VILNIAUS GEDEMINO TECHNIKOS UNIVERSITETAS

FUNDUMENTINIŲ MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOINŽINERIJOS IR CHEMIJOS KATEDRA

KRŪTIES VĖŽIO NAVIKŲ MIRNR RAIŠKOS ANALIZĖ

Bioinžinerijos studijų programa
Biotechnologijos studijų kryptis

Darbo vadovas:

Vilnius, 2022

Įvadas
Per praeitus 2021 metus daugiau nei 10 milijonų žmonių mirė dėl vėžio, o dažniausiai sutinkama
vėžio forma pas moteris yra krūtų vėžys. Vėžys gali būti genetiškai paveldimas, jis gali pradėti
vystitis dėl vartojamo maisto (dėl esamu maiste kancerogenų), radioaktyvios aplinkos, oro
užterštumo ir dar daugelio kitų priežasčių. Šita tema man yra ypač svarbi būtent dėl to, kad vėžys
yra antroje vietoje pasaulyje pagal mirčių skaičių, jis atsiranda nepastebimai ir gali gyventi
žmogaus kūne ilgą laiką, kol atsiras pirmieji požymiai.

Darbo tikslas: susipažinti su moksliniais starpsniai, aprašantys miRNR, lncRNR pokyčius moterų
organizme sergančiu trigubia neigiamų krūtų vėžių, išmokti gryninti RNR ir DNR iš žmogaus
kraujo ėminių, spektrofotometriškai nustatyti DNR bei RNR koncentracijas.
 Ilgosios nekoduojančios RNR (lncRNA)
Ilgos nekoduojančios RNR (lncRNA) veikia kaip pagrindiniai genų raiškos reguliatoriai; buvo
nustatyta, kad mutacijos ir netinkamas reguliavimas yra susiję su įvairiais biologiniais procesais
sergant vėžiu. LncRNR 200 nukleotidų ilgio yra baltymų nekoduojantys transkriptai (non-protein-
coding trascripst). Besivystantys tyrimai rodo, kad daugelis vėžio tipų, tokie, kaip krūties vėžys,
kiaušidžių vėžys ir daugelis kitų, pasižymi lncRNR raiškos reguliavimo sutrikimu.TBNC-yje
dereguliuoti lncRNR vaidina svarbų vaidmenį naviko genezės procese per įvairius mechanizmus.
LncRNR gali būti branduolinėse arba citozolinėse frakcijose ir persidengia su daugybe
koduojančių ir nekoduojančių transkriptų arba yra tarp jų. Priklausomai nuo jų geno atstumo iki
artimiausio transkripto, lncRNR skirstomi į 5 kategorijas: sutampa vienas ar daugiau baltymą
koduojančio geno egzonų kryptis; persidengia su vienu ar daugiau egzonų baltymų, kurie koduoja
genus priešingoje grandinėje; inicijuoja savo raišką labai arti genomo, esant <1000 bazinių porų,
nuo gretimo koduojančio transkripto priešingoje grandinėje; kilęs iš antrojo transkripto introno;
veikiantis kaip nepriklausomas vienetas genominiame intervale tarp dviejų genų.
Buvo atrasta, jog bet kokioje vėžio formoje, įskaitant TNBC, yra padidėjusi nenormali lncRNR
raiška. LncRNR gali elgtis kaip miRNR „kempinės“, taip paveikdamos miRNR sukeltą genų
reguliavimą.Ypač lncRNR gali veikti kaip konkurencingos endogeninės RNR (ceRNR),
konkurencingai prisijungdami prie mikroRNR (miRNR), kad tarpininkautų jų išreiškimi pasroviui
taikomi vėžio genai. CeRNR-mediated reguliuojantis mechanizmai yra svarbūs lncRNR-
modulated posttranskripcinei kontrolei TNBC.
 Micro RNR (miRNA)
Nuo 1993 m. buvo atrasta mikroRNR (miRNR) – mažos, vienagrandės RNR molekulės, galinčios
prisijungti prie komplementarių sekų mRNR molekulės. MikroRNR (miRNR) yra mažos
nekoduojančios 20–22 nukleotidų RNR sritys, kurios atlieka svarbų vaidmenį visuose daugialąsčių
organizmuose, įskaitant žinduolius. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis miRNR veikia
grįžtamojo ryšio mechanizmuose, apsaugodamos pagrindinius biologinius procesus, įskaitant
ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir apoptozę. Nevykstant geno raiškos reguliavimui, už kurią
atsakynga miRNR, gali sukelti vėžio ir kitų ligų vystymąsi. Ilgesnė RNR grandinė yra apdorojama
ląstelių fermentais į miRNR, viengrandę RNR apie 22 nukleotidus, kurie sudaro kompleksą su
vienu ar daugiau baltymais. MiRNR leidžia kompleksui prisijungti prie bet kurios mRNR
molekulės su mažiausiai septyniomis ar aštuoniomis komplementarios sekos nukleotidais. MiRNR
baltymo kompleksas suardo tikslinę miRNR arba tiesiog blokuoja jo trasliaciją. Žmogaus genome
yra apytiksliai 1500 genų priklauso miRNR, biologai vertina, kad pusė visų esančių genų žmogaus
organizme raiška yra reguliuojama miRNR.
Kita klasė trumpų nekoduojančių RNR, pagal ilgį ir funkcijas panaši į miRNR, vadinasi mažos
trukdančios RNR (siRNR). Šios molekulės reguliuoja genų raišką slopindamos tikslinį geną.
MiRNR ir siRNR gali jungtis su su tokiais pačiais baltymais, gaunant panašius rezultatus. Jei
siRNR pradmuo įterpiamas į ląstelę, tai ląstelės mechanizmas gali gali jas modifikuoti į siRNR,
kurios slopina genų raišką, tai primena miRNR veikimo būdą. Skirtumas tarp miRNR ir siRNR
grindžiamas jų pirmtakų struktūros skirtumu.
 Tikro laiko PGR metodas, metodo esmė, naudojami reagentai

