta ir laikas.

AUGAL GENETIKA

| 223

Ortologai genai, kurie lemia t pai funkcij ir yra kil i vieno bendro protvio. Paralogai genai, atsirad dl duplikacij, bet gij funkcinio savitumo to paties augalo genome, sudaro eimas pagal bendr kilm, DNR homologij ir koduojamus baltymo domenus, kartotines aminorgi sekas. Raidos (organ tapatumo) genai reguliuoja konkreius raidos etapus ir organus: ABCDE gen klass ir tvarka, kuria pasireikia iedo ir sklapradio organ tapatumo genai; ydjimo pradios genai skirstomi genus, kurie kontroliuoja skirtingus ydjimo pradios kelius: autonominio kelio genai suderina vis ydjimo keli gen raik, iedo meristemos raid, iedo organ raidos pradi; fotoperiodizmo genai priklauso nuo periodini apvietimo slyg kitim diena/naktis trukms ir atitinkamo ilgio dien skaiiaus; vernalizacijos genai tokia pati priklausomyb nuo alt dien skaiiaus; giberelino kelio genai reguliuojami giberelin ir auksin, priklauso nuo bendros organizmo fiziologins bsenos ir tinkam ydjimui aplinkos slyg. Cirkadinio ritmo genai susieti su diena/naktis cirkadiniu ritmu, gali bti iki tredalio augalo gen: viesos jutikli (fotoreceptori) genai koduoja fitochromus (Phy), kriptochromus (Cry), fototropinus (Pho) ir kt., jais priimami viesos signalai. Centrinis osciliatorius savit gen reguliuojama kilpa (ratas), nuo kurios priklauso visi kiti cirkadinio ritmo genai, tarp j ir fotosintezs, ydjimo pradios, yra keletas papildom kilp, kuriomis neamos pataisos dl temperatros, viesos intensyvumo ir kt. Signalo molekuli genai koduoja signalo molekules, kuriomis signalai plazmodezmomis (lstels sienels kanalliais) ir ind sistema (karniena ir mediena) ineiojami po vis augal arba tam tikr augalo dal, pvz., augimo kgel. Genai koduoja hormonus, signalo polipeptidus, transkripcijos veiksnius ir kitus baltymus, miRNR: florigenas perneamas ydjimo pradios signalas (ne genas, o baltymas arba RNR), pasigamina lapuose, perneamas augimo kgel, kad ten susidaryt iedyno/iedo meristemos; sisteminis (bendrasis) atsakas nulemiamas gen, kuri koduojamos signalo molekuls iplatinamos po vis augal;

224 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

sisteminis gytas atsparumas (SAR) augalo atsakas patogeno invazij, kur lemia PR-genai, signalas apie patogen perduodamas bent trim keliais: salicilo rgties, jazmin rgties/etileno ir signalini lipid; hiperjautrus atsakas (HR) lokalus atsakas patogeno invazij, numatytos lsteli ties (apoptozs) forma, signalas iplatinamas tik nedidelje lsteli grupje, signal perduoda R-baltymai, HR trukdo patogenui plisti po augal.

R-genai koduoja apsauginius/signalo baltymus, kurie lemia atsparum (avirulencij, avr) patogeno rasei, daniausiai turi LRR ir proteinkinazs domenus, sveikauja su WRKY eimos transkripcijos veiksniais. PR-genai koduoja augalo apsauginius baltymus nuo patogeno ir vairi stresus sukeliani veiksni, labai miri grup. Elicitorius patogeno kilms mediaga (membranos dalis, baltymas ir kt.), sukelianti augalo atsak patogen: juo paveikus, galima tirti augalo reakcij patogen, nekreiant paiu patogenu. Transkriptas nuoraas nuo geno transkribuojamosios dalies: pre-RNR pirmin RNR, kurios nukleotid seka atitinka geno transkribuojamosios dalies nukleotid sek, subrendusi RNR galutin RNR po vis modifikavim. RNR redagavimas potranskripcinis RNR modifikavimas, kai terpiami arba paalinami pavieniai nukleotidai arba j sekos. Splaisingas vienas pagrindini geno raikos reguliavimo bd po transkripcijos: i pre-RNR paalinami intronai, o egzonai sujungiami vien bendr grandin: alternatyvusis splaisingas skirting RNR susidarymas i pre-RNR: nepaalinami intronai(as) arba paalinami egzonai(as); trans-splaisingas hibridini RNR susidarymas, kai susijungia egzonai i skirting transkript. Splaisingo mutacijos mutacijos, keiianios splaisingo eig intron mutacijos mutacijos intronuose, gali pasireikti ir stambiais fenotipo pokyiais, jeigu tai mutacijos svarbi splaisingui sek arba reguliacini element, kurie yra intronuose. SR-baltymai vieni pagrindini splaisingo ir augal potranskripcins gen raikos reguliavimo baltym (turi motyv, kuriame gausu serino ir arginino). RNR kodas (RNR operonas) visuma RNR ir baltym sveik su RNR, kurios valdo geno raik po transkripcijos. Panaiai kaip transkripcijos veiksniai jungiasi su savitomis DNR nukleotid sekomis, taip yra baltymai, kurie jungiasi su savitomis RNR sekomis.

AUGAL GENETIKA

| 225

Heterogenin branduolio RNR bendra RNR mas, kuri sintetina RNR II polimeraz, tik nedidel jos dalis virsta realiai veikiania subrendusia RNR (i ia RNR operonas). Egzonas RNR seka, kuri paprastai lieka subrendusioje RNR po splaisingo, iimtys dl mutacij ir alternatyviojo splaisingo. Intronas RNR seka, kuri paalinama i pre-RNR vykstant splaisingui, introno ribas ymi dinukleotidai 5-GU- ...AG-3, iimtys dl t pai prieasi kaip egzono. Splaisosoma maj branduolio RNR (U1-6) ir baltym kompleksas, kuris vykdo splaising. Egzosoma baltym kompleksas, kuris suskaido nekokybikas ar nereikalingas RNR branduolyje arba citoplazmoje. Proteosoma baltym kompleksas, kuris suskaido nekokybikus arba nereikalingus baltymus. Jeigu tai buvo baltymai-represoriai, aktyvinami visi j nuslopinti genai. Kodai: Genetinis kodas koduoja aminorgi viet ir sek polipeptide; RNR kodas koduoja geno ir gen visumos raik po transkripcijos (r. aukiau); Histon (chromatino) kodas savitas histon ir DNR modifikavimas, nuo kurio priklauso chromatino sandara ir aktyvumas lokuse, vienas i bd reguliuoti geno raik laike, erdvje ir gen orkestre. Transkripcijos kodas suderinta gen raika transkripcijos metu, transkripcijos vietos, laiko ir trukms nustatymas. Platesne prasme vienija visus bdus reguliuoti geno raikos viet, laik ir trukm, derinius su kitais genais.

5.1. Genai erdvje ir laike

Kelias transkripcijos kod. Kaip ne kart jau minta, nam kio, apyvokos genai pasireikia vis laik, o prabangos genai tik tam tikru laiku. Kaip valdoma gen veikla erdvje ir laike, yra viena sudtingiausi genetikos problem. is klausimas ypa svarbus daugialsiams sudtingos sandaros organizmams, kokie yra augalai. Daug kart sitikinta, kad net tuose paiuose augalo audiniuose skirtingu metu veikia skirtingos gen grups, kad ir endosperme vieni genai veikia vis laik, kiti, pvz., PHERES ar DEMETER, labai trumpai. Pagal pasireikimo pobd genai skirstomi dvi (ar net tris) grupes. Konstituciniai genai veikia pastoviai, vis laik. Tai lstels ir augalo gyvybines funkcijas, pvz., kvpavim nulemiantys genai. Tad, kaip minta, i grup dar vadinama nam kio, apyvokos genais. Ne vis laik veikiantys, prabangos genai yra dvejopi.
226 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Adaptaciniai genai lemia prisitaikym prie aplinkos veiksni. Daniausiai jie pasireikia tik tol, kol veikia juos suadins aplinkos veiksnys. Augalui, kurio visas gyvenimas glaudiai susietas su aplinkos veiksniais, tai labai svarbu, todl intensyviai tiriama gen grup. Augalas negali nei palaikyti pastovios vidins aplinkos, nei ,,pabgti nuo nepalanki aplinkos ir biotini veiksni. Paprastai aplinkos veiksnys suadina tam tikr, savit gen grup, koduojani atsak biotin ar abiotin aplinkos veiksn. Dl ios prieasties daniausiai genai/baltymai vardijami atsak suklusio veiksnio vardu: iluminio oko, sausros, abscizo rgties ar auksino ir pan. atsako genai/baltymai. Saviti audiniams genai pasireikia tik konkreiuose audiniuose arba organuose, lemia lsteli diferenciacij ir audini/organ raid. Tai genai, kuri raika bdinga tik toms lstelms, kurios yra specializuotos, diferencijuotos savitai sandarai ar funkcijai. Augal diferencijuotos lstels, o kartu ir j genomas daniausiai isaugo vis pradin genetin informacij, yra totipotencins (genetikai visaverts). Tokios lstels gali dediferencijuotis ir gyti nauj raidos program. Ir iems vykiams turi bti saviti genai. Prisiminkime somatin embriogenez (3.2; 3.3.2 sk.), androgenez (3.3.3 sk.) ar apomiks (r. 3.6 sk.). Kaip somatin lstel sugeba keisti somatins lstels genetin program gemalo raidos program yra vienas labiausiai intriguojani klausim. Pagal urnal Science, tai viena svarbiausi mokslo problem apskritai, kuri turt bti isprsta XXI amiuje. Kas yra normalusis (laukinis) tipas? Gen skirstymo konstitucinius ir adaptacinius savitus audiniams slygotumas. Dar akobas (F. Jacob) ir Mono (J. Monod), kurie pirmieji ved gen skirstym konstitucinius ir adaptacinius, nustat, kad ias geno savybes gali keisti mutacijos, ir adaptaciniai genai dl mutacij gali virsti pastoviai veikianiais, konstituciniais. Gana danai atranka mutacijas teisina kaip normalj-laukin tip. Jos tampa taksono skiriamuoju poymiu. Prisiminkime: sudtingus zigomorfinius didiojo ioveinio (Antirrhinum majus) iedus. Paaikjo, kad jie atsirad dl dviej dominuojanij gen Cyc ir Dich, paprastam iedui atsirasti btinos recesyviosios i gen mutacijos (dvigubas mutantas); gametofito ir gemalo maieli vairov; skirtingas dviej vairenio ri Arabidopsis thaliana ir A. lyrata dauginimosi sistemas: savidulke A. thaliana tapo dl mutacijos SRK (S-receptorins proteinkinazs) gene; vairius apomikss tipus; greit nereikalaujani vernalizacijos vairenio Columbia (Col) ir Landsberg erecta (Ler) raid, atsiradusi dl dviej gen mutacij, dl ko ie ekotipai taip populiars mokslo laboratorijose. Keliais reimais veikiantys genai. Daug gen veikia ne vienu, o dviem ar daugiau reim: kaip konstituciniai (daniausiai silpniau) ir indukuoti vairi veiksni: aplinkos (kaip atsakas) ir vidini (kit gen produkt, pvz., transkripcijos veiksni). Keliuose gen orkestruose genas dalyvauja ir kokiu bdu jis pasireikia yra istorin geno ypatyb, atsiradusi dl mutacij ir rekombinacijos. Individualus ir geno sitraukimo orkestr laikas. Bet visa tai yra suderinta. Yra ir dirigentai. Kas ,,diriguoja genams, kaip priimamos komandos, vienas svarbiausi ios knygos dalies klausim.
AUGAL GENETIKA

| 227

5.2. Funkcins gen grups. Struktriniai ir valdymo genai. Valdymo sekos

5.2.1. Operonas. Branduollio organizatorius ir rrn operonai, nuo kuri nuraomas didiausias RNR skaiius lstelje Pagal pasireikim suskirstme genus vis laik veikianius konstitucinius ir adaptacinius savitus audiniams. Pastarj raikos laikas ribojamas arba aplinkybi, arba vidins raidos programos. Skiriamos ir kitu principu sudarytos funkcins gen grups. Pagal valdymo pobd skiriamos dvi gen grups: operonas ir regulonas. Operonai augal, kaip ir gyvn genome, yra retas reikinys. Tenka rodinti, kad apskritai yra. Pagrindinis krvis tenka regulonui, ne taip kaip bakterij, kuriose operonai sudaro enkli genomo dal. Operon atrado akobas ir Mono, jo pagrindu sukurdami gen valdymo pradmenis apskritai. Jie ityr bakterijos Escherichia coli prisitaikym (adaptacij) skaidyti disacharid laktoz monosacharidus. Paaikjo, kad genai, kurie koduoja tris baltymus, btinus disacharido metabolizmui, yra vienas alia kito. Be to, nuo j yra nuraoma viena bendra mRNR. Tik dl speciali enkl (pradios ir pabaigos kodon) nuo tokios mRNR sintetinami atskiri skirtingi baltymai. Taiau alia i gen visai gretimai buvo aptikta DNR seka (kaip i pradi manyta, genas), kurios mutacijos vis gen valdym gali apversti auktyn kojomis: i adaptacinigen, kokie ir buvo tiriami, gali padaryti konstituciniu bdu veikianius arba ir visai neveiksnius. Ir svarbiausia, kad ios DNR sekos mutacijos vienu metu keiia vis baltymus koduojani gen raikos pobd. Kitas panaaus pasireikimo (jau i ties) genas, nuo kurio priklauso viso operono veikla, buvo aptiktas atokiai. Tai specialios paskirties reguliacinis genas. Jo funkcija valdyti kitus genus. Jo mutacijos irgi keit i karto visos gen grups veikl: arba genai, kurie koduoja baltymus, dl mutacijos tapdavo nevaldomi ir veik vis laik konstituciniu reimu, arba nutildavo visam laikui, bet visi trys kartu. Akivaizdu, kad ie genai sudaro vien bendr valdom gen grup, kuri akobas ir Mono pavadino operonu, o genus, kurie koduoja baltymus, struktriniais. Vliau i grup buvo papildyta ir genais, kurie koduoja struktrines RNR (rRNR, tRNR), o alia i struktrini gen yra valdymo seka, operono atradj pavadinta operatoriumi. Dabar i geno arba operono dalis yra vadinama promotoriumi, nes jame yra vairios reikmingos valdymui sekos, tarp j ir tos, kurios btinos prisijungti RNR polimerazei. Pasitelk mutacijas akobas ir Mono sukr laikinas bakterij heterozigotas ir rod, kad valdymo sekos, esanios alia struktrini gen privalo bti cis padtyje, t. y. tik alia j. Genas-reguliatorius, kuris yra atokiai, vienodai gali bti ir vienoje, ir kitoje homologines chromosomas atitinkaniose DNR atkarpose, trans padtyje valdom gen atvilgiu. Taip atsirado valdymo sek skirstymas cis ir trans veikianias. Operono sandara. Isiaikinome, kad operon sudaro struktriniai genai su alia, cis padtyje, esaniomis valdymo sekomis. Dar dvi ypatybs yra labai svarbios operonui: nuo operono nuraoma viena bendra mRNR, vliau tokios RNR buvo pavadintos policistroninmis;

228 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

susintetintos mRNR yra trumpalaiks. Tai bdinga adaptaciniams genams. Kai

nra poreikio baltymams, juos koduojanios mRNR yra suskaidomos. Operonai augal genomuose. Daugiskaita ia pavartota neatsitiktinai. Augalai be branduolio, turi dar du genomus: mitochondrij ir plastidi (chloroplast). ie du genomai atsirad dl simbiozs su bakterijomis, todl isaugoj daug bakterij genomams ir genams bding savybi, tarp j ir enkli dal operonus organizuot gen grupi. Vienas operonas, btent rrn (tik vairiais pavadinimais), yra bendras visiems savarankik baltym sintez vykdantiems organizmams ir struktroms nuo bakterij iki mogaus. is operonas yra ne tik augal branduolio genome, bet ir mintuose mitochondrij ir plastidi genomuose. Jis netgi gali bti ymuo, kad lstels struktra savarankikai sintetina baltymus. rrn operonai ir j sankaupos augal branduolio genome. Neginijamai rrn atitinka visas operono ypatybes: genai sutelkti vienoje vietoje ir alia turi bendras cis valdymo sekas; nuo rrn nuraoma viena bendra pre-rRNR. Tiesa, skirtingai nuo gen, kurie koduoja laktozs metabolizmo ar panaius adaptacinius baltymus, i pre-rRNR, kai transkriptas brsta, suskaidoma atskiras rRNR. Stebina labai didelis rrn konservatyvumas vairi organizm genomuose. Skirtumai yra, pvz., bakterij rrn koduoja ir 5S rRNR, taip pat kai kurias tRNR, o visikai neturi 5,8S rRNR geno. Eukariot, ypa branduolio, rrn konservatyvumas dar didesnis (5.1 pav., A). Operonai skiriasi tik subrendusi rRNR dydiu, pvz., vairi augal stambiausios rRNR dydis

5.1 pav. Ribosomini RNR rrn operonas:

A gyvn ir augalo (pomidoro) rrn palyginimas: ETS iorinis transkribuojamasis tarpiklis (External Transcribed Spacer); ITS (Internal TS) vidinis transkribuojamasis tarpiklis; NTS (Non TS) - netranskribuojamasis tarpiklis; tarpikliai skiria vien gen nuo kito; B sanklotinio plastidi 23S rRNR geno palyginimas.

AUGAL GENETIKA

| 229

yra nuo 23 iki 28 S. Augal branduolio genome ji daniausiai bna 26S. Kai kuri augal (saman, taip pat dumbli) plastidi genome i 23S rRNR koduojantis genas yra sanklotinis. Jame telpa dar 12 maj branduollio RNR genai (5.1 pav., B). Nuo rrn, kaip minta, nuraoma viena bendra 40-45S pre-rRNR, kurioje yra ir transkribuojamieji tarpikliai. Jie skiria vien rRNR nuo kitos. Kai pre-rRNR brsta, ir nuoraas yra sukarpomas, ie transkribuojamieji tarpikliai (ITS1 ir ITS2) yra paalinami. Paios rRNR labai konservatyvios, bet ITS1 ir ITS2, atvirkiai, labai polimorfiniai. Dl ios prieasties jie naudojami tirti DNR vairov ir giminysts ryius. Dar viena rrn ypatyb: lstelei reikia labai daug rRNR, i kuri dar branduolyje susidaro ribosomos subvienetai, todl branduolio genome rrn yra netgi ne imtai, o tkstaniai. Paprastai augal genome j yra 14002700, bet pasitaiko per 5000, o ypatingais atvejais gali bti dar daugiau. is skaiius yra kintantis dydis. Priklauso nuo baltym sintezs intensyvumo lstelje. Branduollio organizatorius rrn sankaupos chromosomoje vieta. Kai kurios chromosomos turi vadinamuosius palydovus (satelitus). Tokios, pvz., yra 2-oji ir 4-oji vairenio chromosomos. Palydov nuo pagrindins chromosomos dalies skiria antrin ssmauka (pirmin yra centromeros vieta). Daniausiai (bet ne visada) antrinje ssmaukoje sukaupti kartotiniai rrn. Chromatinas ioje vietoje yra ypatingos sandaros, labai aktyvus, netgi aktyviausias. Tuo galima sitikinti elektroniniu mikroskopu. Matyti vadinamoji kald eglut nuo iniciacijos vietos vis ilgesns ir ilgesns pre-rRNR. Labai intensyviai jungiamas radioaktyviuoju izotopu ymtas uridinas. Antrinje ssmaukoje susidaro branduollis, todl is chromosomos rajonas pavadintas branduollio organizatoriumi (santrumpa NOR-nuo Nucleolus Organiser Region) (5.2 pav.). Ssmauka susidaro todl, kad ioje vietoje yra ypatingi tik NOR bdingi histon variantai.

Atsargiai rRNR genai heterochromatine

Chromosomos petys

Branduollis interfazje

NOR

palydovas

NOR
Centromera

rRNR genai

Tarpgeninis tarpiklis

Koduojanti seka 5.8S 25S

Kartotin DNR

Promotorius 18S

5.2 pav. NOR (branduollio organizatoriaus rajonas) palydovinje chromosomoje (viruje), rrn santalka (viduryje) ir rrn operonas (apaioje). Branduollio dominavimas epigenetinis reikinys, rRNR genai/NOR niekur neinyksta, virsta heterochromatinu.
(pagal C. S. Pikaard. Arabidopsis Book. 2002)
230 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

NOR ir branduollis tai pre-rRNR sintezs ir brendimo, ribosom subvienet susidarymo centras. ia sintetinama daugiau kaip pus vis lstels RNR. Branduollis puiasi dar ir todl, kad j gabenami baltymai, reikalingi rRNR sintezei, brendimui ir ribosom subvienetams. Normaliai lstelje pagaminama apie 1000 ribosom per minut. Branduollio proteomikos tyrimais nustatyta, kad jame sukaupiama kur kas daugiau skirting baltym, negu tiktasi per 500. Augal kol kas aptikta apie 220 baltym. Be to, aptinkami ir tokie baltymai, kurie neturi tiesioginio ryio su rRNR sinteze ir ribosomomis. Pvz., aptinkami baltymai, kurie kontroliuoja lstels cikl. Spjama, kad branduollis gali bti laikina j saugojimo vieta. Taiau branduollis yra labai dinamika struktra, ir jos ryys (kitimas) su lstels ciklu yra labai akivaizdus. Prisiminkime mitozs profaz, kurios pabaigoje inyksta ne tik branduolio apvalkallis, bet ir branduollis(-iai). Paprastai j bna vienas. Chromatino sandara branduollio viduje tiesiogiai priklauso nuo lstels ciklo (5.3 pav.).

Ankstyvoji G1 stadija

Ankstyvoji S stadija

G2 stadija

FC SFC rDNR SAR/MAR

5.3 pav. NOR ir rrn kitimai lstels ciklo interfazje nuo ankstyvosios G1 iki G2 stadijos su padvigubjusia DNR:
G1, S, G2 interfazs stadijos, kai veikia rrn genai; FC fibrili (skaidul) centrai; SFC sutankjusi skaidul centrai; SAR/MAR vietos, kur jungiasi matrikso baltymai. Labiausiai kondensuotas NOR yra ankstyvojoje G1, o S ir G2 stadijose yra didels rrn sritys, laisvos nuo nukleosom, todl labai aktyvios (pagal H. R. Junera et al. Journal of Cell Science. 1995, Vol. 108, P. 34273441).

Branduollio ir NOR veiklos reguliacija. Intensyvi NOR veikla labai priklauso nuo chromatino sandaros, kuri reguliuojama epigenetiniu bdu. iuo bdu reguliuojamas ir aktyvi rrn skaiius. Seniai inoma, kad alia NOR yra vieta, kur sutelktas konstitucinis (pastovus) heterochromatinas (5.2 pav.). I ties tai heterochromatinu paversta dalis rrn, kurie yra rezervas ir gali bti panaudotas ypatingais atvejais, kai lstelje labai padidja poreikis naujoms ribosomoms, pvz., veikiant destruktyviems stresams. Hibriduose vienos augal ries NOR gali visai inykti. Pasireikia vadinamasis branduollio dominavimas, beveik pagal Mendel: hibriduose vienos augal ries branduollis (ir palydovin chromosoma) ilieka, kitos ries inyksta. I ties NOR niekur neinyko, virto heterochromatinu.
Reguliuojamas ne tik NOR lokusas, bet ir branduollio veikla. Apie j galima sprsti netgi pagal branduollio dyd. Vienas toki reguliatori yra genas Sfp1, kurio koduojamas transkripcijos veiksnys valdo bent 60 gen, sukurianij ribosom ansambl. Svarbus vaidmuo tenka maosioms branduollio RNR (angl.

AUGAL GENETIKA

| 231

santrumpa snoRNA). Paios rRNR irgi yra modifikuojamos. Apie 100 viet rRNR metilinamos savitos metiltransferazs, pavadintos fibrilarinu, taip pat yra redaguojamos: uridinas paveriamas pseudouridinu.

Dar viena rRNR yra 5S, bdinga visiems organizmams, kurie sintetina baltymus. Gen, kurie koduoja 5S rRNR, nepalyginamai daugiau negu rrn. Be to, j skaiius skiriasi netgi to paties augalo skirtingose veislse, pvz., lin veislse j gali bti nuo 50000 iki 120000. domu ir tai, kad to paties augalo genome gali bti skirtingo dydio 5S rRNR genai, pvz., kviei yra du variantai 410 ir 500 bp, o lin, nors ir nelabai skiriasi, bet irgi du nevienodo dydio genai 340 ir 360 bp. Be to, j koduojaniajai daliai tenka tik 118 bp. Multigeniniai lokusai. Gen perteklius. Augal genome daug gen yra pertekliniai. J daugiau, negu reikt normaliai funkcijai. Pertekliniai genai daugiau parodo, kad i gen augalo genome, matyt, yra tiek, kad bt rezervas. Jie atsirad dl dviej tip duplikacij: viso genomo (auto ir alopoliploidijos) ir pavieni lokus duplikacij, todl yra paralogai. Sudaro daugybini (multigenini) gen eimas, nes dl mutacij ir rekombinacijos geno viduje ie genai daugiau ar maiau skiriasi, pvz., sklos atsargini baltym (r. 4.2.2 sk.). Gen perteklius augalui svarbus dl daugelio prieasi, tarp j iskirtume tris: stipriau pasireikia gen koduojamas poymis, o dozs kompensavimo mechanizmais galima reguliuoti gen pasireikim priklausomai nuo ekologini veiksni. Augalui, kurio gyvavimas glaudiai susietas su aplinka, tai labai svarbi aplinkyb. nedaug vienas nuo kito pagal pasireikim besiskiriantys genai sukuria augal vairov ries-populiacijos viduje. Ji gali tapti privaloma slyga normaliai proceso ar reikinio eigai, pvz., pasireikti S-nesuderinamumui (r. 2.4.2 sk.). kai atsiranda vieno svarbaus geno nul mutacija, ir tai gresia augalo ilikimui, paralogai bent i dalies gelbsti padt, neleisdami pasireikti mutacijai fenotipe. Dl ios prieasties labai silpnai pasireikia ir labai svarbi gen nul(loss-of-function, knock-out) mutacijos, nors pagal geno svarb mutacija turt bti mirtina. Tai gerokai apsunkina ir geno koduojamo poymio tyrimus. Nra reta padtis, kai nustatomas geno buvimas, jo sandara (nukleotid sekos, net ir koduojami baltymo domenai), bet neinoma jo koduojamo baltymo konkreti paskirtis, fenotipinis pasireikimas. Jeigu paralogai atsiranda ne dl poliploidijos, jie turt bti sutelkti vienoje vietoje, kaip artimus baltymus koduojantys genai Pto lokuse (5.1 intarpas). Dl translokacij duplikuoti genai gana danai yra isklaidyti po vis genom, bet jeigu tai naudinga ir reikalinga. Duplikuot gen sutelkimas vienoje vietoje gali bti naudingas. Geriau organizuoti sutelkt gen raik. Duplikuotame rajone sutelkiami visi reikiami i gen raikai veiksniai ir itekliai. Puiki proga tuo sitikinti buvo NOR ir branduollis. Daugiau turt dominti tie rrn, kurie atsiduria u NOR rib kam tai reikalinga, nes sitikinta, kad net tokiose paviense vietose susikuria minibranduollis. Jeigu nebt prieasties, tokie pavieniai rrn bt per didel prabanga. Duplikuotus genus/paralogus santalkos vietoje yra lengviau valdyti. Paralogai turi isaugoj daug tapai valdymo sek, ypa kai genai susieti dar ir koduojamos funkcijos bendrumu. Taiau tai ne operonas, ir Pto lokusas greiiau yra lokuso funkcins evoliucijos pavyzdys. Pto lokuse atsiduria ir susieti funkcija, bet ne struktra, genai, pvz., Prf genas, kuris koduoja ne proteinkinazs domen turinius baltymus, o LZ-NB-LRR baltym (5.1 intarpas). Lygiai tas pat
232 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

S-nesuderinamumo lokusuose, kuriuose sutelkti genai koduoja vyrikj ir moterikj determinantus ir signalo molekules, praneanias ini apie Ssuderinamum ar nesuderinamum (r. 2.4.2.2 sk.). Genai, kurie yra iame S-lokuse (determinantai), pasireikia skirtingose, be to, erdvikai atribotose lstelse (iedadulkje ir piestels audiniuose). Vadinasi, gali bti naudinga sutelkti vienoje vietoje netgi ne paralogus. Jeigu vyko viso geno duplikacija, atsirad duplikuoti genai isaugoja ne tik koduojanias, bet ir reguliacines sekas, todl vienu metu juos gali valdyti tie patys arba artimi transkripcijos veiksniai.
5.1 intarpas. Ar pomidor Pto lokusas, kuris koduoja R-baltym, yra operonas? Pomidor Pto lokusas koduoja R-baltym, kuris nulemia atsparum toms bakterijos Pseudomonas syringe pv. tomato rasms, kurios turi avrPto veiksn. Tai vadinamoji avrR (genas prie gen) imuniteto sistema. Patogenas tampa nepavojingas, avirulentikas. R-baltymas yra signalas augalo apsauginms reakcijoms, tarp j savitam apoptozs tipui, kuris vadinamas hiperjautriu atsaku. Infekcijos vietoje lstels va ir taip neleidiama patogenui plisti po vis augal. Jeigu Pto lokusas yra i ties operonas, tai jis gana didelis 60 kb ir j sudaro septyni genai. Pth4 Prf Fen Pth3 Pth2 Pto Pth5 60 kb Pto geno koduojamas baltymas visikai atitinka signalins molekuls paskirt tai citoplazmin receptorin proteinkinaz. Pto proteinkinaz aktyvina transkripcijos veiksnius Pti (Pth 2-5), o ie jungiasi su gen, kurie koduoja PR-baltymus (nuo Pathogenesis Related), promotoriais. Pto proteinkinaz veikia ne viena, o kartu su dviem labai artimos sandaros proteinkinazmis Pti1 ir Fen. Pastarj irgi koduoja genas Fen, kuris yra Pto lokuse. Jo pavadinimas atsirads nuo jo lemiamo augal atsparumo insekticidui fentionui. Pto ir Fen proteinkinazs veikdamos kartu yra signalas hiperjautriam atsakui. Dl mutacij Pto gene Pto proteinkinaz gali sukelti hiperjautr atsak ir nesant patogenui. domu ir tai, kad homologinius proteinkinazs aktyvumo domenus turi ne tik gen Pto, Pti1 ir Fen koduojamos proteinkinazs, bet ir vairenio ERECTA geno koduojamas baltymas:

(pagal G. Sessa et al. Europian Journal of Biochemistry, 2000, Vol. 267, P. 171178) Mutacija erecta vairenio Landsberg ekotipe lemia vien i Landsberg erecta privalum: ma g, dl kurio ie augalai uima labai nedaug vietos ir telpa mgintuvliuose.
AUGAL GENETIKA

| 233

Neminjome Prf geno. Jis i ties indukuoja R baltym, kuris sudarytas i tipik jam domen LZ-NB-LRR, taiau be Pto, Pti, Fen jo signalai neperduodami branduol ir nesukelia atsak patogen. Tai ir buvo prieastis manyti, kad Pto lokusas yra operonas, nes visi genai jame veikia suderintai, taiau trksta bendr visam operonui bding valdymo sek. Kita vertus, dl duplikacij atsirad genai paralogai yra i bendro kamieno. Kiekvienas j individualiai gali bti isaugoj tapaias reguliacines sekas. Likti tokiems genams viename lokuse yra net privalumas: jie turt bti lengviau pasiekiami erdvikai t pai juos kontroliuojani transkripcijos veiksni.

5.2.2. Funkcin geno sandara ir gen raikos valdymas Regulonas ir cis-trans veikiantys veiksniai. Vl teks prisiminti akobo ir Mono darbus. Jie veiksnius, kurie valdo gen raik, suskirst cis ir trans veikianius. Pritaikius tai eukariotams, cis veiksniai turi bti vienoje DNR molekulje (chromosomoje) kaip ir valdomos koduojanios sekos, o trans veiksniai gali bti kitoje homologinje chromosomoje ar netgi (daniausiai) nehomologinse chromosomose. Pats svarbiausias principinis visai biologijai akobo ir Mono laimjimas: jiems pavyko tikinamai pagrsti, kad yra baltymai, kurie atpasta bdingas DNR nukleotid sekas ir su jomis jungiasi. Taip valdomi genai. Tokiomis savybmis pasiymintys baltymai pavadinti transkripcijos veiksniais. Juos koduoja saviti, tik valdymui skirti genai. Priklausomai nuo valdymo pobdio, jie gali sveikauti ne su viena DNR cis seka, su kitais baltymais, su hormonais, metabolitais, aplinkos veiksniais. Pagal valdymo pobd transkripcijos veiksniai skirstomi aktyvatorius ir represorius. Vieni aktyvina, kiti slopina geno raik. Pasitaiko dvigubo veikimo transkripcijos veiksni, kurie (daniausiai priklausomai nuo sveik su kitais veiksniais) veikia ir kaip aktyvatoriai, ir kaip represoriai. Eukariot gen valdymas labai sudtingas. Genui tenka klausyti komand ne vieno, o keli, ar net (neatmetama tokia galimyb) deimi vairi reguliatori, nes reguliatori gretas papild ne tik vairs baltymai, bet ir reguliacins baltym nekoduojanios RNR. Tad funkcines grupes genai jungiami kitu pagrindu negu operonas. Pagal cis sekas, vadinamas elementais, ir jas atpaistanius transkripcijos veiksnius. Ir tai dar ne viskas. Geno raika valdoma vairiais etapais: transkripcijos metu, po transkripcijos, transliacijos metu, po transliacijos. Taigi yra veiksniai, kurie reguliuoja gen atitinkamame jo pasireikimo etape, ir tai gali bti veiksniai, kurie atpasta bdingas ne DNR, o RNR nukleotid ar baltymo aminorgi sekas. Prisiminkime potransliacin sklos atsargini baltym brendim ir perna j saugojimo struktras baltym knelius arba saugojimo vakuoles. Pagal pasireikim arba pagal veiksn, kuris genus reguliuoja vienydamas regulon, genai sudaro grupes, vadinamas reguliuojanio veiksnio arba gen raikos pokyius suklusio veiksnio vardu. Daniausiai gen raika yra atsakas veiksn: giberelin, auksin, ilumin ok, alt, sausr ir pan. Nors nam kio/apyvokos genai yra konstituciniai, ypatingomis slygomis jie gali bti ijungti (pvz., badaujant). Be to, kaip minta, jie gali veikti ne tik konstituciniu reimu (pastoviai), bet ir indukuotu. Paprastai tada po indukcijos j raika labai padidja.