PGR metodas- tai genų inžinerijos metodas, leidžiantis sukurti daugelį DNR fragmento kopijų
viename mėgintuvėlyje. PGR procedūros metu trijų žingsnių ciklas sukuria grandininę reakciją,
kurios metu identiški DNR fragmentai eksponentiškai daugėja, sukuriant tokius pačius identiškus
DNR fragmentus.

Genų ir didelių DNR fragmentų pagausinimas, klonuojant juos bakterijose, yra ilgas ir sudėtingas
procesas. Nepaisant greičio ir specifiškumo, PGR amplifikacija negali pakeisti genų klonavimo
ląstelėse, kad pagausinti geno kiekius. Taip yra dėl to, kad panaudotos polimerazės neturi DNR
pol, DNR replikacijos metu DNR polimerazė atlieka koregavimo funkciją, tad PGR reakcijos metu
klaidų skaičius apriboja gerų kopijų skaičių. Tačiau PGR metodas naudojamas norint pagausinti
specifinį DNR atkarpą. Buvo sukurtas greitesnis ir efektyvesnis alternatyvus trumpų (apie 300
nukleotidų) DNR fragmentų pagausinimo metodas naudojant PGR. Reikia trumpo DNR
fragmento pradmens (primer), kuris atpažintų norimą pagausinti DNR fragmento dalį. Kadangi
DNR dvigubėjimas vyksta 5‘ – 3‘ kryptimi, atitinkamo fragmento sintezei reikalingi 2 pradmenys,
kurių nukleotidų sekos būtų komplementarios tikslinės DNR galams. Prieš gausinimo pradžią
DNR grandines būtina atskirti. Tai daroma DNR pakaitinant. Pradmenims prisijungus prie atskirų
tikslinės DNR grandinių, DNR polimerazė susintetina likusią antrosios DNR grandinės dalį.
Aukštoje temperatūroje polimerazė praranda aktyvumą, tačiau iš karštųjų versmių bakterijos
Thermus aquaticus buvo išskirta Taq polimerazė, atspari aukštai temperatūrai. Būtinos visos
statybinės medžiagos iš kurių sudaroma DNR grandinė. Reakcija yra ciklinė: tikslinės DNR
grandinių atskyrimas; dviejų pradmenų prijungimas prie DNR fragmento grandinių 5‘ ir 3‘ galinių
nukleotidų sekų; pradmens sekos ilginimas pagal tikslinės DNR grandinės seką. Per kiekvieną
ciklą gausinamų fragmentų kiekis padvigubėja ir kitame cikle kiekvienas tampa matrica naujos
DNR grandinės sintezei. Matrica dažniausiai yra tarsi šablonas, pagal kurį atgaminama identiška
grandinė. Reakcijos pabaigoje DNR kiekis didesnis 105– 106 kartų.
 Trigubas neigiamas krūtų vėžys (TNBC). Kuo skiriasi nuo kitų krūtų vėžio formų bei
kokių genų ir miRNR, lncRNR raiškos padidėjimai nustatomi TNBC atvėju. Kas buna po
chemoterapijos, kodėl atsinaujina? Krūties vėžys yra heterogeninė liga, kurią sudaro daug