234 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Funkcin augal geno sandara nuo kit eukariot gen labai nesiskiria. Genai, kurie koduoja baltymus, yra i dviej dali: promotoriaus ir transkribuojamosios dalies. Nuo ios nuraoma pre-mRNR. Skiriamoji riba tarp i dali transkripcijos pradios (starto) vieta. Ji ymima ir +1. Transkripcijos kryptimi, kaip minta, visi nukleotidai ymimi ;;+ (pliuso) enklu ir skaiiumi didjania tvarka (pasroviui). Nuo starto vietos visi nukleotidai prieinga kryptimi ymimi (minuso) enklu irgi didjania tvarka (prie srov). Genus vien nuo kito skiria tarpikliai, bet funkcinis tarpiklis yra specialus. Tai insulatorius, nedidels (ne daugiau kaip 42 bp), bet savitos nukleotid sekos. Transkribuojamoji geno dalis ne visa yra koduojanti aminorgi sek baltymo molekulje. Abejuose ios geno dalies galuose yra UTR (nuo UnTranslated Region) sekos ymimos atitinkamai 5-UTR ir 3-UTR. Jos sekos reikalingos valdyti RNR ir baltymo brendim, transliacij, baltymo sijungim lstels struktras. Prisiminkime sklos atsargini baltym sintez, brendim ir perna saugojimo struktras baltym knelius ar vakuoles. Intronai i pirminio transkripto paalinami, ir tai yra bdas valdyti geno raik tam tikroje vietoje ir tam tikru laiku, o alternatyvusis splaisingas, be to, sukuria transkript ir j koduojam baltym vairov (r. 5.5 sk.). Taiau apie 30 % vis augal gen intron neturi, pvz., atsargini baltym prolamin genai.

5.3. Promotoriai : cis elementai

Promotorius (r. taip pat 1.9 intarp) yra netranskribuojamoji geno dalis prie srov nuo +1 transkripcijos starto vietos. Tai pagrindin geno transkripcijos reguliavimo vieta. Btent prie jos jungiasi dauguma transkripcijos veiksni ir netiesiogiai RNR polimerazs,. nes kaip ir kiti eukariotai, gen transkripcijai augalas turi tris skirtingas RNR polimerazes. Yra dar kitos RNR polimerazs, bet jos sintetina RNR nuo RNR matricos ir j paskirtis kita nekoduojani RNR sintez. Trys RNR polimerazs, kurios sintetina RNR nuo DNR matricos, i karto suskirsto genus tris gerai inomas grupes: I RNR polimeraz sintetina rRNR nuo rrn operon; II RNR polimeraz labiausiai dominanti, nes ji transkribuoja visus genus, kurie koduoja baltymus ir daugum branduolio maj RNR; III RNR polimerazei tenka visokios smulkios RNR, pvz., 5S rRNR, maosios branduollio RNR, bet miRNR genus irgi transkribuoja II RNR polimeraz. Dvi promotoriaus dalys. Baltymus koduojani gen promotorius yra i dviej grietai vienas nuo kito neatskirt, netgi sanklotini dali: pagrindinio (bazinio arba erdies) promotoriaus su juo sveikauja pagrindiniai (baziniai) transkripcijos veiksniai, o per juos atitinkama RNR polimeraz, jo ribos nevirija -100bp (nuo starto vietos); su kuria i RNR polimerazi sveikauja TF (transkripcijos faktorius), galima sprsti i jo santrumpos romniko skaiiaus, pvz., TF II sveikauja su II RNR polimeraze, nevardijama promotoriaus dalis (kartais vadinama. ,, esanti prie srov nuo pagrindinio promotoriaus), kurioje yra konkreiam genui bdingi cis elementai.
AUGAL GENETIKA

| 235

5.3.1. Pagrindinis promotorius Pagrindinis promotorius (erdis) yra nedidelis (gana danai jo riba nurodoma tik 40 bp), taiau be jo transkripcija nevyksta. Tai viena konservatyviausi geno dali. Daugelio augal gen, kaip ir kit organizm, netgi bakterij, promotoriuje yra TATA elementas. Augal genuose i 7 nukleotid seka yra apie -25 bp nuo transkripcijos pradios vietos +1, o jos konsensusas yra TATAAAA. Btent prie jos jungiasi didelis, apie 50 skirting baltym transkripcijos pradios kompleksas, tarp kit: TFIID (transkripcijos faktorius/veiksnys II D) tai irgi yra baltym kompleksas: TATAjungianio baltymo TBP (nuo TATA-box Binding Protein), kuris pirmasis atpasta TATA sek; 14 kit baltym, kurie jungiasi su TBP ir vienas su kitu, bet ne su DNR TFIIB, kuris jungiasi su DNR ir su II RNR polimeraze; Kai II RNR polimeraz fosforilinama, visas sudtingas iniciacijos kompleksas atsiskiria ir prasideda elongacijos etapas RNR polimeraz toliau sintetina RNR. Pagrindiniame promotoriuje yra ir daugiau cis element: CAAT (daniausiai apie -80 bp nuo,,+1), GC elementas ir kt. Nuo i element priklauso promotoriaus stiprumas ir didesnis savitumas. Pagrindin promotori turi visi baltymus koduojantys augal genai, bet ir tarp j yra vairov, ne tik pagal mintus CAAT ar GC elementus, bet netgi pagal TATA sek: dauguma gen turi TATA sek: TATA dalies gen starto vieta nra grietai apibrta, jos vietoje yra gausi pirimidino liekanomis seka, apibdinama kaip Inr (iniciatorius); transkripcija prasideda kakur jos viduje:
TATA

kai kurie genai, domiausia, kad tarp j dauguma fotosintezs gen, neturi TATA sekos: Inr I

Inr

dauguma tilakoid membran baltymus koduojani gen neturi nei TATA, nei Inr:

Labai didel augal gen vairov ir pagal TATA bei Inr skaii. Abu ie elementai danai atsikartoja daugiau kaip vien kart. TBP grietai jungiasi tik su vienu TATA elementu. Taiau augalai pateik dar vien netiktum: sojos vieno i tubulin gen promotoriuje TBP jungiasi dvejose vietose, ir, svarbiausia, kad nuo to priklauso augalo prisitaikymas prie apvietimo slyg. Taip pat sitikinta, kad nuo cis element TATA arba/ir Inr skaiiaus pagrindiniame promotoriuje priklauso kiekybiniai gen raikos skirtumai. Pvz., darins pupels
236 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

(Phaseolus vulgaris) atsarginio globulino -fazeolino geno Phas pagrindiniame promotoriuje yra trys TATA ir keletas spjam Inr motyv (5.4 pav., A). Fazeolino, kaip ir kit sklos atsarginius baltymus koduojani gen, raika labai grietai kontroliuojama laike (kai skla pasiekia brandos vidur) ir erdvje (tik bdingose sklaskili lstelse, r. 4.2.3 sk.). vairi nukleotid mutacijos skirtinguose TATA elementuose svarbios Phas geno raikos stiprumui, bet ne pasireikimui laike ir erdvje. Tai lemia kiti cis elementai, prie srov nuo pagrindinio promotoriaus esanioje dalyje (5.4 pav., B). Prie i cis element jungiasi transkripcijos veiksniai, kurie slopina Phas geno raik kitose augalo dalyse. Atkreipkite dmes, kad nors i transkripcijos veiksni pasireikimas yra vienodas jie slopina Phas, tad yra represoriai, taiau vairiuose augalo organuose su Phas geno promotoriumi jungiasi skirtingi transkripcijos veiksniai, be to, prie skirting cis element. Tai irgi vienas i transkripcijos kodo pasireikim: skirtingi organai, skirtingos lstels ir t pat gen doroja skirting gen produktai.

B 5.4 pav. Atsarginio sklos baltymo fazeolino geno Phas promotoriaus funkcin sandara ir Phas geno reguliavimas erdvje ir laike:
A. Trys TATA motyvai pagrindiniame promotoriuje. Skirtinga j funkcin svarba rodyta mutacij metodu. Delecijos () ymimos ,,-, terptosios sekos maosiomis raidmis. TATA elementai pajuodinti, o T1, T2, T3 j vieta promotoriuje; UTR netransliuojamoji mRNR dalis. Aleli raikos vieta nustatyta prie Phas promotoriaus prijungiant reporter gen gus (pagal M. L. Grace et al. Journal of Biological Chemistry. 2004, Vol. 279, P. 81028110). B. phas promotoriaus elementai, kurie reguliuoja Phas geno raik skirtinguose organuose ir skirtingu laiku (pagal M. D. Burow et al. Plant Journal. 1992, Vol. 2, P. 537548).

Pagrindinis promotorius daniausiai inicijuoja silpn raik t gen, kurie yra adaptaciniai, bet yra ir labai stipri promotori. Kita vertus, nors pagrindin geno raikos savitum sukuria toliau esantys cis elementai, inoma keletas audini specifini pagrindinio promotoriaus form.

AUGAL GENETIKA

| 237

5.3.2. Savita promotoriaus dalis ir saviti cis elementai. Cis elementai intronuose Prie srov esanioje promotoriaus dalyje daugiausia yra tie cis elementai, nuo kuri priklauso kada ir kuriose lstelse veikti genui, kokiam regulonui turt priklausyti genas. Augalo pririimasprie aplinkos atsispindi ioje promotoriaus dalyje. Joje yra cis elementai, prie kuri jungiasi transkripcijos veiksniai, saviti konkretiems atsakams (alio, druskingumo, sausros, konkrei hormon ir pan.) arba vidinius procesus ir raid kontroliuojantiems genams. Danai pagal tai yra ir i cis element pavadinimai (5.1 lentel). Jie aptinkami, kai apibendrintai itiriamas pakankamai didelis skaiius viena kryptimi veikiani gen, o nustaius cis elementus vieno augalo genome galima nustatyti tokia paia kryptimi veikianius genus ir kit augal genomuose.
5.1 lentel. Cis sekos augal vairi gen promotoriuose Elementas Visas Santrumpa pavadinimas
PB-300

Nukleotid seka(os)

Genai arba gen grups

TV

Atsargini baltym, skl raidos, brendimo ir dygimo genai Prolamin, endosperTGTAAAG/CTTT Proline Box, E motif mo raidos Endospermo raidos, CACGTG, CANNTG E-box Endosperme Box vairs bHLH HMG-GATA GATA core (pagal n.s.) TATC/GATA-TATCCAC Desikacijos/brendimo AACA/TA Gibberellin Acid TAACARA, TAACAAAA Dygimas/giberelin GARE Responsive Element atsakas CTTTT GLM GCN4-like Motif Atsarginiai baltymai, ATGAG/CTCAT (G/A)TGA(G/C)TCA(T/C) dygimas GCCACGT(c/a)AG Globulin genai

DOF, SAD bHLH, MYC GL3, TT8 SHAQKYF 1R MYB, Itr1 bZIP, SPA, BLZ1-2 b ZIP, REB bZIP, Sph, Osem, Em bZIP, VP1, ABI5

G/C ir A/G G/C and A/G hybrid box N Nuo N (azoto) RY RY motif, repeat

TGACATGTAAAGTGAA N valdomi genai Pupini . atsargini CATGCATGT baltym Atsakas abscizo rgt (brendimas-desikacija, stresai) Slopina dygim, desiBRE, ACGT- AB Responsive ACGT(GG/TC), box Element, ACGT (pagal CGCGTG ir kt. vairs tame kacijos genai, alio, sausros ir kt. stresai paiame g. n.s.) CE3 ABRE/G-box ASCF ABA-inducible sph-containing element Nonperfect ABRE Coupling Element GCGT, GTGTC, CCGAC ABR atsakas CACGTG CATGCATG ABR atsakas Fotosintez, fotoperiodas

'' bZIP, HVA1

bHLH bZIP, GBF Rbcs, PIF3, HY5

238 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.1 lentels tsinys Elementas Visas Santrumpa pavadinimas

AuxRE TGA DRE GRA, GC HSE LTRE

Nukleotid seka(os)

Genai arba gen grups

TV

Auksino (indolilacto rgties) atsakas morfogenas TGTCCCAT, TGTCTC Augimo reguliacija, Auxin-Responsive arba inversija GAGACA gemalo raida ir kt. Element Pagal n.s. Drought Responsive Element GC-rich rab activator, GC-element Heat Schock Element Low Temperature Responsive Element TGACGTAA, TGACGCAG TGACGTGG vairs stresai TACCGACAT, ACGTGTC TGGCCGAA CACTGGCCGCCC NGAANTTCNNGAAN A/GCCGAC Augimo reguliacija

ARF, AP2/ARF, AUX/IAA

Dehidratacijos seka AP2/EREBP alio promotoriuose vairs stresai RAB iluminio oko atsako Atsakas em to

ARE GT-m. GC-m. ARE1 ARE2 TGA W-box EE CBS ME CCA/TGG CArG

Anaerobins slygos, hipoksija Hipoksija dl vandens Anaerobic Responsive MYB2 pertekliaus dirvoje, Element, GT motyvas GTTTT ADH mangrovi augalai, GC motyvas GCCCC altis CCATAG GAGAATA Biotiniai stresai (patogenai), atsakas ksenobiotikus Atsakai patogenus, Pagal pirmsias n.s. TGA... cukr sintezs genus (C/T)TGAC(C/T), TTGAC Atsakai patogenus TATGGAAA(T)TGAC(C/T) ir hipoksij Cirkadiniai reikiniai, diena/naktis AAAATATCT Vakaro genai Evening Element AAAAAATCT (trumpas CBS) Dienos genai CCA1 Binding Site AAAAAAATCT (ilgas CBS) Morning Element Ryto genai AACCACGAAAAT Raidos genai CCA (TGG kartotins CCA/TTG Prokambio genas, sekos) Osho1 turi 13 CCA / TTG kartot. sek. CC (A/T)6GG iedo organ raida Nuo WRKY bZIP, TGA,CREB, NPR1, SUC WRKY ZIP PPRG, CCR2 CCA1, LHY

Osho1, HDZIP MADS

Sekos yra santykins, gali skirtis vairiuose genuose ir augaluose, pateikiami konsensusai, sekos erdis (daniausiai konservatyvi) pajuodinta; R, Pu A arba G; Y, Py T arba C; N bet kuris nukleotidas; g. genas, b baltymas; n.s. pagal nukleotid sek; maosiomis raidmis nurodyti nukleotidai, kuri danis uimamoje padtyje nevirija 53 %; / ioje padtyje gali bti vienas ar kitas nurodyt nukleotid; TGA ta pati cis seka gali bti skirtingos paskirties genuose.

AUGAL GENETIKA

| 239

Danai promotoriuje yra ne vienas tapatus cis elementas su nedidelmis nukleotid sek variacijomis, panaiai kaip TATA elementas fazeolino geno pagrindiniame promotoriuje (r. 5.4 pav., A). Kita vertus, tam paiam atsakui ar procesui grieiau kontroliuoti promotoriuje gali bti skirtingi cis elementai, kaip tai yra kai kuri gen, kuriuos reguliuoja abscizo rgtis, promotoriuose. Juose, be ABRE, dar yra CE (Coupling Element) elementas, kuris sustiprina ir sugrietina j turinio ABR atsako geno raik ( r. 3 intarp ir 5.1 lentel) ir kiti cis elementai. Regulon sudarani gen raikos stiprumui labai svarbi, bet ir vairi, atitinkam cis element padtis nuo transkripcijos pradios vietos +1. I pradi buvo didel naujiena, o dabar prastas dalykas yra cis elementai, nutol nuo geno rib 5 ar 3 pus per tkstanius ar deimtis tkstani bp. ie elementai gali skatinti (enhanceriai) arba slopinti (sailenseriai) geno raik, bet reikia, kad kontroliuojantys trans veiksniai juos priartint prie pagrindinio promotoriaus ar labiau nutolusi promotoriaus viet. Susidaro kilpa, bet ji bdinga netgi pagrindiniam promotoriui ir j supantiems baltymams (5.5 pav.). i nutolusi cis element poveikis geno raikai yra papildomas saugiklis, kad genas nepradt veikti ne laiku ir ne vietoje. Priartinimui yra specials trans veikiantys baltymai.

Promotorius cis regionas Modulis

Transkribuojamoji dalis UTR Egzonas Intronas

Pagrindinis promotorius

Chromatinio remodeliavimo kompleksas TV kofaktorius TV

Pol II holofermentas Transkripcijos starto vieta TATA box TATA jung. baltymas Chromatinas Kilp sudarantys veiksniai

Chromatinas

Moduliai

5.5 pav. Promotoriaus sandara (A) ir funkcionavimas (B)

(pagal G.A. Wray et al. Molecular Biology and Evolution. 2003, Vol. 20, N9, P. 13771419).

Naujas poiris intron reikm cis sekos intronuose. I ne vietoje esani cis element didelio susidomjimo sulauk cis elementai, esantys intronuose. Augal genomuose tokie cis elementai aptikti labai svarbi organ identiteto gen intronuose. Vairenio AGAMOUS geno 2-ojo introno tyrimai apskritai yra unikals genetikoje. Tai pripaintas iedo lytini organ: kuokeli ir piestels identiteto genas. Be jo aktyvi aleli ie organai neisivysto. AG genas koduoja MADS supereimos transkripcijos veiksn. Kita vertus, AG genas irgi kontroliuojamas kit gen, tarp j dviej iedo meristemos gen LEAFY (LFY) ir WUSCHEL (WUS). AG geno antrajame introne yra kelios LFY ir WUS koduojam transkripcijos veiksni prisijungimo vietos. iame introne yra ir daugiau cis element, su kuriais jungiasi kiti TV. Svarbiausia, kad is transkripcijos veiksni derinys keiiasi su iedo raida (5.6 pav.). Tai dar vienas ingsnis transkripcijos kod, tik kart netiktas per intronus. Homologiniai AG cis elementai (tik vairiais deriniais) aptikti ir kit tirt Brasicaceae eimos augal 2-ajame AG geno ortolog introne (tarp j keturi Arabidopsis genties ri), taip pat kai kuri kit tirt augal, priklausani kitoms augal eimoms, AGAMOUS geno ortologuose: agurk CUM1, tuopos PTAG1 ir PTAG2, ioveinio PLE ir TAR, petunijos PMADS3, pomidor TAG1 (5.7 pav.). Tad bent tarp dviskili augal cis elementai io geno introne yra konservatyvus reikinys.
240 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.6 pav. glio (SAM)/iedo meristem santykio kitimai, priklausomai nuo vairenio AGAMOUS geno reguliavimo, kur atlieka cis elementai 2-ajame introne
(pagal R. L. Hong et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 12961309).

5.7 pav. vairi augal palyginimas pagal spjam cis sek padt AGAMOUS geno homologiniuose intronuose:
rodykle parodyta Tam3 transpozono siterpimo vieta, dl kurios atsiranda PLE geno ovulata mutacija, LBS vietos, prie kuri jungiasi LEAFY transkripcijos vaiksnys (r. 5.5.2.3 sk.) (pagal R. L. Hong et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 12961309).
AUGAL GENETIKA

| 241

Gali bti, kad intronuose esanios cis sekos apskritai kontroliuoja iedo raid. Tuo sitikinta ityrus miei dominuojani homeozin mutacij Hooded. Mutacija atsiradusi dl gan didels 305 bp DNR segmento duplikacijos miei HD supereimos (r. 3.3 intarp) Kn3 (Knox) geno ketvirtajame introne. Dl mutacijos varpos akuotas virts papildomu iedu, be to, invertuotu (apverstu 180), todl tai atrodo kaip kepurls. I ia ir mutacijos pavadinimas. domu ir tai, kad vairs Hooded aleliai pasireikia labai skirtingai: kai kuri ne visas akuotas virts papildomu iedu, o papildomas iedas yra ant akuoto (5.8 pav.).

5.8 pav. Miei mutant Hooded vairov:

nors visi jie turi stambi 305 bp duplikacij IV-ajame introne, mutantai pastebimai skiriasi, pvz., 4-ojo i kairs papildomas iedas (kepurl) yra ant akuoto, kit visas akuotas tapo papildomu invertuotu iedu ,,kepurle;kairje- WT( normalusis tipas) Istorija su cis elementais intronuose tik prasideda. Intronai, turintys takos geno raikai transkripcijos metu arba po transkripcijos, pavadinti IME (nuo Intron-Mediated Enhancement). Jie aptikti vairi augal ir vairiuose genuose: Alcohol dehydrogenase1, Bronze1, Shrunken1, Phosphoribosylanthranilate transferase1, SUVH3 ir kt. Pastarasis genas yra chromatino remodialiavimo (r. 3. 5. 2 sk.). Turi du intronus 5-UTR dalyje ir pirmasis j yra IME. Jis nulemia stipri ir konstitutyvi SUVH3 geno raik. Tad ir epigenetinius reikinius, chromatino funkcin sandar gali valdyti cis sekos intronuose. Bioinformatikos (sek analizs) metodais intronuose iekoma ir aptikta daug konservatyvi nekoduojani sek, kuri paskirtis kol kas neaiki. Akivaizdu, kad jos ten neatsitiktins. Pvz.,, net 5-i tirt Poaceae eimos augal (kukurzo, ryio, bambuko, eryts, Arundo) lg1 (liguleless 1) geno 1-ajame introne nustatyta ne tik didel i konservatyvi (vadinamj. CNS) sek homologija, bet sutapo netgi j tarpusavio isidstymas tirt augal introne.

5.3.3. Saviti promotoriai ir gen promotori konstravimas Saviti promotoriai. Geno raikos vieta ir laikas nustatomi vairiais metodais. Vietai nustatyti prie promotoriaus prijungiama koduojanti geno reporterio (r. 2.2 intarp) dalis. Jo koduojam baltym daniausiai lengva aptikti pagal bding spalv (5.2 intarpas). Naudojami vairs reporteriai: -gliukuronidazs (GUS), luciferazs (luc, luxA) arba aliai fluorescuojanio baltymo (GFP) genai. Prie reporterio prijungus tiriamojo geno promotori transgenas vedamas augalo lstel. Geno produktas gali bti aptinkamas ir imuno242 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

liuminescentiniu bdu, kai tiriamasis baltymas pagaunamas ir suriamas antiknais su prijungtu fluorochromu. Pagal susikaupusio baltymo kiek, o tiksliau pagal spalv, sprendiama apie tiriamojo geno raikos stiprum. Taip buvo, pvz., vertinti mutantiniai -fazeolino promotoriai (5.4 pav.) Savit promotori prijungimas GMO tikslais. Savit promotori prijungiant prie geno, kuris paprastai augalo lstelse netranskribuojamas, galima gauti vairi mediag producentus. Prisiminkime, kad ir sklos atsargini baltym sintezs ar pernaos baltym knelius ir saugojimo vakuoles genus (r. 4.2.3 sk.). Kai prijungiamas atitinkamas promotorius, svetimas rekombinantinis baltymas sintetinamas konkreiame organe (gumbuose, lapuose ar sklose ir pan.). Kita vertus, prijungus savit promotori prie geno, kuris paprastai pasireikia kitose lstelse, tiriama ektopin (ne vietoje) geno raika, jos pasekms. Tai padeda nustatyti geno viet gen ansamblyje. Genetin ablacija ir saviti promotoriai. Tai daugiau jau nagrinto klausimo priminimas (r. 2.4 intarp). Lstel arba jos organel sunaikinama ir tiriamos to pasekms. Taip nustatoma j reikm ir funkcijos. Tikslingai lstel arba jos struktros sunaikinamos lazeriu, bet t galima uprogramuoti genetikai. Tam tikslui prie savito promotoriaus, kuris pasireikia tik sunaikinti numatytose lstelse, prijungiama geno dalis, koduojanti toksin. Daniausiai naudojamas difterijos toksino genas. Taip, pvz., buvo itirta aleurono lsteli paskirtis ir rodyta krakmolingojo endospermo lsteli transdeterminacija aleurono lsteles, kai ios yra sunaikinamos (r. 3.4.2 sk.). Labai skmingai genetin ablacija pritaikyta gauti vairi augal vyrikj sterilum. Daniausiai prie dulkins tapeto lstelms savito promotoriaus prijungiamas bakterij toksin RNaz barnaz koduojantis genas. Sunaikinamos tapeto lstels, o kartu nesivysto ir iedadulks. Tuo paiu iaikinta ir tapeto reikm vyrikojo gametofito raidai (r. 2.3.5 sk.).
5.2 intarpas. Matomi gen reporteri produktai, naudojami tirti augal gen raik Svarbu, kad bt galima aptikti reporterio koduojam produkt pagal spalv. -gliukuronidazs (GUS) genas uidA i Eschericia coli yra vienas i daniausiai naudojam tirti augal genus, jo produktas aptinkamas histocheminiu bdu pagal netirpias mlynas nuosdas. Luciferazs genai i vairi nakt vieiani organizm. Pirmasis buvo luc genas i vabzdio Photinus pyralis. Naudojami alternatyvs genai i kit organizm, kurie vyti skirtingomis spalvomis, tarp j augal transgenams konstruoti luxA genas i bakterij. aliai fluorescuojanio baltymo (GFP) genas i medzos Aequorea victoria. Naudojami vairs variantai, pvz., mutantin forma geltonai fluorescuojantis baltymas i Anthozoa. Todl galima i karto ymti du genus ir tirti j suderint pasireikim. Patogu tirti ir baltym perna i vien organeli kitas, tarp j transkripcijos veiksni judjim i vienos lstels kit arba dideliais atstumais karniena. Nereikalauja substrato, kuris btinas luciferazei, todl atspindi real geno raikos laik. Augaluose teko veikti neteisingo splaisingo problemas (turi slapt splaisingo viet).

Stipri promotori paiekos ir prijungimas. Pripaintas stiprus promotorius yra konstitutyvusis iedinio kopsto mozaikos viruso promotorius CaMV 35S (nuo Cauliflower Mosaic Virus). Danai jis tiesiog nurodomas kaip 35S promotorius. Geno raikai dar labiau sustiprinti gali bti prijungiamas ne vienas, o du CaMV 35S (35SS) promotoriai.
AUGAL GENETIKA

| 243

Taiau pasitaiko ir nemaloni staigmen, kai per didelis geno raikos stiprinimas atnea ne naud, o al. Prisiminkime t neskm, kuri itiko, kai prie vairenio sklapradio geno ANT (AINTEGUMENTA) koduojaniosios dalies buvo prijungti du 35S promotoriai. ANT genas reguliuoja lsteli dalijimsi ir augalai, prie kuri ANT prijungtas 35S promotorius, yra stambesni. Tiktasi, kad kur du stos, daugiau padarys. Taiau prijungus du 35S promotorius, augalai tapo moterikai sterils. Branduolo ir chalazos lstels tiek suvejo, kad nustelb gemalo maiel. 35SS :: ANT fenotipas atitinka hipermorfin, arba kitaip gain-of- function (perteklin) ANT geno mutacij. Danai toki gen valdymas sutrinka, ir genas pasireikia ne vietoje, pvz., prijungus prie gen CPS (CAPRISE) arba TRY (TRIPTYCHON) stipr promotori, plaukeliai atsirado ant sklaskili, kur paprastai j nebna. Plaukeliai bdingi tik tikrajam lapui (r. 3.1 intarp). Taip pavyko iaikinti ne tik gen CPC ir TRY koduojam baltym funkcij, bet ir valdym. Ektopikai pasireikiantys genai daniausiai konstruojami prie geno promotoriaus, savito lstelei, prijungiant koduojani dal geno, savito kitoms lstelms ar net organizmams. Sustiprjusi geno raika gali duoti netikt rezultat, ne tik plaukelius ant skilialapi, sustiprinus vairenio ydjimo laik reguliuojanio FLC (FLOWERING LOCUS C) geno raik papildoma transgeninio FLC geno doze, vairenis i vienmeio augalo virto dvimeiu. FLC genas slopina ydjim, todl padidjs FLC baltymo kiekis veik kaip reostatas: dar labiau udels iedo meristemos susidarym (5.8 pav.).

flc/FLC
FLC didjimas

FLC/FLC

flc/flc

vienmetis

dvimetis

papildomos FLC kopijos

5.9 pav. FLC geno ,,reostatas: kai padidinus FLC (transgenais) gen skaii genome vairenis i vienmeio virto dvimeiu
(pagal S.D. Michaels, R.M. Amasino. Plant, Cell and Environment. 2000, Vol. 23, P. 1145-1153; J.Z. Zhang. Current Opinion in Plant,z Biology. 2003, Vol. 6, P. 430-440).

Stipri promotori paiekos tsiamos toliau, ypa vienaskili augal, nes manoma, kad CaMV 35S promotorius tinkamesnis dviskiliams augalams. Surastas kukurz ubikvitino geno promotorius ymimas kaip Ubi-promotorius, kuris stiprumu apie 10 kart lenkia CaMV35S promotori. Dar stipresn, pat stipriausi, i inom promotori, pavyko rasti irni plastocianino gene PetE. io geno koduojamas baltymas yra elektrono neiklis. Stiprumu PetE geno promotorius kelias deimtis kart virija CaMV 35S promoto244 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

ri. Tai suteikia naujas galimybes augal gen ininerijai. PetE geno promotoriaus stiprumas siejamas su A/T poromis gausiu promotoriaus rajonu tarp -176 -444 (vadinamuoju. P 268). Jame gausu viet, prie kuri jungiasi HMG (nuo High Mobility Group) baltymai (6 vietos HMG1 ir 8 vietos HMG-I/Y baltymams). ioje vietoje sukuriama savita erdvin DNR sandara (juostos), kuri skatina kit baltym prisijungim. Dirbtiniai promotoriai vis daniau naudojami vairiais tikslais. Vienas i galim j pritaikym paversti gen kontroliuojamai indukuojamu. Dirbtiniuose promotoriuose vairiais deriniais jungiami inomi, gerai itirti cis elementai. Taip sukonstruojamas chimerinis promotorius arba genas. Pvz., chimerinis LEAFY genas paverstas kontroliuojamu, prie jo promotoriaus prijungus DNR sek, kuri atpasta gliukokortikoido receptorius. Teko sukonstruoti ir atitinkam transkripcijos veiksn, turint domen, kuris jungiasi prie ios DNR sekos. Augalai neturi tokio hormono, tad reikiamas konstravimui sekas teko pasiskolinti i induoli. LEAFY genas paprastai kontroliuojamas ydjimo laiko gen. Nagrintoje dirbtinai sukurtoje promotoriaus/TV sistemoje LEAFY genas tampa valdomas gliukokortikoido. Paprastai iam tikslui naudojamas sintetinis hormono analogas deksametazonas. Chimeriniai promotoriai sukuriami ir grynai dirbtinai sujungiant vairius inomus cis elementus. Kaip bazinis (pagrindinis) promotorius, ioje konstrukcijoje vartojamas CaMV 35 S, o geno indukcijai saviti cis elementai. Patraukliausia ir i ties, matyt, yra perspektyviausia sukonstruoti tok promotori, kuris pasiymt itin stipriu atsaku konkreius aplinkos veiksnius. Taip tikimasi padidinti augal atsparum nepalankiems biotiniams (pvz., patogenams, augalus grauiantiems vabzdiams ir pan.) ar abiotiniams (sausra, altis, sunkieji metalai ir kt.) veiksniams. Teigiam rezultat jau yra, pvz., pavyko sukonstruoti chimerin promotori, kuris stipriau reaguoja jazmin rgt ir patogeno iskiriam mediag, kuri sukelia augalo apsaugin reakcij. Tokia mediaga vadinama elicitoriumi. J naudojant nebtina augal ukrsti patogenu. Augalo reakcija bt lyg jam usikrtus patogenu. Promotoriui konstruoti panaudoti du cis elementai. Vienas j aptinkamas atsako patogenus promotoriuje tai cis elementas AGACCGCC. Viename promotoriuje jis sujungtas su W-box elementu (r. 3.1 lentel) ir TTGACC, kuris jungiasi su WRKY transkripcijos veiksniais. ie irgi itin svarbs atsakui patogen. Kaip pagrindinis promotorius, naudotas CaMV 35S. Konstrukcija (G st 1-box): TTCT AGCCACC AGAT TTGACC AAAC lenk promotorius su vienu kuriuo i naudot konstravimui cis element . Slaptieji (kriptiniai) reguliaciniai elementai yra aptikti tabako ir kit augal genomuose, naudojant kaip vektori T-DNR i Agrobacterium tumefaciens. Tai prastinis augal gen ininerijos vektorius, tik GUS-nos genas neturjo promotoriaus. Staiga atsirado kas j pakeiia. Slaptieji reguliaciniai elementai gali veikti kaip promotoriai, transkripcijos ar transliacijos enhanceriai, slaptos poliadenilinimo ar splaisingo vietos. Jie turi pakeisti viet, nes prastoje vietoje daniausiai jie yra neaktyvs. Slaptai reguliacinei nukleotid sekai pradti veikti gali pakakti ir mutacijos nukleotid sekoje: vienos nukleotid poros pakaitos kit arba nukleotid poros ikritos.
Slaptieji promotoriai labai panas chimerinius promotorius, kurie sukonstruojami dirbtinai. Pvz., tabako slaptasis, be to, veikiantis konstituciniu bdu, promotorius tCUP (nuo tabacco Constitutive Promoter) sudarytas i pagrindinio promotoriaus element, transkripcijos enhanceri ir dalies 5-UTR. Tabako genome taip pat aptikti slaptieji reguliacijos elementai sudaryti i kartotini sek TGTTGA(T/C)ACCCATTTT(T/C).
AUGAL GENETIKA

| 245

Bendras j dydis maiausiai 5 kb, o homologija siekia 8090 %. Neityrus tokios sekos funkcinio pasireikimo, sunku sivaizduoti, kad tai reguliacin seka.