molekulinių potipių. Trigubas neigiamas krūtų vėžys (TNBC) yra ypač agresyvus krūties vėžio
potipis. TNBC yra heterogeninis krūties vėžio potipis, kuris pradeda augti ir keistis dėl savo
savybių ir klinikinio atsako į tikslinį terapinį metodą. Iki šiol TNBC gydymu buvo citotoksinė
chemoterapija. Trigubai neigiamam krūties vėžiui (TNBC) būdingas estrogeno receptoriaus (ER)
ekspresijos, progesterono receptorius (PR) ir žmogaus epidermio augimo faktorius 2-receptoriaus
nebuvimas. Krūties vėžys paprastai nebuvo laikomas imunogeniniu naviku. Tačiau įrodyta, kad į
naviką infiltruojantys limfocitai (TIL) yra krūtų vėžio audiniuose, o rezultatas yra teigiamas
abiejuose ankstyvos stadijos ir pažengusios TNBC ligos nustatyme.

TNBC turi didesnę mutacijų tikimybę nei kitos krūtų vėžio rušys. Nustatyta, kad dauguma
proto-onkogenų koduoja augimo faktorius – baltymus, kurie stimuliuoja ląstelių dalijimąsi arba
kitus baltymus, kurie veikia ląstelės ciklą. Kai genai funkcionuoja normaliai, ląstelių dalijimasis
ir jų ciklas vyksta normalia eiga. Mutavus tam tikriems genams, augimo faktorius suaktyvėja ir
gali lemti nekontroliuojamą ląstelių dalijimąsi, t.y. suformuoti nenormalią ląstelių masę, vadinamą
naviku.
 260/280 ir 260/230 spektrai

DNR ir RNR grynumui įvertinti naudojamas 260 nm ir 280 nm absorbcijos koeficientas. Baltymų
sugerties savybės priklauso nuo triptofano ir tirozino kiekio jų molekulėse, todėl daugelio baltymų
sugerties maksimumas matuojamas ties 280 nm. ~1,8 koeficientas laikomas kaip "grynas" DNR;
~2,0 koeficinetas laikomas kaip "grynas" RNR. DNR būdingą sugerties maksimumą 260 nm
srityje sąlygoja visų DNR sudėtyje esančių heterociklinių bazių sugebėjimas sugerti šviesos
spindulius. Tačiau bendras DNR šviesos dugrties spektras yra apie 40% mažesnis nei ją sudarančių
laisvų bazių. Jei bet kuriuo atveju santykis yra pastebimai mažesnis, tai gali reikšti, kad yra
baltymų, fenolio ar kitų priemaišų, kurie žymiai pakeičia sugertį esant 280 nm arba netoli jo.
260/230 santykis naudojamas kaip antrinis nukleino rūgšties grynumo matas. "Grynos" nukleino
rūgšties 260/230 vertės dažnai yra didesnės už atitinkamos 260/280 vertes. Tikėtinos 260/230
vertės paprastai yra 2,0–2,2. jei santykis yra pastebimai mažesnis nei tikėtina, kad tai gali reikšti,
kad yra priemaišų, kurie sugeria esant 230 nm bangos ilgiui.
 Saugos taisyklės dirbant laboratorijoje su žmogaus biologinėmis medžiagomis