5.3.4. Elementai, enhanceriai ar moduliai? Promotori duomen bazs Sekoskaita ir cis element nustatymas. Skm nustatyti svarbias gen raikai DNR sekas, tarp j ir cis elementus, labai priklauso nuo genom ir gen sekoskaitos rezultat. Tad neturt stebinti faktas, kad vis gausjant organizm, tarp j ir augal, kuri sekvenuotas ne visas genomas, o bent jo dalis, kaip i gausybs rago liejasi nauj cis element skaiius. Kuo daugiau yra sekvenuota viena kryptimi veikiani gen, tuo detalesn promotoriaus ir kit geno dali funkcin sandara ir didesn tikimyb aptikti cis elementus. Pvz., vis atsarginius baltymus prolaminus koduojani gen promotoriuose yra nustatyta bendra nukleotid seka TGTAAAG, kuri taip ir pavadinta PB (nuo Prolamin Box) arba pagal atstum nuo +1 starto tako -300 elementu (r. 5.1 lentel), nors io elemento atstumas nuo transkripcijos pradios vietos vairi augal ir j prolamin gen promotoriuose gerokai skiriasi (5.10 pav.). TCTAAAG seka sudaro PB elemento erd. Reikmingos ir apie j esanios sekos. Manoma, kad jos lemia prolamin gen savitum, nes skiriasi viena nuo kitos dar labiau negu elemento erdis, kuri yra palyginti labai konservatyvi.
Augalas/genas Kukurzai
22-kDa zeinas 19-kDa zeinas 15-kDa zeinas 27-kDa zeinas 10-kDa zeinas

PROLAMIN BOX seka

Vieta

Mieiai
B-hordeinas C-hordeinas -hordeinas D-hordeinas

Kvieiai
-gliadinas LMW-gluteninas HMW-gluteninas

Rugiai
-sekalinas

5.10 pav. PB (Prolamin Box) elementas miglini augal gen, kurie koduoja atsarginius grdo baltymus, promotoriuose
(pagal J. Vicente-Carbajosa et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997, Vol. 94, P. 76857690).

Danai tas pat elementas, netgi tame paiame gene, atkartojamas su variacijomis kaip motyvas. Dar kart prisiminkime pupeli -fazeolino gen (r. 5.4 pav.) ar vairenio AP3 (APETALA3). Pastarasis genas koduoja iedo vainiklapi raid (yra B klass genas). Jo promotoriuje yra trys CArG elementai. Jie bdingi genams, kuriuos valdo MADS TV (5.1 lentel). Palyginamieji io geno tyrimai augaluose atskleid domius dsningumus:

246 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

vienas CArG elementas yra konservatyvus (r. 5.3 intarp) visiems tirtiems AP3
genams; kiti CArG pastebimai skiriasi. Be to, visi trys elementai atlieka skirting reguliacin vaidmen (5.11 pav.).

5.11 pav. Vairenio APETALA3 (AP3) geno promotoriaus funkcin sandara:

Prie CArG(1, 2, 3) element jungiasi transkripcijos veiksniai, kurie yra aktyvikliai ir slopikliai (r. tekst; pagal J. J. Tilly et al. Development. 1998, Vol. 125, P. 16471657).

5.3 intarpas. Kodl nukleotidai gali bti uraomi maosiomis raidmis? Btina atkreipti dmes, kad vis PB (Prolamin Box) element erdis yra labai konservatyvi (pastovi). Kiekvienoje jos padtyje nukleotidai 100 % sutampa. Daniau susiduriame su elemento variacijomis, o seka nurodoma kaip konsensusas, pagal tai, koks nukleotidas kiekvienoje padtyje yra vyraujantis. Taiau kaip patikimas priimamas nukleotidas, kurio danis atitinkamoje padtyje virija 54 %. Maesnio danio, bet vyraujantis nukleotidas nurodomas maja raide, o jeigu dviej nukleotid pasiskirstymas atitinkamoje sekos padtyje yra madaug vienodas, nurodomi abu nukleotidai (pvz., A/T, T/C ir pan.). Gali bti, kad konkreioje padtyje nra vyraujanio nukleotido, toki padt ymi N. Kuo daugiau organizm, kuriems galioja nustatyto elemento ar apskritai geno homologija, tuo didesnis elemento ar geno konservatyvumas, tuo gilesns jo kilms aknys. Pvz., TATA elementas aptinkamas vis tirt organizm genuose, bet sitikinome, kad ne visuose genuose. Nedaug, bet varijuoja ir nukleotid sekos paiame TATA elemente. Vis tik pripastamas didelis, vienas i didiausi, jo konservatyvumas. Jeigu seka kartojasi vairiuose organizmuose ar funkcija susiet gen grupje, sprendiama apie jos svarb. Kai seka toje paioje geno dalyje kartojasi su variacijomis, ji vadinama motyvu. Tie patys statistins sek analizs principai vienodai taikomi visoms nukleotid sekoms, tarp j genams, judriesiems genomo elementams ir netgi genomams. Suprantama, atpainti atsikartojanias, reikmingas sekas, nustatyti j konsensus, konservatyvum ir evoliucinius ryius be kompiuterini program ir turting duomen bazi, nemanoma. Taiau btinos ir geros inios, gdiai ir analitiko gebjimai. Daug atradim dabar daroma in silico, t. y. kietajame diske. Taip, pvz., atrasta keletas judrij genomo element, apie kuriuos iki tol nebuvo inoma, taiau j gebjim judti teko rodyti genetiniais metodais. Kompiuterins analizs metodais pagal homologij nustatomi vairs elementai ir genai, j skaiius genome. Apie j koduojam
AUGAL GENETIKA

| 247

produkt paskirt irgi sprendiama i homologijos ir analogijos su inomais elementais ar genais. Taip galima nustatyti, kiek vairenio genome yra MYB ar MADS eim gen, o pagal atitinkam element buvim, pvz., ABRE (5-CCACGTGG-3) geno promotoriuje, kad jis valdomas hormono abscizo rgties, ar pan. Taiau konkreti funkcin geno ar elemento reikm, vieta ir pasireikimo laikas nustatomi kitais metodais.

Modulin promotoriaus sandara. Sukurtos specialios kompiuterins programos aptikti cis reguliacinius elementus: MEME, CONSESUS, DRAGON MOTIF BUILDER (DMB) ir kt. Duomenys apie promotorius kaupiami duomen bazse: Athena, Plant CARE, Plant Prom ir kt. Athena bazje 2005 m. jau buvo 30067 vairenio promotori. Bioinformatikai nurodo, kad promotoriuje vidutinikai turt bti 1516, o kitais duomenimis net iki 30 reikming cis element. Kita vertus, gausjant ini apie cis elementus, inyksta ribos tarp cis element, kurie yra paiame promotoriuje ir u jo rib, taip pat tarp cis element, kuri paskirtis skatinti geno raik (enhancerio), ir cis sek, dl kuri geno raika silpnja (sailenseri). To paties cis elemento reikm gali bti skirtinga, kaip tai yra jau mint TATA element -fazeolino gene arba CArG element AP3 gene. Funkcinius cis element skirtumus nulemia vairios prieastys: kaip ir kur isidst cis elementai promotoriuje ir u jo rib; koks TV jungiasi prie cis sekos: ar represorius, ar aktyvatorius; kokiais tarpusavio deriniais jungiasi TV ir kiti trans veikiantys veiksniai; ar susidars kompleksas sveikauja tik su vienu ar daugiau kaip vienu cis elementu. Labai daug ini apie promotoriaus funkcin sandar teikia gen ortolog i skirting augal ir gen paralog palyginimas to paties augalo genome. Prisiminkime, kad ortologas yra tapatus (homologinis) genas vairiuose organizmuose. Daugiau ar maiau gali skirtis jo nukleotid sekos, bet pakankamai didel yra ir j homologija. Paralogai yra duplikuoti genai tame paiame genome, danai dl mutacij gij skirting funkcin reikm. Palyginkime du ortologus genus ADH1, vien kukurz, o kit vairenio (5.12 pav., A). ADH1 genas koduoja augalui labai svarb ferment alkoholdehidrogenaz, skaidant alkohol, kuris daniausiai susidaro esant hipoksijai, kai trksta deguonies. Nors abu genai koduoja t pat ferment ir j promotoriuose yra toki pai cis element GC ir GT, j isidstymas, atstumas ir netgi kryptis nedidelje 4070 bp atkarpoje skiriasi: vairenio atsiranda papildomas G-elementas, kurio neturi kukurz ADH1 geno promotorius. Ir dar btina atkreipti dmes du elementus (5.12 pav., A), paymtus kaip MBS-1 ir MBS-2. Tai cis elementai, prie kuri jungiasi MYB eimos transkripcijos veiksniai. Jie i esms skiriasi: MBS2 yra dimeras, sudarytas i 2-j cis element, o MBS1 tik i vieno elemento. Matyt, tai nulemia skirting TV prisijungim, kai veikia skirtingi stres sukeliantys aplinkos veiksniai (r. toliau). Panas skirtumai nustatomi ir tarp kit gen ortolog ar netgi paralog. Tuo galime sitikinti dar kart pavelg 5.6 ir 5.7 paveikslus. AGAMOUS geno 2-ajame introne esantys CArG ir kiti elementai taip pat derinasi vairiais deriniais ir atstumais kaip moduliai. Taip sukuriama unikali promotoriaus funkcin sandara, bdinga konkreiam genui, nors is koduoja t pat arba beveik t pat baltym.
248 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.12 pav. Vairenio ir kukurzo alkoholdehidrogenazs ADH1 ortolog promotori palyginimas (A) ir vairenio ADH1 geno raikos reguliavimo pobdis, kai kinta aplinkos veiksniai (B):
rodyklmis parodytas cis elemento aktyvumas: aktyvus; slopinamas; kuo daugiau rodykli, tuo didesnis cis elemento aktyvumas arba, atvirkiai, slopinimas; didiausias reguliavimo pasireikimas, kai trys rodykls (A pagal F. U. Hoeren et al. Genetics. 1998. Vol. 149, P. 479490; B pagal R. Dolferus et al. Plant Physiology. 1994, Vol. 105, P. 10751087).

Kaip galjome sitikinti, modulin sandara bdinga ir reguliaciniams elementams, esantiems u promotoriaus rib, kitose geno dalyse, kaip tai yra 2-ajame AGAMOUS geno introne. Modulin reguliacini struktr sandara yra bdas sukurti geno unikalum genomo sistemoje. Moduliai isidsto vairia tvarka, atstumais, vairiose vietose ir vairiomis kryptimis. Skiriasi ir j skaiius promotoriuje ir kitose reguliacins paskirties struktrose, tarp j ir tose, kurios kontroliuoja geno raik po transkripcijos.
AUGAL GENETIKA

| 249

Sait-specifin mutagenez cis sek funkcins analizs metodas. Saitspecifin mutagenez yra puikus bdas nustatyti bet kurios nukleotid sekos, kad ir promotoriaus cis element funkcin reikm. Tai kryptingai valdomas mutacij gavimo bdas. Tiriamoje nukleotid sekoje gali bti padaryti vairs pakeitimai: viena nukleotid pora (ar visa seka) pakeista kita = pakaita, nukleotid pora (ar visa dominanti seka) paalinta = ikrita (delecija), terpta nukleotid pora arba itisa nukleotid seka = intarpas (insercija). Kaip pavyzd vl pasitelkime vairenio ADH1 gen (5.12 pav., B). Jo valdymas yra daugiaplanis. J suadina abscizo rgtis ir paprasiausias mechaninis augalo paeidimas, altis, dehidratacija ir, atvirkiai, padidintas vandens kiekis, ypa dirvoje. Genas pasireikia ir be suadinimo (indukcijos). Bet svarbiausias veiksnys yra hipoksija deguonies stoka. Kiti aplinkos veiksniai irgi gali, kad ir netiesiogiai, sukelti hipoksij, pvz., padidintas vandens kiekis dirvoje augalo akn lstelms. Tai dar viena io geno pasireikimo ypatyb: genas suadinamas ne visuose augalo audiniuose i karto, o matyt, tik tuose, kurie tiesiogiai kenia nuo mint stres sukeliani veiksni, kaip augalo aknys nuo deguonies stokos dl suplktos ar per daug lietos dirvos. Visa tai atsispindi geno promotoriaus sandaroje, kuri buvo nustatyta sait-specifins mutagenezs bdu. Remiantis juo ADH1 promotorius buvo padalintas keturis regionus (5.12 pav., B), kuri svarba geno atsakui vairius aplinkos veiksnius nevienoda. Tai vl nustatyta sait-specifins mutagenezs bdu. Kryptingos mutacijos padarytos vairiuose regionuose ir net j vietose (III ir IV region), ir stebta, kokios takos tai turs, kai yra skirtingos aplinkos slygos: altis, dehidracija, deguonies stoka ir pagaliau, kai genas veikia konstituciniu bdu (be indukcijos). Mutacijos I ar II regionuose geno raikai tirtomis slygomis neturjo didels takos. Ypatinga svarba nustatyta III ir IV region. Paaikjo, kad IV regionas apskritai labai svarbus geno raikai bet kokiomis aplinkybmis, o III regione esantys du G-elementai savitai reguliuoja geno raik, kai yra skirtingos aplinkos ir geno veikimo slygos. Konkreiai mutacijos G1 ir G2 elementuose iek tiek padidino geno raik, kai stokojama deguonies, bet labai padidjo geno raika be suadinimo, jeigu mutacijos vyk G2 elemente. Galima manyti, kad G1 ir ypa G2 elementai neleidia genui pereiti suadint reim. Mutacijos G1 elemente iek tiek padidino geno raik, kai buvo dehidratacija, bet visikai nekeit geno aktyvumo esant aliui. Kas kita, mutacijos G2 elemente. Jos labai stipriai slopino ADH1 geno raik, kai buvo dehidratacija ir ypa, kai buvo alta (5.12 pav., B). Vl galima daryti ivad, kad G2 elementas kontroliuoja ADH1 geno atsak dehidratacij ir alt. ADH1 genas tik vienas i daugelio, kurio funkcinei struktrai tirti panaudotas saitspecifins mutagenezs metodas. Pateiktas pavyzdys parodo, kaip jis taikomas.

5.4. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija

5.4.1. Bendras apibdinimas ir transkripcijos veiksni eimos Modulin sandara bdinga daugeliui transkripcijos veiksni (TV), kurie sudaryti i domen, arba daugybines funkcijas atlieka trans-veikiani baltym kompleksas. Pagrindiniai yra du domenai: DB (arba DBD) (nuo DNA Binding Domain), kuriuo TV atpasta bding cis element (nukleotid sek) ir su ja jungiasi;
250 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

AD (Activation Domain), kuriuo palaikomas ryys su transkripcijos iniciacijos kompleksu ir RNR polimeraze. Tipikas visavertis TV sudarytas i keli domen. Be jau mint DB ir AD, jame dar yra: signalini molekuli prisijungimo vietos/domenas, bdingas tiems TV, kuri veikla suadinama signalini molekuli (hormon) ir aplinkos veiksni; oligomerizacijos domenas(-ai), bdingas tiems TV, kurie veikia ne kaip monomeras, o sudaro kompleksus su kitais trans-veikianiais veiksniais, tarp j ir su kitais TV, pagal tai skiriami homo- ir hetero- dimerai, tetramerai = homo- ir hetero- oligomerai; homo sudaryti i tapai baltym, o hetero i skirting, pvz., iedo organ raid kontroliuojantis kvartetas sudarytas i 23- skirting baltym; NLS (nuo Nuclear Location Signal) tai aminorgi sekos, kurios reguliuoja jau subrendusio baltymo perna branduol. Prisiminkime, visi baltymai sintetinami citoplazmoje ir visi branduolio baltymai turi bti gabenami branduol. Be to, jie turi bti patalpinti reikiamoje vietoje, tam tikroje branduolio srityje. Augal tai kol kas maai itirta. TV koduojantys genai irgi yra valdomi. Susidaro TV kaskada: aukiau esantis (prie srov) genas valdo emiau kaskadoje esanius genus (pasroviui). Gana danai prie juos koduojanio geno jungiasi netgi tokios pat eimos TV. Kaip ir kiti genai, TV genai valdomi visais lygmenimis: transkripcijos, transkripto brendimo, pernaos citoplazm ir kt. bdais. Patys TV gali bti modifikuojami, daniausiai fosforilinami. Pvz., kukurz (miglini) Opaque 2 TV jungiasi su DNR tik nefosforilintas. domiausia tai, kad Q2 fosforilinimas sustiprja dien, o susilpnja nakt. Tad atsargini grdo baltym sintez stipriau vyksta nakt. Daug baltym yra perneami branduol tik tada, kai yra modifikuoti. Branduolio por kompleksas atlieka sieto vaidmen du kartus: reguliuoja transkripto ijim citoplazm; baltymo patekim branduol. Daug TV turi ne vien, o du ir daugiau NLS. Pvz., kukurz HD eimos TV Hox2a ir 2b turi net 8 NLS. Jie isirikiav vien grandin i TV N-gale. Kai kurie TV, tarp j kviei KNOTTED1 ir kukurz Opaque 2, turi du skirtingos funkcijos NLS. Taip kontroliuojamas i TV patekimas branduol. NLS nepriklauso nuo DB domeno. Mai baltymai gali neturti NLS ar kit moduli, tada i funkcij atlieka kiti baltymai. Tai irgi papildomas bdas laike ir vietoje reguliuoti geno pasireikim. Pasitaiko ir sudtingesni atvej. Kai kurie TV nepraleidiami branduol tol, kol nesusidaro dimeras ar oligomeras arba, atvirkiai, kol nuo TV neatsiskiria prisijungs kofaktorius. Taip vadinami visi veiksniai, kurie tiesiogiai nesijungia su DNR, bet veikia TV pasireikim. Pvz., du MADS eimos TV APETALA ir PISTILLATA, kurie priklauso iedo organ raidos vad. B klasei (takoja vainiklapi ir kuokeli raid) sudaro heterodimer dar citoplazmoje, ir kol to neatsitinka, jie branduol nepatenka. TV oligomerizacija, kofaktoriai, moduli derinys nulemia atskir TV iskirtinum, individual pasireikim, nors palyginti yra maas sudedamj dali skaiius.

AUGAL GENETIKA

| 251

Kofaktoriai daniausiai neturi DB domeno, bet turi domenus sveikai baltymasbaltymas. Jie irgi priklauso trans veikiani veiksni grupei. Kaip pirminis metodas aptikti kofaktorius ir paius TV, daniausiai naudojama mieli dihibridin sistema (5.4 intarpas).
5.4 intarpas. Trans veikiani veiksni tyrimas mieli dihibridine sistema ir jos modifikacijomis Dauguma trans-veikiani veiksni (ne tik TV, bet ir vairi kit baltym) yra sudaryti i moduli (domen). Tuo pagrsta mieli Saccharomyces cerevisiae dihibridin sistema ir jos modifikacijos. Tai priklauso, kokio grobio tikimasi: dihibridin sistema (pagrindin). Tiriama sveika baltymas-baltymas, nustatomi baltymai, kurie sveikauja vienas su kitu (pvz., vienas TV, o kitas aktyvatorius-tarpininkas tarp TV ir RNR polimerazs); monohibridine sistema pagaunamas baltymas, kuris jungiasi su DNR (yra TV); trihibridine sistema tiriama sveika RNR-baltymas, t. y. pagaunami baltymai, kurie turi RDB domen ir jungiasi su RNR. Pirmajai mieli dihibridinei sistemai sukurti pasinaudota GAL4 geno koduojamu baltymu; jis turi du domenus: BD juo baltymas jungiasi su DNR, o taip pat aktyvacijos domen AD. Juo baltymas jungiasi su II RNR polimeraze (sveika baltymas-baltymas). BD funkcijai utenka 65100 aminorgi. GAL-4 baltymo N gale. Kaip reporteris, danai naudojamas lacZ genas, kuris koduoja -galaktozidaz. Ji aptinkama pagal spalvin reakcij. Sistemoje GAL4 geno koduojanti dalis padalinama dvi dalis: vienoje lieka BD; kitoje AD domenus koduojanios sekos. Toks padalintas genas neveiksnus, ir atskirai paimtos GAL4 TV dalys neaktyvina reporterio geno. X Y Konstruojamos dvi hibridins plazmids: Plazmid BD Plazmid AD vienoje j terpta GAL4 geno dalis, grobis jaukas koduojanti BD. Ji suliejama su tiriamojo baltymo koduojania geno dalimi, vadinamuoju jauku (angl. bait) (X). Jo sveik su kitais baltyX Y AD BD mais ir norima itirti; kitoje plazmidje yra GAL4 geno AD dalis, sulieta su genu, kuris koduoja baltym laukiam grob (angl. X Y AD prey) (Y), bet gali bti vadinamas ir BD Transkripcijos uvimi (angl. fish) (irgi ukimba ant sistema Genas reporteris ,,jauko). Abu hibridiniai baltymai ekspresuojami vienoje lstelje, ir grobis paklius tik tada, jeigu X jungsis su Y ( pasireik sveika baltymas-baltymas) ir tuo paiu susijungs BD ir AD. Tik esant tokiai slygai pasireikia reporteris. Arba kitaip, reporterio raika parodo, kad tiriamieji baltymai jungiasi vienas su kitu. Paprastai grobis bna ne toks jau didelis, nors pasiruoiama ir bandoma daug hibridini gen su GAL4 geno AD dalimi. iuo metodu nustatoma ne tik sveika baltymas-baltymas tarp to paties genomo trans veikiani veiksni, bet ir funkciniai ortologai kituose genomuose. Vairenio jaukas gali tikti grobiui i kit augal. iuo bdu iaikinti baltymai (ir juos koduojantys genai), kurie svei252 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

kauja su AP3 baltymu petunijos (Petunia) arba ioveinio (Antirrhinum) genomuose. Kai grobiu yra baltymas, kuris jungiasi su DNR, atpaindamas cis sekas, jaukas yra atitinkamas promotorius su cis elementu, o grobis baltymas, kuris jungiasi su iuo elementu. Tad konstruoti tenka tik vien chimerin gen. Metodas ne visiems baltymams pritaikomas, gali gautis neteisingi rezultatai. tai atsivelgiama, todl taikomi ir kiti metodai sveikoms DNR- baltymas, RNR-baltymas ir baltymas-baltymas tirti. (Pagal B. Causller. Mass Spectrometry Reviews. 2003, Vol. 23, P. 350367).

DB domenai. TV eimos. Daug DB domen yra labai konservatyvs, todl bendri visiems eukariotams (5.2 lentel), taiau, kaip pastebjote, yra tik augalams bding TV eim.
5.2 lentel. Kai kuri transkripcijos veiksni skaiiaus palyginimas vairi organizm genomuose Transkripcijos veiksni eima Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis Drosophila Homo Arabidopsis elegans melanogaster sapiens thaliana

HD 127 267 148 109 9 (homeodomeno) 243 32 18 17 15 MYB 157 131 81 25 71 bZIP 281-353 297 148 121 Zn ,,pirteli 153 131 84 41 8 bHLH 116 2 2 4 MADS 155 0 0 0 0 AP2/EREBP 108 0 0 0 0 NAC Skaiiai yra gana santykiniai, remiantis keliais altiniais [J. L. Riechmann et al. Science. 2000. Vol. 290, P. 21052110; G. A. Wray et al. Molecular Biology and Evoliution. 2003, Vol..20, P. 13771419; K. Iida et al. DNA Research. 2005, Vol. 12, P. 247256; G. Toledo-Ortiz et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 17491770], ne visikai sutampantys, keiiasi su isamesniais genom tyrimais; ypa nepatikimi skaiiai, nes Zn ,,pirtelieima dalijasi kelet smulkesni eim (r. 5.3 lentel) Komentarai: a akivaizdus skirtumas tarp vienalsi mieli ir daugialsi organizm; b suklestjusios MADS, MYB, AP2/EREBP, NAC eimos augal genome; c apskritai didesnis transkripcijos veiksni skaiius augalo genome.

Transkripcijos veiksniai skirstomi pagal tai, kaip jie jungiasi su DNR, kokius cis elementus atpasta j DB domenas ir kokias gen grupes jie kontroliuoja. Pagal sveik su DNR ir erdvin DB sandar skiriami keli TV tipai, tarp j daniausi (5.13 pav.): Spiral-poskis-spiral, arba kitaip HTH (nuo Helix-Turn-Helix) iam tipui priklauso ir HD eima su keliais poeimiais (r. 3.3 intarp). Cinko pirteli motyvas su DNR sveikaujama cinko pirteliais, sudaro kelet eim, kurios skiriasi pagal pirteli skaii, sandar ir papildomas aminorgi sekas, pvz., WRKY (5.3 lentel). Kai kurios eimos unikalios, bdingos tik augalams, pvz., DOF (nuo DNA-binding with One Finger) tik su vienu Zn pirteliu. Taiau yra didel grup baltym, kuriems bdinga cinko pirteli sandara, o paskirtis kita - sveika baltymas-baltymas, tarp j daug baltym, kurie yra E3 ubikvitinligazs komplekso dalis, tarp j RING domen turintys baltymai (r. 2.7 intarp).
| 253

AUGAL GENETIKA

OOC OOC

5.13 pav. vairs transkripcijos veiksniai ir j sveikos su DNR modeliai: L leucinas.

Leucino utrauktuko motyvas, arba kitaip bZIP (nuo basic leucine-rich ZIpper-like Protein), yra i dviej lygiagrei polipeptid, kuri kiekviename reguliariai isidst Leu liekanos sudaro tarp polipeptid darin, pana utrauktuk, o bazinis domenas btinas polipeptid dimerizacijai. Spiral-kilpa-spiral arba kitaip bHLH (nuo Helix-Loop-Helix) domene skiriamos dvi dalys N-galu jungiamasi su DNR, o C-galas yra dimerizacijos, viso apie 60 aminorgi, poeimiai skiriasi jungimusi prie skirting cis element (G-box, E-box, N-box, non-E-box). MYB, arba kitaip HHTH, turi 5152 aminorgi ilgio kartotin domen (r. 3.4 intarp), kurio sandara spiral-spiral-poskis-spiral. Skiriasi pagal kartotini MYB sek skaii: nuo 3- (kaip gyvn), augal daniausiai 2, bet bna ir vienas. Labai suvejusi augal genomuose supereima (5.2 lentel). MADS TV dar viena suvejusi augal genome TV supereima (5.2 lentel). Domenas sudarytas i vienos ilgos -spirals ir 2- -grandini. Sveikauja su vadinamuoju. CArG elementu, daniausiai CC(A/T)6 GG (5.5 intarpas), keiia DNR erdvin sandar (juostas).

254 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.3 lentel. TV pltra magnolijn genome lyginant su aliadumbliais TV eima

ABI3/VP1 AP2/EREBP ARF bHLH bZIP C2C2-Co like C2C2-Dof C2C2-GATA C2C2-YABBY C2C2 C3H WRKY GRAS ND zf-HD MADS MYB MYB-related NAC Trihelix TUB

(pagal D. M. Riano-Pachon, I. Dreyer, S Ruzicic, B. M. Mueller-Roeber: diriano, dreyer, ruzic, bmr@uni- potsdam.de)

O. tauri
0 8 0 1 8 1 1 3 0 4 19 3 0 6 0 1 11 15 0 0 1

C. reinhardtii
1 10 0 4 7 1 1 7 0 4 14 1 0 1 0 2 11 14 0 0 2

A. thaliana
59 155 31 153 88 19 42 30 5 104 71 82 34 94 16 116 156 81 108 26 12

P. trichocarpa
85 207 37 165 83 15 41 39 12 134 98 101 99 126 23 101 195 106 163 43 11

O. sativa
57 172 36 163 102 21 33 33 11 109 90 109 54 112 15 80 125 94 139 21 17

Fone vairios Zn pirteli eimos; ABI3 abscizo rgties atsako; ARF auksino atsako; TUB citoskeleto transkripcijos veiksniai. Genomai: aliadumbli Ostreococcus tauri ir Chlamydomonas reinhardtii; vairenio (Arabidopsis thaliana), trivaiss tuopos (Populus trichocarpa); sjamojo ryio (Oryza sativa). Vis augal genomai sekvenuoti.

AP2/EREBP domen turintys TV. Domenas (68 aminorgi) sudaro amfifilin -spiral (viena dalis yra hidrofilin, o kita hidrofobin).
5.5 intarpas. MADS transkripcijos veiksniai valdo ne tik iedo organ raid I ties MADS domen turintys transkripcijos veiksniai (TV) valdo ne tik ABCDE funkcijas, bet ir kitus svarbius augalo raidos vykius: -iedyno ir iedo meristem susidarym, APETALA1, CAULIFLOWER, FRUITFULL genai kontroliuoja iedyno sandar reguliuodami du ne-MADS genus LEAFY ir TERMINAL FLOWER; SOC1 (SUPPRESSION OF OVER-EXPRESSION OF CONSTANS, arba AGL20), reguliuoja ydjimo pradios/fotoperiodizmo ir cirkadin (diena-naktis) gen CONSTANS; lsteli tipo specifikacij: SHATTERPROOF 1 ir 2 koduoja veiksn, kuris nulemia vaisi atsiskyrimo zonos lsteles, FRUITFULL yra btinas lsteli dalijimuisi, ekspansijai ir diferenciacijai lapuose ir iedyne; ydjimo pradi reguliuoja FLC (FLOWERING C) genas; keletas gen kontroliuoja akn raid, ANR1 onini akn susidarym kaip atsak N (azot) ir kt. MADS TV koduojantys genai pagal skaii vairenio genome yra vieni i gausiausi. domen
AUGAL GENETIKA

| 255

koduojanias nukleotid sekas turi per 100 vairenio gen. MADS pavadinimas kils i 4-ri gen (be to, i skirting organizm) pirmj raidi MCM1 mieli Minichromosome Maintenance1 = feromon atsako/lsteli ciklo genas; AG vairenio AGAMOUS = lytini organ identiteto; DEF ioveinio (Antirrhinum majus) DEFICIENS = ortologas AP3 genui; SRF induoli Serum Response Factor = kraujo serumo (cirkadinio ritmo) veiksnio genas. Labai akivaizdi intensyvi MADS domen turini gen evoliucija augal genomuose. Ne tik pagal didel gen skaii (r. 4.2 lentel), bet ir pagal TV sandar. Augal MADS TV skirstomi du tipus: II tipo MADS baltymai N-gale turi MADS domen ir I rajon, taip pat K-box, baigiasi C-domenu, todl io tipo genai/baltymai dar vadinami MIKS-MADS: I yra tarpininkas (Intermediate) ir K yra panaus gyvn citoskeleto baltym keratin. Abu ie domenai reikalingi sveikai baltymas-baltymas, nes MADS TV sudaro multimerinius kompleksus. C-gale yra transaktyvinimo domenas. Jis nra toks konservatyvus kaip kiti domenai; I tipo MADS baltymai neturi I ir K rajon. Augaluose io tipo MADS funkcijos aptiktos visai neseniai. domu tai, kad II tipo MADS baltymai yra iimtinai augal genome:
SRF (gyvnai ir grybai) MADS SAM

I tipas (augalai) MEF2 (gyvnai ir grybai)

MADS

MADS

MEF2

II tipas (augalai)

MADS

ia MEF2 (Myocite enhancer factor 2); SRF ir. aukiau. iedo tapatumo genai (ABCE klasi) koduoja antrojo tipo MADS TV. Augal MADS TV, kaip ir gyvn ar gryb, jungiasi prie DNR nukleotid sekos, kurios konsensusas yra CC(A/T)6GG, vadinamas CArG-box(cis) elementu. Tai tik konsensusas. vairi TV MADS domenas atpasta gerokai besiskirianias sekas. i seka i vairi augal ir gen iek tiek skiriasi. Antai vaisi ir gametofito raid reguliuojantis TV AGL15 (AGAMOUS-LIKE15) atpasta DNR sekas TAGCTATATAATGTTG arba TATCTATTTATTGATT, arba CCTCCAAATGTGGCAA . Ypa pastebimai skiriasi kaimynins CArG elementui sekos. Gali bti, kad kaip tik jos nulemia skirtumus tarp augalo ekotip, to paties geno pasireikim skirtingu laiku ir skirtingoje vietoje. Dar viena i TV savito pasireikimo prieastis yra baltym dimerizacija ir oligomerizacija. MADS domen turintys TV sudaro dimerinius ir multimerinius kompleksus. Tyrimais nustatyta, kad gali bti bent 269 dimer dariniai, o iedo organ identitet lemia kvartetai: keturi baltym kompleksai. Sveikos su valdomais genais savitum nulemia ir kompleksai su kitais, ne MADS TV tipo, veiksniais. Vien tik AGAMOUS tiesiogiai arba netiesiogiai valdo bent 200 gen. Tai genai, kurie koduoja signal perdavimo baltymus, kitus TV, struktrinius baltymus, ir -tubulinus. domu tai, kad
256 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

MADS TV gali sveikauti su juos paius koduojani gen promotoriais. Tokia savire

guliacija nustatyta, pvz., B grups MADS genams GLOBOSA, DEFCIENS ioveinio (A. majus) genome; savireguliacija nustatyta ir AGL15 genui; vien MADS TV taikiniu yra kiti MADS TV koduojantys genai, kad ir daug kart mintas genas SPOROCYTELESS. Jis lemia gametogenez ir yra AGAMOUS MADS TV taikinys. AG TV taip pat jungiasi su kit MADS TV koduojani gen SEPALLATA 3 (SEP 3), AP3 (APETALA3), PISTILLATA (PI) promotoriais.

Daugelis tik augalams bding TV yra atsirad i bendr DB (HTH, ZIP, HLH) tik su papildomomis sekomis, pvz., SHAQK(Y/F)F ar WRKY, arba MYB su skirtingu kartotini domen skaiiumi ir pan.Vienas TV gali turti ne vien DB domen. Gausios NAC supereimos (5.2 lentel) TV gali atpainti ne vien cis element, tarp j CATGTG sek, bding atsak abiotinius stresus genams. Taiau NAC TV kontroliuoja labai skirtingus procesus ir reikinius. Tai parodo net eimos pavadinimo kilm. Ji i 3- skirtingus procesus kontroliuojani gen: N i geno NO APICAL MERISTEM(NAM), mutantas nam yra letalus, visikai nesusidaro virnin meristema; A i ATAF1-2 (streso atsako) gen, o C i CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON2). Mutant cuc2 skilialapiai panas puodel. NAC genai kontroliuoja ydjimo genus. Tokia kontroliuojam gen vairov yra todl, kad NAC eimos TV yra dimeras ir gali susidaryti homo- ar heterodimerai. Padidja galimybs atpainti cis elementus. DB pagrind sudaro apie 60 aminorgi HTH, bet visas DB yra apie 160 aminorgi ir dalijasi 5 subdomenus. Dimer sudaro monomerai su antiparalelinmis grandinmis, viena ilgesn, kita trumpesn. Taip sukuriama unikali NAC DB sandara. Dar vienas ios eimos kai kuri TV ypatumas: apie 10 % NAC TV susieti su membrana. Tai j aktyvinimo bdas (r. toliau). Gausi cinko pirteli TV eim (C2H2, CBH, WRKY) grup skiria vairi cinko pirteli sandara. Be to, kaip minta,WRKY eimos TV turi bding aminorgi sek WRKYGQK, nuo kurios pirmj aminorgi kil eimos (5.3 lentel) ir W-box cis elemento (5.1 lentel), kur atpasta WRKY eimos TV, pavadinimai. Ne tokia unikali, kaip anksiau manyta, bet irgi gausi augal genomuose yra AP2/EREBP eima (5.2 lentel). Jos neaptikta nei mieli, nei gyvn lstelse, taiau skm prklauso, kur iekoti. ios eimos TV aptikta pirmuoni, tarp j itin gerai itirtos Tetrahymena termophila, melsvabakterij (pvz., Trichodesmium erythraeum), virus (Bacteriophage Felix 01) genomuose. Spjama, kad augal genomus iuos TV koduojantys genai pakliuvo horizontaliosios rekombinacijos bdu, t. y. perneti i vieno genomo kit. Gana daug ios TV eimos gen yra tirt aliadumbli genomuose (5.3 lentel), i kuri kildinami augalai. Tad horizontaliosios rekombinacijos vykis turjo bti prie pai augal kilms itak. Kai kurias TV eimas, kurios unikalios arba labai suvejusios augalo genome, beveik tiesiogiai galima susieti su konkreiu reikiniu ar procesu. Taip MADS TV daniausiai kontroliuoja augalo organ raid. Tada suprantamas ir ios eimos suvejimas: augalo organai visikai skiriasi nuo kit organizm (gyvn) organ. J raidai kontroliuoti HD TV, kurie bdingi gyvn organ raidai, augalams netiko. Savitas krvis augalo gyvenime tenka ir AP2/EREBP eimos TV. Kaip rodo antroji pavadinimo dalis, ios eimos TV kontroliuoja atsak hormon etilen: EREBP (nuo
AUGAL GENETIKA

| 257

Ethylene REsponsive Binding Protein). Etilenas kontroliuoja augalo vaisi brendim, atsakus biotinius (vadinamj jazmin rgties/etileno keli) ir abiotinius stresus. Nuo j augalo gyvenimas labai priklausomas. I viso augalo genome aptikta per 30 TV eim ir vis dar atrandamos naujos TV eimos. Ne visos j vienodai gausios. Tarp neseniai atrast yra ir GRAS eima. eimos pavadinimas kils i trij pirmj gen, kuriuose buvo aptiktas GRAS DB domenas (GAI, RGA, SCR), pirmj raidi. GRAS genai kontroliuoja augalo-bakterijos simbioz pupini (Fabaceae) eimos augaluose, akn gumbeli genus NOD, taiau visikai neseniai GRAS TV aptikti ir ne pupini . augaluose. GRAS TV kontroliuoja akn lsteli raid. TV duomen bazs. Kaip ir cis elementams, yra centrai, kurie kaupia inias apie augal TV. Daniausiai duomen bazs yra bendros TV ir cis elementams, ir tai suprantama. Tokios bazs yra Plant CARE, PLACE, TRANSFAC. Yra ir tik vieno augalo TV duomen bazs, pvz., vairenio AGRIS (http://Arabidopsis.med.ohio-state.edu), ryi RARTF (http://rarge.gsc.riken.jp/rartf) ir kt. Ryi atskirai sekvenuoti poriai (Oryza sativa subsp. japonica ir O. sativa subsp. indica) ir kaupiamos atskiros j duomen bazs. TV gen ekspansija (pltra) augalo genome. i augal genomo ypatyb jau buvo atkreiptas dmesys. I dalies (per atskir TV eim suvejim) aptartos ir to prieastys. Viena j - visikai neturintys analog augal organai. Kas kita tokios gyvybins funkcijos kaip DNR, RNR, baltym ir netgi daugelio nepolimerini jungini sintez, lstels kvpavimas ir pan. Jos daugiau ar maiau bendros visiems lstelins sandaros organizmams, todl apie 45 % vis vairenio TV koduojani gen turi ortologus gyvn genomuose. Kita vertus, bendra TV koduojani gen dalis augalo (vairenio, ryio ar tuopos) genomuose yra pastebimai didesn negu gyvn genomuose. Pagal jau palyginti senokai (2000 m.) paskelbt, bet dar danai cituojam kaip bazin vairenio genomui J. L. Riechmann et al. straipsn, vairenio genome yra per 1500 TV koduojani gen, ir j dalis tarp baltymus koduojani gen sudaro 4,5 %, o mogaus ir nematodo Caenorhabditis elegans 3,5 %. Pagal vien paskutinio meto tyrim (K. Iida et al., 2005), vairenio genome yra bent 1968 TV genai, o j dalis yra 7,4 % baltymus koduojani gen. domu tai, kad mieli Saccharomyces cerevisiae, kurios pasirenkamos kaip ieitins eukariot genomo evoliucijai, TV koduojantys genai sudaro 7,5%. Taiau augalai kildinami i aliadumbli, o i genome TV genai tarp baltymus koduojani gen sudaro neymi dal. TV sudaro tik apie 1 % Ostreococcus tauri arba 1,5 % Chlamydomonas reinhardtii proteom (baltym visumos; 5.14 pav.) Labai akivaizds skirtumai tarp olini augal vairenio arba ryio proteom ir medio plaukuotvaiss tuopos (Populus trichocarpa) proteomo. Medio gyvenimas kur kas sudtingesnis: bent jau lapus keiia ir iedus krauna kasmet. Taip pat kasmet keiiasi gen, kurie reguliuoja augim, bendr metabolizm raika. Tad ios tuopos proteome nustatyti net 2467 TV, bet jie sudaro tik 4,3 % nuo bendro baltym skaiiaus, nes ir bendras baltym skaiius kur kas didesnis 58036 (palyginti. su 30690 baltym vairenio proteome). Sjamojo ryio proteome TV dalis dar maesn tik 3,4%. Keista, bet ryio proteome nustatyti net 62827 skirtingi baltymai. Labai akivaizdu, kad augal genomas ir proteomas toli paeng nuo dumbli, kuri genomuose (5.14 pav.) i viso nustatyti tik 122158 TV (1,51,04%).

258 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Proteomas TV sk. TV %

5.14 pav. Transkripcijos veiksni (TV) bendrojo skaiiaus palyginimas vairi augal ir aliadumbli proteomuose:
Proteomas bendras koduojam baltym skaiius; TV sk. ir TV % transkripcijos veiksni skaiius ir procentas. Tirti organizmai (i kairs dein): dumbliai Ostreococcus tauri ir Chlamydomonas reinhardtii; augalai vairenis (Arabidopsis thaliana), plaukuotvais tuopa (Populus trichocarpa) ir ryis (Oryza sativa) (pagal D.M.Riano-Pachon et al. Plant Transcription Factors @uni-potsdam.de).

TV koduojani gen pltros prieastys augalo genome. Prieasi pltrai yra labai daug, netgi savit konkretaus geno evoliucijai, tarp j: augalo morfogenez nesibaigia gemalo raida kaip induoli, be to, poembrionin augalo raida priklauso nuo daugybs aplinkos signal: viesos (fotomorfogenez ir fotoperiodizmas), temperatros (vernalizacija) ir kit j valdomiems genams yra saviti TV; daug TV reikia meristem raidai, diferenciacijai, pvz., iedyno, iedo, lateralins, glio ir akn virnins, kita vertus, btinas i meristem isaugojimas gyvn genome toki problem nra; kaip minta, visikai skirtingi augalo organai; tarp j daugyb atsikartojani onini (lateralini ak, lap, akn) ir virnini (apikalini iedyno dali, ied, netgi apikalins meristemos glio virnje) organ ir struktr; ie gen pasireikimai vl siejasi su sezoniniais vykiais: medi lapkritys ruden ir atgijs augimas pavasar visa tai kontroliuojama TV; daugybei atsak vairius aplinkos veiksnius reikalinga sudtinga geno promotoriaus modulin sandara ir gausyb atsakus kontroliuojani TV; komplikuota viso augalo (sistemin) proces, atsak kontrol ir signal perdavimo sistema, tam reikalinga papildom gen ir kas juos reguliuoja TV. 5.4.3. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija. Dirbtiniai transkripcijos veiksniai ems kio augalai dl trumpos j istorijos (civilizacijos pradios prie 1500010000 met) yra puikus modelis tirti ries ir atskir gen, kurie skiria ems kio augal nuo jo laukini giminaii, atsiradimo mechanizmus. Tuo jau galjome sitikinti palygin atsarginius baltymus koduojani gen evoliucij su kviei ri evoliucija (r. 4.2.2 sk., ir 4.4 pav.). Naujai atsiradusi mutacija (nukleotid pakaita, ikrita ar intarpas) arba rekombinacija geno viduje yra tik naujo geno istorijos pradia. Naujas genas turi sirayti jau egzisAUGAL GENETIKA

| 259

tuojani gen sistem, ir, jeigu tai vyksta skmingai, gene ta paia kryptimi kaupiasi naujos mutacijos, nes danai genas nuo savo pirmtak yra nutols anaiptol ne pagal vien nukleotid por. iuo metu pakankamai pagrstai rodyta, kad postmis daugeliui genomo pertvarkos vyki ir nauj gen atsiradimui, yra transkripcijos veiksni konfliktas, kuris atsiranda tolimuosiuose hibriduose, naujuose poliploiduose ar vykus takinei mutacijai. Reguliacins geno dalies evoliucija. Doublio ri atsiradimo teorija. Aminorgi seka baltyme, o tuo paiu j koduojanti geno dalis, kinta labai ltai. Baltymo evoliucija matuojama evoliucijos periodo vienetais (EPV). Tai laiko tarpsnis per kur baltymo aminorgi sudtis pasikeiia 1 %. Tai tiek ltas reikinys, kad jis ireikiamas milijonais met. Visai kas kita DNR sek kitimai, bet jie arba neutrals kodono treiajame nukleotide, arba nekoduojaniose aminorgi geno dalyse (reguliacinje, intronuose, UTR). Doublis (J. Dobley) tikinamai rod, kad naujai riai ar poriui atsirasti visikai nebtini dideli viso genomo pokyiai, kokie vyko dl kviei tolimosios hibridizacijos/poliploidijos. Utenka pasikeisti 57 pagrindiniams kontrols (master) genams, kurie kontroliuoja augalo raid. Doublio idjos perjo ir kit organizm evoliucin genetik. Jos leidia paaikinti netgi t padt, kuri atsirado, kai buvo nustatyta, kad mogaus DNR nuo impanzs skiriasi tik 1 %, o morfologijos ir ypa nervins veiklos/proto skirtumai tarp j yra didiuliai. i padtis atrodo kuriozikai, kai net dviej varls Xenopus ri X.laevis ir X. borealis DNR skiriasi 1520 %. I ko kils kukurzas? Bent kukurzams Doublis ir jo bendradarbiai rod, kad skirtumus tarp teosinte ir kukurzo lemia 5-7 pagrindiniai (master) genai, ir kad didiausi pokyiai vyk i gen reguliacinje dalyje. Kukurzas kils neseniai, prie 10000 (o kai kurie tyrintojai teigia, kad tik prie 5000 met) i laukini pirmtak, kuriuos Meksikos indnai vadina teosinte. Apie kukurzo evoliucijos tempus galima sprsti ir i archeologini tyrim. Zea parviglumis, i kurios kildinamas kukurzas, turi tik 2 cm ilgio burbuoles, bet prie 5000 met jau aptiktos kukurzo burbuols 7 cm ilgio, o per pastaruosius 3000 met burbuoli ilgis padidjo 50 kart. Botanikai dl kukurzo kilms nra vieningi. Vieni mano, kad Zea mays L. yra vienintel ris Zea gentyje, o teosinte skiria atskir gent Euchlaena, kiti atskiras Zea ris, bet ne dvi, o daugiau. Pagal H. H. Iltis ir J. Dobley (2003) teosinte yra Z. mays poriai (i viso j bent 4), nors ir labai skiriasi nuo kukurzo. Kiti poriai lengvai kryminasi su Z. mays ssp. mays (5.15 pav.) Tai ir yra svarbiausias argumentas skirti teosinte Z. mays porius. Manoma, kad kukurzas kils i Z. mays ssp. parviglumis, kuris iki iol auga kalnuotoje Meksikos vietovje MeTeosinte (i ia kils teosinte pavadinimas). Gen, kurie lemia skirtumus tarp teosinte ir kukurzo, aminorgtis koduojanti dalis beveik nesiskiria. I esms ie genai skiriasi tik reguliacine dalimi (5.15 pav.). Duplikacijos ir gen evoliucija. Pripaintas mechanizmas atsirasti naujiems genams, tarp j ir koduojantiems TV, yra duplikacijos. Dl j atsiranda paralogai, todl apie duplikacijas, kaip prieast atsirasti TV, sprendiama i gen paralog skaiiaus. Pagal S-H. Shin et al. (2005), i 582 tirt TV gen paralogus turjo 25 % vairenio ir 27 % ryio gen. Visi konkrei TV eim koduojantys genai yra paralogai, kil dl poliploidijos (viso genomo duplikacijos) arba pavieni lokus duplikacij. Pastarosios sukuria slygas keistis genetine mediaga (DNR) lokuse, netolygiam krosingoveriui.

260 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

B 5.15 pav. Kukurzo ir teosinte varpos (burbuols, A) ir geno Teosinte Branched (B) palyginimas:

A. Kukurzo stambi burbuol, o teosinte akotas stiebas ir ant iedstiebi daug smulki varpui. Stiebo akojimsi lemia Teosinte Branched1 (TB1) genas. B. Palyginti teosinte ir kukurzo TB1 genai. Koduojanioje j dalyje panaumas siekia 70 %, o reguliacinje tik 2 %; 5-NTR netranskribuojamoji geno dalis (pagal J. Dobley. Annual Review of Genetics. 2004. Vol. 38, P. 3759)

Gen/moduli ir j dali suliejimas dar vienas bdas atsirasti naujiems TV. Manoma, kad taip atsirado trihelix TV eima. Viename jos domen yra susijung vien trys spirals. Spjama, kad vyko viena paskui kit dvi duplikacijos, o paskui susiliejimo vietoje prarastas antrasis intronas (5.16 pav.). Papildomai vyko 5- ir 3-gal divergencija.

5.16 pav. Nauj transkripcijos veiksni evoliucija. Trihelix atsiradimas susiliejant geno dalims, kurios koduoja H1-H2-H3 spirales

(pagal J. Smalle et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1998, Vol. 95, P. 33183322)

AUGAL GENETIKA

| 261

Intron praradimas, atskir geno dali susiliejimas yra gana dani bdai atsirasti naujiems genams, tarp j ir koduojantiems TV. Dirbtiniai TV. Jeigu gamta sujung ZIP domen su HD domenu ir atsirado HDZIP TV eima arba prie HD prijung Zn ,,pirteli domen ir atsirado HD-pirto (PHD finger) eima (r. 3.3 intarp), tai kodl mogui, perpratusiam galingas gen ininerijos priemones, nepabandius konstruoti naujus TV. Daniausiai prijungiama geno dalis, koduojanti TV sveik su specifiniu ligandu arba savitas sveikas lemiant aktyvacijos domen. Hormono signal paprastai priima specials baltymai-receptoriai. Tam tikslui jie turi savit domen. Jeigu domen koduojanti geno dalis prijungiama prie kurio nors TV geno, jo koduojamas rekombinantinis baltymas jungsis su hormonu (ligandu) ir bus jo aktyvinamas. Taip galima kontroliuoti gaut chimerinio TV geno raik. Tok domen koduojanti dalis buvo pasiskolinta i gyvuli gliukokortikoidin hormon jungianio receptoriaus geno. Kol nra ligando, chimerinis TV netgi nepatenka branduol. Po sveikos su hormonu baltymas aktyvinamas, paklina branduol ir jungiasi su valdom gen cis elementais. Pats chimerinio baltymo suadinimas sukeliamas dirbtiniu junginiu deksametazonu. Koks io chimerinio TV privalumas? Galima valdyti laik, kada pasireikti TV, isiaikinti jo valdom gen kaskad. Pvz., suadinus iuo bdu ydjimo laiko kontrols gen CONSTANS, augalas praydo anksiau ir transgenas pasireikdavo i karto. iedo meristemos genai LEAFY ir TERMINAL FLOWER pasireik tik 24 val. po CO geno suadinimo. Tai rodo, kad ie du genai yra CO geno reguliuojami, veikia ,,pasroviui. Dirbtiniai TV padeda iaikinti TV tarpusavio ryius. Tai dar vienas ingsnis transkripcijos kod.
Siekant itirti augal TV funkcij pasinaudojama ir drozofilos HD TV eimai priklausaniu Engrailed (EN) genu, kuris koduoja dominuojantj aktyvj represori. Kai prie vairi TV gen prijungiama domen koduojanti seka, gaunamas i TV gen loss-of-function mutacij fenokopijos. Taip itirtos sveikos tarp vairi TV koduojani gen, pvz., SHOOTMERISTMLESS, APETALA3, PISTILLATA, KNAT1. Kai papildomai prijungiama gliukokortikoido receptoriaus domen koduojanti DNR seka, galima valdyti tokio chimerinio geno raikos laik. Taip sitikinta, kad dl TV gen paralog, augalo genome mutantinis fenotipas danai gaunamas tik tada, kai slopinamas ne vienas TV genas. Vienas paralogas gali gelbti kito mutantinio paralogo fenotip. Kita vertus, kai nuslopinamas genas, kuris koduoja represori, pasireikia iki tol represoriaus slopinti genai. Taip, pvz., atsitinka, kai nuslopinami genai, kurie koduoja DELLA domen turint baltym. ie baltymai yra augalo slopikliai, ir nutrkus j veiklai augalas pradeda intensyviai augti. Danai represoriai neleidia pasireikti genams ne vietoje (ektopiniu bdu). Kai nuslopinamas toks represorius, jo slopinamas genas pasireikia ne vietoje, gali atsirasti geno produkto perteklius, atitinkantis gain-of-function mutacijos fenotip. Paprastai sukuriama chimerinio geno konstravimo sistema su paruotais atskirais tarpiniais konstravimo elementais. Tokia sistema naudojama konstruoti vairius chimerinius TV. Tokios sistemos turi netgi savo pavadinimus. Minta sistema, kurioje panaudotas EN aktyvacijos domenas, pavadinta CHRIS (Chimeric Repressor Interference System). ios sistemos privalumas yra, kad EN aktyvacijos domen koduojanti seka yra N-gale, todl j lengviau prijungti ar paalinti. Konstravimui naudojamos ir kit gen aktyvacijos domenus koduojanios nukleotid sekos: Herpes simplex viruso p16 baltymo ir ypa mieli Gal4 geno. Jos veiklios ir augal chimeriniuose genuose, nes ne visi chimeriniai genai pasireikia.

262 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.5. Gen raikos reguliavimas po transkripcijos. Splaisingas ir jo mutacijos

5.5.1. Branduolio ir citoplazmos RNR Tarp transkripto sintezs, ypa mRNR, ir galutinio geno pasireikimo yra ilgas ir gausus vykiais kelias. Galima iskirti tris rykius etapus po transkripcijos, nuo kuri priklauso geno raika: transkripto brendimo, pernaos citoplazm ir ribosomas, o kai kuri transkripcijos veiksni pernaos i vien lsteli kitas ar netgi i vien organ kitus; transliacijos; baltymo brendimo ir sijungimo lstels struktras. Pastarojo etapo sudtingumu jau turjome galimyb sitikinti i sklos atsargini baltym brendimo ir pernaos baltym knelius arba baltym saugojimo vakuoles (r. 4.2.3 sk.). Vis dar atrandami nauji gen potranskripcins kontrols bdai, jeigu ne bendro pobdio, tai bent konkrei gen. sidmtini vykiai, kurie vyksta branduolyje po mRNR transkripcijos, nes pagal Barton (J. L.Barton, 2006) tik 3050 % RNR nuo bendro mRNR kiekio pasiekia citoplazm. Galutin mRNR kiek branduolyje ir citoplazmoje veikia daugyb vyki (5.17 pav.).

5.17 pav. mRNR apykaita nuo sintezs iki suskaidymo egzosomoje

(pagal M. C. Barton. Biochemica et Biophysica Acta. 2006, Vol. 1759, P. 385387)

Pirmiausia bendro pobdio pre-mRNR modifikavimas: prie 5-galo prijungiama kepur invertuotas ir metilintas m7G5ppp5Nmp, o i kito - 3- galo prijungiama uodega poli-A. Abu ie vykiai stabilizuoja transkript. Geno raikos reguliavimui itin svarbus poli-A prijungimas. Jis gali kontroliuoti kit svarb vyk splaising. Daugelis augal (kaip ir kit eukariot) gen transkribuojamoje dalyje sudaryti i egzon ir intron. I pre-mRNR intronai yra paalinami, ikerpami, o egzonai sujungiami vien grandin. I ia kilo ir pats vykio pavadinimas. Tai jreivi, vliau ir cirko artist triukas karpyti virv, nepaliekant sukarpyt gal. Be to, RNR redaguojama: vieni nukleotidai pakeiiami kitais. Ir splaisingo, ir redagavimo tikslas bendras: sukurti transkript vairov nuo vieno geno.
AUGAL GENETIKA

| 263

Nors vyki didel gausa, bet jie puikiai suderinti. Kepurs prijungimas prie 5-galo ir splaisingas vyksta suderintai su transkripto elongacija. Sveikauja RNR polimerazs CTD (Carboxyl-Terminal Domain), elongacijos veiksniai ir baltymai, kurie brandina mRNR (5.17 pav.). ia pat vyksta ir susintetintos RNR kokybs kontrol. Panaiai kaip proteosomoje suskaidomi nereikalingi ar nekokybiki baltymai, egzosomoje suskaidomos nekokybikos ar atidirb RNR (5.6 intarpas). Vadinasi, vl prireikia kontrolieri, kurie visus iuos vykius suderintai valdyt. Tad yra saviti trans veikiantys branduolio baltymai, kurie reguliuoja branduolyje vykstant pre-mRNR modifikavim. Jie patys irgi pasiskirsto ne bet kaip, o sudaro baltym kompleksus (splaisosom, egzosom), talpinami Kajalo knelius, granules ar takelius. Tvarkingai pasiskirsto po branduolio skyrius. Tas pat galioja ir chromosomoms, kuri kiekviena turi savo vadinamj teritorij. Branduolio por kompleksas yra vienas i veiksming RNR pernaos citoplazm, ir atvirkiai, baltym pernaos branduol reguliatori, nes kaip inoma, RNR sintez vyksta branduolyje, o baltym citoplazmoje. Branduolio por kompleksui skiriamas atskiras reguliacinis vaidmuo: mRNR gali bti paprasiausiai neileidiamos i branduolio, nors ir turi reikiam eksporto i branduolio signal, vadinamj NES (nuo Nuclear Export Sequence). Por kompleksas neileidia i branduolio mRNR, i kuri nepaalinti intronai. Dl to kyla ir papildom klausim: kaip yra su alternatyviojo splaisingo nepaalintais intronais (pagal vyki dan tai daniausiai atsitinkantis augal alternatyviojo splaisingo vykis); kaip per branduolio por kompleks pereina mRNR po splaisingo arba intron mutacij, kurios sukelia labai panaius alternatyvj splaising pokyius. Branduolyje vyksta: DNR sintez; mRNR ar kit RNR tarnskripcija ir transkripto modifikavimas; mRNR stabilizuojama; atliekama pre-mRNR kokybs kontrol; integruojamos reikiamas struktras tos RNR, kurios lieka branduolyje, o likusij vyksta pernaa citoplazm; rRNR sintez ir ribosom subvienet susidarymas. Transkriptas iki reikiamo momento gali bti susijungs su branduolio matrikso baltymais. Tai irgi gen potranskripcinio valdymo bdas. Deja, kol kas tikinamai nustatytas tik gyvnams, bet labai tiktinas ir augalams. Dalis RNR apskritai nepajuda i branduolio, lieka jame, kaip antai maosios branduolio RNR (sn RNR) arba maosios branduollio RNR (snoRNR). Ne visos ir citoplazm patek mRNR ilieka nesuskaidytos iki transliacijos. Suskaidomos tos RNR, kuri koduojanioje dalyje yra nonsens kodon arba kurias paymi suskaidymui mi/siRNR. Tai vl vienas i potranskripcinio gen valdymo bd. Augal miRNR daniau skatina paymt mRNR skaidym, reiau keiia transliacij. Kiekvienas i proces yra kontroliuojamas savit baltym. Taigi yra trans-veikiantys veiksniai, kurie nesijungia su DNR, bet turi sekas, kuriomis jie jungiasi su RNR. Tokios sekos yra keli tip, tarp j RRM (nuo RNA Recognition Motif), arba kitaip RBD (RNA
264 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Binding Domain), ir KH (lizino, kuris ymimas K raide, Homologijos) domenai (5.6 intarpas). Vairenio genome RRM koduoja 196 genai, o KH baltymus 26 genai.
5.6 intarpas. Nuo gimimo iki mirties mRNR po transkripcijos duris beldiasi dar vienas kodas baltym sveikos su RNR. Baltymai lydi RNR nuo gimimo/sintezs iki atidirbusios, tapusios nereikalinga RNR suskaidymo mirties. Baltymai, jungdamiesi su bdingomis RNR sekomis, panaiai kaip TV, irgi reguliuoja geno raik. is kodas iuo metu vadinamas potranskripciniu operonu. Pavadinimas atsirads todl, kad branduolyje vienu metu sintetinama daug RNR J mas vadinama heterogenine branduolio RNR (angl. hnRNA). Ji labai nestabili ir tik nedidel jos dalis subrsta iki funkcionali RNR. Tai valdomi procesai, priklausantys nuo baltym, kurie sveikauja su pre-RNR, turi atitinkamus motyvus. Manoma, kad branduolyje i viso yra apie 106 hnRNR. RNR operono sutrikimai, ypa TV mRNR, gali bti esmini augalo raidos nukrypim prieastis. Nukrypimai irgi dvejopos kilms: mutacijos, paveldimi; nepaveldimi funkciniai sutrikimai. Baltymai, sveikaujantys su RNR, turi domen arba domenus, kuriais atpastamos RNR sekos, panaiai kaip savo DB domenu TV atpasta cis sekas geno promotoriuje. Domenai, kuriais baltymai jungiasi prie RNR, daniausiai yra dviej tip: KH ir RBD. Pastarasis danai sudarytas i 23- RRM motyv. Baltymai, kurie jungiasi su RNR, dalyvauja vairiuose procesuose: pradedant RNR sinteze ir jos reguliavimu, RNR brendimo reikiniuose, pernaoje citoplazm, reguliuoja transliacij, pagaliau, panaiai kaip E3 ubikvitinligazs pristato baltymus suskaidyti proteosomai, taip baltymai, kurie jungiasi su RNR, pristato baltymus suskaidyti egzosomai. I ties baltymai lydi RNR nuo gimimo iki mirties. Egzosom vieta yra skirtinga: vienos j yra branduolyje, kitos citoplazmoje. Suprantama, kad vairiais momentais jungiasi skirtingi baltymai, ir jie atpasta skirtingas RNR sekas. Taiau i sek tyrimai kol kas nra taip toli paeng, kaip cis element geno promotoriuje ar u jo rib. Tai kol kas neisprstas klausimas, nors jau inoma, kad taip gali bti reguliuojami atsakai hormonus ir abiotinius veiksnius, cirkadiniai reikiniai. Augaluose aptiktos streso granuls, kuriose yra mRNR. Jos atsiranda po iluminio oko arba kit baltymus denatruojani veiksni poveikio. Bet streso granuls geriau itirtos mieli ar induoli lstelse dl j panaumo prionus. Mielse Schizosaccharomyces pombe aptikta apie 520 skirting baltym, kurie jungiasi su RNR. induoli genome aptikta bent 500 gen, koduojani baltymus, kuriems bdingas RRM motyvas. Vairenio kol kas aptikta per 200 RBD domen turini baltym. Daniausiai baltymai grupuojami pagal RNR viet, su kuria jungiasi RBD ar KH domenus turintys baltymai. PABP (nuo Poly-A Binding Protein) jungiasi su mRNR uodega poli-A. Kiti baltymai jungiasi prie kepurs. Toks yra vairenio baltymas ABH1, kuris yra CB80 homologas, bet jo pavadinimas kils nuo abscizo rgties (Abscisic Hypersensitive1). Baltymai, su kuriais jungiasi mRNR, aptinkami vairiais bdais, tarp kit metod yra trihibridin mieli sistema (r. 5.4 intarp). Bioinformatikos metodais augaluose aptikta TIA-1/TIAR baltymai. Kaip tik TIA1 baltymai C-gale turi prion pana domen PRD ir skatina streso granuli susidarym. N-gale ie baltymai turi tris RRM. Tai labai panau miglini grdo atsarginius baltymus prolaminus, kurie sudaro baltym knelius. Pakanka vieno TIA-1 baltymo PRD domeno, kad citoplazmoje susidaryt mikroagregatai. Tad manoma, kad PRD yra pastolis, apie kur susidaro streso granuls. Tai bdas saugoti netransliuojamas mRNR neaktyvios bsenos. TIA-1 tipo baltymai taip pat reguliuoja alternatyvj splaising. Jungiasi su RNR vietomis, kuriose gausu U. Be baltym, kurie tiesiogiai dalyvauja, kai sintetinamos, modifikuojamos, brandinamos ir t. t.
AUGAL GENETIKA

| 265

mRNR, yra ir baltym grupi , kurios reguliuoja mRNR raik. Viena j jau minta TIA-1/TIAR. Be ios, yra dar keletas reguliacin funkcij turini, prie RNR prisijungiani baltym grupi, tarp j: Y-box alio atsako baltymai. Jie turi CSD (nuo Cold Shock Domain) domen, kuriuo jie jungiasi su RNR, viengrandine ar dvigrandine DNR, atpasta Y-box element: CTGATTGGCCAA. baltym, kurie jungiasi su RNR, grup jie patenka todl, kad turi du RRM. Vairenio GRP (Glycine-rich RNR-binding Protein) irgi turi du RRM. Jis reguliuoja transkripcij ir transliacij. Dar akobas ir Mono suvok, kokia svarbi geno raikai mRNR egzistavimo trukm. Ji ukoduota paioje mRNR, o tuo paiu gene, nuo kurio ji nuraoma. Taiau mRNR stabilumui itin svarbus mRNR modifikavimas (kepurs ir uodegos prijungimas), taip pat baltymai, kurie jungiasi prie kepurs ir prie uodegos. PABP saugo mRNR ne tik uodeg, bet netiesiogiai ir kepur. PUF baltymai (nuo drozofilos geno Pumilo) taip pat stabilizuoja mRNR. Abi baltym grups sudaro kompleksus ir yra daugiareikms. ios baltym grups ne tik slopina mRNR skaidym, bet ir skatina transliacij. PABP taip pat sveikauja su baltymais, kurie atlieka RNR perna citoplazm. Vairenis turi bent 8 baltymus, kurie jungiasi su poli-A. PUF baltymai ne tik suteikia RNR stabilumo, bet irgi reguliuoja transliacij. Tai labai konservatyvi baltym grup. Vis j C-gale yra RBD domenas ir 8 kartotini sek tandemas. Jungiasi su mRNR 3-UTR. Vairenio genome yra apie 20 PUF koduojani gen. Bet ateina mirties metas. inomi du mRNR suskaidymo keliai, susij su poli-A ir su 7mGpppN kepure. Abu prasideda vienodai: nuo poli-A suskaidymo RNR egzonukleazmis (vyksta deadenilinimas). Bet toliau keliai isiskiria: vieno j hidrolizuojama kepur, ir 5-egzonukleazs suskaido mRNR. Kitas kelias: pagrindin mRNR dalis suskaidoma 3-egzonukleazmis dar prie kepurs hidroliz. Galiausiai lieka tik kepur, ir 5-egzonukleazs suskaido ir j.; mRNR suskaidymas yra grietai reguliuojamas reikinys. Augaluose reguliacijos plonybes dar teks itirti. Daugiau tenka pasiremti tuo, kas vyksta drozofilos lstelse. Jose Pumilo (PUF) baltymas jungiasi su kitu baltymu Nanos, ir tai skatina labai esminius drozofilos raidos poskius. Suskaidoma vieno i pagrindini drozofilos raidos gen Hunchback koduojama mRNR. ios mRNR 3UTR gale yra specialus iam skaidymui reguliuoti Nanos atsako elementas NRF. Kito pagrindinio raidos geno koduojama TV bicoid mRNR irgi turi NRF element 3-dalyje. Tai tik parodo koks sudtingas ir grietai kontroliuojamas mRNR suskaidymas. Panaaus mechanizmo galima tiktis ir augaluose. Labai svarbus yra mRNR, ypa TV mRNR, pastatymas viet. Ypatinga jo svarba irgi I pirmiausia sitikinta drozofilos raidai. Morfogen (raid konIIa troliuojani baltym) pastatymas viet sukuria bendrj drozofilos raidos plan, polius III ir pagaliau net viet, kur branduoliai, o paskui kamienins lstels determinuojamos organ raidai. Panaiai yra ir IV augaluose. Prisiminkime gemalo raid (r. 3.2 sk.), auksino ir IIb PIN baltym reikm susidaryti poliams ir determinuotoms gemalo lstelms. Augal TV mRNR, panaiai kaip drozofilos
266 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

bicoid mRNR, perneamos i vien lsteli kitas (AP2 i L1 L2), taiau labai svarbi ir reikminga mRNR pernaa floema dideliais atstumais, i vieno organo kit, pvz., mslingojo florigeno i lap glio meristem (r. 5.6 sk.). Tai numatyta mRNR sandaroje. Dar dvi baltym grups, kurios jungiasi su mRNR, yra labai intensyviai tiriamos. Tai EJC (Exon Junction Complex) baltymai, kuri jungimosi vieta yra 2024 nt prie intron. Jie turi RRM/RBD. J reikm irgi labai vairi, bet pirmiausia svarba splaisingui. Be to, nuo j priklauso mRNR asociacija su polisomomis, aberantins RNR suskaidymas. Dar intensyviau yra tiriami SR baltymai, kurie irgi yra daugiaveiksniai, bet j reikm ypa akivaizdi splaisingo metu. Jie reguliuoja geno raik btent iuo metu. SR baltymai turi ne tik RRM, bet ir aminorgi sek, kurioje gausu serino ir arginino liekan (i ia i baltym pavadinimas). Serinas yra kintanio fosforilinimo vieta. Taip reguliuojama ne tik SR, bet per jas ir vairi gen raika potranskripciniame etape. vairus ir margas baltym, kurie jungiasi su RNR pasaulis (pav. pagal S. Meyer at al. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2004, Vol. 39, P. 197216).