1. Laboratorijose atlikti praktinius ir laboratorinius darbus gali studentas, laborantas, kuris

susipažino su saugaus elgesio taisyklėmis.
2. Dirbant laboratorijoje svarbu:
2.1 laikytis nustatytų laboratorijos vidaus darbo taisyklių;
2.2 naudoti individualios apsaugos priemones: apsauginius akinius, chalatą;
2.3 naudoti įrenginius pagal jų eksploatavimo reikalavimus;
2.4 dirbti su lakiomis medžiagomis tik esant įjungtai mechaninei ištraukiamajai ventil-
iacijai;
2.5 įvykus nelaimingam atsitikimui, pranešti darbo vadovui ar laboratorijos darbuotojui.
Būtina nukentėjusiam suteikti pirmąją pagalbą ir reikalui esant, iškviesti greitąją
medicinos pagalbą tel. 112;
2.6 laboratorijose draudžiama valgyti, rūkyti, vartoti alkoholį ir narkotines medžiagas,
naudoti laboratorinius indus asmeniniams reikalams;
3. Prieš pradedant darbą svarbu:
3.1 Prieš pradedant darbą, apsivilkti chalatą, užsidėti apsauginius akinius ir susirišti plau-
kus.
3.2 Patikrinti elektros prietaisų, esančių darbo vietoje, tvarkingumą.
3.3 Susipažinti su darbo aprašymu;
4. Veiksmai darbo metu:
4.1 laikytis prietaisų eksploatavimo taisyklių;
4.2 neužkrauti darbo vietos, joje turi būti tik tam darbui skirtos priemonės;
4.3 palaikyti darbo vietoje švarą ir tvarką: išsilieję reagentai neutralizuojami ir utilizuo-
jami, sudužę indai surenkami į atskirą šiukšlių dėžę, sugedę prietaisai išjungiami
laikantis taisyklių;
4.4 neliesti, neragauti, neįkvėpti žmogaus biologinių medžiagų, kitų darbui atlikti
reikalingų medžiagų;
4.5 tinkamai pašalinti biologinę medžiagą: draudžiama išmesti žmogaus biologines
medžiagas į bendro naudojimo šiukšlių dėžes;
4.6 jei biologinę medžiagą pakliuvo ant atviros, neapsaugotos darbo chalatų, apsauginų
pirštinių ar apsauginių akinių, odos, nedelsiant pranešti darbo vadovui.
 Pipetmano valdymas

Yra du pipetmanų tipai: oro išstumimo ir teigiamo poslinkio pipetmanai. Išstumimo pipetmanai
skirtos bendram naudojimui su vandeniniais tirpalais. Teigiamo poslinkio pipetės yra naudojamos
labai klampiems ir lakiems tirpalams. Abiejų tipų pipetmanai turi stūmoklį su antgalių, kuris
įdedamas į mėgintuvėlį.
Išstumimo pipetmano veikimo principas:
1. Pipetmano antgalis įdedamas į indą su tirpalų, kai nustatytas tinkamas tūris.
2. Kai veikimo mygtukas nuspaustas iki pirmojo pasipriešinimo, išleidžiamas nustatytas oro
tūris.
3. Po to kai pipetmano antgalis buvo įmerktas į tirpalą, mygtukas atleidžiamas ir dėl sukurto
vakuumo (slėgio skirtumų) tirpalas įsiurbiamas į pipetmano antgalį.
4. Kai pageidaujama išpilti susiurbtą tirpalą, nuspaudžiamas mygtukas iki pirmojo
pasipriešinimo, išleidžiant tirpalą, ir iki antrojo pasipriešinimo, kad išsipiltų likusiejį
lašeliai.