5.5.2. Splaisingas augaluose. Intronins-egzonins geno sandaros privalumai. SR baltymai 5.5.2.1. Splaisingo privalumai Privalum yra keletas, ir visi jie yra bendro pobdio, vienodai reikmingi vairiems augal genams, kurie transkribuojamoje dalyje turi egzonin-intronin sandar. Intronai labai padidina geno ilg koduojanioje geno dalyje. Tai turi dvejop prasm. Padidja rekombinacijos danis geno viduje, o dl domenins baltymo sandaros, moduli,atsiranda galimyb pertvarkai geno viduje permutacijoms. Tokio tipo kitimus geno viduje jau esame nagrinj. Prisiminkime Solanaceae . augalams bding proteinazs inhibitoriaus gen Pin2 (r. 1.10.3 sk. ir 1.11 intarp). gen turi ir kiti augalai, tik be duplikacij geno viduje, bet Solanaceae . augal Pin2 geno baltym koduojanti dalis yra sudaryta i duplikuot segment, pastoviai vyksta j pertvarka ir atsiranda naujos duplikacijos dl netolygaus krosingoverio geno viduje. Pastoviai duplikuoti segmentai sumaiomi kaip kortos kaladje, ir netgi toje paioje lstelje yra vairs Pin2 baltymai. Baltymai skiriasi duplikuot segment skaiiumi ir tvarka. Prisiminkime ir tai, kam visa tai reikalinga. Proteinazs inhibitoriai yra tarp PR-baltym, kuriais augalas kovoja su patogenu. Patogenas iskiria proteolitinius fermantus, kad skaidyt lstels-eimininko turin. tai lstel atsako inhibitoriumi, kuris slopina proteolitinius fermentus. Bet ir patogenas prisitaiko prie io augalo ginklo. Jo baltymai tampa atspars inhibitoriui. Kad taip neatsitikt, augalas vis keiia ir keiia proteinazs inhibitoriaus sandar. Taip augalas santykinai tampa neveikiamas. Permutacijos ne tik Pin2 geno iradimas. Jos bdingos ir kit apsaugini baltyms, tarp j lektin, genams. Lektinais augalai apsisaugo nuo oldi. Lektin ypa gausu pupini augal sklose, ir selekcininkams pavyko j kiek ems kio augal sklose sumainti iki nekenksmingo lygio.
AUGAL GENETIKA

| 267

Gali bti keiiamasi egzonais (geno moduliais) tarp alelini ir netgi nealelini gen. Tai atsitinka genams, kuriems bdingas vadinamasis transsplaisingas. Sujungiamos dalys esanios per atstum. Toks trans-splaisingas aptiktas tabako chloroplast (rps12, psaA) ir mitochondrij (nad1, nad2, nad5) gen transkriptuose. Be to, tokia pertvarka vyksta ne paiame gene, o tarp mRNR, todl yra nepaveldima ir prireikus vl gali bti pakartota, galbt net naujais deriniais. Kita vertus, labiausiai kintantys yra intronai, nekoduojanios DNR sekos. Egzonai, kurie koduoja aminorgi sek, yra konservatyvesni. Susikuria skirtumai paralog intronuose, dl kuri yra apsunkinta konjugacija tarp paralog mejozs metu. Tai irgi naudinga savyb. Alternatyvusis splaisingas (intron/egzon paalinimas) vairiais deriniais sukuria vieno geno koduojam transkript ir baltym (izoferment) vairov. Intronai riboja skaitymo rmelio poslinkio mutacij plitim tik iki egzono 3galo. Kitaip bt pakits (pasislinks) vis kodon skaitymas nuo pat mutacijos (ikritos ar intarpo) vietos. Tik kai mutacija vyksta sekose, svarbiose splaisingui (r. toliau), tai gali pasireikti splaisingo mutacijomis ir susidaryti pertrauktos sandaros neaktyvs baltymai. Svarbus reguliacinis intron vaidmuo. Juose daug vairi reguliacini cis element, ypa stambiuose intronuose, kaip tai yra jau minto AGAMOUS geno 2-ame introne.

Vienas svarbiausi intronuose esani reguliacini cis element privalum yra tai, kad ikirpus intron su jame esaniais cis elementais, geno raika ar koduojamas reikinys tampa negrtami. Negali vykti transdiferenciacija. Labai svarbu taip nuslopinti identiteto gen koduojam organ transdiferenciacij. Kita vertus, pats genas nesikeiia ir isaugo vis pradin genetin informacij. Intronai patys gali koduoti RNR (pvz., masias branduollio RNR) arba patys gali veikti kaip biokatalizatoriai ribozimai. Tokie intronai aptinkami mitochondrij genuose. Jie katalizuoja splaising. Kai kuri gen intronai koduoja baltymus. Intronuose esanios cis sekos regulioja RNR modifikavim, netgi tada, kai paalinami intronai (bent j dalis). Taip, pvz., atsitinka plastidi tRNR. J pre-tRNR turi intronus. CCA prie plastidi tRNR prijungiamas sunkiai, kol neikirpti intronai. Splaisingas vienas i potranskripcinio gen valdymo bd. Kaip minta, mRNR, i kurios nepaalinti intronai, apskritai neperneamos per branduolio por kompleks. sitikinta, kad tai irgi bdas reguliuoti geno pasireikim vietoje ir laike, t. y. tam tikrose lstelse ir tam tikru metu. Papildomas galimybes valdyti gen raik teikia alternatyvusis ir trans-splaisingas. Alternatyvusis splaisingas sukuria transkript ir baltym vairov i vienos bendros pre-RNR, kuri koduoja vienas genas. Be to, kontroliuojamas alternatyviojo splaisingo laikas. Tad vairs vieno geno produktai gali pasigaminti skirtingose lstelse ir skirtingu laiku. Kita splaisingo variacija, trans-splaisingas, dar domesn. I esms, jis sukuria hibridines mRNR. Dalis egzon nuo vieno transkripto prijungiama prie kito transkripto egzon.
268 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Taiau apie 30 % vairenio gen apskritai neturi intron, ir j transkriptui splaisingas nereikalingas. Su prijungta kepure arba uodega, arba be j, jie tiesiai gabenami citoplazm, o branduolio RNR pastatomos reikiam viet branduolyje. Tai irgi bdas diferencijuotai valdyti genus grupuojant: turi intronus - neturi intron; reikalingas kepurs ir uodegos prijungimas, ar ne. Visos ios pre-RNR modifikacijos ar j nebuvimas irgi sudaro galimybes prie transkripto/RNR prisijungti skirtingiems baltymams (r. 5.6 intarp ir toliau). 5.5.2.2. Intronai ir egzonai. Splaisingo mechanizmas Splasingo pobdis, visos su juo susij sveikos yra numatytos genuose, j atitinkamose nukleotid sekose. Egzon ir intron sekos yra ne tik pre-RNR, bet ir jas koduojaniuose genuose. Prisiminkime splaising (5. 18 pav.). Tai vienas i t pre-RNR, kurios turi antropre-mRNR
5' Kep

Vieta
GU

Atsiakojimo seka

Vieta

Egzonas 1

Intronas

CUNAN

AG

Egzonas 2

Uo

3'

Splaisosomos komponentai

mb RNR U1, U2, U5, U4/U6 ir baltymai

Uo

3'

(1)

5' Kep

Egzonas 2 Intronas

Egzonas 1 Splaisosoma

Splaisosomos sveika su intronu

Uo 3'

(2)

5' Kep

Egzonas 2

Egzonas 1

3'

(3

Sujungti egzonai 1 ir 2

Splaisosomos A komponentai (ciklas kartojasi)

Introno kilpa (bus degraduota)

5' Kep

Egzonas 1

Egzonas 2 mRNR

Uo

3'

5.18 pav. Splaisingo eiga, dalyvaujant splaisosomai:

(r. tekst). ir osios branduolio RNR. , egzonai;

intronas; Kep kepur; Uo uodega; U ma-

AUGAL GENETIKA

| 269

nus brendimo proces. Intronai ikerpami, o lik egzonai sujungiami vien bendr grandin. Tik i pairos ia viskas paprasta. I ties tai vienas sudtingiausi reikini, kuriame dalyvauja dinamikas (kintantis) baltym ir maj branduolio RNR (mbRNR arba angl. snRNA) kompleksas. Maosios branduolio RNR, ymimos U raide, jau bna susijung su baltymais yra mbRNP. Splaisomoje dalyvauja bent keturios mbRNR: U1, U2, U4/U6, U5. Kitos U reikalingos egzono/introno atpainimui arba yra labiau dinamikos. Tai priklauso nuo introno sandaros. Papildomai turi susidaryti atpainimo kompleksai, kurie atpasta egzon/intron apskritai ir vadinamsias 5 ir 3splaisingo vietas. Splaisingas labai konservatyvus, todl kas inoma apie induoli pre-RNR splaising, beveik viskas tinka ir augalams, taiau skirtum yra: ne tiek splaisosomos, kiek intron, egzon atpainim ir splaisingo pradi reguliuojani baltym. Nuo j priklauso ir alternatyvusis splaisingas. Trumpai splaisingo vykius galima apibdinti taip: atpastamos 5 ir 3 intron ribos; splaisosomos baltymai kerpa intron 5-gale ir 5-gal sujungia su vadinamuoju atsiakojimo taku - tai bdinga nukleotid seka, kurioje esminis yra A nukleotidas; kerpamas introno 3-galas, ir i introno susidaro laso pavidalo kilpa; paprastai intronas suskaidomas. Ilieka tik tos intron sekos, kurios turi papildom paskirt. Paios dalyvauja splaisinge kaip ribozimai arba maosios branduolio mRNR vadinamos U. Kartais intronai koduoja baltym (tai bdinga sanklotiniams genams ,,genas-gene). Introno seka gene gali koduoti masias branduolio ar branduollio arba nekoduojanias reguliacines RNR (5.19 pav.).Visa splaisingo eiga, baltym svekos su pre-RNR sekomis (egzone ir introne) yra koduojamos konkrei geno sek, kaip ir kitos modifikacijos, kurias patiria RNR ir baltymai.
Egzono nustatymas Introno nustatymas

5.19 pav. Splaisingo komplekso dalis: egzono ir introno rib nustatymas:

E egzonas; AT atsiakojimo takas; sv splaisingo vieta; kiti paaikinimai tekste (pagal A. S. N. Reddy. Annual Review of Plant Biology. 2007, Vol. 58, P. 267294).

Intron/egzon rib nustatymas ir splaisingo pradia labiausiai genetikus dominantys vykiai. Btent tuo metu splaisingas pasireikia kaip gen potranskripcinio valdymo bdas.
270 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Introno ribas i abiej pusi ymi labai konservatyvs dinukleotidai: 5-GA, kitaip vadinami donoru, o 3-UG receptoriumi. Tai splaisingo vietos. Dl didelio konservatyvumo (nurodoma 100 %) jos vadinamos invariantinmis. Apie 0,4 % intron turi neprastas 5 ir 3-vietas: tai AT-AC, AT-AA, AT-AG, AT-AT, GT-GG. ios nekanonins vietos sveikauja su kitais baltymais ir U. Pagal tai intronai netgi skirstomi U2 (kanoninius) ir U12 (nekanoninms 5 ir 3-vietomis). Splaisingui svarbs ir gretimi 5 ir 3-vietomis nukleotidai egzone ir introne: 5-gale 9 nukleotidai CAG:GUAAGU ir 5 nukleotidai 3-gale GCAG:G (dvitakis ymi egzono-introno ribas). Tai konsensusai. J reikm rodyta splaisingo/intron mutacijomis (r. toliau). Laso kilpai (5.18 pav.) susidaryti labai svarbus atsiakojimo takas. Nesutariama, ar visi augal genai savo intronuose turi i nukleotid sek. Pati seka, matyt, labai variabili, nes netgi jos konsensusas uraomas vairiai: CUNAN, UUNAN, RUNAN. Bulvi gen intronuose, pvz., ji yra CUAAU (arba kitaip CURAY). Stuburini intronuose alia 3-galo yra vadinamasis pirimidin ruoas (traktas). Bent jau dauguma dviskili augal ios nukleotid sekos neturi. Vietoje jos augal intronuose gausu AU kartotini sek. Jos btinumu splaisingui sitikinta, kai kukurz Bronze2 (Bz-2) gen terpta gausi AU nukleotid seka. Splaisingas vyko intensyviau, atsirado alternatyvusis splaisingas, susidar naujas intronas, nes intronuose gali bti paslpt (kriptini) invariantini sek, kurios gali pakeisti kanonines 5 ar 3-vietas. Tai vienas i alternatyviojo splaisingo mechanizm. Kai iose AU sekose U pakeiiamas A, lieka nepaalinti intronai. Prie AU jungiasi bdingi baltymai (UBP1, RBP4, RBP47). Jie keiia splaisingo efektyvum, tai turi takos geno raikai. Pagaliau augal genuose (bet ne visuose) aptikta ir pirimidin ruoas, kuriame itisai yra U...(vairaus ilgio). Dviskili augal intronuose skmingam splaisingui turi bti ne maiau kaip 59 % UA sek. Splaisingui yra svarbios ir nukleotid sekos, esanios egzonuose. Juose yra vadinamieji splaisingo enhanceriai. Prie j jungiasi SR baltymai. Splaisingo enhanceriai yra ir intronuose. J derinys nulemia konkreios pre-mRNR splaisingo savitum. Gretimai esantys egzonas ir intronas, taip pat gretimai esantys egzonai sujungti vien bendr funkcin splaisingo atvilgiu grandin. Tuo sitikinta dvejopu bdu: pagal intron mutacijas, kai mutacija viename introne atkuria normal gretimo mutantinio introno splaising; naudojamos vairios dirbtins konstrukcijos, pavyzdiui, derinys i introno, paimto i irni atsarginio baltymo legumino geno ir kviei amilazs geno. Pirmojo intronas turi gausi AU srit ir intensyviai pasireikia splaisingas, o amilazs introne maai AU ir splaisingas labai ltas. Tokiame derinyje amilazs introno splaisingas padidjo 3,54,4 karto. Dirbtins konstrukcijos, kaip ir splaisingo mutacijos, yra viena pagrindini priemoni tirti splaisingo mechanizm. Spalaisosoma ir introno atpainimas. Bendras splaisingo veiksni skaiius augalo branduolyje yra per 200, taiau pai splaisosom, kuri atpsta 5-GU ir 3-AG vietas, sudaro penkios mbRNR, ymimos U1, U2, U4/U6, U5, ir apie 40 splaisingo veiksni. Tarp j yra baltymai, kurie sudaro splaisosomos erd. Jie ymimi tiesiog raidmis ir skaiiais, panaiai kaip mbRNR: B, B, D1, D2, D3, E, F, G. Splaisosomos baltymai yra dviej tip:
AUGAL GENETIKA

| 271

 kurie jungiasi su U1, U2 mbRNR ir kitomis mbRNR ir splaisosomoje veikia kaip ribonukleoproteidai mbRNP; ne-mbRNP (angl. non-snRNP) baltymai. Dar prie tai, kai susidaro splaisosoma, nustatomos intron ir egzon ribos. Tai atlieka U2AF veiksnys. Jis sudarytas i skirtingos paskirties subvienet: U2AF65, kuris jungiasi su pirimidino ruou, o U2AF35 prie introno 3-galo (5.21 pav.). Vairenio genome yra keturi genai (tarp j vienas pseudogenas, ymimas), kurie koduoja AF65, ir du AF35 genai. Skaiiai parodo j molekulin mas, o U2, kad AF65 ar AF35 susijungs su U2 mbRNR. Tarpininkas tarp kaimyninio egzono ir introno yra SR baltymas (SRp), o U2AF35 yra tarpininkas tarp SRp ir U2AF65. Prie 5-GU vietos jungiasi U1mbRNP. Tarpininkais tarp egzono ir introno, taip pat 5 ir 3- viet vl yra SRp (5.19 ir 5.20 pav.).
Patys didiausi kiekiai yra maosios branduolio RNR U1, nes j koduoja daugyb vien santalk sutelkt gen. Visi splaisingo komponentai saugomi branduolyje iki reikiamo momento Kajalo kneliuose ir takeliuose (angl. specles).

SR baltymai. Jau galjome sitikinti, kokie egzono/introno rib nustatymui yra svarbs SR baltymai, taiau j reikm kur kas didesn. Jie jungiasi prie egzone esani splaisingo enhanceri ESR arba/ir introne esani panaios paskirties cis element IRS (nuo Intron Splaising Regulator). Taip nustatomi splaisingo laikas ir vieta (5.20 pav.). Augalams, kuri genome alternatyvusis splaisingas nra toks danas kaip gyvn, tai gali bti labai svarbus bdas reguliuoti geno raik po transkripcijos. I dalies tai patvirtina dvigubai didesnis vairius SR baltymus koduojani gen skaiius augalo genome. Vairenio genome koduojami bent 20 SRp, o ryio dar daugiau 23, mogaus genome koduojama tik 10 skirting SRp. Mieli Schizosaccharomyces pombe apskritai yra tik du SR baltym genai. Tai rodo, koks didelis SR gen evoliucijos uolis padarytas gyvn ir ypa augal genomuose ir kaip lyg ant mieli augo SR baltym svarba ir funkcij vairov.

5.20 pav. SR baltym sveika su ESE sekomis egzonuose ir baltymais, kurie jungiasi su splaisingo pradios vietomis intronuose:
(r. tekst; pagal L. Collins, D. Penny. Molecular Biology and Evolution. 2006, Vol. 23, P. 901910).

Pats j pavadinimas kils nuo dviej aminorgi serino (S) ir arginino (R), kuri gausu domene, esaniame C-gale. Tipikas SR baltymas N-gale turi vien arba du RRM ir C-gale RS domen:
RRM1
RRM2

RS

272 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Taiau augal SRp labai vairs. Kai kuri SR baltym vidinje dalyje yra vienas arba du Zn lankstai (angl. knucles):
RRM

Zn

Zn

RS

SRp saugomi takeliuose (angl. specles), kurie yra diferencijuoti, kaip ir daugelio SRp paskirtis: atpainti introno-egzono ribas, sujungti atpainimo sritis ir splaisosom vien derin, reguliuoti alternatyvj splaising ir, svarbiausia, diferencijuotai reguliuoti konkrei pre-mRNR splaisingo viet ir laik. Deja, kaip tai SRp atlieka, kol kas kuriami tik spjami modeliai (5.19 ir 5.20 pav.), bet SR genai ir baltymai dabar intensyviai tiriami toliau. Kai kurie SRp yra bendri gyvnams ir augalams, bet vairenio genome koduojami bent 7 SRp, kuri gyvnai neturi. Toks yra, pvz., SR45 baltymas, kuris turi du RS domenus, o juos skiria siterps tarp j RBD domenas. RS domenu SR baltymas jungiasi su baltymais, todl galima manyti, kad SRp45 i karto jungiasi su dviem baltymais.
SRp kontroliuoja abu, vad. konstitucin ir alternatyvj, splaisingo tipus. Taiau ir paioms keleto gen koduojamoms SR pre-mRNR irgi bdingas alternatyvusis splaisingas (9 i 20 vairenio gen). Kita vertus, nors pirmaeil SRp paskirtis yra splaisingo kontrol, jie yra daugiaveiksmiai baltymai. Dalyvauja RNR pernaoje, stabilizuoja mRNR ir net patys reguliuoja transliacij. Kai kurie SRp juda tarp citoplazmos ir branduolio ,,audykls (audimo stakli) principu pirmyn-atgal. Keista, taiau toks yra SRp1, kuris labai svarbus splaisingui. Be to, jis turi dar vien paskirt: prisijungs prie mRNR 3UTR dalies jis stabilizuoja mRNR. SR reikm splaisingui pirmiausia nustatyta induoli ir mieli lsteli branduoliuose. SR baltymas, pavadintas ASF/SF2 veiksniu, atpasta bdingas sekas pre-mRNR. Tai egzono enhanceriai ESR (arba dar kitaip ESE) (5.20 pav.). ASF/SF2 skatina splaisingo veiksni prisijungim prie 3 ir 5-splaisingo viet. Vien tik su U1-70K, kuris nustato 5-splaisingo viet, jungiasi bent keturi skirtingi SRp, tarp j ir SRp45, kuris bdingas tik augalams. Augal SRp numeruojami atradimo tvarka, todl ASF/SF2 homologas yra ymimas SR1/SRp34. Vairenio genome SRp koduoja net 4 genai. Manoma, kad tik SR1/SRp34 yra bendro veikimo splaisingo veiksnys. Kiti SRp yra saviti audiniams. Pvz., RSZ33p, kuris turi du Zn lankstus, siterpusius RS srit, aptinkamas tik kai kuriose augalo dalyse: ieduose, glio ir aknies virninje meristemoje. is baltymas kontroliuoja SRp (AtSRp30 ir AtSRp34/SR1) veikl. SR baltymus kontroliuoja ir vairios proteinkinazs. Tai turi takos SRp perskirstymui branduolyje.

Papildomi pagrindiniam splaisingo kompleksui SRp baltymai sukuria papildom lygmen reguliuoti geno raik po transkripcijos. Patys SRp ir kiti baltymai tampa moduliais baltym komplekse, sukurdami komplekso pasireikimo savitum vairiuose augalo audiniuose ir esant vairioms aplinkybms. Didieji augal gen intronai reguliacini cis element buvein? sitikinta, kad splaisingui prasidti ir skmingai jo eigai labai svarbs pirmasis egzonas ir intronas, kurie danai yra 5-UTR, t. y. netransliuojamoje transkripto dalyje. Nuo j prasideda ir plinta tolyn splaisingas. Tad yra signalai splaisingo pradiai. Paprastai augal intronai yra trumpi, gerokai trumpesni nei gyvn ir ypa mogaus: vairenio intron vidutinis ilgis yra 169 bp, o mogaus 3400bp. Taiau aptikta daug augal gen, kuri pirmasis intronas yra palyginti stambus. Apskritai atkreiptas dmesys stambiuosius intronus. Jau minjome, kad AG, FLC, STK gen cis elementai yra dideliame 3 kbp introne. Tik AG geno tai yra antrasis intronas. Be to, nustatyta, kad is intronas gali
AUGAL GENETIKA

| 273

bti intensyviai metilinamas. Tad manoma, kad taip epigenetiniu bdu kontroliuojamas io geno pasireikimas tik tam tikrose lstelse ir tam tikru laiku. Panaiai yra FLC geno, tik pirmajame introne. Vienas i bd itirti introno reikm intron terpti arba paalinti genui, kuris sulietas su genu reporteriu. Tokia analiz Vaijo ir Morikavos (K. Washio, M. C. Morikava, 2006) atlikta su ryi aleurono GMD1,2,3, RPD1,2,3, RPBF genais, kurie yra giberelino (GA) atsako genai ir pasireikia, kai grdas dygsta. Stambj 1-j GAMyb ir RPBF intron koduojanios sekos buvo vestos arba ne tirt gen 5UTR srit. Tai labai padidino tirt gen raik (iki 6,3 karto). Mikro arba miniegzonai. Pagal dyd jie kitas kratutinumas, nes j dydis paiame gene nevirija 25 bp. Kol kas j daugiausia aptikta mogaus genome. Vairenis yra antroje vietoje (5.4 lentel), bet tai gali nulemti i mikroegzon itirtumas genomuose, nes dviej ar keli nukleotid egzon aptikti nelengva. Paprastai remiamasi kanoninmis splaisingo vietomis 5-GU ir 3-AG (5.21 pav.). Egzonui btinos vidins sekos, kurios reguliuoja splaising splaisingo enhanceriai. Paskaiiuota, kad minimalus gyvn egzono dydis, dl kurio jau gali vykti autonominis splaisingas, yra 51 nt. Tad netgi 25 nt egzonas yra maiau io minimalaus ilgio, o k kalbti apie 2 nt mikroegzon. Pasirodo, ie egzonai apsirpina padedami kaimynini intron. Manoma, kad mikroegzonai svarbs alternatyviajam splaisingui, taiau i dviej itirt mikroegzon vairenio genome, alternatyvusis splaisingas nustatytas tik vieno (5.4 lentel). Be to, dviej nukleotid ikirpim galima palaikyti paprasiausia ikrita, ir mikroegzon alternatyvj splaising nelengva aptikti.
5.4 lentel. Mikroegzon pasiskirstymas pagal ilg (bp) vairi organizm genomuose
(pagal N. Volfovsky, B. J. Haas, S. L. Salzberg. Genome Research. 2003, Vol. 13, P.12161221)

Genomas
Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Homo sapiens

2 5
0 1 7 5

Mikroegzono ilgis bp 610 1115 1620

2 10 19 59 1 6 13 77 3 5 28 90

2125
4 12 74 194

I viso
10 34 141 425

Egzono peroka
3 4 1 60

Geriausiai jis itirtas bulvi invertazs miniegzono. Jis koduoja i viso tik 3 aminorgtis, taiau neabejotinai rodyta, kad io miniegzono perok (praleidim subrendusiame transkripte) sukelia alio stresas. Invertaz (-fruktozidaz) yra fermentas, kuris sacharoz skaido gliukoz ir fruktoz. Didesn cukr koncentracija lstelje yra labai svarbi priemon apsisaugoti nuo alio. Be to, cukrai augalo lstelse yra proces reguliatoriai, iuo metu priskirami prie hormon. Miniegzonas aptinkamas ir kit augal invertazs genuose. Tad reikia manyti, kad taip valdoma ir kit augal invertazs geno raika.

274 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.21 pav. Vairenio (Arabidopsis thaliana) mikroegzono alternatyvusis splaisingas. Mikroegzono viet galima nustatyti pagal 5GT-...AG-3
(pagal N. Volfovsky et al. Genome Research. 2003, Vol. 13, P. 12161221).

5.5.2.3. Intron ir splaisingo mutacijos Jos labai intensyviai tiriamos mogaus genome. Tai visikai suprantama, nes splaisingo ir intron mutacijos yra daugelio paveldim lig prieastis. Be to, paaikjo, kad panaaus fenotipo mutacijos gali atsirasti dl pokyi aminorgtis koduojanioje geno dalyje (egzonuose) ir nekoduojaniose DNR sekose, tarp j intronuose. Augal genome ios mutacijos leidia isamiau painti splaisingo mechanizm ir geno funkcin sandar, bet, svarbiausia, alternatyviojo splaisingo ir gen valdymo mechanizm evoliucij: i kur ir kaip atsirado alternatyvusis splaisingas. Daugelis alternatyviojo splaisingo atvej yra laiku natraliosios atrankos panaudotos splaisingo ir intron mutacijos. Splaisingo ir intron mutacijos daniausiai pasireikia vienu kuriuo i trij bd: introno (arba intron) isaugojimu intronas subrendusioje mRNR ilieka nepaalintas; egzono (arba egzon) peroka (angl. skipping) egzonas paalinamas kartu su j supaniais intronais; sutrumpjusiu egzonu ar intronu dl ne vietoje atsiradusi 5- ar 3-splaisingo arba poliadenilinimo viet. Visi ie pokyiai stebimi ir kai vyksta alternatyvusis splaisingas. Intron mutacijos invariantinse ir variantinse sekose. Pagal mutacijos atsiradimo viet intron koduojanioje geno dalyje intron mutacijos skirstomos invariantines, kurios vyk gene 5-GTarba 3-AG splaisingo vietose, variantines, kurios vyk kitose labiau kintaniose, ne tokiose konservatyviose vietose. Invariantini nukleotid sek (5-GT arba 3-AG) mutacijos yra geriausiai itirtos. Jos padjo irykinti gene ir pre-RNR slaptsias (kriptines) splaisingo vietas. Potencialiai jos jau egzistavo introne ir iki mutacijos. Mutacija jas tik priverstinai irykino, nes 5 ar
AUGAL GENETIKA

| 275

3-vietos funkcij teko perimti slaptajai vietai. Slaptosios splaisingo vietos gali atsirasti ir egzon (tai jau egzono/splaisingo mutacija), ir intron koduojanioje geno dalyje. Priklausomai nuo j atsiradimo vietos susidaro ilgesni ar trumpesni transkriptai: pailgja ar sutrumpja egzonas (5.22 pav.).

5.22 pav. Invariantini sek mutacijos, slaptj splaisingo viet atsiradimas ir pasekms:

Mutantiniai egzonai, intronai ir splaisingo vietos ymimos , , . Pilkai ymima nauja egzono dalis, atsiradusi egzone papildomai dl splaisingo vietos mutacijos; baltai egzono dalis ar visas egzonas peroktas, kurio nra subrendusioje RNR.

Danesns, netgi danos, yra variantini sek mutacijos, bet ias mutacijas reiau pavyksta nustatyti pagal fenotipo pokyius. Tik jeigu tai intronuose esani cis element arba svarbi splaisingui AU, pirimidin ruoo ar atsiakojimo tako mutacijos, jas galima nustatyti ir pagal fenotipo pokyius. Apie daugel intron variantini sek mutacij tenka sprsti i sekoskaitos rezultat, taiau kasmet didja skaiius gen, pagal kuri mutacijas, pasireikianias fenotipe, nustatomos cis reguliacins sekos intronuose. Be jau mint AGAMOUS, SPINDLY, COP1, FCL, ribulozobisfofatokarboksilazs/oksigenazs (kitaip Rubisko) mutacij intronus koduojaniose sekose ir taip aptikt cis element, panai yra irgi minta miei dominuojanioji mutacija Hooded (r. 5.8 pav.) Ji vykusi dl stambios 305 bp duplikacijos IV- Knox 3 geno introne Atsiakojimo tako mutacijos pasireikia silpniau nei 5-GU arba 3-AG splaisingo viet mutacijos. Tai nustatyta vairiems augalams ir vairiems genams: irni legumino, kviei -amilazs ir kt. Egzono peroka, kai egzonas arba egzon grup tiesiog perokamas arba dar kitaip praslystami (angl. slipping) dana splaisingo mutacija. Vienas arba daugiau egzon su276 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

brendusioje RNR yra praleidiami (5.22 pav.). Prieastys vairios: 5-GT arba 3-AG viet mutacijos, slapt splaisingo viet atsiradimas, kit splaisingui svarbi nukleotid sek pokyiai. Kai perokamas egzonas ar egzonai, nuo tokios mRNR sintetinamas pertrauktas, todl danai neveiklus baltymas. Kai ne vietoje atsiranda nukleotid seka, prie kurios prijungiamas poli-A, nuo mRNR sintetinamas trumpesnis, nei turt bti polipeptidas. Tai danas vykis, kai yra alternatyvusis splaisingas. Ityrus kai kurias splaisingo mutacijas sitikinta, kad splaisingui svarbios ne tik kanonins nukleotid sekos, pvz., 5-GU arba 3-AG, bet ir jiems kaimyniniai nukleotidai, todl nurodomos ir sekos, kurios supa 5-GU arba 3-AG i abiej pusi. Pvz., egzono peroka nustatyta vairenio APETALA3 (AP3) geno mutante ap3-1. AP3 genas pagal iedo tapatybs gen klasifikavim ABCDE priklauso B genams. Vadinasi, lemia iedo vainiklapius ir kuokelius, pastaruosius kartu su kitu iedo organ genu AGAMOUS. Kai atsiranda ap3 geno mutacija, kuri inaktyvina AP3 gen, susidaro tik piestels ir taurlapiai. iedas be vainiklapi, ir tai labai pastebimas fenotipo pokytis. I ia mutacijos pavadinimas be vainiklapi. Mutanto ap3-1 subrendusioje mRNR trksta vieno, btent 5-ojo egzono. Jis peroktas, vykstant pre-RNR splaisingui. Gana tipika splaisingo mutacija, tik ji vykusi 5-jo egzono gale, per 2nt nuo 5-ojo introno splaisingo vietos. Vienas nukleotidas pre-mRNR pakeistas kitu, btent AT (5.23 pav., A). Lygiai toks pat rezultatas gautas su transgeniniu AP3, kuris buvo prijungtas prie CaMV 35S promotoriaus, o DNR nukleotid sekoje, kuri koduoja 5-j egzon, toje paioje vietoje (2 nt prie 5-GT) atlikta pakaita AT. Introno mutacija jos negalima vadinti, todl splaisingo mutacija yra platesnis terminas nei introno mutacija, kuri vyksta tik introne. Splaisingo mutacija yra bet kuri mutacija, kuri keiia splaising. Splaisingo/intron mutacijos gene netelpa prast pakait ar ikrit grup, kurios pasireikia kaip missense, nonsense, rmelio poslinkio (frame shift) mutacijos. Tai savita mutacij grup, danai sukelianti tok pat fenotipo pokyt, kaip vardytos mutacijos. Dar vienas reversij tipas splaisingo/intron mutacij reversijos. Reversijos, kitaip yra grtamosios mutacijos. Kai jos vyksta, mutantas vl virsta normalaus fenotipo augalu. Grtamosios mutacijos atsiranda vairiu bdu (5.7 intarpas). Splaisingo/intron mutacij tyrimai padjo atrasti dar vien j atsiradimo tip: grtamsias splaisingo/intron mutacijas. Augal tokio tipo grtamosios mutacijos, matyt, ir buvo pirm kart aptiktos tarp jau minto APETALA3 geno splaisingo mutanto ap3-1 palikuoni. Itirtas normalaus fenotipo augalas ir jo palikuonys. Jie turjo vainiklapius, o subrendusioje AP3 mRNR aptiktas ir 5-asis egzonas. Jis mutante ap3-1 buvo peroktas. Bet transkripte be tiesiogins mutacijos, aptikta dar viena mutacija. Be to, netiktoje vietoje, sekoje, koduojanioje 4-j intron. Tad ap3-11 paymti augalai yra dvigubi mutantai (5.23 pav., B ir C): mutacija 4-ajame introne slopino mutacij (tiesiogin) 5-ajame egzone. Kas vyko, kad atsirado toks revertantas? Tiksliai revertanto fenotip paaikinti sunku, bet manoma, kad 4-ajame introne dl vl vieno nukleotido pakaitos GA 33 vietoje atsirado naujas papildomas atsiakojimo takas.

AUGAL GENETIKA

| 277

Pakaita U ...AUG - Met

5.23 pav. Egzono (5-ojo) peroka (nra subrendusiame transkripte) vairenio APETALA3 mutante ap3-1 ir normalaus splaisingo reversija dvigubame mutante ap3-11:
Spjama, kad reversija vykusi dl naujo papildomo atsiakojimo tako 4-ajame introne. A AP3 genas normalus fenotipas; mutantas ap3-1 mutantinis fenotipas, jo subrendusioje mRNR praleistas 5-asis egzonas; revertantas ap3-11 jis atsirado dl naujos mutacijos (pakaitos, ji parodyta rodykle) jo sekoje, koduojanioje 4-j intron, ir jame susidar du atsiakojimo takai (senas ir naujas). Siekiant atskirti egzon sekas nuo intron nukleotid sek, pastarosios gene uraomos maosiomis raidmis. B ir C dirbtin pakaita (B) transgeno CaMV35S::AP3 5-ojo egzono gale AT (mRNR AU) ir (C) jos pasekms peroktas E5 egzonas. Jo nra subrendusioje transgeninje mRNR (paymtoje AP3-Met-153mRNR). E5 pavaizduotas juodai (pagal Y. Yi, T. Jack. Plant Cell. 1998, Vol. 10, P. 14651478 ).

is revertantas yra pakankamai svarus rodymas, kad tarp alia esani egzon ir intron palaikomas funkcinis ryys, ir egzon sujungimas bendr grandin subrendusioje mRNR yra grietai kontroliuojamas. Splaisingo/introno tiesiogins mutacijos ir reversijos dl judrij genomo element vietos kitimo (transpozicijos). Gamtins splaisingo/intron mutacijos gali atsirasti dl transpozon siterpimo splaisingui svarbias vietas egzone ar introne. Tokia mutacija aptikta didiojo ioveinio (Antirrhinum majus) Plena gene, kuris yra ortologas vairenio AGAMOUS genui. Dvi Plena geno mutacijos yra atsirad dl transpozono Tam3 siterpimo io geno didij intron, be to, dvejopu bdu, dl ko atsiranda fenotip skirtumai. Tad mutantai pavadinti skirtingais vardais plena ir ovulata.
278 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Vieno mutanto (ple-625) Plena gene Tam3 siterps ta paia kryptimi, kaip geno nukleotid seka (53) (5.24 pav.). Alelis tampa neaktyvus, atitinka apibdinim loss-of-function, nes Tam3 turi transkripcijos pabaigos (terminacijos) sek. Pasireikia plena fenotipas: nesusidaro kuokeliai ir piestels (panaiai kaip vairenio ag mutanto).

5.24 pav. Skirtinga Tam transpozono siterpimo padtis ioveinio (Antirrhinum majus) Plena gen ir du skirtingi iedo morfologijos mutantai: ovulata vidutinis; kairje WT ; deinje plena
(r. tekst; pagal D. Bradley et al. Cell. 1993, Vol. 72, P. 8595).

Kitas dl Tam3 siterpimo atsirads mutantas (ple-627) vertinamas kaip gain-of function (perteklinis). Transpozonas Tam3 siterps beveik toje paioje vietoje, kaip ir pirmojo mutanto, tik prieinga geno Plena nukleotid sekai (35) kryptimi (5.24 pav.). Pasireikia nekontroliuojamas itisinis skaitymas (angl. read-through). Geno produktai kaupiasi ne vietoje, todl isivysto ovulata fenotipas: vien tik kuokeliai ir piestels. Nra kit iedo dali. Reikia transpozonui Tam3 isikraustyti i introno, ir vyksta grtamoji mutacija, augalai gyja normali iedo sandar. Tad ir splaisingo/intron mutacijos, kaip ir j reversijos, gali vykti dl vairi prieasi.
5.7 intarpas. Kuo skiriasi intron/splaisingo mutacij reversijos nuo kit grtamj mutacij Tikrasis grimas i mutanto pradin padt labai retas. Danai pakanka, kad nul (arba kitaip loss-of-function) mutantas vl atgaut gebjim sintetinti veikl baltym, nors ir su iek tiek pakeista aminorgi seka. Tarp toki mutant gana danos grtamosios mutacijos i nonsense mutanto (ne vietoje atsirado stop kodonas UAG, UAA ar UGA). Reikia, kad tokiame beprasmiame kodone vykt nukleotido pakaita, ir kodonas koduot koki nors konkrei aminort. Kad ir taip: AAG UAG UUG Lys (WT) Nonsense Leu Tiesiogin mutacija (Reversija)
AUGAL GENETIKA

| 279

Kitas labai gerai inomas tipas yra Kriko reversijos. Jos bdingos mutantams, kurie atsirad dl vadinamj rmelio poslinkio mutacij: gene ikritusi arba siterpusi nukleotid pora. Nuo ios vietos vis kodon skaitymas sutrinka, pasislenka per vien nukleotid, todl ir ios mutacijos yra nul fenotipo. Bet pakanka, kad gene netoli pirmosios mutacijos vykt kita irgi rmelio poslinkio mutacija, bet prieinga pirmajai: jeigu i pradi buvo ikrita, tai antroji mutacija turi bti intarpas (seka nurodyta mRNR): CCA UGG CGG CAC AAA UUU GAG WT G CCA UGC GGC ACA AAU UUG AG rmelio poslinkio mutacija (ikrita) CCA UGC GAG CAC AAA UUU GAG Kriko reversija (intarpas) A arba atvirkiai, jeigu pirmoji buvo intarpas, tai antroji ikrita. Abiem atvejais, nors dalis aminorgi sekos yra pakitusi, polipeptido sintez dvigubame mutante atsikuria. Tai ir yra Kriko reversija. Reversija gali vykti dl netolygaus krosingoverio segmente, kuriame prie tai vyko duplikacija. Vienoje homologinje chromosomoje lokusas patrigubja, bet kitoje vl lokusas tik viengubas (WT), t. y. joje yra reversija WT:

Grimas pradin fenotip taip pat gali bti dl nealelinio geno, vadinamojo supresoriaus poveikio. Supresija gali vykti dl vairi prieasi. Viena j: kai supresorius nuslopina ne vietoje (ektopikai) pasireikiant mutant, apibdinam kaip gain-of-function. Grtamj mutacij br papildo ir splaisingo/intron mutacij reversijos. Tiesiogines mutacijas gali sukelti judrij genomo element siterpimas, tarp kit ir splaisingo/intron mutacijas. Kai judrusis elementas isikrausto i terpimo vietos, i mutantinio grtama normalj fenotip. Tai irgi vertinama kaip grtamoji mutacija. Taip atsitinka ir splaisingo/intron mutantams, kurie atsirad dl judriojo genomo elemento siterpimo.

5.5.3. Alternatyvusis splaisingas augaluose. Autonominis ydjimo meto kontrols kelias ir alternatyvusis splaisingas 5.5.3.1. Alternatyvusis splaisingas augaluose Augal vairov pagal alternatyvj splaising. sigaljusi neteisinga nuomon, kad alternatyvusis splaisingas (AS) augal genomuose nra toks danas ir reikmingas reikinys, kaip tai yra mogaus ar gyvn genomuose. mogaus iki 74 % vis transkript yra AS produktai. Taiau tyrim rezultatas priklauso nuo pasirinkto vertinimo metodo, itirt gen ir transkript skaiiaus, augal ries ar netgi veisls. Geriausiai tai parodo tyrimai, kuriuos atliko Ner-Gaonas (H. Ner-Gaon et al., 2007) su bendradarbiais. Jie ityr, koki dal sudaro AS transkriptai 11 augal ri, o kai kuri augal ir veislse. domiausia tai, kad maiausia dalis transkript, atsiradusi dl AS, teko vaireniui ir ryiams. Iki iol ie augalai buvo etalonas, pagal kur buvo sprendiama apie AS mast augaluose.
280 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Didiausias AS transkript procentas tarp tirt augal aptiktas salotos (Lactuca sativa) ir sorgo (Sorghum bicolor). Dideli skirtumai aptikti ir tarp augal veisli. Bet ir vairenio, ir ryi AS transkript kartel teko pakelti iki 30-45 %, nors dar neseniai manyta, kad j dalis iuose augaluose yra apie 11 %. Manoma, kad madaug ant 30 tkstani vairenio gen turt susidaryti per 120 tkstani transkript.
Kai kuri, ypa SR baltymus koduojani, gen AS pobdis yra labai konservatyvus. Tokiu paiu bdu vyksta AS netgi samanose (Physcomitrella patens). Nepaisant to, augalai gali skirtis ir pagal pavieni, konkrei gen splaisingo pobd. Tai nustatyta, pvz., labai svarbiam augal genui CONSTANS (CO), kuris yra vienas i pagrindini fotoperiodizmo gen ilgadienio augalo vairenio genome. Jame AS nevyksta. Kitaip yra trumpadienio augalo sukuio (Pharbitis nil) ortologe PnCo. Tarp 18 itirt PnCo geno transkript visi intronai buvo paalinti tik viename j. Vienas transkriptas kodavo pertraukt baltym, o likusiuose intronai buvo nepaalinti. Intron ikirpim i PnCo pre-mRNR reguliuoja dienos/nakties trukms santykis. Intronai paalinami tik tada, kai yra trumpa diena. Vertas dmesio ir transkript, kuriems paalinti intronai, santykis. Gali bti, kad tai raktas, kaip reguliuojama augalo atmintis, kiek dien augalas augo trumpos dienos slygomis, nes augalas pradeda ydti tik po tam tikro trump dien skaiiaus. Gali bti, kad kuo ilgiau augalas ibna trumpos dienos slygomis, tuo daugiau transkript yra su paalintais intronais. Sukuio normaliai ydjo co mutantas, jeigu jo genom vesta CO kDNR, kuri neturi intron. Gen vairov pasireikia jau vien pagal tai, kad ne visi genai turi intronus. Vairenio genome intronus turi 79 % branduolio, tik 18 % - plastidi ir 12 % mitochondrij gen. Mitochondrij ir plastidi genomai yra kil i bakterij, todl nedidelis gen su intronais skaiius j genomuose visikai normalus reikinys. J genome mus domina daugiau tie genai, kurie turi intronus. Jie vlesns kilms.

Genai, kurie neturi intron, ivengia sudtingo splaisingo kaip potranskripcinio gen raikos reguliavimo bdo. Alternatyvusis splaisingas, atvirkiai, sukuria to paties geno transkript vairov. Vienas genas gali koduoti daugiau kaip vien mRNR ir baltym. Be to, skirtingi geno produktai gali pasigaminti skirtingose lstelse skirtingu metu ir priklausomai nuo aplinkybi. Transkript vairov, kuri sukuria alternatyvusis splaisingas. Bendro pobdio rezultatai dar nepakankamas pagrindas sprsti apie AS reikm augalams. Didelis vieno kurio geno transkript skaiius, kuris susidaro dl AS, gali gerokai santykinai padidinti AS transkript santyk bendroje transkript masje. Kad tai manoma, parodo du drozofilos genai, kurie koduoja netiktinai didel transkript skaii. Tai drozofilos genas Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule). Nuo jo dl AS pasigamina net 38016 vairi transkript. Bet visus pralenkia kitas drozofilos genas Neuroplegic. Dl jo pre-mRNR vairi modifikacij, tarp j ir AS, susidaro per milijon vairi transkript. Abu drozofilos genai labai svarbs ryiams tarp nervini lsteli, o Dscam geno mutacija imituoja mogaus inomo defekto Dauno sindromo pagrindin pasireikim: sutrikusius ryius tarp lsteli dl adhezijos baltym stygiaus. Augaluose tokie genai, nuo kuri susidaryt tiek daug transkript bent kol kas neaptikti. Taiau transkript vairov, kuri atsiranda dl AS ir kit RNR modifikacij nustatyta gana dideliam gen skaiiui. Danai AS bdinga SR genams, pvz., kukurz zmRS31A geno susidaro bent ei transkriptai, o jo ortologo RS31B keturi. Bent tris transkriptus pavyko jau aptikti ryi SR32 geno, o vairenio atSR45a net septynis transkriptus. Dauguma j neturi RS domeno (5.25 pav.). Daugiausia transkript aptikta bulvi ureazs geno, kurio koduojamas fermentas skaido lapal. J augalas naudoja kaip amoniako (azoto) altin. Prie kito bulvi geno, kuris koduoja invertaz, transkript vairovs prisideda
AUGAL GENETIKA

| 281

miniegzonas. Invertaz yra svarbus fermentas. Jis skaido sacharoz. Cukrai yra btini ne tik augalo metabolizmui, bet ir kaip signalins molekuls.
5' 3' Genomas Konstitucinis splaisingas Alternatyvi donoro vieta Alternatyvi akceptoriaus vieta Apskritai alternatyvi padtis Konstitucinis splaisingas Egzono peroka Konstitucinis splaisingas

Introno isaugojimas

atSR45a pre-mRNA
1 P1 P2 2 3 4
5

300 kb 6 7 8 P3

Konstitucinis splaisingas
atSR45a-1a
AUG

Koduojamas baltymas
RS RRM RS

Alternatyvusis splaisingas
atSR45a-1b atSR45a-1c atSR45a-1d atSR45a-1e atSR45a-2 atSR45a-2b
AUG

1
AUG

2 2 2 2
AUG

3 3 3 3 3 3

4 4 4 4 4 4

6 6 6 6 6

7 7 7 7 7 7

8 8 8 8 8 8

RS RRM

1
AUG

RS RRM

1
AUG

RS RRM

1 2

RS RRM

RS RRM

RS

AUG

RS RRM

5.25 pav. Alternatyviojo splaisingo tipai (A) ir vairenio (at A. thaliana) SR45a pre-mRNR alternatyvusis splaisingas ir koduojam SR baltym vairov po alternatyviojo splaisingo (B):
RS ir RRM baltymo domenai (A pagal B - B. Wang, V. Brendel. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2006, Vol. 103, P. 71757180; B N. Tanabe et al. Plant Cell Physiology. 2007, Vol. 48, P. 10361049).

Labai svarbu, kad RS, invertazs, uriazs gen AS priklauso nuo aplinkos veiksni. Taiau daugelis susidariusi po AS transkript ir j koduojam baltym yra pertrauktos
282 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

sandaros, neaktyvs, kaip jau ir minto geno atSR45a (5.25 pav.). Kokia prasm susidaryti neaktyviems geno produktams, daugeliui gen dar kol kas neaiku. FCA, kuris yra vienas pagrindini autonominio ydjimo kelio gen, taip reguliuojamas poreikis aktyviam baltymui. Panaiai yra ir bulvi ureazs genui. Paprastai is genas veikia pastoviu reimu, bet silpnai, todl dauguma baltymo izoform yra neaktyvios. Tik kai yra lapalo, padidja aktyvi baltymo molekuli. Be to, ureazs skirtingi izoform spektrai yra aknyse ir lapuose. Tad AS yra kontroliuojamas. AS svarba augalui. Kaip galjome sitikinti, svarbu ne bendras gen skaiius, kuriems bdingas AS, o k tie genai koduoja. Labai svarbus poymis yra pats splaisingas. AS bdingas ne tik apie pusei SR gen, bet ir dar vienam tiesiogiai splaising vykdaniam veiksniui U1-70K. is baltymas sudaro RNP su U1mbRNR. Dl AS susidaro du jo transkriptai ir baltymai: vieno j paalinti visi intronai, o kito lieka nepaalintas vadinamasis terptinis intronas. Vienas U1-70K baltymas yra 204 aminorgi, o kitas 427 aminorgi. Susidar kiekybiniai SRp profiliai svarbs prisijungti prie skirting pre-mRNR ir prie skirting egzono enhanceri tame paiame gene. Atsiranda skirtumai tarp lsteli, audini, o gal bt ir organ. SR pre-mRNR AS tai vienas i bd reguliuoti gen raik po transkripcijos. domu tai, kad ir II RNR polimerazs kai kurie subvienetai susidaro dl AS. Taip irgi reguliuojama gen veikla. Pvz.,nustatyta, kad RNRP II sveikauja su HUA2 baltymu ir taip reguliuojami keletas ydjimo laiko ir iedo organ identiteto gen, tarp j AG, FLC, FLM. Tarp gen, kuriems bdingas AS, bent trys yra susij su fotosinteze. Tai pagrindinio fotosintezs baltymo ribulozo-1,5-bisfosfato karboksilazs/oksigenazs (Rubisko) aktyvazs genas. Jo koduojamas fermentas aktyvina Rubisko, kai dl apvietimo keiiasi redoks potencialas arba ADP/ATP santykis. Tai atlieka dvi to paties geno koduojamos baltymo izoformos, atsirad dl AS. pinat jos abi yra aktyvios, tik skiriasi dydiu. Didesnioji turi papildomas aminorgtis C-gale. Vairenio AS vyksta tose paiose vietose, bet susidar baltymai skiriasi daugiau: vienas - 44, o kitas 47 kDa.
Plastidi, fotosintezs ir viso augalo saugai svarbus yra fermentas askorbato peroksidaz. is fermentas inaktyvina laisvuosius radikalus, kurie susidaro, kai vyksta fotosintez. Dl AS susidaro keturios izoformos. Skiriasi j vieta: viena sijungia chloroplasto strom, kitos tilakoidus. Molig NADH hidroksipiruvato reduktaz nra chloroplast, o peroksisom baltymas, bet jis yra svarbus fotorespiracijai ir veikia kartu su chloroplast ir mitochondrij fermentais. Jo AS reguliuoja viesa. Susidaro dvi izoformos. Viena j turi signal (Ser-Lys-Leu) C-gale lokalizacijai peroksisomoje, o kita neturi. Tad yra lokalizuojama citozolyje. viesa reguliuoja ir askorbatperoksidazs AS.

Kita labai svarbi gen grup, kurios transkript AS vertas ypatingo dmesio tai genai, kurie koduoja baltymus, lemianius augalo imunitet. Tarp toki gen yra tabako N (arba kitaip RSP4) genas. Jis koduoja R baltym, kuris lemia atsparum tabako mozaikos virusui TMV. Dl AS susidaro dvi io baltymo izoformos. Abi jos btinos visikam atsparumui TMV, nes viena kit papildo. Viena j viso ilgio sintetinama prie ir 3 val. po infekcijos, o kita trumpesn, pertraukta po 48 val. Tada gyjamas visikas atsparumas TMV. R gen AS yra bdas ivengti patogeno prisitaikymo prie gynybini augalo priemoni prie patogen.
AUGAL GENETIKA

| 283

Kaip jau minta, AS sukuriama baltymo izoform vairov gali bti atsakas vairius aplinkos, ypa stres sukelianius veiksnius, atsak sudtin dalis. Sukuriama baltymo izoform vairov leidia augalui geriau prisitaikyti prie pasikeitusi aplinkos slyg. Kai kurie baltymai, kuriuos koduojani gen transkriptui bdingas AS, yra tiesioginiai atsak dalyviai. Toks fermentas yra FeSOD (superoksido dismutaz). is fermentas inaktyvina superoksidin radikal O2, kuris susidaro ne tik oksidacinio ar kit stres, bet ir normaliomis slygomis. Tai irgi apsauginis baltymas. Dl AS susidaro dvi Fe SOD izoformos, kurios abi yra aktyvios. Kai kuri gen AS labai konservatyvus. Panaiai vyksta ne tik ryi ar vairenio, bet ir samanos Physcomitrella patiens lstelse. Tai nustatyta SR baltymus koduojantiems genams. AS sukuria ne tik baltymo izoform vairov, bet ir yra bdas reguliuoti geno raik. Taip, pavyzdiui, reguliuojama Solanaceae . augal geno PPCK2 raika. Genas koduoja ferment fosfoenolpiruvato karboksilazs kinaz. Dl AS susidaro du baltymai: visas (ilgas) ir pertrauktas (trumpas). Kai tik poreikis fermentui sumaja, sintetinamas pertrauktas baltymas. Alternatyviojo splaisingo tipai. AS vyksta panaiu bdu, kaip atsiranda splaisingo mutacijos: gali bti perokamas egzonas arba egzonai; isaugomas intronas arba intronai; paalinama dalis egzono arba paliekama dalis introno (5.25 pav.). Pastarasis susidaro dl alternatyviosios donoro (5-GU) arba alternatyviosios receptoriaus (3-AG) vietos, o gali bti ir dl abiej. Tarp j gali pasireikti ir nekanonins splaisingo vietos, kurios apskritai yra retos. Paprastai introno ribas ymi 5-GU ir 3-AG. Pvz., kukurz SR geno zmRSp31A alternatyvs transkriptai atsiranda dl nekanonini splaisingo viet: AU-GA, GU-AU, CU-AG, AA-AG, o jo ortologo RSp31B dl GU-UG, UA-AG. Pagal AS pobd augalai irgi skiriasi nuo gyvn. mogaus ir gyvn vyraujantis AS tipas yra egzono arba egzon perokimas. Be to, gali atsirasti alternatyvi poliadenilinimo vieta, dl kurios transkriptas netenka vieno ar keli C-gale esani egzon. Augal vyraujantis AS tipas yra introno isaugojimas. Tokio tipo yra apie 56 % alternatyvij vairenio transkript ir apie 53,5 % alternatyvij ryi transkript. Pagal intron paalinimo pobd intronai ir egzonai skirstomi : konstitutyviuosius, kurie, atitinkamai, paalinami arba ilieka visuose geno transkriptuose; alternatyviuosius, kuri ikirpimas ar isaugojimas priklauso nuo AS. 5.5.3.2. Alternatyvusis splaisingas ir autonominis ydjimo pradios kelias. Alternatyvusis poliadenilinimas ir autoreguliavimas Raidos program perjungimas i vegetacins reprodukcin. Ko gero, vienas didiausi augalo funkcins genomikos ypatum yra tai, kad augalas kelis kartus keiia raidos program ir kad jo morfologin raida gemalu nesibaigia, o praktikai vyksta vis augalo gyvenim. Raidos programa perjungiama: kai pereinama i gametofito sporofit, ar atvirkiai = pasireikia kart kaita;
284 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

sklos raidos metu: nuo zigotos (netgi dar neapvaisintos kiauialsts dar gametofito) iki visikai susiformavusio gemalo su apikaline (virnine) glio ir akn meristemomis: atskir program gyja centrin gemalo maielio lstel; ypatingomis slygomis gemalo raidos program gyja somatin lstel = tai dar vienas programos pakeitimas i somatins gemalo raidos program tai iskirtin augalo ypatyb; gemalo raidos pakeitimas vegetacin augimo program, perjungimas vyksta, kai skla dygsta; perjungimas i vegetacins reprodukcin raidos program: iedyno, iedo susidarymas. Ypa sudtinga daugiamei augal, medi program kaita. Tam reikia papildom reguliacini gen, todl toks didelis tuopos transkripcijos veiksni skaiius (r. 5.14 pav.). ydjimo pradios kontrol. Metas ydti! fraz geriausiai paaikina raidos programos pasikeitimo pobd. Augalui ateina metas ydti, ir jo vegetacins raidos programa yra keiiama reprodukcin. glio virns meristemoje susidaro iedyno/iedo meristema. I jos vystosi iedynas ir iedas. Be to, iedyno ir iedo meristem ir organ raid kontroliuoja skirtingos gen grups, taiau svarbiausi yra genai, kuri koduojami transkripcijos veiksniai neleidia augalui ydti, kol neatjo tam metas. Toki gen yra keletas, bet tarp j, bent kol, kas centrinis yra FLC (FLOWERING LOCUS C). FLC nra blogas, greiiau atvirkiai. Jo paskirtis itin svarbi neleisti ydti, kol tam neatsirado btinos slygos: augalas nepasiek tokio vegetacins raidos laipsnio, kad pajgt imaitinti reprodukcinius organus, sklos ir vaisiaus augim ir sukaupti pakankam kiek atsargini mediag; yra reikiamos aplinkos slygos ydjimui ir sklos/vaisiaus raidai, pvz., baigsi iemos/alio periodas (vernalizacija) ar sukaupiama pakankamai fotosintezs produkt (fotoperiodizmas). Augalai pagal ydjimo pradios kontrol labai vairs, todl pagrindinius ydjimo kontrols mechanizmus papildo saviti konkreioms augal grupms ar net konkreiam augalui bdingi kontrols bdai. Vien augal (efemer) vegetacin faz labai trumpa, kiti ydi tik antraisiais raidos metais (dvimeiai, pvz., kopstai), o kaln olinis augalas ferula (Ferula) praysta tik septintais metais ir ydi tik vien kart, paskui nunyksta. Medi ir kit daugiamei augal vegetacin-reprodukcin raida kartojasi ciklikai, bet daniausiai ciklinis kartojimasis prasideda ne i karto. Augalas pradeda ydti tik tada, kai subrsta, po didesnio ar maesnio grynai vegetacins fazs met skaiiaus. ios augal vairovs genetins prieastys irgi yra tiriamos. FLC genas centrinis ydjimo pradios supresorius. Jis koduoja MADS eimos (r. 5.5 intarp) transkripcijos veiksn. is baltymas pagal veikimo pobd yra represorius. Jis slopina bent du iedo meristemos integratorius. Tai FT (FLOWERING LOCUS T) ir SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1). FLC geno mutantai flc flc yra anksti ydintys. Be to, jiems nereikalinga vernalizacija. Vairenio Landsberg erecta ekotipo augaluose FLC geno paties didiausio 3-ojo introno 3 gal yra siterps Mutator-like tipo transpozonas. Tad, i esms, tai introno mutantas. Be to, io ekotipo
AUGAL GENETIKA

| 285

augaluose mutacija vykusi FRIGIDA gene, kuris normaliai skatina FLC geno raik. Dl i aplinkybi Ler ekotipo augaluose FLC geno raika yra labai silpna. Visai prieingas vairenio genotipas gautas panaudojus kaip papildomas geno kopijas FLC transgenus. Rezultatas pralenk bet kokius lkesius. Vairenis i vienmeio augalo virto dvimeiu augalu, todl manoma, kad kaip ydjimo slopiklis FLC TV veikia reostato principu: kuo jo maiau, greiiau ydima; didinant FLC TV kiek, vis labiau udelsiama ydjimo pradia (r. 5.8 pav.). FLC geno kontrol. Keturi kontrols keliai. Pagrstai manoma, kad ydjimo pradios kontrol dar sudtingesn, negu pavaizduota 5.26 pav., nes ia pateikti tik pagrindiniai ydjimo pradios kontrols genai ar netgi tik j grups (vernalizacijos, autonominio, alio, viesos/fotoperiodo, giberelino keli) ir vadinamieji genai integratoriai SOC1, TSF/FD, FT, LFY. Jie suderina visus gaunamus signalus ir aktyvina iedo meristemos genus, tarp j AP1.

5.26.pav. ydjimo kontrol vairenio genome:

Genai: ydjimo slopiklis (supresorius) FLC (FLOWERING LOCUS C) j nuslopina vernalizacijos genai; fotoperiodizmo genai GI (GIGANTEA) ir CO (CONSTANS) j raik vairenio lap gyslose suadina ilgabang viesa; ydjimo integratoriai: FT (FLOWERING LOCUS T) jo baltymas yra florigenas, veikia kartu su FD (FLOWERING LOCUS D), suadina kitus integratorius SOC1 (SUPRESSOR OF CONSTANS 1) ir du iedo meristemos genus AP1 (APETALA1) ir LFY (LEAFY) (pagal L. Corbesier and G. Coupland. Journal of Experimental Botany, 2006, Vol. 57, P. 33953403). Veikia ir kiti ydjimo pradios slopikliai, ne tik FLC genas. Be to, jie pasireikia apeinant FLC. FLC genas vairenio genome turi net penkis homologus MAF (MADS AFFECTING FLOWERING 15). Vienas j atrastas anksiau, todl danai vadinamas kitu pavadinimu FLM (FLOWERING LOCUS M). Dl i gen ydjimo pradia slopinama iki reikiamo momento ir tada, kai nra aktyvaus FLC geno, veikia savarankikai. Bet FLC geno pagrindinis vaidmuo, matyt, iliks ir kaupiantis naujoms inioms apie ydjimo pradios kontrol. Pasirodo, FLC koduojamas MADS transkripcijos veiksnys tiesiogiai jungiasi su CArG cis elementais SOC1 ir FD promotoriuose ir pirmuoju intronu FT gene. Pastarasis genas, 2005 m. sensacija, koduoja florigen, veiksn, kuris pasigamina lapuose. Vliau perneamas glio virn (SAM) ir ten sveikauja su FD. Btent veiklus integratorius yra (FT+FD) kompleksas. FLC slopina FT ir glio meristemoje ir lapuose. ios sveikos rodytos imunoprecipitacijos metodu, todl nekelia abejoni ir tik dar labiau sustiprina FLC, kaip ydjimo pradios reguliatoriaus,svarb. Suprantamas dmesys ir paties FLC geno reguliacijai. FLC genas reguliuojamas labai sudtingai: jo veikl reguliuoja ne tik transkripcijos veiksniai: vieni j FLC raik skatina, kokie yra, pvz., FRIGIDA grups genai, kiti, atvirkiai, slopina, kaip tai daro autonominio kelio genai;
286 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

dalis i veiksni patys patiria potranskripcin modifikavim ir nuo to priklauso j aktyvumas, o tuo paiu poveikio FLC stiprumas: pats FLC irgi reguliuojamas po transkripcijos; FLC ir j kontroliuojantys veiksniai yra reguliuojami epigenetiniu bdu, be to, irgi labai sudtingai: vieni genai FLC lokuso chromatin aktyvina, daniausiai di-, trimetilindami histonus H3 ir H4 FLC promotoriaus srityje; kit, pvz., autonominio kelio gen FLD, LD, FVE koduojami baltymai FLC chromatin slopina; Svarbiausia, FLC geno raika priklauso ne tik nuo vidini, bet ir nuo iorini aplinkos veiksni: alio ir kario, apvietimo slyg (viesos kokybs ir dienos/nakties santykio ir kt.). ydjimo pradios kontrol labai spariai pasipildo naujais faktais ir genais. Netgi integratori gretas papild naujas genas FD, sin. TSF (TWINSISTER OF FT), kuris koduoja bZIP TV ir priklauso nuo viesos kokybs, o taip pat vernalizacijos ir autonominio kelio gen, nes yra kontroliuojamas FLC geno. Kita vertus, svarbus vaidmuo ydjimo pradiai kontroliuoti skiriamas miRNR.

Kaip apibendrinimas iki iol turimoms inioms, skiriami bent keturi ydjimo pradios kontrols keliai (5.26 pav.). Vernalizacija btina iemojantiems/ieminiams augalams. Tai alt dien skaiius, be kurio augalas neydt. Tuo galima sitikinti pasjus ieminius rugius ar kvieius pavasar. Augalas krmijasi, bet iaudas nesusidaro. Pagal reakcij em temperatr, btin augalo raidai, augalai skirstomi ieminius, vasarinius ir tarpinius. ieminiai augalai be reikiamo alt dien skaiiaus visai neydi arba kaip vairenis ydi labai udelstai. Pagreitinti jo ydjim utenka alio oko. Btina skirti vernalizacij bd reguliuoti augalo raid nuo tolerancijos (atsparumo) aliui. Tai skirtingos savybs, kontroliuojamos skirting gen. Fotoperiodizmas susijs su kitu aplinkos veiksniu viesa, cirkadiniais ritmais viesa/tamsa, diena/naktis. Be to, sigilinus aikja ir augalo priklausomyb nuo viesos kokybs spinduli spektrins sudties, kuri ms platumose keiiasi: vienokia yra pavasar, kitokia - vasaros pabaigoje/ruden. Tai papildomi signalai augalo raidai, ypa daugiameiams augalams. Prisitaikymas prie cirkadinio ritmo diena/naktis yra ir signalas, kad augalas sukaups pakankamai itekli ydjimui, skl ir vaisi brandinimui. Taiau yra ir kita io kelio dalis: tam tikras reikiamo ilgio dien skaiius. Jis netgi tos paios augalo ries skirtingoms veislms yra nevienodas. Kaip augalas tvarko savo kalendori: skaiiuoja, kiek dien j veikia altis, ar ilga/trumpa diena, yra viena i aktuali genetikos problem. Pagal fotoperiodizm augalai skirstomi ilgadienius (tarp j vairenis), trumpadienius ir neutralius, kuriems dienos/nakties santykis nesvarbus. Vernalizacijos ir fotoperiodizmo keliai atsirad istorikai, priklausomai nuo aplinkos, kurioje augalai met metus gyvuoja. Pvz., apie pusiauj, kur dienos/nakties santykis nesiskiria, auga vairenio ris A.suecica, kuri fotoperiodizmui neutrali. A. thaliana priklausomai nuo istorini slyg atsirado ekotipai. Daugelis vairenio ekotip yra ieminiai ir ilgadieniai. Jiems btina vernalizacija ir ilga diena. Taiau yra keletas vadinamojo. greitojo ciklo ekotip (Shakhdara, Wilna-2, Cvi, Kondara, Kz-9), tarp j ir pagrindiniai laboratoriniai ekotipai Col (Columbia), Ler (Landsberg erecta), kuriems vernalizacija nereikalinga. J atsiradimo prieastys ne maiau domios. Nustatyta, kad vyk mutacijos vernalizacijos gene FRIGIDA ir/ar labai susilpnjusi pagrindinio ydjimo stabdio geno FLC raika.