Teigiamo poslinkio pipetmano veikimo principas:

1. Stūmoklis antgalio viduje pakyla užpildant antgalį skysčiu.

2. Kai dozavimo svirtis yra nuspaustas žemyn, stūmoklis nusileidžia ir pasirinktas tūris yra
išpilamas. Dozavimo svirtis turi būti spaudžiamas po vieną kartą kiekvienam dozavimui.
Darbo priemonės:
• PAXgene Blood RNR mėgintuvėliai (BD ir BD įgalioti platintojai, kat. nr. 762165)
• Etanolis (96–100%). Nenaudoti denatūruoto alkoholio, kurio sudėtyje yra kitos medžiagos,
pvz., metanolis arba metiletilketonas.
• Izopropanolis (100%)
• Pipetės (10 μl – 4ml)
• Sterilūs, aerozoliniai barjerai, RNR neturintys pipetės antgaliai
• Graduotas cilindras
• Centrifuga, galinti pasiekti 1000–8000 x g, ir su besisukančiu rotoriumi bei centrifugos
koriais RNR mėgintuvėliams laikyti
• Vortex maišytuvas
• Susmulkintas ledas

Svarbūs žingsniai prieš pradedant darbą:

• Įsitikinti, kad rinkinio dėžutė nėra pažeista, neprasipylė buferiai.
• Naudojant pipetmaną įsitikinti, kad nustatytas reikalingas tūris bei skystis yra atsargiai
įsiurbtas bei visiškai išpiltas
• Būtinai tinkamai ir įskaitomai sužymėti mėgintuvėlius
• Prapilti mėginių ir buferių kiekiai procedūros metu gali ženkliai sumažinti jų išeigą bei
RNR grynumą
• Visos atliekamos procedūros, jei nėra nurodyta, yra atliekamos kambario temperatūroje
(15-25 °C)
• Atsargiai pipetuoti tirpalus į mėgintuvėlio dugną, kad mėgintuvėlio sieneliuose nebūtų
medžiagos
• Būtinai keisti pipetmano antgalį po kiekvienos medžiagos paėmimo
• Neliesti kolonelės membranos su pipetmano antgaliu
• Viso tyrimo metu naudoti apsaugines pirštines. Jei ant pirštinių pakliuvo tyriamoji
medžiaga nedelsiant pakeisti pirštines į naujas
 Darbo eiga:

Kai tyriamoji medžiaga surinkta į PAXgene kraujo RNR mėgintuvęlį centrifuguokite PAXgene
kraujo RNR mėgintuvėlį 10 min. 3000–5000 x g, naudodami sukamąjį rotorių. Atskirtą superna-
tantą atsargiai nupilti arba pasinaudoti pipetmanu, kad atsargiai surinkti visa nereikalingą atskirtą
supernatantą. Buvo prideta 4ml RNase-free vanduo prie atskirtų kraujo ląstelių. Vorteksavome
medžiagas iki tol, kol jos pilnai neišsiklaidė viena kitoje ir centrifugavome 10 min. 3000-5000 x
g. Atskirėme supernatantą su pipetmanų, kad liktų tik tai nuosedos. Pridėjome 350 µl buferio BM1
bei vorteksavome iki pilno susimaišymo (medžiagos turi būti pilnai pasiskirsčiusios, kad tirpalas
būtų skaidrus). Tirpalas pipetuojamas į 1,5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį. Pridedama 300 µl
buferio BM2 ir 40 µl proteinazes K. Maišyti su vorteksu 5 sekundes bei inkubuoti gautą tirpalą 10
min. 55°C temperatūroje inkubatoriuje 400-1400 apsukų per min. greičiu. Pipetuoti 2 ml tirpalo į
PAXgene Shredder kolonėlę ir centrifuguoti 3 min. ne aukštesniu nei 20000 x g greičiu. Atsargiai
perpilėme visą tirpalą į naują 1,5 mikrocentrifugos mėgintuvėlį neliečiant nuosedų. Pridėjome 700
µl izopropanolio (100% konc.) ir sumaišėme medžiagas su vorteksu. Pipetavome 700 μl mėginio
į PAXgene RNR sukimosi kolonėlę (raudoną), įdėtą į 2 ml apdorojimo vamzdį. Dangtis švelniai
uždaromas ir centrifuguojama 1 min. 8000–20 000 x g. Pridėkite 350 μl buferinio tirpalo BM3 į
PAXgene RNR sukimosi kolonėlę. Švelniai uždaryti dangtį ir centrifuguoti 15 s, esant 8000–20
000 x g. Sukimosi kolonėlė dedama į naują 2 ml mėgintuvėlį ir išmeskite seną mėgintuvėlį. .
Įpilkite 10 μl DNase I ir 70 μl RDD į 1,5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį. Sumaišėme švelniai ir
trumpai centrifugavome, kad surinktume likutsį skystį iš mėgintuvėlio sienelių. Pipetavome
DNase I gautą tirpalą (80 μl) tiesiai ant PAXgene RNA kolonėles membranos ir inkubavome 15
min. 20–30°C temperatūroje. Pridėjome 350 µl buferio BM3 į PAXgene RNA kolonėlę ir uždarytą
kolonėlę su tirpalų centrifugavome 15 sekundžių 8000–20,000 x g. Pridėjome 500 µl buferio BM4
į PAXgene RNA kolonėlę, uždarėme kolonėlę su dangčių ir vėl centrifugavome 15 sekundžių
8000–20,000 x g. Vėl pridėjome 500 µl buferio BM4 į PAXgene RNA kolonėlę, uždarėme ir cen-
trifugavome 2 min. 8000–20,000 x g. Išmeskite apdorojimo vamzdelį ir padėkite PAXgene RNR
kolonėlę į naują 2 ml apdorojimo mėgintuvėlį. Centrifuguoti 1 min. 8000–20,000 x g. Svarbu
išdžiovinti membraną, kad pašaliniai produktai nereaguoti tarpusavyje. Mėgintuvėlį, kuriame yra
tirpalas, išmetėme. Įdėjome PAXgene RNR kolonėlė į naują 1,5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį
ir 40 μl buferinio tirpalo BR5 pipetavome tiesiai ant sukimosi kolonėlės membranos. Švelniai
uždarėme dangtį ir centrifugavome 1 min. esant 8000–20 000 x g. Buvo pridėtas buferis BR5
tiesiai ant sukimosi kolonėlės membranos. Tai sušlapina visa membrana, užtikrinant maksimalų
eliuavimo efektyvumą. Inkubavome mėginį 5 min. 65°C temperatūroje, po inkubacijos atšaldyti
susmulkintame lede. Rezultatų patikrinimui buvo atliktas spekrtofotometrinis tyrimas, kuris
parodė, kad 260 nm ir 280 nm spektre DNR ir RNR koncentracijos atitinka teorinėm koncentraci-
jom.

Nukleino rūgščių spektrų pavyzdys

 Išvados

Išgryninus DNR ir RNR iš kraujo ėminių buvo atlikta spektrofotometrinė analizė. Analizės
rezultatai parodė, kad 260 ir 280 nm spektruose RNR ir DNR koncentracijos atitinka teroinėm
koncentracijom. Tai įrodo, kad atliktas gryninimas buvo atliktas tinkamai.