AUGAL GENETIKA

| 287

Giberelino kelias tampa akivaizdus, kai augalas dl nepalanki augimo slyg nustoja augti ir vystytis, o kai atsiranda palankios slygos, vl ie procesai atsinaujina. Augimo ir raidos slopinimas, kaip ir atsinaujinimas yra reguliuojami transkripcijos veiksni. Augalo augim slopina TV, kurie turi DELLA domen, o procesus aktyvina genai, kurie reaguoja giberelin, turi atitinkamas cis sekas (r. 5.1 lentel). DELLA domen, pvz., turi
GAI (GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE), RGA (REPRESSOR OF GAI 1-3), RGL-1

is kelias vienodai svarbus ieminiams/vasariniams, ilgadieniams/trumpadieniams augalams. Autonominis kelias pirmiausia aptiktas neutraliuose augaluose, tarp j tabake (Nicotiana tabacum). Tabako augalai keli engia pasiek tam tikr lap/bambli skaii ant stiebo. Klonavus tokio augalo virn, prigijs augalas ydi kur kas anksiau negu augalas, iaugs i sklos. Be to, pats augalas nedidelis, iaugina nedaug lap. Kas kita, jeigu virn nupjaunama ir klonuojama nuo augalo, kuris pastas i sklos, bet dar maas ir turi nedaug lap. Klonui iki ydjimo teks nueiti vis keli. Be indukcijos autonominio kelio genai aktyvs ir flc flc mutantuose, taip pat vairenio ekotipuose, kurie turi silpn FLC alel. Tai Shakhdara ir Kondara i Tadikijos, Kz-9 i Kazachijos, pagaliau gerai inomas ekotipas Landsberg erecta. J genome normaliai pasireikia autonominio kelio genai, nors j paskirtis yra slopinti FLC. Manoma, kad jie slopina liekamj FLC raik ir FLC homologus. Taip pat sitikinta, kad augalui engus autonomin ydjimo keli, ydjim tik laikinai gali pristabdyti nepalankios slygos. Atsiradus galimybei, jis vl atnaujinamas (pasireikia giberelino kelias). Augalas genome turi visus reikiamus genus susidaryti iedo meristemai ir organams, tik reikia, kad inykt visi stabdiai, kurie neleidia augalui ydti. Vis keturi ydjimo keli pagrindinis tikslas yra bendras: ydjimo pradia, taiau sprendiami skirtingi udaviniai. Giberelino kelio gen tikslas slopinti DELLA baltymus ir juos nukreipti proteosomas. Gana panas, bent formaliai, yra ir vernalizacijos ir autonominio kelio tikslai: slopinti FLC (ir galbt jo homologus), taiau tai atlieka skirtingos gen grups. Vernalizacijos metu aikiai isiskiria dvi skirtingu metu pasireikianios gen grups. Viena j, kurios lyderis yra FRIGIDA genas, padeda FLC slopinti ydjim, kol augalui nesibaig vernalizacija (nesulauk reikiamo alt dien skaiiaus). Tai FRL-2, VIP4, VIP6 ir kt. J skaiius vis dar pasipildo naujais (FLM, SVIP, TFL1, TFL2). Prieingo veikimo genai pradeda veikti, kai augalas baig vernalizacij. Jie slopina FRI, FLC ir kitus ydjimo supresorius, tai VIN3 (VERNALISATION INSENSITIVE 3), VRN, VRN2. Manoma, kad jie pakeiia chromatino sandar FLC lokuse ir taip nuslopina gen. Panaiai veikia ir kai kurie autonominio kelio genai (FLD, REF6, FVE, MGO3).
Kai kuri supresori koduojami TV gali tiesiogiai jungtis su genais, kurie yra ydjimo integratoriai, pvz., MADS veiksnys SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE) pats jungiasi su integratoriaus FT (FLOWERING TIME) CArG cis elementu. Netgi vernalizacijai aptiktas kelias, kuris aplenkia FLC gen. Manoma, kad vernalizacijos genai gali tiesiogiai sveikauti su integratoriais FT, SOC1 (SUPRESSOR OF THE OVEREXPRESSION OF CO/AGAMOUS LIKE 20) ir, be to, su naujai atrastu integratoriumi AGL24.

(RGA-LIKE1), SPY (SPINDLY) genai.

288 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Kita vertus, vernalizacijos, fotoperiodizmo ir autonominiame kelyje pagrindinis vaidmuo tenka FLC genui (r. 5.26 pav.), kurio koduojamas TV sveikauja ne tik su SOC1, FT, bet ir dar su vienu naujai atrastu genu integratoriumi, pavadintu FD. Kitaip pavadintu TSF (TWEEN SISTER OF FT) dl labai didels FT (82 %) aminorgi homologijos. Autonominio kelio genai (5.5 lentel) kas metai pasipildo genu. Lentelje nepateiktas dar vienas naujas genas MGO3, kuris kaip nedaugelis turi net tris pavadinimus: MGO3 (MGOUN3), BRU (BRUSHY) ir TSK (TONSOKU) skirtingomis kalbomis, nes j atrado skirtingos mokslinink grups. Vadinasi, net jo pavadinimas nenusistovjs, bet jau inoma, kad tai chromatino modifikavimo genas, kuris reguliuoja ir FLC gen. FLC lokuse deacetilinamas histonas H3, o deacetilinimas paprastai slopina geno raik. Taiau, kad MGO3 priklauso autonominio kelio gen grupei, dar reikia rodyti. Abejoni kelia tai, kad is genas pasireikia ir glio (SAM) ir akn (RAM) virnli meristemose. Mutantui mgo 3 bdingi stiebo ir gli suaugimai (fasciacijos), ne vietoje (ektopiniai) pasireikia iedo organ genai AGAMOUS, SEPALATA, PISTILLATA.
5.5 lentel. Vairenio autonominio ydjimo kelio genai ir j koduojami baltymai Genas
FCA FPA FLK (FLOWERING LATE KH MOTIF) FY1 LD (LUMINIDEPENDENS) FLD(FLOWERING LOCUS D) FVE REF6(RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6)

Baltymas
Jungiasi prie RNR, N-gale turi du RRM motyvus ir C-gale WW aminorgi sek turi tris RRM motyvus

turi tris KH motyvus

Poliadenilinimo veiksnys, turi 7 WD-40 ir dvi PPLPP aminorgi sekas HD baltymas Chromatino remodialiavimo: susijs su HDAC2 Chromatino remodialiavimo: MSI1 homologas,3 turi ND-kartotin sek ir yra su RB susijusio baltymo homologas Chromatino remodialiavimo: vadinamasis Jumonji/Zn ,,pirteli TV, jam bdingas ir histon demetilazs aktyvumas

1 FY sveikauja su FCA, skatina FCA pre-mRNR alternatyvj splaising; 2 lizinspecifins histono demetilazs LSD1 homologas; 3 FVE yra su retinoblastomos baltymo (RB) homologu augaluose susijs baltymas. RB tiesiogiai reguliuoja meristemos raid.

genai, kurie kontroliuoja FLC ir kitus genus j transkripto brendimo metu, turi jungimosi prie RNR domenus, bet vl jie yra dvejopi: vien koduojamas baltymas turi RRM (tai FCA, FPA), o kit koduojamas baltymas, konkreiai FLK, turi kit jungimosi su RNR motyv KH, kuriuo irgi jungiamasi su RNR; kita autonominio kelio gen grup, btent FLD, FVE, ir ELF6, slopina FLC gen epigenetiniu bdu. Maina FLC lokuso histon acetilinim, o tuo paiu ir FLC geno raiAUGAL GENETIKA

pes:

Kitus pripaintus autonominio kelio genus (5.5 lentel) galima suskirstyti dvi gru-

| 289

k. FLD ir FVE baltymai deacetilina FLC lokuso chromatin dviejose vietose: apie transliacijos pradios tak ir ties seka, kuri koduoja 1-j FLC pre-mRNR intron. ELF6 genas irgi maina FLC lokuso histon acetilinim. Jo koduojamas baltymas turi Jmj domen ir keturis C2H2-Zn pirteli domenus. Kitas labai homologinis ir panaios sandaros baltymas REF6, atvirkiai, aktyvina FLC lokus. Nors tai galutinai nerodyta, bet ir LD(LUMINIDEPENDENS) genas, nors ir koduoja HD baltym, yra chromatino remodeliavimo genas. Irgi slopina FLC gen, keisdamas chromatino sandar FLC lokuse. Tokia ivada daroma, kad ir kitas VIN3 genas, kuris priklauso FRIGIDA gen grupei ir, atvirkiai, sustiprina FLC raik, irgi koduoja HD baltym. Konkreiai vadinamj PHD, nes be homeodomeno dar turi Zn-pirtel(r. 3.3 intarp). Dar vienas, jau deimtas, genas HAC1 pretenduoja autonominio kelio gen grup Jo koduojamas baltymas jungiasi su FLC mRNR kepure, priklauso CBP80 baltym grupei. HAC1 savitai slopina FLC gen. Be to, kartu su kitais dviem CBP/P300 baltymais, kurie jungiasi prie kepurs. Netiesiogiai ie baltymai irgi keiia chromatino remodeliavimo pobd. Tad neaiku, kiek dar nauj autonominio kelio gen bus atrasta. FCA geno alternatyvusis splaisingas, autoreguliavimas ir autonominio kelio kontrol. Kol kas nei vienas autonominio kelio genas nra taip isamiai itirtas, kaip FCA. Tai dl io geno autoreguliacijos alternatyviojo splaisingo (AS) bdu. Vairenio mutantas fca yra vlai ydintis (5.27 pav., A) Udelsto ydjimo pavyksta ivengti dvigubame mutante fca flc arba kai FLC genas nuslopinamas antiprasmine FLC mRNR. Tad tikinamai rodyta, kad FCA genas slopina FLC geno raik. FCA geno valdymo ypatumai paaikina itin svarbi problem: kodl dauguma augalo lsteli yra vegetatyvinio augimo fazje, nors genome yra visi ydjimo kontrols ir iedo/generatyvini organ genai. Problema daug kuo primena lstels ciklo reguliacij gyvn somatinse lstelse. Visais bdais udrausta, kad tik lstel nepradt dalintis. Taip ir ia. Visais bdais udrausta, kad tik lstel nepakeist vegetatyvins programos reprodukcin program. Tai paaikina ir i pirmo vilgsnio domi padt: dauguma FCA transkript dl AS yra neaktyvs. FCA genas turi 20 egzon, ir alternatyvusis splaisingas vyksta 3-ajame arba 13-ajame intronuose (5.27 pav., B ir C). Susidaro keturi skirtingi transkriptai. Jie ymimi , , , ir j dalis atitinkamai yra 1 %, 54, 10, 35 %. Aktyvi FCA izoforma yra , kuriai yra paalinti visi intronai. Kaip galjome sitikinti, jos susidaro tik apie tredal. Baltymas turi du RRM motyvus, kuriais jis sveikauja su mRNR ir WW domen, kuriuo sveikaujama baltymas-baltymas. is domenas labai svarbus, nes juo sveikaujama su kitu autonominio kelio geno FY koduojamu baltymu (5.27 pav., C). Taiau, kaip aikja, FCA baltymo C-gale yra ir daugiau labai svarbi aminorgi sek. Su viena j sveikauja papildomas saugiklis, neleidiantis pasireikti netgi aktyviai FCA izoformai. Tai abscizo rgties jungimosi vieta.

290 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

C 5.27 pav. Vlai ydintis fca-1 mutantas (A), FCA mRNR izoformos po alternatyviojo splaisingo (B) ir FCA, FY, FLC gen sveika ir ydjimo kontrol (C):
(A, B pagal V. Quesada et al. EMBO Journal. 2003, Vol. 22, P. 31423152; C V. Quesada et al. International Journal of Development Biology. 2005, Vol. 49, P. 773780).

Gausiausias yra FCA transkriptas. Jis turi tik iek tiek daugiau kaip N-gal. Nra RRM ir WW (gausaus prolino) domen. Jis atsiranda dl alternatyviojo splaisingo ir ne vietoje atsiradusios poliadenilinimo vietos 3-ojo paties didiausio introno viduje (5.27 pav., B). Atkerpama ir ilieka transkripte tik dalis io introno. Vl vienas paradoksas: poliadenilinimui viet nustato ir tuo paiu neaktyvios FCA izoformos polipeptido susidarym reguliuoja FCA ir FY kompleksas, kai FY baltymas prisijungia prie WW domeno (5. 27 pav., C). Vadinasi, FCA genas pats save reguliuoja. Kita vertus, labai svarbs yra baltymai, kurie parenka alternatyvisias poliadenilinimo vietas. Autoreguliacija tuo nesibaigia. Susidars FCA transkriptas savo eile, bent kai kuriose lstelse gali reguliuoti FCA transkript pasireikim. Tai nustatyta transgeniniu FCA be intron. FCA slopino transgeno pasireikim glio ir akn virnlse, jaunuose iedpumpuriuose. Geno FCA transkripto, kaip ir FCA-transkripto, ikirpti visi intronai, taiau dl AS 13-ajame introne (5.27 pav., B) ne vietoje susidaro stop kodonas. Dl ios prieasties transliacijos metu FCA prarandamas WW domenas. Kol kas ir FCA paskirtis nra iaikinta. Visas dmesys ir FCA transkriptams. Nepavyko rodyti, kad transkript ,,, santykis keistsi, kai kaitaliojamos aplinkos slygos arba anksti ydiniuose mutantuose ap1-1 ir tfl1-2.

Vl du antagonistai: abscizo rgtis ir giberelinas. Giberelino keli, nors trumpai, jau aptarme. Prisiminkime antagonistinius abscizo rgties (ABR) ir giberelin santykius, kai skla brsta ir dygsta (r. 3.1 ir 3.4.4 sk., 3.2 ir 3.5 intarpus). Abscizo rgtis neleidia sklai dygti, o giberelinai, atvirkiai, skatina sklos dygim. Tik nelaim, jeigu is dviej hormon karas sutrinka, kaip tai atsitinka viviparous mutantuose. Sklos/grdai sudygsta ne laiku, dar derliaus nenumus.
AUGAL GENETIKA

| 291

Lygiai taip subtiliai abscizo rgtis reguliuoja ydjimo pradi ir tai atlieka per FCA gen. Nustatyta, kad FCA baltymas pasireikia ir kaip hormon abscizo rgties ir etileno jutiklis. FCA baltymo gale, u RRM ir WW domen yra nekonservatyvi aminorgi seka, su kuria jungiasi ABR. FCA+ABR kompleksas neleidia prisijungti prie FCA baltymo FY baltymui. Tik kai FCA isilaisvina i ABR gniaut, prie FCA galo (kitos vietos, negu kai slopinama FCA raika) prisijungia FY. Manoma, kad FCA+FY kompleksas i 3-galo slopina FLC gen , nes pats FLC transkriptas nesikeiia. FCA baltymo C-galas i ties intriguojantis. Prie jo jungiasi FCA ABA Swi/Snf chromatino remodeliavimo komplekso erd sudaranFCA FCA FY tis At SWI3B baltymas, ir ta vieta irgi yra u WW domeno rib. Tad FCA reguliuojamas sudtingiau, negu anksiau manyta: ne FCA FCA tik alternatyvij splaisingo ir poliadenilinimo, bet ABR, o taip pat ir chromatino remodeliavimo bdu. Neydi ydi Ir FCA geno alternatyviojo splaisingo tipas, ir reikm nra dar visikai itirti. Pvz., miei aleurone yra ABAP1 baltymas, kuris yra ABR atsako baltymas, vadinasi, slopina aleurono lsteli funkcij. Savo C-galu jis yra visikai tapatus FCA, tik neturi RRM domen bding FCA:
FCA ABAP1
RRM RRM Q Q WW WW Q Q

Manoma, kad tai irgi FCA geno alternatyviojo splaisingo produktas, pertraukta, tik i kito galo, izoforma. Vl viskas i naujo. Laikrodis persukamas atgal (angl. reseting). Epigenetini ir potranskripcins gen raikos kontroliavimo mechanizm gausa ydjimo keliuose neatsitiktin. Tai yra lengviausias kelias grti atgal pradin padt. DNR nukleotid sekos nuo to nesikeiia, tad isaugojama pradin genetin informacija. Panaiai kaip induoli genomo ,,imprintingo, kai pradeda susidaryti induoli generatyvins lstels, visi iki tol buv laikini reguliaciniai mechanizmai inyksta. Potranskripcins ir epigenetins gen raikos kontrols mechanizmai yra patogs ir tuo, kad leidia kaupti patirt viena kryptimi, kad ir pagal laipsnikai didjant ar majant transkript kiek. Kita vertus, augalo genome yra reguliaciniai genai, kurie isaugo kamienines lsteles (nediferencijuot meristem) pradins bsenos. Vienas i toki gen yra EMF2. Dl jo veiklos meristemos lstels normuotai pereina i vegetatyvins programos ydjimo/reprodukcin program. Tad palaipsniui susidaro nauji ir nauji iedai. Mutanto emf2 labai greitai atsiranda virninis iedas ir susidaro labai nedaug ied.

292 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

5.6. Signal pernaa ir signalo molekuls. Meristemos. ydjimo kontrol. Cirkadiniai reikiniai. Florigenas. Sisteminiai atsakai ir imuniteto pagrindai
5.6.1. Plazmodezmos ir reguliaciniai ryiai tarp lsteli. Simplastas Koordinuota gen raika tarp augalo dali. Augalas neturi toki puiki signal perdavimo sistem kaip humoralin-kraujotakos ar nerv sistemos, kurias turi gyvnai, bet signalai yra ineiojami po vis augal. Tai ypa pasidaro ryku, kai augal paveikia stresas vienoje vietoje (lokaliai), o atsakas stres iplinta po vis augal. Tai vadinama bendruoju, arba sisteminiu, atsaku. Tai gali bti mechaninis augalo paeidimas ar vabzdio (amaro) kandimas, ar kokio patogeno (viruso, bakterijos, grybo) lokalus paeidimas. Pasireikia bendrasis (sisteminis) atsakas stres arba patogen. Pastaruoju atveju is reikinys apibdinamas kaip sisteminis gytas atsparumas (angl. SAR Systemic Acquired Resistance). Prie koordinuotos gen veiklos augale prisideda mineralini mediag gabenimas lapus, o fotosintezs produkt po vis augal. Ypa svarb reguliacin vaidmen atlieka cukrai per j valdomus reguliacinius genus. Dl ios prieasties cukrai iuo metu vertinami kaip hormonai. Signalai perduodami dviem pagrindiniais keliais: i lstels lstel per plazmodezmas; po vis augal ind sistema (floema ir ksilema.) Plazmodezmos. Simplastas ir apoplastas. Plazmodezmos (5.28 pav.) tai gana sudtingos sandaros kanalliai, kurie jungia vien augalo lstel su kita. Unikali, bet, matyt, priverstin augalo ypatyb, nes augalo vien lstel nuo kitos skiria lsteli sienels. Jeigu jose nebt kanalli, tarplsteliniai ryiai bt nemanomi. Plazmodezmos sujungtos su lstels vidinmis pernaos struktromis (endoplazminiu tinklu, Goldio kompleksu), o per jas su lstels branduoliu. Tad susidaro bendra protoplazm sistema simplastas, o lstels sieneli su jose esani ertmi, kanalli sistema apoplastas.

5.28 pav. Plazmodezmos schema:

ET endoplazminis tinklas, J jungtys tarp vidins ir iorins dali; R jungtis su ET; VD vidin dalis/erdis (pagal P. Zambryski. Journal of Cell Biology. 2004, Vol. 164, P. 165168).

AUGAL GENETIKA

| 293

Plazmodezmos skirstomos dvi grupes: pirmines, kurios susidaro citokinezs metu ir yra paprastesns sandaros, bet labai svarbios gen (ypa raidos) raikos reguliavimui: per jas palaikomi ryiai tarp vieno klono lsteli; antrines, kurios atsiranda tarp lsteli, negimining klono ryiais. is suskirstymas esminis, nes labai svarbi transkripcijos veiksni ir j reguliatori pernaa i vienos lstels kit, bdinga jaunoms meristemos lstelms. Ji yra raktas, kaip susidaro diferencijuot lsteli klonas. i lsteli netgi plazmodezm diametras yra didesnis, o sandara paprastesn, kad nebt apsunkinti ryiai tarp lsteli ir galt lengviau pro plazmodezmas praeiti makromolekuls. Keista, bet suvokti kaip vyksta makromolekuli pernaa per plazmodezmas ir karniena, padjo augalini virus tyrimai. Augal virusai tiesiog kaip piratai ugrobia pernaos keli. Pirmiausia, buvo nustatyta, kaip keiiamas plazmodezmos diametras, kad galt pereiti stambios molekuls, kokios yra virusins RNR. Kita vertus, aptikti pernaai reikalingi viruso koduojami MP (Movement Protein) baltymai. RNR molekuli pernaai tirti netgi kaip modelis danai yra naudojama viroid RNR, kuri yra maos molekulins mass, pvz., bulvi PST (Potato Spindle Virus) yra tik 359 nukleotid ilgio. Taip pavyko nustatyti, kad ir RNR pernaa per plazmodezmas yra genetikai numatyta. Perneamos tik tos RNR, kurios turi tam skirtas nukleotid sekas, panaiai kaip to reikia pernaai per branduolio por kompleks. Pagal tai RNR ir baltymai yra skirstomi dvi grupes: lstels autonominiai, neieina u lstels rib; lstels neautonominiai, kitaip NCAP (Non Cell Autonomous Protein), perneami plazmodezmomis arba floema kitas lsteles ar netgi dideliais atstumais. Dalis neautonomini baltym yra tiesioginiai pernaos vykdytojai per plazmodezmas ar floema (karniena), tarp j MP ir CP, kurie reguliuoja plazmodezmos plyio, pro kur pereina molekuls, diametr, vadinamj SEL (nuo Size Exclusion Limit). Anksiau manyta, kad maas plazmodezmos diametras (24 nm) yra klitis pereiti pro j makromolekulms. iuo metu, ne be virus tyrim, sitikinta, kad kai reikia, plazmodezma keiia diametr, panaiu bdu kaip gyvat ar altys rydami varl, ir tai reguliuoja MP ir CP (viruso apvalkallio) baltymai. Plazmodezmos anga gali ir visai usidaryti nepraleisdama joki molekuli. Tad molekuls pro plazmodezm praleidiamos pasirinktinai. Toks pasirinkimas ypa svarbus augalo embriogenezei. Tai nustatyta naudojant specialiai sukonstruotus transgenus, kurie vadinami MSG (Meristem Specific GFP). Jie ekspresuoja vairaus dydio tirp aliai fluorescuojant baltym GFP. Pvz., nustatyta, kad 27 kDa dydio transgeninis baltymas laisvai juda po vis gemal nuo erdies iki torpedos stadijos vidurio (r. 3.2.1 sk.), o apskritai gali judti transgeninis baltymas, kurio dydis yra iki 54 kDa. Be to, simplastas pasidalija atskirus domenus (skyrius), kuri dydis keiiasi gemalo ir sklos raidos metu. Tad neautonomins RNR ir baltymai simplasto domene gali judti tik iki tam tikro laiko, kol nepasikeiia simplasto domeno ribos. Kita vertus, vairiuose gemalo ir meristem audiniuose SEL yra nevienod matmen ir praleidia nevienodo dydio makromolekules. SEL dydiui reguliuoti labai svarbs motoriniai baltymai aktinas ir miozinas. Per plazmodezm molekuls juda difuziniu bdu arba perneamos speciali neikli. Vienas i toki baltym CmPP16 aptiktas moligo ir
294 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

(Cucurbita maxima) floemoje, bet yra ir plazmodezmose. is baltymas panaus virus MP ne tik paskirtimi, bet ir aminorgi sekomis. Perneam plazmodezma baltym erdvin sandara gali bti keiiama aperon. Taip, pvz., modifikuojamas transkripcijos veiksnys KNOTTED1 (KN1). aperonai keiia ir SEL diametr. Baltymai, kaip ir plazmodezma perneamos RNR, turi pernaos plazmodezma signal. J turi ir KN1 baltymas. Labai patogus glio meristemai tirti modelis yra bulvi stolonas, poeminis stiebas, i kurio iauga bulvs gumbas. Taip, pvz., nustatyta, kad karniena juda ne tik KNOX, bet ir kitas HD TALE TV BEL5-LIKE. Jis gabenamas stolono virn, i kurios iauga bulvs gumbas. Transkripcijos veiksniai, kurie gabenami plazmodezmomis i vien lsteli kitas. Labai svarbs gyvn raidos vykiai yra reguliuojami TV pernaos i vien lsteli kitas. Taip buvo aptikti drozofilos motininiai genai, kuri produktai pasigamina motinos lstelse ir gabenami ovocit. Tai nulemia bendrj bsimo individo raidos plan. Perneama bicoid, nanos ir kt. gen koduojama mRNR. Toki gen, kurie nulemt gemalo raidos plan, iekoma ir augalo genome (r. 3.2.3 sk.). Kita vertus, kyla klausimas, kas perneama i vien lsteli kitas: mRNR ar baltymas. tikinamai rodyta, kad i nematodo Caenorhabditis elegans inkarins lstels kaimynines lsteles perneamos ir nekoduojanios RNR. Inkarin lstel per joje sintetinamus TV nulemia kaimynini lsteli raid kiauintak. Kai ablacijos bdu sunaikinama lstel, kiauintakis nesusidaro. Panaus reikinys, vien lsteli determinuojantis poveikis kit lsteli raidai, neseniai aptiktas ir augaluose. Vairenio SHORT-ROOT (SHR) genas koduoja GRAS eimos TV. Genas nulemia akn endodermio raid, bet pasireikia stels periciklo lstelse. I j baltymas perneamas bsimas endodermio lsteles (5.29 pav.). Stels lstelse SHR baltymas aptinkamas branduolyje ir citoplazmoje, o endodermio lstelse tik branduolyje. Tai suprantama. Citoplazmin SHR forma yra paruota pernaai bsimas endodermio lsteles. Prisiminkime, kad TV turi prisijungti prie reikiam cis sek, valdom gen promotoriuose. Tai branduolio baltymai. SHR tapo puikus modelis tirti neautonominius TV. Nustatyta, kad pakeitus vien aminorgt izoleucin SHR baltymo VHIID domene treoninu, sutrinka ir SHR lokalizavimas branduolyje, ir pernaa kaimynines lsteles.

5.29 pav. SHR (SHORT ROOT) transkripcijos veiksnio pernaa i periciklo (stels) lstels kaimynines lsteles, kurios diferencijuojasi endoderm
St stel; En endodermis; v iev (korteksas); Ep epidermis; (r. tekst; pagal T. Kurata et al., Current Opinion in Plant Biology. 2005, Vol. 8, P. 600605).

AUGAL GENETIKA

| 295

Bet svarbiausia, kad surastas genas, kurio koduojamas baltymas riboja SHR baltymo plitim i lstels lstel. SHR baltymas neaptinkamas ievs lstelse. Tai geno SCARECROW (SCR), koduojamas irgi GRAS eimos TV. Panai pozicin raika nustatyta ir kitam aknyse pasireikianiam genui CAPRICE (CPC), kuris koduoja nedidel tik 94 aminorgi baltym. Tai labai paranki judjimui plazmodezma ypatyb: CPC mRNR aptinkama tik tose lstelse, kurios neturi plaukelio. akn plaukelis susidaro lstelje, kuri perneamas CPC baltymas:

domu tai, kad pasireikia savotika krymika TV raika. GLABRA3 (GL3) ir ENHANCER OF GLABRA 3 (EGL3) gen, kurie koduoja bHLH TV, mRNR aptinkama tik akn plaukelius turiniose lstelse, o baltymas, atvirkiai, perneamas lsteles, kuriose akn plaukelis nesusidaro. Kaip atsiranda augal chimeros? Vienas pirmj augal vien lsteli tak kit lsteli raidai tyr vokiei mokslininkas Vinkleris (H. Vinkler). Jis dar 19071916 m. dirbtinai kr augal chimeras ir iekojo taip vadinamj takos hibrid. Tik po daugelio met (Sessions et al., 2000) chimeros vl prisimintos ir panaudotos kaip modelis tirti transkripcijos veiksni perna i vieno glio virnins meristemos sluoksnio (L1) kitus du (L2 ir L3). Chimeros sukurtos keliais bdais, bet panaudoti transgenai. Vienas j: prie vairenio LEAFY (LFY) ar APETALA1 (AP1) gen, kurie koduoja iedo meristemos susidarym, prijungtas savitas tik L1 sluoksnio lstelms bdingas promotorius. Tad abu genai galjo pasireikti tik L1 lstelse. Tokie transgenai vesti dvigubo mutanto lfy ap1 genom ir: su rekombinantiniu LFY genu iedai isivyst normaliai, nes L1 susidars LFY TV buvo pernetas L2 ir L3 lsteles; AP1 genas yra autonominis, pasireikia tik tose lstelse, kuriose sintetinama jo mRNR, tad augalai buvo mutantinio fenotipo, nes genas pasireik tik L1 lstelse, o jo TV reikalingas L2-L3 lstelms. Labai panaiai, kaip akn plaukelius sudaraniose ir nesudaraniose lstelse, L1-L3 irgi yra atvirkiai pasireikiantis TV genas. Tai jau ne kart mintas HD TV koduojantis genas KNOTTED1 (KN1). KN1 TV aptinkamas L1 lsteli branduoliuose, bet io sluoksnio lstelse nerandama KN1 mRNR. Ji sintetinama L3 sluoksnio lstelse, ir TV perneamas L1 sluoksn. Tokia krymika lsteli raidos reguliacija apsikeiiant TV, matyt, yra neatsitiktin, o vienas i lsteli diferenciavimo ir specializavimo mechanizm. Suprantama, kad tai tik pradia. Ar plaiai paplits toks lsteli diferenciacijos mechanizmas, parodys ateitis. Meristemini lsteli paradoksas. Meristem lstels labiausiai nusiteik priimti svetimas RNR ir baltymus. J plazmodezmos yra didiausio diametro (turi didiausi SEL). domu tai, kad meristemas virusai prasiskverbia sunkiai arba visai nesugeba prasiskverbti. iuo reikiniu pagrsta labai svarbi biotechnologin priemon: iauginti devirusuot sodinamj mediag.
296 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Devirusuota sodinamoji mediaga iauginama, kai i meristemos lsteli regeneruojamas augalas. Lietuvoje tokia technologija pritaikyta bulvms (A. Bujausko) ir glininkysts kiuose dekoratyviesiems augalams (gvazdikams). Kol kas io reikinio mechanizmas neitirtas. Manoma, kad meristemos lstels atpasta viruso dvigrand RNR. Kita vertus, apsisaugoma ir nuo viruso MP baltym. Jie nepadeda viruso RNR prasiskverbti meristemos lsteles. Vadinasi, makromolekuli patekimas lsteles, ypa meristemos, labai grietai kontroliuojamas. Makromolekuli pernaa per plazmodezmas bdinga tik konkreioms molekulms ir lstelms, vyksta tik tam tikru laiku ir nustatyta kryptimi.
INCREASE SIZE EXCLUSION LIMIT OF PLASMODESMATA (ISE). Toki gen yra ir

Aptiktas genas, kurio koduojamas baltymas kontroliuoja plazmodezmos SEL, tai

daugiau. Gali bti, kad reikiama informacija pernaai reguliuoti yra ir paioje perneamoje molekulje. Tai nustatyta bent vienam i perneam per plazmodezmas TV, btent, kukurz HD TV KNOTTED1. Jis sugeba pakeisti plazmodezmos diametr (SEL). TV pernaos plazmodezmomis konservatyvumas. Bent kai kuri TV pernaa plazmodezmomis i vien lsteli kitas yra konservatyvusis poymis. Toki ivad galima padaryti, kai kukurzo (miglini eimos augalo) KNOTTED1 geno koduojamas TV palyginamas su ortolog vairenio genome KNAT1/BREVIPEDICELLUS ir SHOOT MERISTEMLESS (STM) gen koduojamais baltymais. Jie irgi perneami i vien meristemos lsteli kitas. Net judjimo vieta ir laikas sutampa. Kita vertus, sitikinta, kad ir iuo atvilgiu augalai yra vairs. Pvz., ioveinio (Antirrhinum majus) geno DEF (DEFICIENS) koduojamas TV yra neautonominis baltymas, juda per plazmodezmas, o jo ortologo vairenio genome koduojamas AP3 TV yra autonominis, aptinkamas tik tose lstelse, kuriose jis sintetinamas. Autonominis yra ir PISTILLATA baltymas, nors su iuo baltymu DEF sudaro heterodimerus. 5.6.2. glio meristemos raida ir ryiai tarp lsteli. Polipeptidai kaip signalo molekuls 5.6.2.1. Meristemos ir augimo reguliavimas. Virns vyravimas Pats organizm grups pavadinimas AUGALAS nusako vien pagrindini ir iskirtini augalo ypatybi: jis pastoviai auga. Nuo pastos sklos iki ydjim pasiekusio ir vaisi subrandinusio olinio augalo ar imtmeius auganio medio. Tai lemia meristemos, todl daug dmesio skiriama genams, kurie lemia j susidarym ir susiskaidym (diferenciacij) savitas onini organ, iedyno ir iedo ir kt. meristemas. Meristemos yra augalo iskirtin ypatyb. Augalas, kitaip nei dauguma gyvn, isaugo kamienines lsteles, kurios nepraranda gebjimo intensyviai dalintis ir diferencijuotis vairius organus, garantuoja augim ilg ir plot. Tik visa tai yra numatyta genetini program. Kamienini lsteli raidos pobdis priklauso nuo j padties ant augalo. Galima manyti ir atvirkiai, nes glio virns meristemoje (angl. santrumpa SAM Shoot Apical Meristem) ir tokios pat akn (RAM root AM)
AUGAL GENETIKA

| 297

lstelse veikia skirtingos gen grups, ir tas skirtumas atsiranda labai anksti, sklos gemalo raidos metu, dar globulje. Dar tada tampa aiku, i kurios lstels kils SAM, o i kurios RAM. irdies stadijoje SAM gyja pavidal, kuris beveik nesikeiia, kol augalas stiebiasi auktyn: susidaro augimo kgelis. Ilieka veikls ir tie patys SAM genai, daugiausia koduojantys HD eimos TV: SHOOT MERISTEMLESS (STM), WUSCHEL (WUS), Netgi onini (lateralini) meristem raid kontroliuoja tie patys genai kaip ir sklos gemale, pvz., CUC1-3 (CUP-SHAPED COTYLEDON 1-3). STM koduojami TV ankstyvosios irdies stadijoje suadina dar vien meristemos raidai svarb gen UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), kuris pasireikia SAM. Jo raika aptinkama tik maoje grupje L2 ir L3 lsteli, kuriose pasireikia ir STM genas. Manoma, kad UFO koduojamas baltymas nustato ribas tarp meristemos organ pradmen. UFO koduoja F-box baltym, kuris yra E3 ubikvitinligazs komplekso sudedamoji dalis ir paymi baltymus, kurie bus suskaidyti proteosomoje (r. 2.7 intarp). Dl SAM augalas auga auktyn, o dl RAM skverbiasi gilyn em, bet augimo pobdis irgi genetikai kontroliuojamas, nes aknys gali bti vairios: pagrindin ir onins arba apskritai kuoktins, o stiebas gali akotis ir nesiakoti. Ir augimas turi ribas. Pagal augimo pobd augalai skirstomi determinuotuosius ir nedeterminuotuosius. Determinuotj augal virn baigiasi iedu, toliau neauga. Nedeterminuotieji augalai teorikai turt augti neribotai, nes virn isaugo SAM, taiau riba vis tik yra. J lemia kiti veiksniai: senjimas, daugelio augal (ypa vienamei olini) vaisi ir skl reprodukcijos pabaiga, aplinkos veiksniai. Kokios bt prieastys, be gen neapsieinama. Vienu i toki gen yra TFL1 (TERMINAL FLOWER 1). Labai subtiliai reguliuojamas glio virns meristemos ir iedyno/iedo meristemos santykis. Gana danai ta pati augal ris turi determinuotsias ir nedeterminuotsias formas ar veisles, pvz., pomidorai, irniai. Tai gali bti netgi speciali selekcijos program tikslas, pvz., sukurti determinuotsias irni veisles. Meristem diferencijacij glio, akn, onini organ ir audini, iedyno ir iedo meristemas nulemia ne tik jau esama j padtis, bet ir signalo molekuls, kurios perneamos i vien lsteli kitas, o dl signalo molekuli pernaos sijungia kiti genai. iuo atveju perneamos transkripcijos veiksni mRNR ar patys baltymai irgi atlieka signalo molekuli vaidmen. Signalo molekuli pernaa gali bti apribota tik kaimyninmis lstelms ar lsteli grupe, bet signalas gali bti iplatinamas ir po vis augal arba i vien organ perneamas kitus, pvz., florigenas perneamas i lap glio meristem (r. toliau). Kai signalas ineiojamas po vis augal, atsiranda bendras (arba kitaip sisteminis) atsakas signal ir j suklus veiksn. Dideliais atstumais signalas perneamas floema (karniena), bet netgi karnienoje signalas i pradi i vieno tipo lsteli perneamas kito tipo lsteles per plazmodezmas (r. toliau). onini pumpur ir gli susidarymas. Virns vyravimas. Augalo augimui auktyn ,,diriguoja glio virns meristema SAM. Tai gerai inomas ir seniai moni pastebtas reikinys. Reikia augalui paalinti virn ir tuoj pat pasipila oniniai gliai. Netgi paalinus augal, kuriems bdingas neakotas stiebas, pvz., pupoms (Vicia faba), virn, gali iaugti oniniai gliai ar net nauji stiebai. Tiems augalams, kurie natraliai krmijasi, tai numatyta j genetinje programoje.
298 |

ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM L1 LAYER1 (ATML1).

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Virns glio vyraujanti padtis pavadinta virns vyravimu (arba kitaip apikaliniu dominavimu). J pirmiausia lemia augimo hormon (auksino) koncentracija ir auktyn nukreiptas maisto mediag srautas (aktyvus vaidmuo tenka ir cukrams). Skiepijimo bdu nustatyta, kad signalas gabenamas stiebu auktyn (5.30 pav.). is signalas pavadintas SMS (nuo Shoot Multiplication Signal; i ties labai panau mobiliojo telefono inutes). Aptikti mutantai, kurie keiia virns vyravim ir onini pumpur/gli susidarym: tai max (more axillary growth), dad (decrease apical dominance) ir kt. Jie ir padjo iaikinti, kokias inutes siunia j funkcionals aleliai. Teko pripainti dar vien grup hormon karotinoidus (zeatin), nes MAX4 ir jo ortologai kit augal genomuose koduoja karotinoid metabolizmo ferment polieno grandins dioksigenaz, kuris metabolizuoja karotinoidus. Kitas genas MAX3 irgi koduoja karotinoid metabolizmo baltym, vien i citochrom P450, btent CYP711A1. Jau mintas kukurz pagrindinis raidos genas Teosinte Branched yra vienas i t gen, kuris slopina onini gli augim, bding teosinte. MAX2 koduoja F-box baltym, kuris, kaip inome (r. 2.7 intarp), yra sudtin E3 ubikvitinligazs dalis, atpasta konkret baltym, skirt suskaidyti proteosomoje.

5.30 pav. oninio augimo reguliacija

(modelis pagal C. A. Beveridge. Current Opinion in Plant Biology. 2006, Vol. 9, P. 3540). slopinimas; skatinimas; IAR indolilacto rgtis (auksinas); MAX2-MAX4 (MORE AXILLARY GROWTH) r. tekst.

Skirtingai nuo transkripcijos veiksni, SMS ir citokininas (irgi btinas virns vyravimui) gaminasi ir gabenami ksilema (mediena). 5.6.2.2. CLAVATA ir glio virns meristema (SAM). CLE genai Panaiai kaip kai kurie transkripcijos veiksniai, i lstels lstel perneami ir kai kurie polipeptidai, kurie yra signalo molekuls ir gali bti prilyginamos hormonams. Vienas j yra CLAVATA 3, svarbus glio virns meristemos raidai. Augimo kgelis. Skirtingi CLAVATA. Vairenio SAM pasireikia trys CLAVATA genai (CLV1-3). Du i j koduoja labai artimos sandaros baltymus tai CLV1 ir CLV2. Jie priklauso didelei gen eimai, koduojaniai receptorines proteinkinazes, kurios turi kartotin LRR (nuo Leucine Rich Repeat) sek. I viso vairenis turi per 400 receptorini kinazi, i j bent 129 turi LRR domen. iai baltym grupei priklauso ir daugelis R-baltym, svarbi sveikai augalas-patogenas. Jie nulemia atsparum patogenui vadinamuoju geAUGAL GENETIKA

| 299

nas prie gen arba kitaip R-avrR bdu. Taiau ne visi baltymai, tarp j ir R-baltymai, yra receptorins proteinkinazs. CLV1-3 genai pasireikia augimo kgelyje labai savitai, augimo kgelio centrinje zonoje. Prisiminkime augimo kgel. Jis sudarytas i trij sluoksni (5.31 pav., A): L1 epidermio; L2 (1 arba 2 lsteli eils) i jo isivysto lapai ir iedai (bet i periferini lsteli). Abu iuos sluoksnius (L1, L2) lengva atskirti nuo treiojo L3, nes j lstels nukreiptos statmenai paviriui. Taip vis laik jos ir dalijasi. Kai augalas auga, lstels diferencijuojasi. L3 sluoksnis sudaro didiausi lsteli mas, bet jos dalijasi vairiomis kryptimis. I ios dalies susidaro stiebas, ksilema (mediena).
WUS raika CZ P L1 L2 L3 PZ P
Lapo pradmuo

CLV1 raika CLV3 raika SAM

Lapo pradmuo

WUS RM

CLV1 CLV2

5.31 pav. Augimo kgelio skirstymas zonas ir sluoksnius (A) ir CLAVATA (CLV) raikos vieta:
CZ centrin zona; PZ periferin zona; P periferin zona, determinuota lapo pradmenis; RM ribin meristema; L1, L2, L3 augimo kgelio sluoksniai, r. tekst (A pagal R. Sablowski. Journal of Experimental Botany. 2007, Vol. 58, P. 899907; K. Lindsey et al. Trends in Plant Science. 2002, Vol. 7, P. 7883; Y. Matsubayashi Journal of Cell Science. 2003. Vol. 116, P. 38633870).

Svarbus ir kitas SAM suskirstymas 3 zonas: centrin (CZ), ribin (RZ) ir periferin (PZ). Kaip minta, btent centrins zonos lstelse pasireikia CLV1 genas. Jo vieta L2 ir keliose virutini L3 lsteli. Ten kaupiamos ir saugomos kamienins lstels, i PZ esant vegetatyvinio augimo fazei susidaro onini gli ir lapo meristema, o kai augalas pereina reprodukcijos faz iedyno ir iedo meristemos. I j vystosi atitinkami organai. CLAVATA yra signal perdavimo sistema, kuri reguliuoja vairenio stiebo ir kamienini lsteli kiek centrinje SAM zonoje, santyk tarp lsteli dalijimosi ir diferenciacijos. Kiti augalai turi CLV gen ortologus.
CLV paskirtimi sitikinta pagal CLV1-3 gen loss-of- function mutacijas: nenormaliai padidja glio ir iedo meristemos, susidaro its arba fascijuoti iedai ir vaisiai. Ne maiau pavojinga ir per didel CLV gen raika. Pvz., kai per daug gaminasi CLV3, labai greitai prarandamos kamienins lstels, ir augalas nustoja augs. Nusistovi labai subtili pusiausvyra tarp CZ ir onini organ susidarymo. Netgi PZ : CZ santykis yra paveldimas, bdingas konkreiam augalui poymis: Arabidopsis 2>1 Rudbeckia 1,6:1 Oryza 7,8:1
300 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

CLV1 ir CLV2 koduoja labai artimus baltymus. Skiriasi tik tuo, kad CLV1 baltymas turi citoplazmin domen, o CLV2 jo neturi (5.34 pav., B). ie du baltymai, labai panaiai kaip Brassica tipo S-nesuderinamumo baltymai SLG ir SRK (irgi receptorin proteinkinaz), sudaro kompleks, kuris slopina meristemos gen WUS (WUSCHEL). Bet jeigu WUS nepasireikia, susidaro labai maai lap, silpnas augalas. I ties turi bti labai subtili pusiausvyra tarp meristemos gen, kad meristemos kamienini lsteli bt nei per daug, nei per maai. Pagrindinis vaidmuo tenka CLV1. Jo koduojamas baltymas sudaro du baltym kompleksus: vien (185 kDa), kaip jau minta, kartu su CLV2. Spjama, kad jis yra L2 sluoksnio lstelse. Kitas kompleksas, kur kas stambesnis, 450 kDa, ir jis ne tik i CLV1 ir CLV2, bet j papildo kiti signal perdavimui svarbs baltymai Rho-GTPaz ir su kinaze susijusi proteinfosfataz (KAPP). Manoma, kad is kompleksas yra L2L3 lsteli grupje, ir jam atsirasti btinas CLV3. Mutantuose clv3 susidaro tik185 kDa kompleksas. WUS skatina CLV3 raik ir tuo paiu reguliuoja stiebo lsteli pusiausvyr su meristemos lstelmis. WUS saugo lsteli bsen L1 ir L2. ia susidaro udaras ratas: WUS aktyvina CLV3, o is aktyvina CLV1 ir susidars kompleksas slopina WUS, o WUS skatina CLV3: CLV3 CLV1/CLV2 WUS

jau minto lstels ciklo geno. CLV3 ir kiti CLE polipeptidai. CLV3 genas priklauso gen grupei, kurie koduoja CLE baltymus (pavadinimas kils nuo CLAVATA/ESR-related; ESR baltymai yra miglini gemal supaniame endospermo lsteli sluoksnyje). Vairenio genome yra bent 25 CLE genai. CLV3 vienas i j. CLV3 sintez vyksta L1 sluoksnyje, i kurio jis perneamas L2/L3. Pradinis polipeptidas yra i 96 aminorgi, bet brendimo metu kitos aminorgi sekos ikerpamos, ir lieka aktyvus 12 aminorgi CLE motyvas. Be to, is polipeptidas modifikuojamas (tik peptidas vadinamas MCLV3 modifikuotas). Jis ir yra ligandas CLV1/CLV2 kompleksui. Vienas i ligando apibdinim yra toks: Ligandas yra molekul, kuri jungiasi su savitomis vietomis ant lstels membranos. Tiksli CLV1-2 raikos vieta, kaip ir CLV3 aminorgi seka, sunkiai nustatomos, nes ie genai ir molekuls pasireikia tik keliose lstelse.Danai pasitaiko, kad kai yra didel gen/baltym eima, tarp paralog yra ir visikai prieingo veikimo. Tas pat galioja ir signaliniams polipeptidams. Paaikjo dar viena CLV3 peptido paskirtis, manoma, kad galbt netgi pagrindin: jis reguliuoja medienos (ksilemos) lsteli diferenciacij, bet slopina lsteli dalijimsi. Ir atvirkiai, kai yra maai CLV3, skatinamas lsteli dalijimasis, bet slopinama lsteli diferenciacija. Viena i patogi sistem tirti ksilemos raid yra gvaizdns (Zinnia elegans L.) lapo
AUGAL GENETIKA

CLV1 reguliuoja dar vienas genas POL (POLTERGEIST bildukas). Toks jo pavadinimas kils todl, kad pol mutantas visikai nesiskiria nuo normalaus WT fenotipo [aitvaras, bildukas, nepastebima nam dvasia]. WUS irgi priklauso nuo kit gen: FASCIATA1,2 (FAS1,2), kurie koduoja chromatino sudedamsias dalis; Pol; AINTEGUMENA (AINT)

| 301

mezofilo lstels (r. toliau, 3.7 sk.), kurios dl tam tikro hormon derinio netiktai virsta ne kaliumi, o medienos lstelmis. Pasirodo, ir ten neapsieinama be CLV3 tipo polipeptid. Vienas j, pavadintas TDIF (Tracheary Differentiation Inhibitor Factor), irgi yra CLE polipeptidas, bet veikia prieingai CLV3: slopina lsteli diferenciacij trachjos (ksilemos) elementus. Tokia jo paskirtis yra ir SAM (augimo kgelio) L2/L3 sluoksniuose. Danai pasitaiko, kad kai yra didel gen/baltym eima, tarp paralog yra ir visikai prieingo veikimo. Tas pat galioja ir signaliniams polipeptidams. 5.6.2.3. Kiti polipeptidai, kurie palaiko ryius tarp lsteli ir kontroliuoja gen raik Gvaizdns (Zinnia) lapo mezofilo virsmas trachjos elementu padjo aptikti ir kelet kit veiksni, kurie skatina augalo lsteli diferenciacij, tarp j ksilogen, unikal arabinogalaktan, kuris yra tarpininkas lstel-lstel sveikose. PSK (fitosulfoksinai) (5.6 lentel) aptikti gvaizdns ir kit augal lsteli kultrose. Kaip jau minta (r. 3.3.2 sk.), lsteli kultrose turi bti tam tikra lsteli koncentracija, kad jos diferencijuotsi gemal. Lygiai tas pat nustatyta gvaizdns mezofilo lsteli dediferenciacijai ir tolesnei diferenciacijai trachjos elementus. Siekiant paskatinti lsteli dalijimsi ir diferenciacij izoliuot lsteli kultrose, netgi griebiamasi tokio metodo: i pradi auginama lsteli, kurios gerai auga ir diferencijuojasi kultra; paskui likusi po j mitybin terp panaudojama auginti sunkiai auganias lsteles. I toki mitybini terpi buvo iskirta aktyvi mediaga ir paaikjo, kad tai tik penki aminorgi liekan polipeptidas: Tyr (SO3H) Ile Tyr (SO3H) Thr Gln Kaip ir kiti polipeptidai, jis sintetinamas i didesnio (89 aminorgi.) pirmtako ir sveikauja su lstels membranos baltymais. Kol kas nustatyti du tokie baltymai (120 kDa ir 160 kDa), bet paskaiiuota, kad PSK lstelje gali sveikauti su 104 viet. RALF (nuo Rapid Alkalinization Factor) pavadinimas yra kils nuo tyrimo metodo, su funkcija ryio neturi, reguliuoja aknies raid. polipeptid turi vairs augalai. Vairenio genome yra bent 9 genai, kurie koduoja RALF. akn raid reguliuoja dar bent du polipeptidai: POLARIS ir ENOD40. Pastarasis savitas pupiniams augalams ir skatina akn gumbeli susidarym. ENOD40 genas koduoja apie 700 bp transkript, bet jo viduje yra du trumpi ORF (atviri skaitymo rmeliai). Vienas j koduoja 13, o kitas 27 aminorgi peptidus. Sojos ie peptidai ne tik trumpesni 12 ir 24 aminorgi, bet ir yra sanklotiniai 24 aminorgi ORF ueina ant 12 aminorgi polipeptid koduojanio ORF. Brasicca tipo S-nesuderinamumas priklauso nuo polipeptido dvigubu pavadinimu SCR/SP11. Jis ypatingas tuo, kad sintetinamas tapeto lstelse. I j perneamas iedadulk, o pati sveika su SRK receptorine proteinkinaze vyksta ant motininio augalo purkos (r. 2.4.2.2 sk.) Sisteminas yra vienas i geriausiai itirt polipeptid. Jis aptiktas pomidoruose, kurie buvo paeisti amar. Kaip rodo pats pavadinimas, sistemino signalas plinta ne tik i lstels lstel, bet ir karniena po vis augal. Atsiranda bendra viso augalo reakcija mechanin ar oldio sukelt paaid. Sisteminas sukelia daugyb vyki, tarp j linoleno
302 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

rgties isilaisvinim i membranos ir virtim oksilipinu. Tai dar viena signalo molekuli, tik nebaltymins kilms. Ji suadina apsaugini gen raik.
5.6 lentel. Signaliniai polipeptidai, j paskirtis ir signal priimantys receptoriai Peptidas
CLAVATA 3 Sisteminas Tabako Tob Sys I Tabako Tob Sys II RALF ENOD 40 SCR/SP11 PSK (fitosulfoksinai) POLARIS 89 200 200 165 165 115

Aminorgi skaiius prepeptide

12 18(14) 18 18 ~25 12-13 ir 24-27 231 5 36

Biologin paskirtis

Receptorius

Augimo/diferenciacijos regu- CLV1/CLV2 185 kDa liavimas meristemoje Apsauga nuo oldio/ gynybinis signalas Apsauga nuo oldio/ gynybinis signalas Apsauga nuo oldio/ gynybinis signalas akn augimas (slopina), nra visai aiki Pupini akn gumbeli susidarymas S-nesuderinamumas (Brassica tipo) Lsteli dalijimasis, akn augimas Sveika su citokininu ir etilenu, reguliuoja akn augim, lsteli dalijimsi MAP kinazs (120 kDa ir 25 kDa 43 kDa gumbeli baltymas SRK (110 kDa) 120 ir 160 kDa membranos baltymas 160 kDa membranos baltymas

Sveikoje SCR/SRK dalyvauja visas baltymas, tai lemia S-nesuderinamumo savitum .

Kaip ir daugelis signalini polipeptid (5.5 lentel), sisteminas sintetinamas i polipeptido pirmtako, bet sintez ypatinga tuo, kad vyksta alternatyvusis splaisingas, ir pasigamina dvi skirtingos molekuls. Abi yra aktyvios. Sisteminas sukelia jau mint proteinazs inhibitori sintez. Sisteminas aptiktas ir kituose Solanaceae eimos augaluose, taiau jo neturi tabakas. Taiau pastangos surasti sisteminus tabake labai praturtino ms inias apie augalo strategij prie oldius ir patogenus. Tabake aptikti kiti panaaus veikimo (kaip sistemin) polipeptidai. Pagal veikimo panaum, jie netgi pavadinti Tob Sys I ir Tob Sys II,. taiau bendra su sisteminu yra tik j paskirtis apsauga nuo oldi. Pagal aminorgi sudt jie visikai skiriasi ir nuo sistemino, ir vienas nuo kito:

AUGAL GENETIKA

| 303

Tuo ir pasireikia augalo kovos su parazitais strategija. Jeigu bt tik vienas Tob Sys peptidas, amarai ir kiti oldiai vabzdiai lengvai prie j prisitaikyt. Dar greiiau tai vykt, jeigu visi augalai turt vienodas apsaugines priemones. I tabako iskirti dar du apsaugin signal perneantys polipeptidai, kurie skiriasi nuo Tob Sys I ir II, nes turi daug hidroksiprolino, todl pavadinti Tob Hyp Sys I ir Tob Hyp Sys II. Jie skiriasi nuo sistemin ir tuo, kad yra glikopeptidai. Bet panai polipeptid paiekos pomidoruose buvo skmingos, aptikti net trys turintys daug hidroksiprolino glikopeptidai Tom Hyp Sys I, II, III. Sprendiant jau vien i pomidor ir tabako palyginimo, signalini polipeptid ateityje turt bti atrasta gerokai daugiau, ypa mobilizuojani augalo apsaugines reakcijas. Prie toki apsaugini polipeptid turt bti priskiriami ir defensinai. Defensinai (5.32 pav.) iek tiek stambesni polipeptidai (45-54 aminorgi, apie 5 kDa). Jie pirmiausia yra apsaugin augalo priemon, ne tik signalo molekul. Augaluose aptikti palyginti seniai, dar 1900 m., kvieiuose ir mieiuose. Defensinai yra ir skorpiono nuodai.

5.32 pav. Vabzdi, ridiko (Raphanus sativus L.) Rs-AFP1 ir mogaus HNP-3 defensin palyginimas
(pagal W. F. Broekaert et al. Plant Physiology. 1995, Vol. 108, P. 13531358).

Defensin apsaugin reikm iuo metu nustatyta ir induoli lstelms. Be to, defensinus turi netgi vabzdiai (drozofila), tad defensinai yra bendras ginklas prie parazitinius grybus. Vertinami kaip natrals fungicidai, kuriuos ms organizmas suskaido iki aminorgi. Tad galima ivengti kenksming fungicid vartojimo (dirbtinai vartojant j veikli koncentracija turi bti 220 mikrogram litrui). Ypa siloma jais apdoroti vaisius ir uogas. Tai ateities priemon. Tose augalo dalyse, kuriose tiktina patogeno invazija, defensin sintez yra pastovi (konstitucin). Labai vairs polipeptidai, skirstomi vairias grupes ir poeimius. 5.6.3. Transkripcijos veiksni ir kit gen raik reguliuojani molekuli pernaa floema. Florigenas. Sisteminiai atsakai 5.6.3.1. Transkripcijos veiksni ir mRNR, mi/si RNR pernaa dideliais atstumais Skiepijimo metodas. Augalai neturi kraujo sistemos, kuri ineioja mediagas po vis kn, bet augaluose j keiia ind sistemos floema (karniena) ir ksilema (mediena). Kaip minta, Vinkleris pirmasis ryiams tarp augalo lsteli tirti pradjo naudoti skiepijimo metod, sukurdamas glio meristemini lsteli chimeras. Toks metodas ir
304 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

iuo metu yra taikomas. Netgi pavyksta paaikinti gamtoje pasitaikanius reikinius, pvz., pilnavidurius iedus. Kai kuriais atvejais pilnaviduriai iedai atsiranda todl, kad transkripcijos veiksnys i L1 sluoksnio neperneamas L2 ir L3. Taip yra, pvz., kamelijos veisls Deasy Eagleson pilnaviduriuose ieduose. Palyginimui dirbtinai sukurta chimera tarp dviej kamelijos ri Camelia sasanqua ir C. japonica. i dviej kamelijos ri chimeras lengva atpainti pagal skirtingo dydio branduolius. Tyrimams naudoti kamelijos iedo organus koduojani transkripcijos veiksni mutantai. Kai L1 sluoksnis buvo i normalaus (WT) tipo, o L2 ir L3 i mutantinio sluoksnio kamelijos iedai buvo su lytiniais organais, o atvirkiu deriniu L1 i mutanto, o L2 ir L3 i normalaus iedai pilnaviduriai. Jie turjo bent 6080 vainiklapi, bet buvo be lytini organ. Vadinasi, nebuvo perneamas transkripcijos veiksnys i L1 L2 ir L3, nes L1 mutanto lstelse jis nesusidar. Kur kas daniau skiepijimo metodas yra taikomas tirti transkripcijos veiksni ir signalo molekuli perna karniena. Vl panaiai kaip kamelijos chimeroms tirti, norint atskirti vien augalo dal nuo kitos, skiepis nuo poskiepio privalo skirtis morfologinmis arba fiziologinmis savybmis, pvz., prajusio vernalizacij ir neprajusio vernalizacijos augalo, ar auginto ilgos ar trumpos dienos slygomis augal. Augal fiziologai metod vertino jau seniai. Genetikai, deja, sivl diskusij dl vegetatyvini hibrid, io metodo ilgokai veng. Kai neinota io reikinio mechanizm, manyta, kad tai kvepia lysenkizmu: vegetatyviniai hibridai buvo T. Lysenkos arkliukas. Taiau puikesnio metodo tirti makromolekuli ir signalini molekuli perna ar ineiojim po vis augal nra. Ir vl KNOTTED1 TV buvo pirmasis, kurio perna karniena pavyko rodyti. Parankus poymis tirti io transkripcijos veiksnio perna yra pomidor pelyts ausels, ypatinga mutanto Mouse ears (Me) lap forma (5.33 pav., A). Ji atsiranda dl pomidor geno Let6, kuris yra ortologas genui KNOTTED1, perteklins raikos. Manoma, kad pelyts ausels toliau paengs lapo susiskaidymas dl Let6 TV pertekliaus. Me yra dominuojanti mutacija, atsiradusi dl dviej gen susiliejimo. Tai Let6 ir PFP
(PYROPHOSPHATE-DEPENDENT-PHOSPHOFRUCTOKINASE):

PFP

LeT6

WT

PFP

PFP/LeT6

Me

PFP/LeT6 pernaa karniena buvo rodyta taip: augalas normalios formos lapais buvo skiepytas Me augal, taiau ir skiepis paymtas genetikai. Panaudotas chlorofilinis mutantas Xanthophylic (Xa), kurio lapai yra geltonos spalvos. Jis paaliuoja, jeigu skiepytas normalios (alios) spalvos augal. Visa tai padaryti tiesiog btina, norint tikinamai rodyti PFP/LeT6 geno produkt perna ir atskirti t augalo dal, kuri susiformavo naujai po skiepijimo. Virn bus paaliavusi.

Tinkamas bandymo slyg planavimas/genotip parinkimas vienintelis bdas tikinamai rodyti tiriam reikin/gauti tikinant rezultat.

AUGAL GENETIKA

| 305

B 5.33 pav. Pomidor normalus (kairje) ir mutanto Mouse ears (deinje ) lapai (A) ir transkripcijos veiksnio pernaos tyrimas skiepijimo metodu (B):
transkripcijos veiksnys LeT6 pernaamas i poskiepio skiep, todl, kai skiepijama WT Me, lapai tampa Me fenotipo, o virn paaliuoja (r. tekst) (A pagal K. H. Chung, N. R. Sinha. Encyclopedia of Life Science. 2007. John Wiley and Sons, Ltd. www.els.net ; B D. Jackson. Plant Cell. 2001, Vol. 13, P. 25692572).

Neapsieinama be netiktum. Pasirodo, skiepio virns lapai gauna pelyts auseli pavidal tik tada, jeigu augalas auginamas ne iltnamio, o lauko slygomis: arba PFP/LeT6 genas yra temperatrinis mutantas Ts; arba PFP/LeT6 geno produkt pernaa/karnienos savybs priklauso nuo aplinkos veiksni. Tai, kad dl poskiepio takos (arba atvirkiai) keiiasi skiepio fenotipas, yra tik pirmasis signalas, kad vyksta TV pernaa. skiepio fenotip gali koreguoti ir kitos mediagos, netgi neorganins. Tuo sitikinta kito pomidor mutanto chloronerva (chln) tyrimais. Mutantas, kaip ir Xantophylic, priklauso chlorofilini mutant grupei. Mutanto chln pakitusi spalva: lapo gyslos alios, o tarpgysliai pagelt. skiepis bna normalus, jeigu jis skiepytas WT fenotipo augal. I poskiepio skiep perneama geleis. Mutanto chln sutriks geleies sisavinimas. Jo fenotip galima normalizuoti ir FeEDTA (5.34 pav.).

5.34 pav. Chlorofilo sintezs atsistatymas pomidor mutanto chloronerva lapuose po poveikio Fe EDTA:
kairje normalaus augalo (+/+), deinje chloronerva (chln/chln), viduryje chln/chln po poveikio Fe EDTA (i H. Bhme, G. Scholz.Kulturpflanze. 1960,B. 8,P. 93109)

306 |

5. FUNKCIN GENOMO SANDARA IR GEN RAIKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

Panaiu bdu aptinkami ir augal, kuriuos lengva skiepyti (pomidor, tabako) fiziologiniai ir biocheminiai mutantai. Tik btina ymti poskiepio ar skiepio fenotip. Danai tai bna chlorofilins mutacijos, nes sutrikus kuriam nors fiziologiniam procesui ar mediagos sintezei, sutrinka ir augalo pigment (chlorofilo) sintez. Taip atsitinka ir augal mutantams, kurie nesintetina pirimidino. Vairenio tokiems mutantams ir trkstamoms mediagoms nustatyti spjama mediaga lainama mgintuvl, kuriame aseptiniu bdu auginamas augalas. Jeigu pataikyta parinkti mediag, augalas paaliuoja. Tai kartu yra ir bdas kontroliuoti mutanto genetin grynum. Kita vertus, per skiepijimo viet gali bti perneamos ir sudtingesns genetins struktros plazmids (episomos). skiepio-poskiepio sveika turi ir praktin reikm. Sodo augal, kurie dauginami vegetatyviniu bdu, savybs priklauso nuo poskiepio, ir parenkant poskiepius skiepiui suteikiamos pageidaujamos savybs, pvz., maas gis.

Floemos (karnienos) sandara ir molekuli pernaa. Gana paradoksali padtis: nors karnienos anatomija tiriama daug met, mediag pernaos karniena mechanizmas iki iol nra pakankamai itirtas. Magnolijn karniena sudaryta i dviej pagrindini lsteli tip: RE ir LL. RE rtinis elementas i ties primena rt su angelmis. Jos patiria dalin apoptoz, yra bebranduols, labai pakitusios dl numatytos lsteli ties mechanizm, bet citoplazma nra galutinai suirusi. Inyksta tik organels (branduolys, chloroplastai, ribosomos). LL lydimosios lstels, atvirkiai, aktyvios. Manoma, kad perneamas karniena junginys pirma paklina LL. Jos atlieka atrankos/sieto vaidmen, o vliau junginys patenka RE ir perneamas dideliais atstumais. Tad ryys tarp LL ir RE palaikomas plazmodezmomis. Nustatyta, kad makromolekuls, kurios perneamos karniena, sugeba pakeisti plazmodezmos diametr (SEL). Kai kurios molekuls, pvz., labai svarbus signalo, polipeptidas CLAVATA3, yra perneamos tarplstelin erdv apoplast.Tirti, kokios mediagos perneamos karniena, labai palengvina tai, kad RE lstelse nra branduolio ir ribosom. Tad iose lstelse nei baltymai, nei RNR naujai susidaryti negali. Nors baltym koncentracija karnienoje labai maa (0,22 g/l), karnienos sultyse aptikta 100-200 vairi baltym, manoma, kad j gali bti iki 1000. Kita vertus, labai ribotas tirt augal skaiius. Daniausiai tokie tyrimai atliekami moliguose, agurkuose ar pomidoruose. Surasti baltymai, kurie svarbs makromolekuli pernaai. Juos aptikti vl palengvino virus plitimo po augal tyrimai. Matyt, pagrindiniu pernaos baltymu yra PP16 baltymas (16 parodo molekulin baltymo mas kDa; tai nedidelis baltymas, todl lengvai pereina pro vairius sietus). Jam tirti irgi taikomas skiepijimo metodas. Ypa daug tyrim atlikta su vienu i svarbi signalini baltym, o kartu cukr (sacharozs) neikliu SUT1 (SUcrose Transporter 1). Prisiminkime, kad cukrai atlieka dvejop vaidmen: yra ne tik maisto/energijos altinis, bet ir signalo molekuls, augaluose pakyltos iki hormon vaidmens. SUC1 mRNR ir baltymas aptikti ne tik LL, bet ir RE lstelse, o skiepijimo metodu pernaa i moligo agurk. Panaiu bdu rodyta ir dviej GR (giberelino) atsako NACP ir GATP baltym pernaa i moligo agurk, t. y. karniena. Joje aptikta plaukeli/trichom raidos TV CAPRICE, TRIPTYCHON, TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (r. 3.1 sk.) ir svarbiausia vairs veiksniai, reguliuojantys glio ir iedo meristem raid. Tarp j jau mintas KN1, taip pat kitas TALE HD TV, btent BEL1. Bulvi karniena perneamas KNOX TV, pavadintas POTH1. Jis reguliuoja giberelin sintez. Karniena perneami CmWRKYP (apsaugini atsak), du GRAS eimos TV NACP (svarbus meristem isaugojimui) ir STMP (irgi meristem), taip pat kiti TV.

AUGAL GENETIKA

| 307

Danai perneamas ne vienas TV, o kompleksas su savitais baltymais. Pvz., KNOTTED1 TV perneamas kartu su MPB (Microtubule-associated Tabacco mozaic virus Movement Protein Binding) ir KNB36 (KNOTTED1 Binding protein 36) baltymais. Karniena gali bti perneami ne tik baltymai, bet ir mRNR, tarp j kukurz KN1 ir cukraus neiklio mRNR. Moligo (Cucurbita maxima) karnienos sultyse aptikta per 100 skirting RNR. Tiek baltym, tiek karniena perneam RNR molekulse turi bti specialiai iai pernaai skirtos atpainimo sekos.

mi/si RNR pernaa karniena. Palyginti neseniai nustatyta, kad tarp t RNR molekuli, kurios perneamos karniena yra ir mi/si RNR. ios RNR dl j maos molekulins mass gali bti geros signalo molekuls. Skiepijimo bdu nustatyta, kad transgen nutildymas, kur sukelia maosios interferentins RNR (siRNR), persiduoda i poskiepio skiepiui. Moligo (Cucurbita maxima) karnienos sultyse yra baltymas, pavadintas PSRP1 (nuo PHLOEM SMALL RNA PROTEIN 1), kuris jungiasi ir pernea lsteles 25 nt vienagrandes si/mi RNR. Mikro RNR (miRNR) yra koduojamos speciali gen. Jos yra gen raikos reguliatoriai, daniausiai po transkripcijos. Tarp miRNR, kurios perneamos floema, aptikta: miR167 reguliuoja atsak auksin; miR171 kontroliuoja GRAS eimos genus, tarp j SCARECROW-like; miR159 reguliuoja MYB TV genus; miR156 reguliuoja SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN gen (ir kt., sraas vis didja). I lstels lstel mi/si RNR perneamos plazmodezmomis. Taip savit gen veiklos program gyja konkretaus audinio lstels. Nors tai dar nepakankamai itirta, bet mi/si RNR pernaa plazmodezmomis ir karniena yra kontroliuojama ir skiriami du pernaos keliai: ilgas, vadinamas LRS (Long-Range Silencing) nuo pagrindins si/mi RNR paskirties nutildyti gen raik; ilgas reikia, kad nutildomi genai dideliu atstumu nuo tos vietos, kur susintetinta si/mi RNR; trumpas, vadinamas SHM (Short-Range Movement). Pernaa vyksta tik artimiausias 1015 lsteli nuo tos vietos, kuri produkuoja pre-si RNR. Signalui plisti didesniame plote reikia, kad mi/si RNR bt daug. Ji pagausinama (amplifikuojama). Tai atlieka savita nuo RNR priklausoma RNR polimeraz. Jos santrumpa RDRP (RNA-Dependent RNA Polymerase). Sintetinama ilga pre-siRNR grandin, paskui transkriptas suskaidomas atskiras mi/si RNR 5.6.3.2. Florigenas. Cirkadiniai reikiniai ir signal pernaa i lap glio meristem Manoma, kad florigeno atradimas yra vienas didiausi 20052007 m. mokslo pasiekim. Tai sena, daug met neisprendiama augal biologijos problema. Kai kurie mokslo skeptikai pastangas surasti florigen lygino su jeiu (sniego mogumi) jis lygiai toks pat nesugaunamas. Prasidjo florigeno istorija dar 1930 m. M. ailachjanas skiepijimo metodu tikinamai rod, kad stimulas augalui ydti dl viesos poveikio atsiranda lapuose. I ten jis

308 |